CN117653566A - 包含药用层孔菌的提取组合物及其应用 - Google Patents

包含药用层孔菌的提取组合物及其应用 Download PDF

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CN117653566A CN202311527267.1A CN202311527267A CN117653566A CN 117653566 A CN117653566 A CN 117653566A CN 202311527267 A CN202311527267 A CN 202311527267A CN 117653566 A CN117653566 A CN 117653566A
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Abstract

本申请涉及菌菇类提取物技术领域，具体公开了包含药用层孔菌的提取组合物及其应用，所述提取组合物的有效成分为药用层孔菌提取物和银耳提取物；其制备方法包括：药用层孔菌子实体粉碎后加1,3‑丁二醇水溶液提取，过滤后获得药用层孔菌提取物；银耳子实体粉碎后加水煮沸冷却，加糖源和复配乳酸杆菌发酵过夜，再加水加热提取，离心去除沉淀后获得银耳提取物，按质量比1‑4:1，将药用层孔菌提取物和银耳提取物混合均匀即得包含药用层孔菌的提取组合物；本申请公开的包含药用层孔菌的提取组合物在制备护肤品、功能性食品或保健品中的应用，具有抗炎、控油、促进胶原蛋白合成等功效。

Description

包含药用层孔菌的提取组合物及其应用
技术领域
本申请涉及菌菇类提取物技术领域，更具体地说，它涉及包含药用层孔菌的提取组合物及其应用。
背景技术
随着人们对护肤重要性不断了解，对护肤知识不断增加，护肤已成为一种日常。皮肤是人体的第一道防线，最易受到外界环境的影响而导致皮肤受损、炎症或者老化。抗炎、修复、控油、除皱、抗衰等功效产品已逐渐作为人们日常使用的主要功效护肤产品。
药用层孔菌，中国古方民间药材“阿里红”，学名为药用拟层孔菌(Fomitopsisofficinalis(Vill.exFr.)Bondartsev&Singer，传统用来治疗慢性支气管炎、腹痛、流感、结核病和各种癌症。各国学者对药用拟层孔菌的化学成分进行研究，迄今报道30余种化合物，以三萜甾体类化合物居多。中国专利公告号CN111643425B公开了一种纯天然植物控油收敛组合物、精华液及其制备方法；该纯天然植物控油收敛组合物包括原料马齿苋提取物、连翘果提取物、陈皮提取物、知母根提取物、糖海带提取物和药用层孔菌提取物；该专利中的组合物能够起到控油和收敛毛孔的效果。在功效护肤领域，含有药用层孔菌提取物的护肤品逐渐被开发。当前的研究多聚焦药用层孔菌提取物本身的功能活性，而对于药用层孔菌提取物功能活性的协同增效作用的相关研究较少。基于上述陈述，本申请提供了包含药用层孔菌的提取组合物及其应用。
发明内容
为了解决上述缺陷，本申请提供了包含药用层孔菌的提取组合物及其应用。
第一方面，本申请提供了包含药用层孔菌的提取组合物，采用如下的技术方案：
包含药用层孔菌的提取组合物，所述提取组合物的有效成分为药用层孔菌提取物和银耳提取物，所述药用层孔菌提取物和银耳提取物的质量比为1-4:1。
优选的，所述药用层孔菌提取物和银耳提取物的质量比为4:1。
优选的，所述药用层孔菌提取物由药用层孔菌子实体粉碎后加1,3-丁二醇水溶液提取，过滤后获得。
优选的，所述1,3-丁二醇水溶液指质量分数为25-35％的1,3-丁二醇水溶液。
优选的，所述银耳提取物由银耳子实体粉碎后加水煮沸冷却，加糖源和复配乳酸杆菌发酵过夜，再加水加热提取，离心去除沉淀后获得。
优选的，所述糖源包括蔗糖、葡萄糖、乳糖中的至少一种。
优选的，所述复配乳酸杆菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌中的至少一种。
优选的，所述复配乳酸杆菌包括活菌数比为1:1:1的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌。
优选的，所述提取组合物由以下方法制得：
S1、制备药用层孔菌提取物：
S11、将药用层孔菌子实体粉碎后过40-80目筛，得药用层孔菌子实体粉；
S12、按料液比1:20-30，将药用层孔菌子实体粉加入到质量分数为25-35％的1,3-丁二醇水溶液中，于60-70℃的温度下搅拌提取2-3h，控制搅拌速率为30-50r/min，经180-220目滤膜过滤收集滤液即得药用层孔菌提取物；
S2、制备银耳提取物：
S21、将银耳子实体粉碎后过40-80目筛，得银耳子实体粉；
S22、按料液比1:20-30，将银耳子实体粉加水煮沸20-40min，冷却后加糖源搅拌溶解完全，得混合液体；
S23、向混合液体中添加复配乳酸杆菌，密封室温发酵过夜(≥12h)，然后再加入银耳子实体粉质量20-30倍的水，常压沸腾提取2-3h，提取液经离心机离心去除沉淀，控制离心转速为3000-4000r/min，离心时间为20-40min，得银耳提取物；
S3、制备包含药用层孔菌的提取组合物：
按质量比1-4:1，将药用层孔菌提取物和银耳提取物混合均匀即得包含药用层孔菌的提取组合物。
第二方面，本申请提供了包含药用层孔菌的提取组合物的应用，采用如下的技术方案：
一种如上述所述的包含药用层孔菌的提取组合物在制备护肤品、功能性食品或保健品中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请将银耳提取物与药用层孔菌提取物混合复配，银耳为食药同源的知名真菌，素有美容功效，含有丰富的蛋白、多糖类成分；通过控制药用层孔菌提取物与银耳提取物的复配比例，能够起到显著的协同增效作用，从而实现低剂量和高效应。
本申请获得的包含药用层孔菌的提取组合物能够促进细胞合成胶原蛋白和透明质酸，进而改善皮肤营养代谢、修复皮肤缺陷、改善皮肤干燥、增加皮肤弹性、减少皮肤皱纹、延缓皮肤衰老；能够抑制皮脂腺细胞脂质合成，起到控油作用，进而避免粉刺、痤疮、脂溢性皮炎等问题产生；同时，其还具有抗炎，减少炎性损伤，阻断引起慢性炎症，恢复炎症细胞因子自稳性的功效。
本申请获得的包含药用层孔菌的提取组合物在制备护肤品、功能性食品或保健品中的应用，具有显著的保湿、修复、抗炎、控油、除皱、抗衰等功效。
附图说明
图1为本申请应用例1多糖含量检测中的葡萄糖溶液浓度-吸光度标准曲线。
图2为本申请应用例1总三萜含量检测中的齐墩果酸浓度-吸光度标准曲线。
图3为本申请应用例1多肽含量检测中的谷胱甘肽浓度与吸光度标准曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明，但不限于此。根据下面的详细描述和实施例，本申请公开的其他特征和优点将变得显而易见，所述详细描述和实施例不应被解释为限制性的。本申请通篇中引用的所有参考文献的内容以引用的方式明确地纳入本申请中。
实施例中所用主要试剂、细胞与仪器如下：
1.1试剂
药用层孔菌，采收自东北大兴安岭地区；银耳采购自福建古田食用菌农贸市场；植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌购自科拓生物有限公司；保加利亚乳杆菌购自润盈生物工程(上海)有限公司；葡萄糖、齐墩果酸(98％，上海源叶生物技术有限公司)；1,3-丁二醇(分析纯，上海麦克林公司)；浓硫酸、盐酸、高氯酸(分析纯，珠海华成达化工有限公司)；苯酚、95％乙醇、香草醛、冰醋酸、甲醇、还原型谷胱甘肽、三氯乙酸、五水硫酸铜、氢氧化钠、亚油酸、尼罗红、维生素C(分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司)；脂多糖(99％，上海麦克林生化科技股份有限公司)；异维A酸(99％，上海麦克林生化科技股份有限公司)；过氧化氢(3％，广东恒健制药有限公司)；氯化钠(杭州微生物试剂有限公司)；；DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；DMSO、100U/mL青霉素-100μg/mL链霉素溶液(北京兰杰柯科技有限公司)；CCK-8试剂(美国碧云天公司)；双氢睾酮(10mM，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；PBS(武汉普诺赛生命科技有限公司)；酵母β-葡聚糖(日本化成工业公司)；MTT试剂(美国Sigma公司)；羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；小鼠TNF-αELISA试剂盒、小鼠IL-1βELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；人透明质酸(HA)ELISA试剂盒(上海恒达生物制品有限公司)；去离子水(自制)。
1.2细胞
SZ95细胞来源于上海BLUEFBIO公司，RAW264.7细胞、HSF细胞来源于深圳市永泼生物科技有限公司。
1.3仪器
紫外可见分光光度计(752N，上海精科实业有限公司)、恒温水浴锅(HH-2，常州澳华仪器有限公司)、漩涡混合仪(MX-S，北京大龙仪器有限公司)、恒温培养箱(ZXDP-B2270，上海智城分析仪器制造有限公司)、细胞培养箱(HERACELL 150i，美国赛默飞公司)、高压蒸汽灭菌锅(SQ510C，重庆雅马拓科技有限公司)、超净台(SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司)、离心机(KA-1000，上海安亭科学仪器厂)、万分天平(BSA224S，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、倒置显微镜(BDS400，重庆奥特光学仪器有限公司)、酶标仪(SpectraMaxi3x，美谷分子仪器(上海)有限公司)。
制备例1药用层孔菌提取物的制备
药用层孔菌提取物由以下方法制得：
S11、将药用层孔菌子实体粉碎后过60目筛，得药用层孔菌子实体粉；
S12、按料液比1:20，将药用层孔菌子实体粉加入到质量分数为30％的1,3-丁二醇水溶液中，于65℃的温度下搅拌提取2h，控制搅拌速率为300r/min，经200目滤膜过滤收集滤液即得药用层孔菌提取物。
制备例2银耳提取物的制备
银耳提取物由以下方法制得：
S21、将银耳子实体粉碎后过60目筛，得银耳子实体粉；
S22、按料液比1:30，将银耳子实体粉加水煮沸30min，冷却后加银耳子实体粉等质量的葡萄糖搅拌溶解完全，得混合液体；
S23、按1×103活菌数/g向混合液体中添加复配乳酸杆菌，密封室温发酵过夜(14h)，然后再加入银耳子实体粉质量30倍的水，常压沸腾提取2h，提取液经离心机离心去除沉淀，控制离心转速为4000r/min，离心时间为20min，得银耳提取物；复配乳酸杆菌包括活菌数比为1:1:1的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌。
制备例3银耳多糖的制备
按照文献[王昭晶等，4种银耳属多糖的理化特征、微观结构及其抗氧化和抗炎症作用研究.中国药学杂志，2019，54(21)：1788-1793.]进行银耳子实体多糖的提取，醇沉得到银耳粗多糖后，Sevag法脱蛋白，冻干获得银耳纯多糖(简称银耳多糖)。
实施例1-2提供了包含药用层孔菌的提取组合物。
实施例1
包含药用层孔菌的提取组合物，其有效成分为药用层孔菌提取物和银耳提取物，且药用层孔菌提取物和银耳提取物的质量比为1:1；按质量比1:1，将制备例1中的药用层孔菌提取物和制备例2中的银耳提取物混合均匀即得包含药用层孔菌的提取组合物。
实施例2
实施例2同实施例1，区别仅在于，药用层孔菌提取物和银耳提取物的质量比为4:1。
应用例1成分及功效检测
2.1多糖含量检测
参考文献[张剑等.一种金针菇水提液多糖含量的检测方法[J].农产品加工,2017,(15):31-4.]中的方法，采用浓硫酸苯酚法显色，以可见分光光度法测多糖含量。
葡萄糖标准曲线的绘制：分别准确吸取葡萄糖标准溶液0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL置于15mL反应管，各以蒸馏水补至2.0mL，分别加入6％苯酚溶液1.0mL摇匀，室温条件下，移液管悬空垂直加入6.0mL浓硫酸，静置10min。用漩涡振荡器混合均匀。置于沸水浴反应30min，反应结束后于冰水浴1min，冷却至室温，在波长490nm处测定吸光度值，以2.0mL水按同样显色操作为空白对照。以吸光度值(A)y为纵坐标，葡萄糖的含量(μg)x为横坐标，绘制标准曲线。
样品测定：离心管中加入8mL95％乙醇，精确移取1mL样品，并称量质量(m)，缓慢滴入乙醇中，边滴边振荡，静置2h，移至离心机进行离心(3000r/min，10min)，把上清液去掉，沉淀以2mol/L的硫酸5mL溶解，转移到25mL(V1)的容量瓶中，以水定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。准确吸取供试品溶液1mL(V2)，加水至2.0mL，每个样品进行3个平行测试，以2mL水按同样显色操作为空白对照。同标准曲线的制备方法，于490nm测定吸光度值。按标准曲线的步骤于490nm处测定吸光度，根据标准曲线查得含糖量。
总多糖含量计算方法：(注意样品重量/体积的稀释倍数)
式中：
X——总糖含量，％；
Y——样品测得吸光度；
a——标准曲线截距；
V1——样品稀释定容体积，单位为毫升(mL)；
V2——供试样品体积，单位为毫升(mL)；
b——标准曲线斜率；
m——样品质量，单位为克(g)；
f——多糖相当于葡萄糖的换算因子，0.9；
n——供试品稀释倍数。
2.2总三萜含量检测
参考文献[孙国强等.灵芝菌丝体中三萜及甾醇含量测定方法研究[J].亚太传统医药,2022,18(11):63-7.]中的方法，以齐墩果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法显色，以可见分光光度法测定总三萜含量。
齐墩果酸标准曲线的绘制：准确称取齐墩果酸标准品20mg，加入甲醇溶解，定容至100mL容量瓶，配制成0.2mg/mL的对照品溶液。分别吸取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL的对照品溶液，于60℃水浴中挥去溶剂后，加入0.2mL 5％香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，60℃水浴中反应15min，冰水浴冷却，加冰醋酸4mL摇匀，同时做空白实验，测定550nm处的吸光度值。以吸光度值(A)y为纵坐标，齐墩果酸(mg)x为横坐标，绘制标准曲线。
样品测定：准确量取样品液0.5mL，置10mL试管中，70℃水浴挥干溶剂，加入0.2mL5％香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，60℃水浴中反应15min，冰水浴冷却，加冰醋酸4mL摇匀，测定550nm处的吸光度值。
2.3多肽含量检测
参考文献[徐娟等.乳蛋白水解液中多肽含量测定方法的研究[J].食品科技,2010,35(12):275-8.]中的方法，以还原型谷胱甘肽为标准品，采用双缩脲法显色，以可见分光光度法测定多肽含量。10％三氯乙酸可以沉淀样品中的大分子蛋白质，去除对多肽测定的影响。
还原型谷胱甘肽标准曲线的绘制：用去离子水配制4mg/mL的谷胱甘肽标准液，依次取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1mL的谷胱甘肽标准溶液，用去离子水定容到6.0mL加入4.0mL双缩脲试剂(A液:B液＝3:1，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度值(以第一管做空白对照)。以吸光度值(A)y为纵坐标，肽的浓度(mg/mL)x为横坐标，绘制标准曲线。
样品测定：取2.5mL样品溶液，加入2.5mL 10％(W/V)的三氯乙酸，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50mL容量瓶中，并用5％的三氯乙酸定容至刻度，摇匀。然后取6.0mL上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0mL(样液:双缩脲试剂＝3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度值(A)，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度(mg/mL)，进而可求得样品中多肽含量。
2.4样品抑制SZ95细胞脂质分泌的实验
细胞培养：用含1％双抗、10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养SZ95细胞，置于37、℃5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次液。
参照文献[叶枫等.Clascoterone对SZ95人皮脂腺细胞增殖、脂质合成和炎症因子表达的影响[J].中国麻风皮肤病杂志,2022,38(06):349-54.]中的实验方法：
取对数期且生长良好的SZ95皮脂腺细胞，消化后接种100μL于黑色透底96孔板中，每孔细胞5×103个，设置空白组、模型组、阳性对照组和实验样品组。空白组只加入100μM亚油酸，模型组、阳性对照组和实验组加入10μM双氢睾酮和100μM亚油酸，每组3复孔，培养过夜后，空白组加入等体积空白培养基，阳性对照组参照文献[张浩等.控油植物活性物组合抑制皮脂分泌的功效研究[J].香料香精化妆品,2023,(03):102-7.]加入异维A酸，实验组加入含不同浓度样品培养基，继续培养48h。
实验组处理48h后弃去培养液并用PBS清洗，随后用PBS稀释的10μg/mL尼罗红染色，37℃避光孵育10min，PBS清洗后，使用多功能酶标仪以激发波长485nm/发射波长565nm检测尼罗红强度。结果以尼罗红的吸光度表示，实验组与对照组的百分比反映细胞内相对脂质含量。
2.5样品对RAW264.7细胞的免疫刺激实验
细胞培养：用含1％双抗、10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养RAW264.7细胞，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次液。
实验方法：取对数期且生长良好的RAW264.7细胞，传代至96孔板内，每孔细胞5×103个，设置空白组，阳性组，每组3复孔，阳性组加入100μg/mL酵母葡聚糖，样品组加入含不同浓度样品的培养基，空白组加入等体积培养基，继续培养24h。
培养上清液中TNF-α和IL-1β含量采用ELISA法检测，根据ELISA试剂盒内说明书操作，每孔细胞取上清100μL，加ELISA试剂盒孔板中，每组设双孔，按照说明书中多步温育，根据标准曲线计算每组的TNF-α和IL-1β含量。
2.6样品对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症因子的抑制作用
细胞培养：用含1％双抗、10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养RAW264.7细胞，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次液。
实验方法：取对数期且生长良好的RAW264.7细胞，传代至96孔板内，每孔细胞5×103个。设置正常对照组、模型组、实验组，每组3复孔。模型组和实验组参照文献[祝珊珊等.槲皮素通过PTEN/PI3K/JNK信号通路减轻小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症[J].中国病理生理杂志,2023,39(03):510-9.]先用2mg/L LPS刺激细胞2h，正常对照组、模型组加入等体积培养基，实验组加入不同浓度的含样品培养基，继续培养24h。
上清液中TNF-α和IL-1β含量采用ELISA法检测，根据ELISA试剂盒内说明书操作，每孔细胞取上清100μL，加ELISA试剂盒孔板中，每组设双孔，按照说明书中多步温育，根据标准曲线计算每组的TNF-α和IL-1β含量。
2.7样品对过氧化氢诱导损伤HSF细胞分泌胶原蛋白、透明质酸的实验
羟脯氨酸为胶原蛋白中特有的氨基酸，约占胶原蛋白中氨基酸的13％，通过测定羟脯氨酸的含量，可以间接测得胶原蛋白含量。
细胞培养：用含1％双抗、10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养HSF细胞，置于37、℃5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，每两天换一次液。
过氧化氢损伤HSF细胞浓度的确定：参考文献[王春宇等.小柴胡汤对过氧化氢诱导的人皮肤成纤维细胞氧化应激损伤的保护作用[J].中国实验诊断学,2018,22(06):1074-7.]中的方法，取对数生长期的成纤维细胞按1×105个mL接种于96孔板，每孔总体积100μL，均置于37，℃5％ CO2培养箱中培养24h，分别加入10μL的含过氧化氢的DMEM高糖培养基溶液至过氧化氢终浓度为25-400μmol/L(临用新配)，另设对照孔，每组设3个复孔，作用4h。然后按MTT试剂说明书操作，以成纤维细胞半数存活率对应的剂量作为损伤浓度。
样品对过氧化氢诱导损伤HSF细胞分泌胶原蛋白、透明质酸的作用：参考文献[刘玲英等.芦荟多糖对体外培养人成纤维细胞增殖和分泌透明质酸与羟脯氨酸的影响[J].中西医结合学报,2010,8(03):256-62.]中的方法，取生长状态良好的对数生长期细胞消化稀释至1×105/mL，取500μL接种于24孔培养板，每孔5×104个细胞，培养24h后，除对照组外分别加入10μL的含过氧化氢的DMEM高糖培养基溶液至过氧化氢终浓度为损伤浓度(400μmol/L)，孵育4h后，吸去原有培养基，换为对照组、模型组加入空白培养基，阳性组参照文献[王菁等.珍珠提取液抑制过氧化氢诱导人皮肤成纤维细胞凋亡的研究[J].药物生物技术,2018,25(05):402-5.]加含维生素C培养基，实验组加入不同浓度含样品培养基，每组设3个复孔，继续培养48h，收集上清。
参考文献[陈诚等.玉屏风散对紫外线照射的人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响[J].沈阳药科大学学报,2023,40(04):463-9.]中的方法，采用比色法检测羟脯氨酸含量，从24孔板中每孔取250μL细胞上清液，然后参照羟脯氨酸试剂盒检测盒说明书操作步骤，取上清采用酶标仪于550nm处检测羟脯氨酸的吸光度(A)，计算羟脯氨酸的含量以及胶原蛋白的含量。计算公式为：
胶原蛋白含量＝羟脯氨酸含量×7.69
C标准：标准液浓度，5μg/mL；N：样本测试前稀释倍数
参考文献[刘玲英等.芦荟多糖对体外培养人成纤维细胞增殖和分泌透明质酸与羟脯氨酸的影响[J].中西医结合学报,2010,8(03):256-62.]中的方法，采用ELISA法检测培养上清液中透明质酸水平，从24孔板中每孔取100μL样品分别加入ELISA酶板中，设置双孔测定，37℃培养箱孵育2h，再依次按照说明书加入试剂，最后用酶标仪于450nm测定吸光度(A)，计算透明质酸含量。
2.8统计分析
数据以平均值±标准差表示，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析，事后比较采用LSD，P<0.05代表有统计学差异。
应用例2结果分析
3.1多糖含量
以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，结果见图1，得出线性回归方程为：y＝0.008x-0.0177，线性相关系数R2＝0.9977。
根据各样品吸光度，各样品多糖含量分别为：银耳提取物(液体)为1.5％，银耳多糖(干粉)为97％，药用层孔菌提取物为0.003％，包含药用层孔菌的提取组合物为0.37％。说明，包含药用层孔菌的提取组合物中多糖主要来源于银耳提取物。
3.2总三萜含量
以齐墩果酸含量为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果见图2，得到回归方程为：y＝37.65x-0.0075，R2＝0.9997。
根据各样品吸光度，各样品总三萜含量分别为：银耳提取物(液体)为0.01mg/mL，银耳多糖(干粉)未测出，药用层孔菌提取物为0.088mg/mL，包含药用层孔菌的提取组合物为0.069mg/mL，说明包含药用层孔菌的提取组合物中三萜类物质主要来源于药用层孔菌提取物。
3.3多肽含量
以谷胱甘肽浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果见图3，得到回归方程为：y＝0.1207x+0.0015，R2＝0.9989。
根据各样品吸光度，各样品多肽含量分别为：银耳提取物(液体)为3.8mg/mL，银耳多糖(干粉)未测出，药用层孔菌提取物(液体)为1.6mg/mL，包含药用层孔菌的提取组合物为2.2mg/mL，说明银耳提取物和药用层孔菌提取物中均含有多肽类成分。
3.4样品对SZ95皮脂腺细胞脂质合成的抑制作用
使用不同浓度和组合的样品处理皮脂腺细胞后，尼罗红染色检测皮脂腺细胞脂质分泌量，结果如表1所示，双氢睾酮+亚油酸可以显著促进细胞中脂质的合成；丁二醇溶剂、银耳多糖对SZ95细胞脂质合成没有抑制作用；银耳提取物、药用层孔菌提取物均对脂质合成有一定的抑制作用。特别地，药用层孔菌提取物与银耳提取物以1-4:1复配时，对脂质的合成具有协同增效作用。而银耳多糖与药用层孔菌提取物以1:4复配时无协同增效作用，说明银耳经过发酵处理后，提取物中含有的非多糖类成分具有抑制皮脂腺细胞脂质合成的作用，而且其作用机理与药用层孔菌提取物中成分的作用机理不同。根据前面的成分检测结果，银耳提取物中主要含多糖和多肽，药用层孔菌提取物中主要含三萜类成分，由此，提示这些成分具有不同的作用机理。
表1各样品对SZ95细胞脂质合成的作用
组别 吸光度比值(％)
空白组 44±3.2a
双氢睾酮+亚油酸组(模型组) 100b
异维A酸组 51±3.3c
丁二醇溶剂 108±12.2b
银耳提取物-0.05％ 84±6.5d
银耳多糖-0.05％ 95±7.4b
药用层孔菌提取物-0.05％ 78±3.9d
银耳多糖-0.01％+药用层孔菌提取物-0.04％ 80±5.2d
银耳多糖-0.25％+药用层孔菌提取物-0.25％ 83±5.3d
银耳多糖-0.04％+药用层孔菌提取物-0.01％ 82±6.3d
银耳提取物-0.01％+药用层孔菌提取物-0.04％ 63±4.4e
银耳提取物-0.025％+药用层孔菌提取物-0.025％ 68±4.1e
银耳提取物-0.04％+药用层孔菌提取物-0.01％ 81±4.0d
注：不同字母代表P<0.05。样品浓度均是以干物质折算后的浓度(下同)。
3.5样品对RAW264.7细胞的激活作用
使用不同浓度和组合的样品处理正常巨噬细胞，ELISA法测定巨噬细胞TNF-α和IL-1β的分泌量。结果如表2所示，与空白组对比，各样品组均具有促进TNF-α和IL-1β分泌的作用，单个组分比较，其中银耳多糖的作用最强、其次为银耳提取物；但各样品组合对细胞分泌TNF-α和IL-1β没有明显的协同作用。
表2样品对RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β分泌的作用
组别 TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL)
空白组 18.2±0.3a 101±4.3a
酵母β-葡聚糖 30.1±0.4b 165±5.2b
银耳提取物-0.05％ 23.8±0.8c 122±6.4c
银耳多糖-0.05％ 26.1±1.2c 146±5.3d
药用层孔菌提取物-0.05％ 22.2±0.6d 118±11.6c
银耳多糖-0.01％+药用层孔菌提取物-0.04％ 24.2±0.8c 126±8.9c
银耳多糖-0.25％+药用层孔菌提取物-0.25％ 25.2±0.7c 125±8.5c
银耳多糖-0.04％+药用层孔菌提取物-0.01％ 26.0±0.9c 131±13.2c
银耳提取物-0.01％+药用层孔菌提取物-0.04％ 25.3±1.1c 126±10.8c
银耳提取物-0.025％+药用层孔菌提取物-0.025％ 25.8±1.4c 130±11.4c
银耳提取物-0.04％+药用层孔菌提取物-0.01％ 25.4±1.6c 123±12.5c
注：不同字母代表P<0.05。
3.6样品对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症因子的抑制作用
LPS处理RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型，使用不同浓度和组合的样品处理细胞24h后，取培养上清液ELISA法测定巨噬细胞TNF-α和IL-1β的分泌量。结果如表3所示，与正常组比较，模型组的TNF-α和IL-1β极为显著提升，表明细胞炎症模型造模成功。与模型组比较，各样品及组合物组均有不同程度抑制TNF-α和IL-1β分泌的作用。特别地，当药用层孔菌提取物与银耳提取物以1-4:1比例进行复配时，对巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β具有协同增效作用，而银耳多糖与药用层孔菌提取物进行复配时，则无协同增效作用。
表3样品对RAW264.7细胞TNF-α和IL-1β分泌的作用
注：不同字母代表P<0.05。
3.7样品对过氧化氢诱导损伤HSF细胞分泌胶原蛋白、透明质酸的作用
从表4可见，400μmol/L过氧化氢溶液处理HSF细胞后成功建立氧化损伤模型，与正常组比较，其胶原蛋白和透明质酸的分泌量明显下降。维生素C具有自由基清除作用，因此，可以提高氧化损伤细胞胶原蛋白和透明质酸的合成量。此外，与模型组相比，各样品组的胶原蛋白和透明质酸分泌量均有明显的提升，提示各样品对氧化损伤细胞具有一定的保护作用。特别地，药用层孔菌与银耳提取物以1-4:1复配时，其胶原蛋白和透明质酸合成量显著高于其他样品组别。由此提示，在促进成纤维细胞合成胶原蛋白和透明质酸作用方面，在一定的配比时，银耳提取物与药用层孔菌提取物之间存在协同增效作用。而银耳多糖与药用层孔菌提取物却无协同增效作用，表明银耳提取物中有非多糖类成分可与药用层孔菌提取物中成分通过不同的分子机理促进细胞合成胶原蛋白和透明质酸。
表4样品对HSF细胞胶原蛋白和透明质酸分泌的调节作用
注：不同字母代表P<0.05。
综上结果，当药用层孔菌提取物与银耳提取物在1-4:1的配比范围时，对SZ皮脂腺细胞的脂质异常合成具有协同增效抑制作用，对LPS刺激RAW264.7细胞导致的TNF-α和IL-1β过度分泌具有协同增效抑制作用，以及协同促进成纤维细胞合成胶原蛋白和透明质酸。同时，药用层孔菌提取物与银耳提取物复配后，对RAW264.7细胞的TNF-α和IL-1β分泌具有提升作用。这些结果表明，银耳提取物复合药用层孔菌提取物具有降低皮脂腺细胞皮脂过量分泌、提升免疫、抑制炎症和促进皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白和透明质酸的优异作用。特别地，在降低皮脂腺细胞皮脂合成、抑制炎症和促进合成细胞外基质活性方面，在一定的比例范围内，药用层孔菌提取物与银耳提取物具有协同增效作用，从而实现低剂量、高效应。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述提取组合物的有效成分为药用层孔菌提取物和银耳提取物，所述药用层孔菌提取物和银耳提取物的质量比为1-4:1。
2.根据权利要求1所述的包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述药用层孔菌提取物和银耳提取物的质量比为4:1。
3.根据权利要求1所述的包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述药用层孔菌提取物由药用层孔菌子实体粉碎后加1,3-丁二醇水溶液提取，过滤后获得。
4.根据权利要求3所述的包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述1,3-丁二醇水溶液指质量分数为25-35％的1,3-丁二醇水溶液。
5.根据权利要求1所述的包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述银耳提取物由银耳子实体粉碎后加水煮沸冷却，加糖源和复配乳酸杆菌发酵过夜，再加水加热提取，离心去除沉淀后获得。
6.根据权利要求5所述的包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述糖源包括蔗糖、葡萄糖、乳糖中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述复配乳酸杆菌包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述复配乳酸杆菌包括活菌数比为1:1:1的植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌。
9.根据权利要求1所述的包含药用层孔菌的提取组合物，其特征在于，所述提取组合物由以下方法制得：
S1、制备药用层孔菌提取物：
S11、将药用层孔菌子实体粉碎后过40-80目筛，得药用层孔菌子实体粉；
S12、按料液比1:20-30，将药用层孔菌子实体粉加入到质量分数为25-35％的1,3-丁二醇水溶液中，于60-70℃的温度下搅拌提取2-3h，过滤收集滤液即得药用层孔菌提取物；
S2、制备银耳提取物：
S21、将银耳子实体粉碎后过40-80目筛，得银耳子实体粉；
S22、按料液比1:20-30，将银耳子实体粉加水煮沸20-40min，冷却后加糖源搅拌溶解完全，得混合液体；
S23、向混合液体中添加复配乳酸杆菌，密封室温发酵过夜，然后再加入银耳子实体粉质量20-30倍的水，常压沸腾提取2-3h，提取液经离心机离心去除沉淀，得银耳提取物；
S3、制备包含药用层孔菌的提取组合物：
按质量比1-4:1，将药用层孔菌提取物和银耳提取物混合均匀即得包含药用层孔菌的提取组合物。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的包含药用层孔菌的提取组合物在制备护肤品、功能性食品或保健品中的应用。
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