CN117651715A - 抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能够结合CD1a的抗体或其抗原结合片段，其特别适合用于治疗或预防一种或多种炎性皮肤或粘膜病症或疾病、或一种或多种相关全身性疾病或病症、或一种或多种全身性表现的炎性药物反应、或CD1a‑表达恶性肿瘤。

Description

抗体

技术领域

本发明涉及抗体，及其在治疗、预防或监测炎性皮肤和粘膜疾病或病症、或相关全身性疾病或病症、或全身性表现的炎性药物反应、或CD1a-表达恶性肿瘤(表达CD1a的恶性肿瘤)中的用途。

背景技术

抗原呈递是宿主免疫的基本支柱之一，免疫系统通过抗原呈递检测包括感染、组织损伤和疾病在内的威胁，并精心策划定制的防御。抗原呈递包括抗原内化、加工和由呈递分子在专门的抗原呈递细胞(APC)表面上的展示。组织抗原的呈递以实现针对抗原源的免疫应答的最佳激活并消除威胁。抗原涵盖多种分子，包括肽、脂质和代谢物等。MHCI和MHCII是在APC表面上表达的蛋白质，其与肽抗原结合并且主要分别呈递给CD8+T细胞和CD4+T细胞。这些T细胞亚群在细胞表面T细胞受体(TCR)识别MHC-结合肽抗原后被诱导发挥其效应子功能，使得能够实现对病原体和癌症的免疫。然而，无害抗原(例如过敏性疾病中的过敏原或自身免疫中的自身蛋白)的呈递失调，会导致宿主损伤、炎症和疾病。因此，靶向抗原呈递途径是调节随后的免疫应答的有力手段。

CD1分子构成了结构类似于MHCI的抗原呈递分子家族。相比之下，CD1分子是相对非多态性的，并且CD1抗原结合沟富含疏水性氨基酸，能够呈递脂质物质。脂质是形成宿主和病原体细胞膜的重要组分的重要抗原，并且比蛋白质衍生的肽抗原更不易发生突变。CD1家族由细胞表面第1组分子CD1a/b/c和第2组CD1d和第3组CD1e组成。大多数对CD1脂质呈递和T细胞应答的理解来自对糖脂结合的CD1d的不变自然杀伤T细胞识别的研究，部分原因是CD1d是正常情况下由小鼠表达的唯一CD1。CD1d和MHCI分子被广泛表达，而MHCII和第1组CD1表达相对限于APC。然而，这些分子中独特的CD1a对皮肤和粘膜具有高度特异性。CD1a由皮肤和粘膜表皮中的朗格汉斯细胞(Langerhans cells，LC)组成型表达(1)，除了langerin(朗格汉斯蛋白)外，通常用作LC的识别标志物。此外，CD1a在真皮树突细胞亚群上以较低水平表达(2-4)，并且可以在皮肤先天淋巴样细胞(ILC)、特别是ILC2上表达和上调(5)。重要的是，CD1a被首次描述在未成熟胸腺细胞的表面上，但表达通常在T细胞成熟后丢失(6)。皮肤中CD1a的高水平组成型表达表明健康和患病人类皮肤中CD1a-依赖性监管和T细胞活化的重要生理作用。此外，特应性皮炎皮肤中CD1a表达的增加可能是炎性皮肤病中CD1a-反应性T细胞群活化增加的基础。

由呈递分枝杆菌脂质-基抗原的CD1a、CD1b或CD1c分子引导的T细胞应答与人类对结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌感染的免疫应答有关。CD1a限制性T细胞对其它更常见的致病性或共生细菌脂质的识别是正在进行的研究的主题，本文提供了一些数据。虽然MHC限制性T细胞对肽抗原的TCR识别通常对肽抗原具有高度特异性，但TCR识别的CD1模式更加多样化，具有高度脂质特异性应答(7)和交叉反应或甚至由直接TCR-CD1相互作用介导的明显脂质独立信号传导(8-10)，CD1a-自身反应性T细胞的情况也是如此。CD1a-自身反应性T细胞在某些情况下在识别小疏水性宿主-衍生的脂质后被激活，所述脂质嵌套在CD1a抗原结合沟内并且不突出，从而允许TCR与CD1a蛋白本身而不是与脂质相互作用。在这种情况下，脂质与大或带电荷头基的结合将阻止自身反应性TCR和CD1a之间的相互作用，从而阻止T细胞激活(11、12)。

CD1a是相对非多态性的，并因此在预防和/或治疗炎性皮肤和粘膜疾病和病症(例如特应性皮炎、牛皮癣、红斑狼疮或相关全身性疾病或病症)或全身性表现的炎性药物反应方面具有全人群的潜力，在这些疾病和病症或炎性药物反应中，CD1a-表达树突细胞亚群的频率发生改变，并且LC或响应性T细胞的迁移模式发生改变(13-15)。此外，CD1a与其它全身性病症有关，包括炎性肠病、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合症、甲状腺炎和神经退行性变(A1-amodi Inflammatory Bowel Disease 2018 24：1225-1236；Caporale JNeuroimmunol 2006 177:112-8；Jamshidian Immunological Investigations 2010 3:874-889；Roura-Mir J Immunol 2005174:3773-80；Wang Aging 2019 11:4521-4535)。此外，CD1a可由某些恶性肿瘤表达，包括朗格汉斯细胞组织细胞增多症、T细胞淋巴瘤亚型、胸腺瘤亚型和罕见描述的其它恶性肿瘤，例如肥大细胞增多症亚型。

本发明的一个目的是提供抗-CD1a抗体。此类抗体特别有用于治疗或预防皮肤或粘膜的炎性疾病或病症，例如牛皮癣、皮肤炎、红斑狼疮或表现为炎性皮肤或粘膜疾病或病症的药物反应。此类抗体还可以有益于治疗或预防相关全身性疾病或病症、或全身性表现的炎性药物反应或治疗CD1a-表达恶性肿瘤。

发明内容

在一方面，本发明提供了一种能够结合CD1a的抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段可以特异性结合CD1a。该抗体或其抗原结合片段可以优先结合CD1a。该抗体或其抗原结合片段可以诱导表达CD1a的细胞的细胞死亡。该抗体或其抗原结合片段可以阻断配体与CD1a的结合。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:3或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的互补决定区(CDR)3(CDR3)；和/或

所述抗体或其抗原结合片段可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:6或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:11或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3；和/或

所述抗体或其抗原结合片段可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:14或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3。

所述抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:19或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3；和/或

所述抗体或其抗原结合片段可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:22或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:27或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3；和/或

所述抗体或其抗原结合片段可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:30或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:35或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3；和/或

所述抗体或其抗原结合片段可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:38或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的CDR3。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:1的CDR1，

SEQ ID NO:2的CDR2，和

SEQ ID NO:3的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列；和/或

b)轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:4的CDR1，

SEQ ID NO:5的CDR2，和

SEQ ID NO:6的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:9的CDR1，

SEQ ID NO:10的CDR2，和

SEQ ID NO:11的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列；和/或

b)轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:12的CDR1，

SEQ ID NO:13的CDR2，和

SEQ ID NO:14的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:17的CDR1，

SEQ ID NO:18的CDR2，和

SEQ ID NO:19的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列；和/或

b)轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:20的CDR1，

SEQ ID NO:21的CDR2，和

SEQ ID NO:22的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:25的CDR1，

SEQ ID NO:26的CDR2，和

SEQ ID NO:27的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列；和/或

b)轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:28的CDR1，

SEQ ID NO:29的CDR2，和

SEQ ID NO:30的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:33的CDR1，

SEQ ID NO:34的CDR2，和

SEQ ID NO:35的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列；和/或

b)轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:36的CDR1，

SEQ ID NO:37的CDR2，和

SEQ ID NO:38的CDR3，

或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。

所述CDR可以与任何框架区相关。优选地，该框架区是人类来源的。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:7或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:7或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:8或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:15或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:15或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:16或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:16或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:23或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:23或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:24或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:24或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:31或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:31或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:32或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:32或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:39或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:39或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:40或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:40或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成的重链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的轻链可变区。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:15或由SEQ ID NO:15组成的重链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:16或由SEQ ID NO:16组成的轻链可变区。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:23或由SEQ ID NO:23组成的重链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成的轻链可变区。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:31或由SEQ ID NO:31组成的重链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:32或由SEQ ID NO:32组成的轻链可变区。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:39或由SEQ ID NO:39组成的重链可变区；和

b)包含SEQ ID NO:40或由SEQ ID NO:40组成的轻链可变区。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链，其包含SEQ ID NO:41或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:41或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链，其包含SEQ ID NO:42或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:42或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链，其包含SEQ ID NO:43或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:43或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链，其包含SEQ ID NO:44或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:44或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链，其包含SEQ ID NO:45或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:45或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链，其包含SEQ ID NO:46或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:46或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链，其包含SEQ ID NO:47或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:47或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链，其包含SEQ ID NO:48或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:48或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含或由以下组成：

a)重链，其包含SEQ ID NO:49或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:49或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成；和/或

b)轻链，其包含SEQ ID NO:50或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列，或由SEQ ID NO:50或与其具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列组成。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成的重链；和

b)包含SEQ ID NO:42或由SEQ ID NO:42组成的轻链。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:43或由SEQ ID NO:43组成的重链；和

b)包含SEQ ID NO:44或由SEQ ID NO:44组成的轻链。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的重链；和

b)包含SEQ ID NO:46或由SEQ ID NO:46组成的轻链。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:47或由SEQ ID NO:47组成的重链；和

b)包含SEQ ID NO:48或由SEQ ID NO:48组成的轻链。

所述抗体或其抗原结合片段可以由以下组成：

a)包含SEQ ID NO:49或由SEQ ID NO:49组成的重链；和

b)包含SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成的轻链。

可以分离本发明的抗体或其抗原结合片段。

在任何方面，“抗体或其抗原结合片段”可以指所列举的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，例如两种。例如，在任何方面，可设想两种抗体或其抗原结合片段，各自包含或由以下组成：

a)具有重链可变区和轻链可变区的第一抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含：

SEQ ID NO:33的CDR1、SEQ ID NO:34的CDR2和SEQ ID NO:35的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列，

该轻链可变区包含：

SEQ ID NO:36的CDR1、SEQ ID NO:37的CDR2、和SEQ ID NO:38的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列；

具有重链可变区和轻链可变区的第二抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含：

SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列，

该轻链可变区包含：

SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列；或

b)第一抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO:39或由SEQ ID NO:39组成的重链可变区；以及包含SEQ ID NO:40或由SEQ ID NO:40组成的轻链可变区，或与其具有至少80％同一性的序列；和

第二抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成的重链可变区；以及包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的轻链可变区，或与其具有至少80％同一性的序列；或者

c)第一抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO:49或由SEQ ID NO:49组成的重链；以及包含SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成的轻链，或与其具有至少80％同一性的序列；和

第二抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成的重链；以及包含SEQ ID NO:42或由SEQ ID NO:42组成的轻链，或与其具有至少80％同一性的序列。

例如，在本文公开的任何治疗应用中，和/或在本文公开的任何监测方法中，可以利用抗体或抗原结合片段的任何组合。优选地，Ab 116和16组合使用。

在另一个实施方式中，Ab 116可以用于本文公开的任何治疗应用，并且Ab 16可以用于监测同一受试者。或者，Ab 16可用于本文公开的任何治疗应用，并且Ab 116可用于监测同一受试者。

本文提及的术语“抗体”是指包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链均由重链可变区(V_H)和重链恒定区组成。每条轻链均由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体中保留选择性结合抗原的能力的一个或多个片段。其抗原结合片段可以是但不限于Fab、修饰的Fab、Fab'、修饰的Fab’、F(ab’)₂、Fv、单域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体以及任何上述的表位结合片段(Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗原-结合片段的方法是本领域众所周知的(参见例如Verma et al.,1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。

抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、ScFv或其它单链或修饰形式、Fab、(Fab’)2、Fv、dAb、Fd、纳米抗体、骆驼抗体或双抗体。优选地，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。

发明人通过产生有效的单克隆抗体，已经靶向CD1a及其在炎性皮肤和粘膜疾病和病症、或相关全身性疾病或病症、或全身性表现的炎性药物反应中的潜在作用。由于CD1a在皮肤和粘膜中高度表达，因此使用此类抗体提供了选择性治疗炎性皮肤和粘膜疾病和病症同时最小化脱靶效应的机会。CD1a不由小鼠表达，但由其它哺乳动物表达。人类CD1a(UniProtKB/Swiss-Prot:P06126-CD1A_HUMAN)由世界范围内的显性等位基因表达，其变体存在于一些中国种族群体中(18)。靶向CD1a抗原呈递还拦截其它细胞因子导向的抗体疗法(例如抗IL17疗法)或其它免疫疗法上游的炎症途径，并因此提供了在免疫级联早期调节促炎性病症的强有力手段。此外，利用CD1a对皮肤的特异性可以提供针对皮肤的附加治疗的方法，例如通过使用双特异性或多特异性或缀合抗体技术，以特异性靶向小分子、药物、核酸、肽、抗体或细胞缀合物疗法。还进一步地，由于CD1a是相对非多态性的，本发明提供了在预防和/或治疗炎性皮肤和粘膜疾病(例如特应性皮炎和牛皮癣，其中CD1a-表达树突细胞亚群的频率增加，并且LC的迁移模式发生改变(13-15))、或CD1a-表达恶性肿瘤方面的普遍潜力。

通过改变CD1a-表达细胞的数量和功能，抗体将具有超出脂质反应性的效果并影响CD1a-表达细胞的所有作用，包括抗原呈递至肽特异性T细胞和先天途径(例如嗜中性粒细胞)。本发明的抗体能够减少朗格汉斯细胞，尽管它们具有鼠IgG1性质。这种减少提供了一种在不存在补体/ADCC-相关炎症的情况下控制广泛炎症途径的方法，这可以提供治疗益处。这在本文描述的咪喹莫特模型中显示，其中例如根据本发明的抗体减少炎症，包括减少至显著低于野生型小鼠的水平，展示对CD1a-表达细胞之外的途径具有深远的抗炎作用，包括先天途径，例如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。本发明的抗体还抑制多种细胞因子的产生，包括与广泛的临床疾病相关的IFN-γ和IL-22。

另一方面，本发明提供了一种编码本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸。此类核酸可以由SEQ ID No:51-90中的任一个提供。本领域技术人员将理解，由于密码子冗余，可以使用许多DNA序列来编码本发明的抗体或其抗原结合片段。或者，核苷酸序列的密码子优化可用于提高在用于产生本发明的抗体或其抗原结合片段的表达系统中的翻译效率。

在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的核酸的载体。可以选择或构建合适的载体，其含有合适的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它合适的序列。载体可以是例如质粒或病毒。对于进一步的细节，请参见例如(Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis.(1989),Molecular cloning:alaboratory manual,2nded.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYork)。例如在核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白质分析中，用于操纵核酸的许多已知技术和方案，详细描述于(Ausubel etal.,Currentprotocols in molecular biology.New York:Greene Publishing Association；Wiley-Interscience,1992)。载体可以是表达载体。载体或表达载体可以是质粒。

本发明的核酸分子或载体可以使用任何合适的表达系统来表达，例如在合适的宿主细胞中或在无细胞系统中表达。

在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸和/或载体的宿主细胞。宿主细胞可以选自细菌宿主细胞(原核系统)例如大肠杆菌，或真核细胞例如酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞的那些细胞。优选地，本发明的宿主细胞能够产生本发明的抗体或其抗原结合片段。可以通过选择和/或分离的方式富集所产生的抗体或其抗原结合片段。

还可以通过化学合成来产生本发明的抗体或其抗原结合片段。可以通过选择和/或分离的方式富集所获得的抗体或其抗原结合片段。

根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体和/或宿主细胞，任选地连同一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。

本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或宿主细胞可以使用已建立的制备方法配制为药物组合物(Gennaro,A.L.and Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,20th Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂。为了制备例如丸剂、粉剂、明胶胶囊或栓剂，乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油和硬化油是可以使用的药学上可接受的赋形剂的示例。用于生产溶液、悬浮液、乳液、气雾剂混合物或在使用前重构为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适的赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇、及其合适的混合物以及植物油。

本发明的药物组合物可以通过治疗有效的任何肠胃外或非肠胃外(肠内)途径给药。肠胃外施用方法包括例如皮内、皮下、肌内、气管内、鼻内、玻璃体内或静脉内注射和输注技术，例如以注射液、输注液或混合物以及气雾剂安装和吸入的形式，例如气溶胶混合物、喷雾剂或粉末的形式。本发明的药物组合物可以按需要以含有常规无毒的药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和媒剂的配方形式(制剂，formulations)全身或局部给药。如果化合物的血清半衰期相对较短或较长或需要快速起效，则静脉内和皮下输注和/或注射的组合可能是最方便的。优选地，药物组合物皮下或静脉内给药。药物组合物可以是水溶液、水包油乳剂或油包水乳剂。

对于静脉内注射、或在病痛部位注射、或其它给药部位而言，活性成分可以是肠胃外可接受的水溶液的形式，其无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等渗媒剂如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。

优选以“治疗有效量”向个体给药所述组合物，该量足以显示对个体的益处。最佳剂量将取决于抗体或其抗原结合片段的生物分布、给药模式、所治疗的疾病/病症的严重性以及患者的医疗状况。如果需要，抗体或其抗原结合片段可以以持续释放配方的形式给出，例如脂质体分散体或基于水凝胶的聚合物微球，如PolyActiveTM或OctoDEXTM(参见，Boset al.,Business Briefing:Pharmatech 2003:1-6)。其它可用的缓释配方为例如基于PLGA的聚合物(PR pharmaceuticals)、基于PLA-PEG的水凝胶(Medincell)和基于PEA的聚合物(Medivas)。治疗处方，例如剂量决定等，属于执业医师的责任，并且通常考虑待治疗的疾病、个体患者的状况、递送部位、给药方法和执业医师所知的其它因素。

药物组合物还可以含有添加剂，例如填料、粘合剂、润湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂和进一步的溶剂或增溶剂或用于实现储库(depot)效应的试剂。后者是指融合蛋白可以掺入缓慢或持续释放或靶向递送系统，例如脂质体和微胶囊。

在另一方面，本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物可用于治疗或预防受试者中的一种或多种疾病或病症。

在一方面，提供了一种治疗或预防受试者中的一种或多种疾病或病症的方法，包含向受试者给药有效量本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或组合物。

在一方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物在制造用于治疗或预防受试者中一种或多种疾病或病症的药物中的用途。

在任何方面，所述受试者可以是哺乳动物。哺乳动物可以表达CD1a直系同源物(orthologue)。优选地，受试者是人类。

所述一种或多种疾病或病症可以是一种或多种炎性皮肤或粘膜病症、或一种或多种相关全身性疾病或病症、或一种或多种全身性表现的炎性药物反应、或CD1a-表达恶性肿瘤。

炎性皮肤或粘膜疾病或病症可以选自：

a)主要为嗜中性粒细胞性皮肤病，例如痤疮、泛发性脓疱型牛皮癣、斑块性牛皮癣、点滴状牛皮癣、掌跖脓疱病、SAPHO综合症、急性发热性中性粒细胞性皮肤病(斯威特综合症)、组织细胞样中性粒细胞性皮炎、手背中性粒细胞性皮肤病、坏疽性脓皮病、中性粒细胞性小汗腺炎(neutrophilic eccrine hidradenitis)、化脓性汗腺炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum diutinum)、白塞氏病、肠相关性皮炎关节炎综合症、其它感染相关炎症、中性粒细胞性荨麻疹性皮肤病、栅栏状中性粒细胞肉芽肿性皮炎(palisadingneutrophilic granulomatous dermatitis)、匍形性回状红斑(erythema gyratumrepens)、中性粒细胞性环形红斑、急性泛发性发疹性脓疱病(AGEP)、血管炎等；

b)自身免疫性病症，例如结缔组织病(例如狼疮、皮肌炎、硬皮病/系统性硬化症、Churg Strauss综合症)、脂膜炎、血管炎、自身免疫性水疱病症(autoimmune blisteringconditions)(例如大疱性类天疱疮、天疱疮、线性IgA病)、疱疹样皮炎、乳糜泻疾病、某些自身炎性疾病、白癜风、斑秃、普秃、全秃(alopecia totalis)、脂膜炎、扁平苔藓、多形红斑、硬化性苔藓、其它苔藓样和多形红斑样疾病、水疱性牛皮癣关节炎(vesiculationpsoriatic arthritis)、类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barre syndrome)、甲状腺炎、横贯性脊髓炎、神经退行性疾病等；

c)肥大细胞病症和嗜酸性粒细胞病症，例如Muckle Wells综合症、嗜酸性粒细胞增多和全身症状综合症、荨麻疹、血管性水肿、角结膜炎、食物过敏、其它过敏或特应性包括特应性皮炎、鼻炎、结膜炎、哮喘、嗜酸性食管炎和其它嗜酸性粘膜炎疾病、接触性皮炎等。

d)表现为炎性皮肤或粘膜疾病或病症的药物不良反应，例如史蒂文斯约翰逊综合症(Stevens Johnsons syndrome)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermalnecrolysis)、具有嗜酸性粒细胞增多和全身症状综合症(DRESS)和急性泛发性发疹性脓疱病(AGEP)的药物反应、多形红斑、大疱性、固定性药疹等。

e)移植物抗宿主疾病。

本文提及的CD1a-表达恶性肿瘤可以是其中可以检测到CD1a表达的任何恶性肿瘤。此类恶性肿瘤可以包括朗格汉斯细胞组织细胞增多症、T细胞淋巴瘤亚型、胸腺瘤亚型或其它恶性肿瘤的罕见病例，例如肥大细胞增多症亚型。优选地，CD1a-表达恶性肿瘤是T细胞淋巴瘤的亚型。

优选地，所述一种或多种疾病或病症包含牛皮癣、皮肤炎、红斑狼疮、嗜中性皮肤病、相关全身性疾病或病症、和/或全身性表现的炎性药物反应、或CD1a-表达恶性肿瘤，或由它们组成。

本文所用的相关全身性疾病或病症可以指可能与本文定义的炎性皮肤或粘膜疾病或病症相关的任何非皮肤部位受累。这可包括非皮肤红斑狼疮。

全身性表现的炎性药物反应可以发生在非皮肤部位，例如脾脏。相关全身性疾病或病症，或全身性表现的炎性药物反应可能是炎症应答的结果。炎症应答可以是例如对诸如Aldara(5％咪喹莫特乳膏)等药物的应答。炎症应答可能导致CD4 T细胞、CD8 T细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞的数量或活性增加，和/或IL-23、IL-12、IL-1β和/或MCP-1的水平增加，和/或IL-10和/或IL-27减少。

此外，本发明的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物可以单独给药或与一种或多种其它治疗剂联合给药，它们可以同时、依次或分开给药，这取决于所要治疗的病情。所述一种或多种其它治疗剂可以选自细胞毒性剂、免疫激活剂例如检查点抑制剂或TLR激动剂、抗炎剂例如类固醇、CAR-T细胞例如调节性或溶细胞性CAR-T细胞、或表达或呈递本发明的一种或多种抗体或抗原结合片段的其它细胞。

在另一方面，提供了一种监测诊断患有CD1a-表达恶性肿瘤的受试者中的治疗功效或疾病状态的方法，包括：

i.提供获自该受试者的生物样品；

ii.在治疗之前、或在治疗之间的间隔、或在不存在治疗的时间间隔，确定本发明的一种或多种抗体或抗原结合片段与获自该受试者的样品中CD1a-表达细胞的结合水平；

iii.如果在治疗后或在治疗间隔之间或在不存在治疗的时间间隔，肿瘤体积、或本发明的一种或多种抗体或抗原结合片段与CD1a-表达细胞的结合水平降低，则确定治疗有效、或疾病状态正在改善，

生物样品可以是血液或血清样品、组织活检、脑脊液、唾液或尿液样品。优选地，所述生物样品可以是血液或血清样品。

可以使用技术人员已知的任何方法来确定本发明的一种或多种抗体或抗原结合片段与样品中CD1a-表达细胞的结合水平。一种这样的方法是例如使用流式细胞术或利用可检测标记以能够确定样品中CD1a-表达细胞的数量的任何其它技术。

可以通过技术人员已知的任何合适的技术来确定肿瘤体积。

肿瘤体积或本发明的一种或多种抗体或抗原结合片段与CD1a-表达细胞的结合水平的减少可以是10％或更多，例如25％或更多、50％或更多、75％或更多、或90％或更多。

所述治疗间隔或不存在治疗的时间间隔可以是2周或更长，例如4周或更长、8周或更长、12周或更长、6个月或更长、或12个月或更长。

用于产生抗体及其抗原结合片段的技术是本领域众所周知的。术语“抗体”还包括不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(例如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig)。抗体或其抗原结合片段的说明性示例包括Fab片段、F(ab')2、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双抗体、结构域抗体或双特异性抗体(Holt FJ et al.,Trends Biotechnol.21(11),2003,484-490)。示例还包括由单个CH结构域或VL结构域组成的dAB片段，其单独能够结合抗原。抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、纳米抗体、单链的和/或人源化的。抗体或其抗原结合片段可以是人类IgG1同种型或人类IgG4同种型或其它天然或修饰的同种型。抗体可以是单克隆的(mAb)或多克隆的。

可以修饰抗体或其抗原结合片段以改变体内稳定性和/或半衰期。修饰例如可以是聚乙二醇化。

抗体或其抗原结合片段可以是抗体样分子，其包括在合成分子例如SMIP和小抗体模拟物中单独或组合使用CDR。

通常通过出于最佳比较目的而对序列进行比对(例如可以在第一序列中引入缺口以与第二序列进行最佳比对)并比较相应位置处的氨基酸残基或核苷酸来确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的百分比同一性。“最佳比对”是产生最高同一性百分比的两种序列的比对。通过比较序列内相同氨基酸残基或核苷酸的数量来确定百分比同一性(即％同一性＝相同位置的数量/位置总数×100)。

可以使用本领域技术人员已知的数学算法来完成两种序列之间的百分比同一性的确定。用于比较两种序列的数学算法的例子是Karlin and Altschul,1990,PNAS,87(6):2264-8的算法，如Karlin and Altschul,1993,PNAS,90(12):5873-5877中修改的。Altschul et ah,1990,J.Mol.Biol.,215:403-10的NBLAST和XBLAST程序纳入了这种算法。可以用NBLAST程序、得分＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸搜索以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用Gapped BLAST，如Altschul etal.(1997)所述。或者，可以使用PSI-Blast来进行迭代搜索，其检测分子之间的远距离关系(distant relationship)(同上)。当利用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。请参阅http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一个示例是Myers和Miller的算法。作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)已经包含了此类算法。本领域已知的其它序列分析算法包括如Torellis and Robotti(1994)中所描述的ADVANCE和ADAM；和Pearson and Lipman(1988)中描述的FASTA。在FASTA中，ktup是设置搜索的灵敏度和速度的控制选项。

本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含一个或多个突变的氨基酸残基。就本发明的核酸或抗体或其抗原结合片段而言，术语“突变的”、“突变体”和“突变”分别指与“天然”存在的核酸或多肽相比，即与可用来定义野生型的参考序列相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的取代(替代)、缺失或插入。

CDR序列中的氨基酸变异可以是保守氨基酸取代。

突变可以是取代，其中该取代是保守取代。保守取代通常是根据待突变的氨基酸列出的以下取代，每个取代后跟一个或多个可被认为是保守的替换：Ala→Gly、Ser、Val；Arg→Fys；Asn→Gln、His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg、Asn、Gln；Ile→Leu、Val；Leu→Ile、Val；Lys→Arg、Gln、Glu；Met→Leu、Tyr、He；Phe→Met、Leu、Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp、Phe；Val→He、Leu。其它取代也是允许的，并且可以根据经验或根据其它已知的保守或非保守取代来确定。

可在本发明的抗体或其抗原结合片段的CDR中进行1、2或3个保守取代。

制备抗体或其抗原结合片段的方法是本领域众所周知的。技术人员可以使用例如杂交瘤技术，或者可以使用重组DNA技术将相应的抗体序列克隆到载体中，例如表达载体。制备双特异性抗体分子的方法是本领域已知的，例如重组DNA技术、两种不同单克隆抗体的化学缀合或者例如两个抗体片段例如两个Fab片段的化学缀合。或者，双特异性抗体分子是通过四源杂交瘤(quadroma)技术制造的，该技术是通过融合产生亲本抗体的杂交瘤进行的。由于H链和L链的随机分类，可能会产生十种不同抗体结构的混合物，其中只有一种具有所需的结合特异性。本发明的双特异性抗体分子可以充当针对每个靶的单克隆抗体(mAb)。抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、人源化的或完全人类的。抗体或其抗原结合片段可以是人类IgG1同种型或人类IgG4同种型或其它天然或修饰的同种型。双特异性抗体分子或多特异性抗体可以例如是双特异性串联单链Fv、双特异性Fab2或双特异性双抗体。

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合，包括与任何方面或任何实施方式组合。

附图说明

图1-显示了一组抗-CD1a抗体对多克隆T细胞应答的抑制。A.多克隆T细胞IFNγ应答随抗-CD1a抗体浓度增加(0.01-10μg/ml)的剂量滴定曲线(n＝6个供体)。B.针对新生成的抗-CD1a抗体和商业抗体组(OKT6、HI149和SK9，n＝6个供体)计算的IC50值。

图2-展示了一组抗-CD1a抗体对CD1a-限制性富集T细胞系应答的抑制。A-B.由空载体(EV)或CD1a转染的呈递内源配体的K562诱导的CD1a-限制性富集T细胞系的细胞因子分泌应答。通过流式细胞术评估了新产生的抗-CD1a抗体组对IFNγ(A.)或IL-22(B.)的抑制。C.由呈递内源配体的CD1a包被珠诱导的CD1a-限制性富集T细胞系的IFNγ分泌应答。通过流式细胞术评估新生成的抗CD1a抗体组的抑制作用。通过流式细胞术评估了新生成的抗-CD1a抗体组的抑制作用。(N＝4-19个富集T细胞系，采用Tukey检验的双因素方差分析(2-way-ANOVA)，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001，其中*表示与“CD1a”相比的显著性。

图3-展示了CD1a转基因小鼠的特征。野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠的细胞的CD1a蛋白表达的A.代表性流式细胞术图和B.图形总结。在(从左到右)总活耳皮肤细胞、CD45+皮肤细胞、真皮树突细胞(dDC，CD45+/CD11c+/langerin-)和朗格汉斯细胞(LC，CD45+/CD11c+/langerin+)上评估了CD1a蛋白表达。C.野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠的耳皮肤内的CD1a蛋白表达，通过免疫荧光可视化。冷冻切片用DAPI(蓝色)和抗-CD1a AF-594(OKT6，红色)染色，比例尺从左到右为50μm、50μm和10μm。D.使用CD1a正向和反向引物以及尾部基因组DNA对CD1a转基因小鼠品系窝(litter)(泳道A-F)进行的示例性PCR基因分型。预期的CD1a条带在655bp。泳道G：来自始祖小鼠(founder mouse)的阳性对照基因组DNA。泳道H：缺乏DNA模板的阴性对照。E.野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠的胸腺CD1a蛋白表达的代表性流式细胞术图。

图4-体内抗-CD1a抗体的表征。A.咪喹莫特-诱导的皮肤炎症和抗-CD1a预防性给药的示意图。B.通过咪喹莫特治疗腹腔注射有小鼠IgG1同种型对照的野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠以及注射有如示意图A所示精制组抗-CD1a抗体的CD1a转基因小鼠引起的耳朵肿胀的每日测量。(N＝6，采用Dunnett检验的双因素方差分析，**,P<0.01；****,P<0.0001表示与第6天或如所示的“CD1a”相比的显著性)。

图5-展示了抗-CD1a对咪喹莫特-诱导的皮肤免疫应答的影响。A-C.经小鼠IgG1同种型治疗的野生型(WT)小鼠和CD1a转基因(CD1a)小鼠以及按照预防性给药模型注射了精制组抗-CD1a抗体的CD1a转基因小鼠的耳部皮肤的流式细胞术分析。计数皮肤T细胞(A.)并评估细胞表面CD69表达(B.)，并确定了皮肤嗜中性粒细胞(C.)和嗜酸性粒细胞(D.)频率。(N＝4，采用Dunnett检验的单因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图6-展示了抗-CD1a对咪喹莫特-诱导的细胞朗格汉斯细胞皮肤和淋巴结应答的影响。经小鼠IgG1同种型治疗的野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠以及按照预防性给药模型注射了精制组抗-CD1a抗体的CD1a转基因小鼠的耳部皮肤(A-B.)和引流颈淋巴结(C-D.)的流式细胞术分析。计数皮肤LC(A.)并评估细胞表面CD1a表达(B.)。计数淋巴结LC(C.)并评估细胞表面CD1a表达(D.)。(N＝4，采用Dunnett检验的单因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,p<0.0001)。

图7-展示了抗体依赖性耗尽(表型变化)。A.抗体诱导的CD1a依赖性细胞减少(例如死亡)的流式细胞术分析。将抗-CD1a抗体或小鼠IgG1同种型对照(iso，5μg/ml)与所示的EV或CD1a-K562一起温育48小时，并且相对于未处理的K562的参考群计算抗体诱导的减少的百分比并相对于EV对照细胞进行归一化。B.随抗-CD1a抗体浓度的增加(0.625-5μg/ml)，抗体诱导CD1a-K562细胞减少的剂量滴定曲线。C-D.将抗-CD1a抗体或小鼠IgG1同种型对照(iso，5μg/ml)与所示的MoDC(上图)和MoLC(下图)一起温育5天，并在第0天或第2天添加抗体和细胞因子，并且相对于同种型对照计算抗体诱导的减少的百分比，如使用Incucyte活细胞成像(N＝4，采用Tukey检验的双因素方差分析)(C.)和MoLC的代表性图像(D.)通过汇合百分比测量的。E.将K562-CD1a或K562-EV(空载体)与抗-CD1a抗体一起温育24小时并进行膜联蛋白V染色，并通过流式细胞术进行分析(N＝3-4，采用Tukey检验的单因素方差分析)。F.补体依赖性细胞毒性(CDC)的流式细胞术分析。在5μg/ml同种型对照抗体或指示抗体存在下，将K562-CD1a细胞与10％正常人血清在37℃下温育3小时。相对于未处理的K562参考群计算细胞毒性百分比，并将其相对于同种型对照处理的细胞(N＝6，采用Tukey检验的单因素方差分析)进行归一化。G.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的流式细胞术分析。在5μg/ml同种型对照抗体或指示抗体存在下，将K562-CD1a细胞与PBMC以1:50的比例在37℃共培养5小时。相对于未处理的K562参考群计算细胞毒性百分比，并将其相对于同种型对照处理的细胞(N＝4-6，采用Tukey检验的单因素方差分析)进行归一化。H.NSG小鼠在侧腹皮下注射25万个CD1a-K562细胞，并允许肿瘤生长18天。在第6、10和14天在腹膜内用100μg同种型对照抗体或指示抗体治疗小鼠。随着时间的推移测量肿瘤体积(N＝6-15，采用Tukey检验的双因素方差分析，星号表示与第18天的“CD1a-iso”相比的显著性)。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。

图8(A)-是来自CD1a表位分析的热图。通过CD1a-AF647平均荧光强度(MFI)测量的通过流式细胞术的CD1a抗体结合的矩阵热图图示。在用与荧光团AF647缀合的抗-CD1a抗体对CD1a-K652染色之前，将相关纯化的抗体与细胞一起温育以评估对AF647-缀合的抗体的CD1a结合的干扰。灰度用色调显示了干扰程度，顶行中的(-)表示没有干扰。(B)-展示了体内CD1a抗体表位竞争测定结果。A.通过用抗-CD1a抗体SK9(左图)或HI149(右图)染色测量的CD1a表达的流式细胞术图。在第0、2和4天给药抗-CD1a抗体116(100μg腹腔注射)，并在第5天收集、处理耳部皮肤组织和进行CD1a染色。

图9-展示了在治疗咪喹莫特-诱导的炎症中应用抗-CD1a抗体的有效性。A.采用治疗性抗-CD1a给药的咪喹莫特-诱导的炎症模型的示意图。通过咪喹莫特治疗野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠后通过腹膜内注射小鼠IgG1同种型对照进行治疗、或注射如示意图A中所示精制组的抗CD1a抗体的CD1a转基因小鼠所诱导的B.耳朵肿胀的每日测量和C.炎症的代表性图像(第8天)(在第3天箭头点)(N＝2-10，采用Dunnett检验的双因素方差分析，**,P<0.01；****,P<0.0001表示与第8天或如所示的“CD1a”相比的显著性)。D.通过免疫荧光可视化用咪喹莫特(Imiq)治疗或未治疗(U)的野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠的耳朵和表皮厚度以及耳部皮肤内的CD1a蛋白表达。用DAPI(蓝色)和抗-CD1a AF-594(OKT6，红色)对冷冻切片进行染色，比例尺为上图10μm和下图100μm。E-G.经小鼠IgG1同种型治疗的野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠以及按照给药治疗模型注射了精制组抗-CD1a抗体的CD1a转基因小鼠的耳部皮肤的流式细胞术分析。计数皮肤T细胞并评估细胞表面CD11a表达(E.)并测定嗜中性粒细胞(F.)和嗜酸性粒细胞(G.)频率(N＝7-9，采用Dunnett检验的单因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。

图10-展示了咪喹莫特应用的全身效应的CD1a依赖性。A.通过咪喹莫特治疗野生型(WT)和CD1a转基因小鼠(CD1a)后通过腹膜内注射小鼠IgG1同种型对照进行治疗、或注射有所示意的精制组抗CD1a抗体的CD1a转基因小鼠在第8天的脾脏重量(mg)测量值和代表性图像(图9A)。B-E.经小鼠IgG1同种型治疗的野生型(WT)和CD1a转基因小鼠(CD1a)；以及按照给药治疗模型注射有精制组抗-CD1a抗体的转基因CD1a小鼠的脾脏的流式细胞术分析。评估脾CD4(B.)和CD8(C.)T细胞CD69表达，并计数嗜中性粒细胞(D.)和嗜酸性粒细胞(E.)(N＝7-9，采用Dunnett检验的单因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)。F.经小鼠IgG1同种型治疗的野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠；以及按照给药治疗模型注射了抗-CD1a抗体的CD1a转基因小鼠的血液的血浆细胞因子水平(N＝7-9，采用Dunnett检验的单因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)。

图11-展示了咪喹莫特应用的全身效应的CD1a依赖性。A-E.经小鼠IgG1同种型治疗的野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠；以及按照给药治疗模型注射了精制组抗-CD1a抗体的CD1a转基因小鼠的血液的血细胞分析。计数了循环T细胞(A.)、CD4+(B.)和CD8+(C.)、嗜中性粒细胞(D.)和嗜酸性粒细胞(E.)。(N＝5-7，采用Dunnett检验的单因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)。

图12-显示咪喹莫特不构成CD1a配体。模拟物和咪喹莫特“负载的”CD1a蛋白在等电聚焦(IEF)凝胶pH3-7上的等电点依赖性迁移。模拟物：媒剂对照TBS2％ CHAPS 7％DMSO。

图13-应用抗-CD1a抗体在持续控制咪喹莫特-诱导的炎症中的有效性。A.没有随后抗-CD1a给药的咪喹莫特再挑战模型的示意图。B.通过咪喹莫特治疗腹腔注射有小鼠IgG1同种型对照的野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠以及注射有如示意性图13A所示精制组抗-CD1a抗体的CD1a转基因小鼠所引起的耳朵肿胀的每日测量(采用Dunnett检验的双因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01表示在咪喹莫特再应用第7天与“CD1a”同种型相比的显著性)。

图14-与护理标准相比，应用抗-CD1a抗体治疗咪喹莫特-诱导的炎症的有效性。通过咪喹莫特治疗野生型(WT)和CD1a转基因小鼠(CD1a)随后通过腹腔注射小鼠IgG1同种型对照(CD1a)进行治疗、或注射有如示意图图9A中所示精制组抗-CD1a抗体和抗IL-17A的CD1a转基因小鼠所引起的耳朵肿胀的每日测量。dx＝与CD1a转基因耳厚度相比达到显著性的模型天数。

图15-应用抗-CD1a抗体治疗咪喹莫特/MC903-诱导的炎症的有效性的比较分析。A.采用治疗性抗-CD1a给药的咪喹莫特-诱导炎症的示意图。B.通过咪喹莫特治疗野生型(WT)和CD1a转基因小鼠(CD1a)随后腹腔注射小鼠IgG1同种型对照进行治疗、或注射有如示意图A中所示精制组抗CD1a抗体或CR2113的CD1a转基因小鼠所诱导的耳肿胀的每日测量。N＝2-7，采用Dunnett检验的双因素方差分析，*,P<0.05，**,P<0.01；****,p<0.0001表示在第8天与“CD1a”或在第8天与OX116 vs CR2113相比的显著性。C.针对WT进行了校正的(B)中提供的数据和比较。D.MC903-诱导的炎症与预防性MC903-诱导的炎症的示意图。E.通过MC903治疗在腹腔注射小鼠IgG1同种型对照治疗后的野生型(WT)和CD1a转基因小鼠(CD1a)、或注射了如示意图D中所示16、110或116抗-CD1a抗体或CR2113的CD1a转基因引起的耳朵肿胀的每日测量。针对WT进行了校正。N＝3-4，采用Dunnett检验的双因素方差分析，*,P<0.05表示在第7天与“CD1a”相比的显著性。F.通过流式细胞术测量皮肤T细胞百分比和嗜酸性粒细胞计数。N＝3-4，采用Dunnett检验的双因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

图16-抗-CD1a抗体在具有咪喹莫特-诱导的炎症皮肤和全身免疫应答中的影响的比较分析。分析了来自经小鼠IgGl同种型治疗的野生型(WT)和CD1a转基因(CD1a)小鼠以及按照示意图15A所示给药治疗模型注射了精制组抗-CD1a抗体的CD1a转基因小鼠的耳皮肤、引流颈部淋巴结和血浆样品。A.使用直接离体流式细胞术检测的细胞内细胞因子表达分析了皮肤T细胞IL-17A表达(左图)，并计数了颈部淋巴结嗜酸性粒细胞(右图)。B-C.通过ELISA测量了血浆(B)和皮肤消化物(C)细胞因子水平(N＝2-7，采用Dunnett检验的单因素方差分析，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)。

具体实施方式

材料和方法

小鼠

所有小鼠均在特定的无病原体设施中饲养。在各个实验中，将小鼠的年龄、性别和背景品系进行匹配，并用野生型同窝小鼠作为匹配对照。本研究中进行的所有实验都是在英国内政部批准的情况下进行的。

CD1a转基因小鼠的产生

小鼠由牛津惠康人类遗传学信托中心产生。使用引物5’-ATGGTACCAAGAGGAATGTAAATGTGTCCGGC-3’和5’-AAGCGGCCGCGATCATGTTAACCAAGGTCAGGAA-3’通过PCR从人类基因组DNA扩增涵盖整个CD1A基因的5.7kb基因组片段，其包括0.8kb上游序列和0.8kb下游序列，并且经由掺入到这些PCR引物中的KpnI和NotI位点亚克隆到Litmus28载体(NEB)中。在编码外显子的序列验证后，从载体骨架上切下转基因片段，纯化并以2ng/μl重悬于显微注射缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.4，0.25mM EDTA)中，并且显微注射到从C57BL/6J小鼠制备的受精合子的原核中。过夜培养后，通过手术将所得的2-细胞胚胎植入假孕CD1养母的输卵管中并将妊娠维持至足月。使用转基因特异性引物通过PCR鉴定转基因后代，并与野生型C57BL/6J小鼠培育为单独的品系。

CD1a基因分型

对来自CD1a转基因小鼠的耳缺口样品进行粗基因组DNA制备。将补充有0.4mg/ml蛋白酶K(Sigma)的100μl DirectPCR耳裂解缓冲液(Viagen)添加至耳缺口并在55℃温育过夜。然后将酶在85℃下热灭活1小时。将样品离心以沉淀碎片，并将裂解物转移至干净的管中。将1μl裂解物用作基因分型的模板。将以下PCR反应用于基因分型。将PCR产物加载到具有SyberSafe的1％TAE琼脂糖凝胶上，进行电泳并在UV下对凝胶进行成像。如果检测到655bp处的预期条带，则认为小鼠的CD1a转基因呈阳性。

DNA模板	1μl
		MyTaqRed混合物(BioLine)2x	25μl
CD1a正向引物	0.4μM
		CD1a反向引物	0.4μM
dd-H2O	至50μl反应体积

1.初始变性	95℃，2分钟
		循环：步骤2-4	X34
2.变性	95℃，20秒
		3.退火	60℃，15秒
4.延伸	72℃，20秒
		5.最终延伸	72℃，2分钟
6.保持	4℃

细胞系

将空载体-转染的K562(EV-K562)和CD1a-转染的K562(CD1a-K562)细胞(来自B.Moody,Brigham and Women’s Hospital,Harvard Medical School,Boston,MA的礼物)维持在补充有10％ FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、1×非必需氨基酸(NEAA)(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)、10mM HEPES(Gibco)、500μM 2-巯基乙醇(Gibco)和200μg/ml G418抗生素(Thermo FisherScientific)的RΜMI 1640培养基中。

ELISpot分析

使用ELISpot测定来检测多克隆T细胞与表达抗原呈递细胞的模型CD1a共培养时，激活-诱导的细胞因子分泌。通过密度梯度(Lymphoprep)分离来自健康供体血液的PBMC，并按照制造商的协议(MACS，Miltenyi)使用抗-CD3磁珠分选纯化T细胞。所有研究参与者均提供了充分知情的书面同意[英国国家医疗服务体系(NHS)国家研究伦理服务(NRES)研究伦理委员会14/SC/0106]。然后将T细胞与IL-2(200U/ml)一起培养3天以扩增数量，然后以25000个K562比50000个多克隆T细胞的比例与未脉冲/内源脂质结合的CD1a-转染的K562(CD1a-K562)或对照空载体-转染的K562(EV-K562)共培养过夜。为了评估抗-CD1a抗体的功能，在抗-IFNγ捕获抗体包被的ELISpot板中与多克隆T细胞共培养之前和期间，将K562与10μg/ml抗-CD1a抗体一起温育1小时。用生物素化的抗-IFNγ检测抗体检测IFNγ分泌，并通过链霉亲和素-碱性磷酸酶显色来可视化。所得斑点指示了产生细胞因子的T细胞，并使用自动ELISpot读数器(Autimmun Diagnostika gmbh ELISpot Reader Classic)进行计数，并且在减去细胞因子产生斑点的EV背景水平后，通过比较抗体处理组和未处理组来计算％阻断。从CD1a IFNγ斑点数(分别有和没有抗体)中减去EV-K562贡献(有和没有抗体)。然后，将调整后的CD1a-K562抗体处理组斑点数除以无抗体组的CD1a并用于计算％阻断。

CD1a-反应性T细胞生成和激活分析：

通过荧光激活细胞分选分离CD1a-限制性T细胞。将T细胞与EV-K562或CD1a-K562共培养，并按照制造商的说明使用Miltenyi MACS细胞因子分泌测定法检测产生细胞因子的应答者T细胞。简而言之，在与CD1a-K562一起培养6小时后，用抗-细胞因子(IL-22或IFNγ)抗体包被T细胞以检测CD1a依赖性自分泌细胞因子的生产。然后，将活的应答者细胞分选到培养板中。通过混合淋巴细胞反应扩增CD1a-限制性T细胞，并使用分析流式细胞仪通过上述基于FACS的细胞因子分泌测定方法评估纯度和CD1a-应答性。CD1a限制性T细胞的激活分析如下。将2x10⁵个K562细胞与1-5x10⁵个CD1a-自身反应性T细胞共培养4小时。将辅助细胞因子添加到共培养物中以支持CD1a-依赖性细胞因子的产生。向产生IFNγ的T细胞培养物提供IL-12(1ng/mL,BioLegend)、IL-18(1ng/mL,BioLegend)和IL-2(25U/mL,BioLegend)；并且向产生IL-22的T细胞培养物提供IL-6(5ng/mL,BioLegend)、TNF-γ(5ng/mL,BioLegend)和IL-2(25U/mL,BioLegend)。按照制造商的说明，使用上述分泌测定(Miltenyi Biotec)通过T细胞的细胞因子产生来评估T细胞的活化。

鼠咪喹莫特给药

小鼠用异氟烷轻度麻醉，并且在预防模型(图4A)中在第0、1、2、3、4、5天或在治疗模型(图9A)中在第0、1、2和4、5、6、7天，将15mg含有5％咪喹莫特的Aldara乳膏施用在耳廓的背侧和腹侧。在预防模型(图4A)中在第-5、-3、-1、1、3、5天或在治疗模型(图9A)中在第3、5、7天，腹膜内给药100μg抗-CD1a抗体或小鼠IgG1同种型对照。在预防模型(图4A)中在Aldara施用第0-6天期间或在治疗模型(图9A)中在Aldara施用第0-8天期间，使用千分尺(Mitutoyo)每天测量耳朵厚度。挑战后24小时处死小鼠并取出组织。

鼠MC903给药

小鼠用异氟醚轻度麻醉，并且连续7天每天将每剂2nmol的MC903施用于耳的腹侧和背侧(耳朵每侧10微升)。如图15D所示，腹腔内给药100μg抗-CD1a抗体或小鼠IgG1同种型对照。每天使用千分尺(Mitutoyo)测量耳朵厚度。

组织加工

最终咪喹莫特挑战后24小时处死小鼠并取出组织。收集耳朵、颈部淋巴结(cLN)和脾脏用于免疫表型分析或成像。通过使组织通过70μm的过滤器并用含有10％ FCS的RPMI洗涤来获得脾脏和cLN的细胞悬浮液。通过与RBC裂解液(eBioscience)一起温育来去除脾细胞悬浮液中的红细胞。

将耳部皮肤组织在HBSS中洗涤以除去过量的咪喹莫特，从腹侧劈开，切成<0.5mm的碎片并用1mg/mL胶原酶P(Roche)和0.1mg/mL DNaseI(Sigma-Aldrich)DMEM在搅拌下消化3x30分钟，将分散酶5mg/mL添加到最后的30分钟消化步骤中。在通过流式细胞术分析之前，通过70μm过滤器用含有10％ FCS的DMEM洗涤后获得单细胞悬浮液。

流式细胞术

对于FACS表面染色，用以下抗-小鼠抗体(除非另有说明，源自Biolegend)标记细胞：CD3(500A2,BUV495:741064BD Pharmingen)，CD11b(M1/70,BUV395:563553BDPharmingen)，CD11c(N418,BV711:117349)，CD8(53-6.7,BUV805:612898BD Pharmingen)，CD4(GK1.5,AF700:100430)，CD45(2D1,FITC:368507)，CD11a(I21/7,PECy7:153108)，CD69(H1.2F3,BV650:104541)，Langerin(4C7,PE:144204)，Ly6C(RB6-8C5,BV605:108440)，Ly6G(1A8,PETxRed:127648)，MHCII(M5/114.15.2,BV785:107645)，SiglecF(S17007L,BV421:155509)，IL-17A(TC11-18H10.1,PECy7:506922)活/死Aqua(Invitrogen)和抗人类CD1a(APC或纯化的SK9,HI149,OKT6,NA1/34)。

流式细胞术：表位竞争测定

将CD1a-K562细胞与纯化的原代新生成的抗-CD1a抗体和商业上可获得的抗-CD1a抗体在冰上温育30分钟(25μg/ml)，然后洗掉未结合的抗体，然后将Alexa-Fluor-647缀合形式的不同抗体与细胞按矩阵排列在冰上温育30分钟(10μg/ml)。使用平均荧光强度(MFI)来评估荧光团缀合抗体的结合程度。

共焦成像

将鼠耳皮肤冷冻在最佳切割温度包埋化合物中并储存在-80℃下。使用Leica低温恒温器切割10μm冷冻切片并收集到Superfrost Plus载玻片上以风干30分钟，然后保存在-80℃下。染色前将载玻片在PBS中再水化10分钟。通过加入0.15％过氧化氢溶液在室温下5分钟来淬灭样品的内源过氧化物酶活性。使用亲和素/生物素封闭试剂盒(VectorLaboratories Ltd)封闭内源生物素，并使用10％山羊血清来减少抗体的非特异性结合。将抗-CD1a抗体用于共聚焦显微镜检查(1:100，OKT6；内部生产并与生物素缀合)。按照制造商的说明，使用Alexa Fluor 594Tyramide SuperBoost试剂盒(链霉亲和素；Thermo FisherScientific)来增强信号。简而言之，将载玻片与一抗在4℃下温育过夜。洗涤后，将HRP-缀合的链霉亲和素添加到切片中并在4℃下温育过夜。洗去多余的链霉亲和素-HRP，将组织与酪酰胺(tyramide)工作液在室温下温育8分钟，并用反应终止试剂终止反应。染色后，使用具有DAPI的抗荧光淬灭封片液(Vector Laboratories Ltd)封固载玻片，盖上盖玻片，并将载玻片在黑暗中冷藏直至通过共焦显微镜(Zeiss LSM 780共焦显微镜-倒置显微镜；25×/0.8Imm Korr DIC M27；室温；Axiocam相机；Zen软件)进行分析，并且使用Fiji进行图像处理。

细胞表型和细胞毒性测定：

将抗-CD1a抗体和(5μg/ml)商业上可获得的比较物NA1/34(5μg/ml)与表达CD1a的K562或EV对照K562一起温育48小时，并通过流式细胞术评估细胞减少。为了测量直接抗体诱导的细胞减少，在与抗-CD1a抗体一起温育48小时之前，用CellTraceViolet荧光标记K562。在通过流式细胞术评估减少之前，将未处理的CFSE标记的K562参考群以1:1的比例添加到抗体处理的K562中。然后，通过比较所分析的、抗体处理的和未处理的参考CD1a+和EVK562的不同群体的活细胞的频率，用以下等式计算诱导减少的百分比。％减少＝100-((抗体处理的CD1a-K562的％活细胞/参考CFSE标记的K562的％活细胞)/(未处理的CD1a-K562的％活细胞/参考CFSE标记的K562的％活细胞)x 100)。为了检查抗-CD1a抗体对CD1a-表达细胞的细胞凋亡的影响，将K562-CD1a或K562-EV与同种型对照或抗-CD1a抗体(5μg/ml)一起温育并且在温育后针对膜联蛋白-V(Biolegend)染色24小时。

补体-介导的裂解(CDC)和抗体-依赖性细胞毒性ADCC测定：

对于CDC测定，用5μg/ml同种型对照抗体或指示抗体将K562-CD1a细胞(每孔5×10⁴个细胞)预处理30分钟，并与10％正常人血清在37℃、5％CO₂中一起温育3小时。对于ADCC测定，使用新鲜的PBMC。将K562-CD1a细胞(每孔5×10³个细胞)与PBMC(每孔2.5×10⁵个细胞)在37℃下在5％ CO₂中与IL-2(100U/ml)以及5μg/ml同种型对照抗体或指示抗体(效应物/靶比例为50:1)共培养5小时。通过使用以下等式计算存活靶K562-CD1a的百分比来确定细胞毒性：％细胞毒性＝((CD1a-抗体处理的CD1a-K562的％活细胞/％活参考K562)/(同种型抗体处理的CD1a-K562的％活细胞/％活参考K562)x 100)。

体内CD1a+细胞耗尽：

将“NSG”(NOD-scid IL2Rgamma^nu11)小鼠的胁腹皮下注射25万个在ECM凝胶(Merck)悬浮液中的CD1a-K562细胞(体积＝100μl)，并允许肿瘤发育18天。在第6、10和14天，腹腔内注射100μg同种型对照抗体或指示抗体治疗小鼠，并测量肿瘤大小。

等电聚焦测定(IEF)：

通过将10μg CD1a与溶解在Tris缓冲盐水和2％ CHAPS 7％ DMSO或单独媒剂(模拟物)中的100X摩尔过量的咪喹莫特(Invivogen)在37℃下温育2小时来评估脂质负荷并在室温下过夜。通过等电聚焦(IEF)分离CD1a样品。快速地，将CD1a-咪喹莫特和CD1a-模拟蛋白加载到IEF pH3-7凝胶(Novex)上，然后在100V下运行1小时，在200V下运行1小时，并且最后在500V下运行30分钟。然后用12％ TCA固定凝胶，用SimplyBlue SafeStain染色7分钟，并在DI水中脱色过夜。

统计分析：

使用GraphPad Prism 6.00版(GraphPad Software)进行单因素和双因素方差分析检验。误差线代表所示的标准偏差。

治疗性抗-CD1a抗体77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)的产生和选择

对跨越不同物种的许多动物(包括小鼠和兔)进行免疫。使用用人类CD1a和小鼠B2M转染的NIH3T3细胞免疫小鼠。使用用人类CD1a和兔B2M转染的Rab9细胞免疫兔。3-5次注射后，处死动物并收获PBMC、脾脏、骨髓和淋巴结。通过流式细胞术监测血清与表达人类CD1a和人类B2M的HEK-293细胞的结合。

建立记忆B细胞培养物(与77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)和116(VR12117)相关)，并在TTP Labtech Mirrorball系统上在基于珠的测定中首先筛选上清液结合用人类CD1a瞬时转染的HEK-293细胞的能力。这是使用用细胞染料染色的表达人类CD1a和人类B2M的HEK-293细胞的多重测定，并且使用山羊抗物种Fc-FITC缀合物作为揭示剂(reveal agent)，针对表达CD1b、CD1c或CD1d以及人类B2M的反染色HEK-293细胞进行反筛选。

在来自总共10x 200-板B培养实验的初级Mirrorball筛选中鉴定出约3500个CD1a-特异性阳性命中。然后将来自该测定的阳性上清液通过以下方式进行进一步表征：

·ELISA，确认与人类CD1a蛋白的结合(详情如下)

·ELISA，确认与嵌合CD1a蛋白上的CD1a脂质结合结构域(CD1a的人类脂质结合结构域、CD1d的小鼠Ig结构域)的结合(详情如下)

·流式细胞术，确认与在HEK-293细胞上表达(与人类β2M共表达)的人类CD1a的结合(详情如下)

使用荧光聚焦方法对在上述测定中展示结合的孔进行V区恢复。

还使用荧光聚焦方法(与16(VR11834)相关)直接筛选来自骨髓的浆细胞结合人类CD1a的能力。此处，使用山羊抗物种Fc-FITC缀合物揭示试剂，在固定于链霉亲和素珠上的生物素化人类CD1a上挑选分泌CD1a特异性抗体的B细胞。挑选了约300个直接焦点。

对挑选的细胞进行逆转录(RT)和PCR后，生成编码抗体V区的‘转录活性PCR’(TAP)产物，并用于瞬时转染HEK-293细胞。所得到的含有重组抗体的TAP上清液通过以下方式进行进一步表征：

·ELISA，确认与人类CD1a蛋白和嵌合CD1a蛋白(CD1a的人类脂质结合结构域、CD1d的小鼠Ig结构域)的结合(详情如下)

·流式细胞术，确认与HEK-293细胞上表达(与人类β2M共表达)的人类CD1a的结合，并且反筛选与相关相似蛋白质的交叉结合：在HEK-293细胞上表达(与人类β2M共表达)的CD1b、CD1c或CD1d。(详情如下)

然后，将来自感兴趣的TAP产物的重链和轻链可变区基因对克隆为兔或小鼠全长抗体并在HEK-293瞬时表达系统中重新表达。总共克隆并记录(登记)了119个V区。然后通过以下方式进一步表征重组克隆的抗体：

·重复上述流式细胞术和ELISA测定。

·流式细胞术，评估与多种细胞系中表达的CD1a的结合。这初步表明结合是脂质非依赖性的。筛选上清液与以下的结合：

-稳定转导的表达CD1a或空载体(与人类β2M共表达)的C1R细胞。这些与110(VR12112)、111(VR12113)和116(VR12117)相关。(详情如下)

-内源性表达CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和β2M的MOLT4细胞。这些与110(VR12112)、111(VR12113)和116(VR12117)相关。(详情如下)

·在BIAcore中进行剖析研究(profiling)以估计解离率和亲和力(详情如下)

选择在上述测定中表现出结合且亲和力<100nM的抗体进行纯化。使用Protein A亲和纯化来纯化细胞培养物上清液。将纯化的样品缓冲液更换为10mM PBS pH 7.4，并分别使用UV光谱、分析尺寸排阻色谱、SDS Page电泳和LAL内毒素测定分析其回收率和纯度。在需要的情况下，对样品进行第二轮纯化以提高单体水平。最终样品进行无菌过滤并储存在10mM PBS pH 7.4中。

纯化后，然后通过以下方式进一步表征所有5种抗体：

·重复上述流式细胞术、ELISA和BIAcore测定

·ELISA，评估与蟹猴CD1a蛋白以及中国常见的人类CD1a蛋白变体的结合(18)(详情如下)

·流式细胞术，评估与用以下特瞬时转染的HEK-293细胞的结合：(详情如下)

-蟹猴CD1a与蟹猴β2M共转染

-中国常见的人类CD1a变体与人类β2M共转染

77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)证明了在抗体发现的各个阶段结合所有测试形式的重组和细胞表达的CD1a蛋白的能力(表1-9)。唯一的例外是116(VR12117)，其显示与重组或细胞表达的蟹猴CD1a没有结合(表4和9)。将抗体116包含在随后的体外和体内分析中并不被认为是显而易见的，而仍然是一个有意的步骤，以便重点关注表位结合区域，其中脂质结合结构域不同于人类和蟹猴，具有潜在不同的功能效应。没有抗体表现出与HEK-293细胞上表达的CD1b、CD1c或CD1d结合(表5)，表明这些抗体是CD1a-特异性的。用商业上可获得的抗体证实了HEK-293细胞中的CD1a、CD1b、CD1c和CD1d表达，支持了该结论(数据未显示)。与在多种细胞类型(HEK、C1R和MOLT4)上表达的CD1a的结合初步表明，抗体结合可能是脂质非依赖性的，因为CD1a可能是从每个细胞系中的不同脂质池加载的。

发现抗体后，在T细胞测定中评估抗体的体外功能，如下。

编码小鼠IgG1主链上77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)和116(VR12117)的重链和轻链V区的DNA在ATUM合成并且在内部的HEK-293瞬时表达系统中表达。然后，对抗体进行纯化和内毒素去除，并在体内测定中进行测试，如下。

77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)对人类CD1a的亲和力

使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)通过捕获针对固定化抗-物种IgG F(ab’)2的抗体，然后滴定人类CD1a来评估纯化的抗体对人类CD1a的亲和力。将Affinipure山羊抗-物种IgG-F(ab’)2片段特异性(Jackson ImmunoResearch)通过胺偶联化学固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上，捕获水平为～5000个响应单位(RU)。将HBS-EP+缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，GE Healthcare)用作运行缓冲液，流速为10μL/min。注射10μL 0.5μg/mL的测试抗体，用于通过固定化山羊抗-物种Fab进行捕获。以30μL/min的流速在捕获的抗体(在0nM、0.6nM、1.8nM、5.5nM、16.6nM和50nM，在运行缓冲液中稀释)上滴定人类CD1a以评估亲和力。

在循环之间通过注射2X 10μL 40mM HCl进行表面再生，并在10μL/min的流速下通过注射10μL 5mM NaOH进行散布(intersperse)。使用Biacore T200评估软件按照标准程序分析背景扣除结合曲线。由拟合算法确定动力学参数。在克隆上清液和纯化的抗体阶段进行该测定。抗体与人类CD1a结合的动力学参数见表10。

通过ELISA评估77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)的结合

通过ELISA鉴定CD1a-特异性抗体。ELISA板用2μg/mL目的蛋白(关注蛋白)(人类CD1a池B、嵌合CD1a池B[人类脂质结合结构域和小鼠CD1d Ig结构域]、中国变体CD1a或蟹猴CD1a)(20μL/孔)在4℃下包被过夜，然后用洗涤缓冲液(0.2％(v/v)Tween-20的PBS(pH7.4)溶液洗涤。然后，将板用80μl/孔封闭缓冲液(1％(w/v)牛血清白蛋白)在室温下封闭1小时，然后在洗涤缓冲液中洗涤。将20μL抗体样品(B细胞培养上清液、TAP上清液、克隆上清液、纯化的抗体溶液)稀释液转移至ELISA板，并且在室温下温育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。添加20μl/孔的在封闭缓冲液中以1:5000稀释的过氧化物酶-缀合的山羊抗-物种IgG Fc-特异性F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch)，并且在室温下温育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。添加TMB底物(EMD Millipore)(20μL/孔)以可视化结合，并且将反应在室温下温育5分钟，然后使用酶标仪(microplate reader)测量630nM下的光密度。在B细胞上清液阶段(人类CD1a池B)、TAP上清液阶段(人类CD1a池B、嵌合CD1a池B)、克隆上清液阶段(人类CD1a池B、嵌合CD1a池B)和纯化的抗体阶段(人类CD1a池B、嵌合CD1a池B、中国变体CD1a、蟹猴CD1a)进行该测定。纯化的抗体的数据如表1-4所示。

通过流式细胞术评估77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)的结合

通过流式细胞术鉴定CD1a-特异性抗体。评估了与HEK、C1R和MOLT4细胞系上表达的蛋白质的结合。使用目的蛋白质(CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、中国变体CD1a或蟹猴CD1a)和物种-特异性β2M(如上所述)转染HEK-293细胞。使用Expifectamine 293试剂盒(Gibco)进行转染并温育过夜。在需要的当天在1x PBS中洗涤C1R-CD1a、C1R-空载体和MOLT4细胞系。对所有细胞系进行计数并重悬于1x PBS中，然后使用DiI或DiO细胞染色剂(Invitrogen)在37℃下染色30分钟。使用流式细胞术缓冲液(1％牛血清白蛋白、2mM EDTA和0.1％叠氮化钠的PBS溶液)洗涤细胞，然后将2个DiI染色和DiO染色群体混合在一起。然后，将细胞(20μl/孔)添加至抗体样品的稀释液(B细胞培养上清液、TAP上清液、克隆上清液、纯化的抗体溶液)(20μl/孔)并在流式细胞术测定板中在4℃下温育1小时，然后用流式细胞术缓冲液洗涤。添加10μl/孔的在流式细胞术缓冲液中以1:2500稀释的Alexaflu647-缀合的山羊抗-物种IgGFc-特异性F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch)，并且在4℃下温育30分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤。然后在iQue筛选器PLUS上测量荧光强度。在B-细胞上清液阶段(表达人类CD1a的HEK-293细胞)、TAP上清液阶段(表达人类CD1a、CD1b、CD1c或CD1d的HEK-293细胞)、克隆上清液阶段(表达人类CD1a、CD1b、CD1c或CD1d的HEK-293细胞；表达人类CD1a或空载体的C1R细胞；MOLT4细胞系)和纯化的抗体阶段(表达人类CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、中国变体CD1a或蟹猴CD1a的HEK-293细胞；表达人类CD1a或空载体的C1R细胞；MOLT4细胞)进行该测定。纯化的抗体的数据显示在表5-9中。

表1.与人类CD1a池B蛋白的抗体结合。在ELISA中测试了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)结合人类CD1a蛋白的能力。通过稀释系列滴定了所述抗体并与对照兔IgG抗体进行比较。所有5种抗体均与人类CD1a池B蛋白结合。显示了纯化抗体的数据。

表2.与嵌合CD1a池B蛋白的抗体结合。在ELISA中测试了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)结合嵌合CD1a[人类CD1a脂质结合结构域、小鼠CD1d Ig结构域]蛋白的能力。通过稀释系列滴定了抗体并与对照兔IgG抗体进行比较。所有5种抗体均结合嵌合CD1a池B蛋白。显示了纯化的抗体的数据。

表3.与中国变体CD1a蛋白的抗体结合。在ELISA中测试了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)结合中国变体CD1a蛋白的能力。通过稀释系列滴定了抗体并与对照兔IgG抗体进行比较。所有5种抗体均与中国变体CD1a蛋白结合。显示了纯化的抗体的数据。

表4.与蟹猴CD1a蛋白的抗体结合。在ELISA中测试了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)结合食蟹猴CD1a蛋白的能力。通过稀释系列滴定了抗体并与对照兔IgG抗体进行比较。除116(VR12117)外，所有5种抗体均与蟹猴CD1a蛋白结合。显示了纯化的抗体的数据。

表5.与HEK-293细胞上表达的人类CD1a、CD1b、CD1c或CD1d的抗体结合。用人类CD1a、CD1b、CD1c或CD1d瞬时转染HEK-293细胞并且与人类β2M共转染。通过稀释系列滴定了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)，并且测试与转染蛋白的结合。将结合量化为通过流式细胞术评估的荧光强度几何平均值相对于背景的倍数变化。所有5种抗体均与HEK-293细胞上表达的人类CD1a结合。没有观察到与HEK-293细胞上表达的CD1b、CD1c或CD1d的结合。显示了纯化的抗体的数据。

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表6.与C1R细胞上表达的人类CD1a、CD1b、CD1c或CD1d的抗体结合。通过稀释系列滴定了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)，并且测试了与用人类CD1a或空载体和人类β2M稳定转导的C1R细胞的结合。将结合量化为通过流式细胞术评估的荧光强度几何平均值相对于背景的倍数变化。所有5种抗体均与C1R细胞上表达的人类CD1a结合。未观察到与表达空载体的C1R细胞的结合。显示了纯化的抗体的数据。

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表7.与MOLT4细胞的抗体结合。通过稀释系列滴定了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)，并且测试了与内源表达CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和β2M的MOLT4细胞的结合。将结合量化为通过流式细胞术评估的荧光强度几何平均值相对于背景的倍数变化。所有5种抗体均结合MOLT4细胞表面蛋白，最有可能是CD1a。显示了纯化的抗体的数据。

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表8.与HEK-293细胞上表达的常见中国变体CD1a的抗体结合。通过稀释系列滴定了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)，并且测试了与用常见中国变体CD1a(18)和人类β2M瞬时转染的HEK-293细胞的结合。将结合量化为通过流式细胞术评估的荧光强度几何平均值相对于背景的倍数变化。所有5种抗体均与HEK-293细胞上表达的中国变体CD1a结合。显示了纯化抗体的数据。

表9.与HEK-293细胞上表达的蟹猴CD1a的抗体结合。通过稀释系列滴定了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)，并且测试了与用蟹猴CD1a和蟹猴β2M瞬时转染的HEK-293细胞的结合。将结合量化为通过流式细胞术评估的荧光强度几何平均值相对于背景的倍数变化。除116(VR12117)外，所有5种抗体均与HEK-293细胞上表达的蟹猴CD1a结合。显示了纯化的抗体的数据。

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表10.抗体对人类CD1a的亲和力。使用biacore评估了77A(VR11851)、110(VR12112)、111(VR12113)、116(VR12117)和16(VR11834)对人类CD1a的亲和力。除了需要异质配体结合模型的16(VR11834)，在所有情况下均使用1:1结合模型来拟合数据。亲和力必须<100nM才能考虑进展。显示了纯化的抗体的数据。

配体	ka(1/Ms)	ka 2(1/Ms)	kd(1/s)	kd 2(1/s)	KD(M)
						77A(VR11851)	4.69E+05		1.13E-04		2.40E-10
110(VR12112)	4.43E+05		8.74E-04		1.97E-09
						111(VR12113)	3.21E+05		1.47E-08		3.12E-11
116(VR12117)	4.83E+05		1.40E-03		2.89E-09
						16(VR11834)	1.86E+06	5.14E+05	7.29E-04	6.58E-03	3.92E-10

实施例

实施例1-抗-CD1a组精制：抗-CD1a抗体的功能评估

在CD1a结合评估之后，筛选了针对抑制功能而产生的一大组抗-CD1a抗体。通过EliSpot在体外抗原呈递模型中测量了T细胞细胞因子的产生。这些数据的汇总如图1所示。确定许多新产生的抗体在抑制CD1a T细胞应答方面比商业抗-CD1a抗体OKT6、HI149和SK9更有效。值得注意的是，抗体16、22、39、46、77、87、110、116均具有比OKT6低至少一个对数的IC50(图1B)，这相对于现有技术中描述的抗体是一种改进，尽管使用了多克隆抗体T细胞，预期其敏感性低于转导的克隆永生T细胞。

实施例2-抗-CD1a组精制：CD1a-限制性富集T细胞系应答的抑制

为了帮助终选用于体内分析的候选抗体，采用了不同的方法来评估CD1a T细胞应答；分离并扩增CD1a-限制性富集T细胞系以在分离(隔离，isolation)状态下而不是在混合多克隆T细胞背景中分析CD1a应答，在混合背景中，低信噪比可能部分掩盖抑制性抗体的潜力。

在这些测定中，抗体116和16作为有效的抑制性抗体脱颖而出，其中16独特地抑制IL-22的自身反应性/内源性产生(图2A和2B)。这种改进表明除了在IFNγ发挥作用的条件之外，在IL-22发挥致病作用的条件下使用抗体的可能性。令人惊讶的是看到了对不同细胞因子的差异性影响。此外，使用无APC的系统来评估CD1a-限制性T细胞活化的抗体依赖性抑制。使用CD1a-包被的珠作为APC的替代物，并通过流式细胞术测量所得T细胞IFNγ的产生。该测定揭示了所有抗体对CD1a-依赖性细胞因子应答的显著抑制，但特别是77a、87、110、111和116(图2C)。

实施例3-皮肤炎症中抑制性抗体的体内评估

这项研究的目的是生产可临床用于治疗人类疾病和病症的抗体，因此有必要确定在类似于人类疾病的复杂免疫系统中的功效。从上述数据的分析中选出了一组高度精制的最佳新生成抗体(抗体16、77a、110、111和116)，并试图确定它们在牛皮癣、皮炎、狼疮的体内模型以及作为药物反应的模型的潜力，该药物反应模型表现为炎性皮肤或粘膜疾病或病症、或相关全身性疾病或病症、或一种或多种全身性表现的炎性药物反应。与WT相比，实验性牛皮癣和皮炎在CD1a转基因小鼠中表现为加剧，并且CD1a-依赖性炎症可以通过给药抗-CD1a抗体来改善(Kim et al 2016)。还值得注意的是，一些人对咪喹莫特产生皮肤/粘膜炎性药物反应，咪喹莫特局部用于治疗多种皮肤病；此类药物反应包括牛皮癣反应、皮炎反应、大疱性疾病、脱发、水疱、苔藓样反应、嗜中性粒细胞疾病、红斑狼疮、多形红斑、口腔糜烂以及诸如DRESS、AGEP、Stevens-Johnson综合症和中毒性表皮坏死松解症等严重药物反应(19-29)。

CD1a转基因小鼠的产生

为了评估CD1a在皮肤和相关全身炎症中的可能作用，发明人产生了CD1a转基因小鼠。小鼠基因组中不存在CD1a，并因此克隆了具有0.8kb 5’和0.8kb 3’侧翼区(包括启动子元件)的人类CD1a基因座，并且通过显微注射插入的转基因类似于已发表的CD1a转基因模型，但需要额外的转基因片段拼接(Illing et al.,Nature 486,554-558(2012))。培育基因型阳性的始祖小鼠并针对CD1a转基因表达筛选品系。发明人继续对小鼠进行表型分析并且确定CD1a蛋白表达是否遵循预期谱并且代表人类CD1a细胞表达。收集野生型和CD1a转基因(CD1aTg)小鼠的耳部皮肤并进行酶处理，以允许通过流式细胞术分析皮肤细胞环境(图3A)。在占总皮肤细胞的4.2％(+/-1.79)和CD45+细胞的23.6％(+/-6.68)的皮肤中检测到CD1a表达。为了评估表达的细胞调节，评估了真皮DC(dDC)和朗格汉斯细胞(LC)的CD1a蛋白。据报道，真皮DC亚群表达CD1a，并且朗格汉斯细胞是典型的组成型CD1a^高。发现41.5％(+/-20.38)的dDC和88％(+/-4.606)的LC表达CD1a(图3A-B)。通过免疫荧光进一步表征了皮肤中CD1a蛋白的表达，揭示了特征性表皮位置和具有LC典型树突的细胞(图3C)。CD1a基因型得到确认(图3D)，并观察了胸腺内的CD1a表达，主要是部分CD4+CD8+双阳性胸腺细胞(图3E)。CD1aTg小鼠在稳定状态下没有表现出异常的皮肤炎症。总之，发明人产生了CD1a转基因小鼠，其以与人类组织表达表型类似的方式展示CD1a表达。

该模型用于测试抗-CD1a抗体用于预防炎性皮肤病和病症(图4A)。施用含有5％咪喹莫特(一种TLR7/8激动剂)的Aldara乳膏是一种已建立的模型，其诱发牛皮癣样、皮炎样、狼疮样皮肤炎症，典型特征是皮肤增厚、鳞屑和发红(30,31)。发现，CD1a-转基因小鼠的耳朵炎症对Aldara的应答明显高于WT小鼠。此外，在咪喹莫特之前给药的所有抗-CD1a抗体减少了随后的耳朵增厚，然而抗体116和16将CD1a-依赖性炎症消除至至少WT水平(图4B)。到实验结束时，用抗体16和110治疗的CD1a-转基因(-Tg)小鼠表现出耳朵增厚的炎症减少至WT水平。令人惊奇且出乎意料的是，抗体116治疗将CD1a-Tg耳部皮肤炎症水平降低到显著低于WT皮肤的水平(图4B)。

实施例4-抑制性抗体对皮肤免疫应答的体内作用

寻求分析皮肤免疫群体对咪喹莫特-诱导的CD1a-依赖性耳炎症的贡献。

发现CD1a转基因小鼠中皮肤T细胞浸润升高，并且该群体的频率被抗-CD1a抗体、特别是预防模型中的抗体116、16和110降低(图5A)。值得注意的是，16和116能够将皮肤T细胞浸润减少到低于野生型的水平，表明对体内炎症具有改善和深远的影响。此外，CD1a转基因小鼠皮肤T细胞表面上的激活标记CD69增加，并且被一些抗-CD1a抗体抑制，特别是预防模型中的116和16(图5B)。已知嗜中性粒细胞是许多炎性疾病的重要细胞，包括牛皮癣应答和小鼠咪喹莫特模型。这里，发现在咪喹莫特治疗后皮肤中嗜中性粒细胞频率升高，并且在CD1a转基因小鼠中进一步增加，在预防模型中用抗-CD1a抗体116和16将其降低至WT水平或更低(图5C)。还注意到皮肤嗜酸性粒细胞对抗体的应答减少，考虑到嗜酸性粒细胞在多种形式的药物反应性中的已知作用，这一点值得关注(图5D)。这一意外的发现代表了一种改进，因为之前尚未观察到对嗜酸性粒细胞的影响。

与WT相比，在CD1a转基因小鼠的咪喹莫特挑战后，皮肤中的朗格汉斯细胞(本文定义为CD11c+Langerin+)也增加，如在人类皮肤炎症病症中观察到的。随着抗体16、116、111和非显著110的给药，预防模型中皮肤LC计数减少(图6A)。值得注意的是，抗体116将皮肤LC数量减少到低于野生型皮肤中的数量，显示出改善的和令人惊讶的效果水平。作为主要的CD1a表达群体，评估了抗体对LC CD1a表达的影响。值得注意的是，抗体110和116的染色减少，但这是由于110/116抗体干扰HI 149检测抗体的结合所致(图6B)。这显示了抗体在体内的持续结合，这是令人惊讶的效果并且与治疗优势相关。这些发现还提出了将抗体用于诊断或预后目的或在治疗前和治疗期间监测CD1a-表达细胞的可能性。使用非竞争性SK9检测抗体未观察到这一现象，如下所示。观察到的LC减少可能是由于抗体-依赖性LC死亡或迁移或表型改变所致。因此，分析颈部淋巴结中CD11c+Langerin+LC的存在。发现与WT相比，CD1a转基因小鼠的淋巴结中LC数量增加，然而向LN的迁移似乎不能解释用抗体110和116治疗的小鼠皮肤LC的减少(图6C)。值得注意的是，抗体116带来的免疫学改善接近野生型皮肤的免疫学改善，显示出改善的和令人惊讶的效果水平。有趣的是，CD1a在淋巴结来源的LC上的表达水平遵循与皮肤相似的模式，因为LC具有减少的染色，这是由于110/116抗体对HI149检测抗体的结合的干扰所致(图6D)，如下文进一步讨论。使用非竞争性SK9检测抗体未看到这一情况。值得注意的是，淋巴结来源的LC每个细胞表达的CD1a比皮肤的少，这可能是预防全身炎症的控制机制。因此，抗体在皮肤中甚至在迁移到淋巴结后仍能保持对体内LC的影响。这是一个重要的增强，因为临床效果将更加持久。

实施例5-抗-CD1a抗体观察到细胞毒性表达对CD1a-表达细胞表型的影响

鉴于增强的迁移并不能完全解释皮肤LC减少，因此研究了抗体诱导CD1a+细胞的表型改变的可能性，尽管具有鼠IgG1性质。

已证明，所有抗-CD1a抗体，但特别是110和116，能够在体外减少缺乏MHC I类和II类的CD1a+K562细胞的数量，并因此允许比较应答(图7A)。对抗体110和116进行了更详细的测试，其显示出以剂量依赖性方式减少(图7B)，考虑到IgG1同种型，这是一种改进并且是令人惊讶的。这显然与已发表的CR2113抗体(16,18)(US10844118B2和CA 2924882A1)不同，后者据称需要补体和/或抗体依赖性细胞毒性。具体来说，据说“CR2113不会直接诱导细胞凋亡”(17)，并且注意到NA1/34不会诱导直接杀伤。然而，由于不同的Fc区影响效应子功能，因此下面直接解决了CR2113对鼠IgG1背景的比较影响。发明人继续评估了抗体诱导原代人类CD1a表达细胞直接减少的能力。通过5天分别使用细胞因子IL-4/GM-CSF和IL-4/GM-CSF/TGF-β的单核细胞体外分化以及在培养的第0或2天添加抗-CD1a抗体，产生了DC-和LC样细胞。据观察，抗体110和116在体外减少了LC，并在较小程度上减少了DC(分别为图7C上图和下图)。在探索这种减少的机制时，发明人发现这种减少与显著的细胞聚集培养物表型形态相关(图7D)。数量的减少可以部分地通过该聚集(聚类，clustering)来解释，但是另外，测试了抗体是否可以诱导CD1a-表达靶细胞的凋亡并且与CR2113(在鼠IgG1背景下)进行比较。图7E显示，即使在不存在补体或ADCC的情况下，110和116(但不是16)和CR2113(在鼠IgG1背景上)通过CD1a-表达K562诱导膜联蛋白V表达。这表明，110、116和CR2113抗体在一定程度上可以介导K562细胞死亡。为了研究补体-介导的裂解(CDC)和抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)的作用，将K562-CD1a与补体(图7F)和/或人类PBMC(图7G)一起温育。尽管抗体具有鼠IgG1性质，但存在补体-介导的裂解和ADCC的证据。为了进一步研究体内机制，在免疫缺陷NSG模型中使用K562-CD1a皮下肿瘤建立了一个新模型，该模型存在广泛缺陷的淋巴细胞应答和其它效应。数据显示，到第10天，所有三种抗体都减小了淋巴样细胞肿瘤的大小，并且到第15-20天，16和116效果持续(至CD1a-表达肿瘤细胞体积减少了25％或更多)，但是CR2113效果丧失(图7H)。体外和体内应答的差异可以通过体内存在的其它辅助因子来解释，例如补体、大量带有对不同Fc具有特异性的FcR的先天细胞亚群、不同的靶细胞密度、体内抗体半衰期缩短以及改变的组织通路。CD1a-表达靶细胞的表型的这种直接改变可以促进CD1a-表达细胞的较少炎症应答。因此，用110和116治疗的CD1a-Tg小鼠的皮肤中LC的减少可能部分地通过CD1a+LC表型的直接抗体依赖性变化来解释，并有助于临床效果，例如在116将炎症降低至低于野生型方面。该数据还提出了抗体可用于治疗CD1a-表达恶性肿瘤的可能性，所述恶性肿瘤包括朗格汉斯细胞组织细胞增多症和某些形式的T细胞淋巴瘤和某些形式的胸腺瘤。然而，靶细胞的表型改变并不能解释图2中所示的T细胞功能应答的减少，因为CD1a-珠测定(图2C)不会受到任何耗尽效应的影响。

实施例6-CD1a抗体的表位结合分析

本文提供的数据表明，五种新产生的抗-CD1a抗体具有一系列功能性，并且寻求使用流式细胞术交叉阻断测定来确定抗体是否具有重叠的结合位点。此外，使用商业上可获得的抗体OKT6、HI149、SK9和NA1/34(已知与CR2113重叠的结合位点，如上所述)评估表位重叠。

将CD1a-K562细胞与纯化的初级抗-CD1a抗体(图8A Y轴，25μg/ml)一起温育，然后洗掉未结合的抗体，然后将不同抗体的Alexa-Fluor-647缀合形式与图8A的矩阵排列中的细胞一起温育(X轴，10μg/ml)。使用平均荧光强度(MFI)来评估荧光团缀合的抗体的结合程度，以及因此由初级纯化的抗体的结合引起的任何空间干扰都将由MFI的降低来表示。结果表明，抗体HI149、OKT6、110和116可能具有重叠或密切相关的表位，并且含有抗体NA1/34、77a、111和16的第二组可能具有密切相关的结合位点。这表明，体内观察到的CD1a表达减少(图6B和D)是由于110/116抗体干扰HI/149检测抗体的结合所致。事实上，非竞争性SK9检测抗体并未观察到这种效应(图8B)。重要且出乎意料的是，抗体因此在皮肤体内的LC上保持存在，并且甚至在迁移到淋巴结和皮肤组织酶消化后也是如此。这可能会带来更持久、更实质性的临床益处。由于抗体分为不竞争的两个主要组，因此图8(A和B)显示选自每个组的抗体成员的组合可以一起使用，例如作为治疗/监测或组合治疗。一种这样的组合是116和16。

实施例7-本发明的抗体对治疗咪喹莫特-诱导的炎症以及全身相关炎症的有效性的证明。

考虑到CD1a的皮肤显性表达，大多数研究都集中在皮肤特异性功能效应上，尽管已经证明了循环CD1a-反应性T细胞的存在(11)。CD1a在皮肤以外组织炎症中的作用尚未得到广泛研究。此外，已知CD1a会增强咪喹莫特皮肤应答(16)，但尚未有关于相关全身后遗症的研究。发明人产生了一种新的CD1a转基因小鼠和CD1a-反应性T细胞，并分别使用人类和小鼠测定法表征抗-CD1a抗体的体外和体内功能。研究结果证实了CD1a-依赖性效应延伸至全身效应，对治疗皮肤病的全身性关联(包括不良炎性药物反应性)具有影响。

抗-CD1a抗体的治疗潜力

为了进一步评估新产生的抗-CD1a抗体的治疗潜力，发明人在咪喹莫特治疗模型中测试了三种临床上最有效的抗体16、110和116，其中在建立咪喹莫特诱导的炎症后引入抗-CD1a抗体(图9A)。尽管持续施用咪喹莫特，所有三种抗体在起始后都迅速改善了临床应答(图9B-C)。116的应答最为明显，它减少了耳朵厚度(图9B)。通过共聚焦显微镜观察了整个皮肤(上图)和表皮(下图)增厚(图9D)，证实了千分尺的评估(图9B)。评估了CD1a转基因表皮中的CD1a蛋白表达(抗-CD1a OKT6 AF-594，红色)，并发现在110和116处理的皮肤中，通过细胞死亡和表位竞争而降低(图8A和图9D)。通过分析咪喹莫特治疗模型后的皮肤细胞免疫应答，我们观察到在引入抗体后，皮肤T细胞计数和活化减少、皮肤LC减少且皮肤嗜中性粒细胞减少(图9E-G)。

CD1a参与咪喹莫特的全身免疫反应

咪喹莫特治疗对人体的影响可以延伸到皮肤之外，并且在小鼠模型中已被证明会引起脾肿大。评估了CD1a对该途径的贡献。引人注目的是，与野生型相比，在咪喹莫特治疗的CD1a Tg小鼠中，脾脏重量增加，并且所述抗体减少了脾脏大小和重量，这与皮肤以外的全身效应一致(图10A)。此外，如通过CD69表达(116和110，图10B-C)、脾嗜中性粒细胞(非显著趋势)和嗜酸性粒细胞频率(16、110、116)所确定的，抗体减少了CD4和CD8 T细胞活化(分别为图10D和10E)。第8天评估了血浆细胞因子水平。在咪喹莫特治疗的CD1a转基因小鼠中观察到IL-23、IL-12p70、IL-1β、IL-1α和MCP-1显著增加，而在16、110和116治疗组的一些或全部中减少(图10F)。分别在抗体16和116存在下，血浆免疫调节性细胞因子IL-10和IL-27增加(并且趋势同其它抗体)。然后确定了对循环免疫细胞的影响。与脾脏类似，在咪喹莫特治疗的CD1a转基因组中，血液CD4和CD8 T细胞计数、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增多。用16、110或116处理后，这种增加被显著阻断(图11A-E)。最后，发明人研究了咪喹莫特本身是否可能是CD1a配体，并表明情况并非如此，这暗示CD1a途径具有更广泛的自身免疫和自身炎症作用(图12)。因此，可以表明，广泛的全身炎症免疫应答是由皮肤中的CD1a引发或影响的。

为了研究抗-CD1a抗体是否可以在施用咪喹莫特后产生皮肤炎症的持续复发，进行了示意图13A中描绘的模型，其中在没有重新给药抗-CD1a抗体的情况下使用咪喹莫特再挑战(图13B)。令人惊讶的是，在没有重复给药抗体的情况下，16、110和116都产生了耳朵厚度的持续改善，这与持续的免疫学效果一致。免疫应答也持续存在，皮肤T细胞(110,116)、皮肤T细胞活化(16,110,116)、皮肤嗜酸性粒细胞(116)和皮肤嗜中性粒细胞(16,110,116)的频率、淋巴结T细胞频率(110,116)、淋巴结T细胞活化(16,116)、淋巴结朗格汉斯细胞(116)、淋巴结嗜酸性粒细胞(116)和淋巴结嗜中性粒细胞(116)、血液T细胞频率(110,116)、血液T细胞活化(116)、血液嗜酸性粒细胞(110,116)、血浆IL-1α(116)、IFNγ(16,110,116)、IL-1β(16,110,116)、IL-6(16,116)、IL-17A(16,110,116)显著降低。

为了将抗体的性能与处理中-重度牛皮癣的当前护理标准进行比较，咪喹莫特治疗模型(图9A)与在与抗-CD1a抗体相同的时间和剂量(100μg)给药的抗-IL-17A(IgG1同种型)一起重复(图14)。所有抗-CD1a抗体再次显示出耳朵厚度结果的显著改善，所有抗体都比抗-IL-17A更早产生显著改善。值得注意的是，与不同的抗-CD1a抗体相比，抗-IL-17A没有显著降低皮肤T细胞、皮肤朗格汉斯细胞、皮肤嗜酸性粒细胞、淋巴结T细胞、淋巴结嗜中性粒细胞、淋巴结嗜酸性粒细胞、血浆IL-23、MCP-1、IL-6的频率。

为了直接比较本文所述的抗体和CR2113之间的皮肤和全身炎症结果，采用咪喹莫特皮肤治疗模型(图15A)。所有抗-CD1a抗体对耳朵厚度都有有益影响，但抗体116比CR2113显著改善(图15B-C)。为了扩展抗-CD1a抗体16、110和116相对于CR2113的改进的研究，对皮肤炎症的附加模型(即MC903-诱导的炎症(图15D))进行了比较，并且观察到抗体16、110和116的显著益处，但CR2113却没有，因此显示出改进(图15E)。注意到16和116显示皮肤T细胞百分比和皮肤嗜酸性粒细胞计数显著减少，而CR2113没有显示显著减少(图15F)。皮肤提取物细胞因子显著减少，而CR2113未表现出IL-5(16,110,116)、IL-6(16,110,116)、IL-9(16)、IL-23(116)、IL-17F(16,110,116)的显著减少。

进一步观察到，116在减少皮肤、淋巴结和血浆对咪喹莫特的炎症应答方面表现出比CR2113一致的改善(图16)。对于某些结果，16也比CR2113得到了显著改善(图16)。具体而言，抗体116在减少皮肤T细胞的IL-17A表达以及引流淋巴结嗜酸性粒细胞的频率方面比CR2113有所改善。116在降低血浆IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-17A、IL-17F、IL-22和皮肤消化物IL-1α、IL-22和TNFα方面也比CR2113有所改善。16在减少淋巴结嗜酸性粒细胞、血浆IL-1β、IL-22、IL-9和IL-5；以及皮肤消化物IL-1a以及IL-17A的强劲趋势方面比CR2113有所改善。总体而言，数据证实本文所述的抗体能够抑制对咪喹莫特和MC903的皮肤和全身炎症应答。

讨论

皮炎、牛皮癣和狼疮等皮肤炎症是常见病症，具有显著相关的身体和心理发病率。皮肤对药物的不良反应也很常见，每1000名住院患者中有1.8-7例发生。具有广泛和全身影响的严重皮肤不良反应，如SJS、TEN、AGEP和DRESS较少见；例如，SJS/TEN的发病率约为每年每百万人1-6例(M.Mockenhaupt,Allergol Select 1,96-108(2017))。Gell和Coombs在20世纪60年代定义了过敏反应的分类，其中迟发性IV型超敏反应需要效应T细胞的作用(R.R.A.Coombs,Gell,P.G.H.,Classification of allergic reactions responsiblefor drug hypersensitivity reactions.In Clinical Aspects of Immunology.(Davis,Philadelphia,ed.second,1968))。尽管人们越来越认识到该分类不能解释药物过敏的所有方面，但仍然主要关注共价半抗原或非共价修饰的肽/MHC分子的识别改变。然而，当前的模型并不能解释药物过敏的皮肤和粘膜受累的主导地位(M.Mockenhaupt,AllergolSelect 1,96-108(2017))。

通过CD1a转基因小鼠和自身反应性人类CD1a限制性富集T细胞系的产生，以及功能性抗-CD1a抗体的表征，本文提供的数据显示了内源脂质配体的CD1a呈递的诱导。这会导致自身反应性T细胞-介导的皮肤和全身炎症。抗-CD1a抗体具有临床和免疫学作用，无论它们是阻断还是阻断/调节，表明CD1a脂质呈递给T细胞是重要的。TLR7可以识别单链RNA，并因此有趣的是，对病毒感染的反应性可以模拟不同严重形式的皮肤炎症的临床表型，包括牛皮癣、皮炎、狼疮和对药物的不良炎症反应(包括SJS和TEN)。这种共享的最终共同临床表现可能表明，许多沉淀剂可以促进CD1a-自身反应性和自身炎症。该模型还可能有助于解释与某些药物反应相关的自身免疫风险增加，包括红斑狼疮和DRESS综合症。此外，这些发现表明了CD1a自身反应性破坏了更广泛的T细胞耐受性。

除了对含有咪喹莫特的药物Aldara的T细胞应答产生影响外，在CD1a转基因小鼠中还观察到皮肤、引流淋巴结和脾脏中的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞应答增加。这些效应通过给药本发明的抗体(特别是16、110和116)而被抑制。这表明了CD1a-依赖性免疫级联比最初预期达到的范围更广。嗜中性粒细胞耗尽已被证明可以改善咪喹莫特-诱导的炎症的严重程度(H.Sumida et al.,Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitatesneutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murinemodel of imiquimod-induced psoriasis.J Immunol 192,4361-4369(2014))。

Aldara/咪喹莫特的施用概括了不同形式的皮肤炎症和相关全身性疾病和病症的关键方面，包括牛皮癣、皮炎、狼疮和严重皮肤过敏反应，包括如上所述的T细胞和嗜中性粒细胞浸润。本文证明的数据表明，皮肤、淋巴结和脾的咪喹莫特-依赖性嗜酸性粒细胞浸润在CD1a转基因小鼠中得到增强，并且通过给药本发明的抗体(特别是16、110和116)而减少。

此外，据报道，与患有不同形式的炎性皮肤病或病症(包括牛皮癣、皮炎、狼疮和斑丘疹药疹)的患者的非病变皮肤相比，病变皮肤中的LC数量增加，并随着皮疹消退而降低至非病变水平(D.I.Dascalu,Y.Kletter,M.Baratz,S.Brenner,Acta Derm Venereol 72,175-177(1992))。有趣的是，牛皮癣与LC迁移的改变有关，表明尽管咪喹莫特施用是牛皮癣、狼疮和皮炎的经过充分研究且有效的小鼠模型，但它也适用于包括不良药物炎性药物反应。此处，发明人表明，CD1a-抗体依赖性调节LC与给药本发明的抗体(特别是110和116)后皮肤炎症的减少相关，这对于牛皮癣、皮炎、狼疮、炎性药物反应和其它病症可能具有治疗重要性。表位分析强调了表位结合位点的潜在治疗重要性；抗-CD1a抗体根据结合位点和所得效应子功能分为两组。表位位点可促进使用抗体110和116但不是77a、111和16观察到的表型效应的聚类和变化，这些抗体主要是阻断抗体。聚类确实可能导致交联/凝集样细胞形态，这也可以解释CD1a转染的K562和单核细胞来源的LC的减少，因为两种细胞类型均表达高水平的CD1a，高于单核细胞来源的DC。两组的不同抗体结合位点不竞争，因此选自两组中的每一个的组合具有可用性，例如在治疗/监测或联合治疗方面具有可用性。

CD1a在皮肤炎症和相关全身性疾病的发病机制中的作用涉及其在许多疾病中的作用，包括牛皮癣、皮炎和红斑狼疮以及药物超敏反应。此外，CD1a阻断和调节抗体的表征为皮肤炎症和CD1a-表达恶性肿瘤的预防和治疗开发提供了新的潜在途径。

总结

总之，发明人已经产生了一组精制的抗-CD1a抗体，其在预防和/或治疗炎性皮肤和粘膜病症中具有治疗潜力。五种抗体16、77a、110、111和116表明是体外人类CD1a抗原呈递的高效抑制剂，并且在典型炎性皮肤病预防和治疗模型(其具有牛皮癣、皮炎、红斑狼疮和表现为炎性皮肤或粘膜疾病或病症的药物反应以及全身性(非皮肤)反应的特征)中以及在异种移植肿瘤模型中显示出功效。抗体发现过程在鉴定改良抗体方面的成功可归因于以下方面的组合：a)筛选大量命中(3500)；b)使用新的嵌合免疫原，由此将人类CD1a脂质结合结构域融合至宿主生物体CD1d Ig结构域，从而将抗体产生靶向于可能存在功能抑制潜力的脂质结合结构域；c)各种多克隆和富集T细胞分析，检查不同的功能结果。

体外人体功能测定显示，如通过对原代多克隆T细胞应答的抑制的IC50评估而测量得到的，这些抗体比商业上可获得的抗体更高效。此外，使用高度灵敏的人类CD1a-限制性T细胞克隆测定，确定抗-CD1a抗体16和116能够阻断IL-22的产生，IL-22是炎性皮肤和粘膜疾病的关键调节因子。此种活性是一种改进和惊喜，因为其在抗-CD1a CR2113的现有出版物或专利((16,17)、US10844118B2和CA 2924882A1)中未示出，其中IL-17或IFNγ的产生在小鼠系统中被诱导和抑制。IL-22抑制是该抗体的一个重要优势，因为IL-22是皮肤和粘膜疾病的关键调节因子。

人类和体内小鼠模型的平行分析为评估新产生的抗体的治疗效果提供了强有力的手段。在体内，使用咪喹莫特来诱导牛皮癣样、皮炎样、狼疮样、药物反应样表型，并提供模型皮肤炎症系统，并且可以更广泛地应用于许多炎性疾病和病症，以及相关的全身性疾病或病症和全身性表现的炎性药物反应。此处显示抗体110、116和16显著减少了由咪喹莫特诱导的CD1a-依赖性炎症，在相同的鼠IgGl背景(CR2113)下比护理标准(抗-IL-17A)和比较抗-CD1a抗体有改善。重要且出人意料的是，抗体116将皮肤炎症减轻至低于WT咪喹莫特治疗小鼠的水平，并使许多皮肤和全身免疫标志物正常化至WT的水平，这表明抗-CD1a 116的作用机制超越了CD1a-TCR信号传导的抑制。对皮肤进行免疫表型分析，并且观察到T细胞数量和活化的减少，并且给药抗体110、116和16后嗜中性粒细胞浸润降低至WT水平。观察到嗜中性粒细胞减少至WT水平是相对于已公开的抗-CD1a CR2113的意外改进，突显了抗体110、116和16的潜力。

重要的是，当分析皮肤内的LC群时，在给药抗体110和116后观察到CD11c+Langerin+LC显著减少。这种减少不能用向引流淋巴结迁移的增强来解释。然而，抗体110以及更大程度地抗体116有可能能够在体内直接减少CD1a+细胞，这解释了体内皮肤LC的减少，并且由体外人类CD1a+细胞的显著减少所证明。考虑到抗体的小鼠IgGl同种型，这是令人惊讶的结果，其中鼠IgG2a同种型更有可能通过补体-介导的裂解导致细胞毒性或者导致抗体-依赖性细胞毒性，并且已经报道了进一步获得专利和公开的抗-CD1a CR2113不能直接耗尽(17)，尽管此处显示在鼠IgG1背景下CR2113也可以诱导CD1a-表达细胞的凋亡。这些抗体的调节能力可以帮助解释咪喹莫特诱导的炎症的减少至低于WT同种型治疗的小鼠。抗体116不仅阻断CD1a与TCR的相互作用，而且还修饰LC，减少/重置皮肤的炎症潜力，并使许多皮肤和全身免疫标志物正常化至WT水平。这可以解释超过野生型对CD1a-依赖性应答的改善作用，而抗-CD1a CR2113则不能。

此外，数据表明，本文提出的16、110和/或116抗体可用于治疗CD1a-表达恶性肿瘤，例如朗格汉斯细胞组织细胞增多症或某些形式的T细胞淋巴瘤和胸腺瘤。这可以通过直接作用实现，或者其中抗-CD1a抗体与一种或多种其它治疗剂(选自包括细胞毒性剂、抗炎剂(例如类固醇)和CAR-T细胞(例如调节性或细胞溶解性CAR-T细胞)或表达或呈递抗体或抗原结合片段的其它细胞的组)结合或缔合。

这项研究表明，抗体16是一种高效的阻断抗体，在体内消除CD1a依赖性炎症而不诱导直接细胞凋亡，110修饰LC表型和功能，显著减少体内CD1a依赖性炎症，而116是一种高效的阻断和修饰抗体，可将炎症减少至低于WT水平，并使许多皮肤和全身免疫标志物正常化至WT水平。这种抗体分组与基本表位分析一致，其中直接修饰抗体110和116簇，并且阻断抗体77a、111和16簇。表位分析还揭示了77a、111和16组与非耗尽型NA1/34识别的表位重叠；重要的是注意到，NA1/34已被证明可以交叉阻断抗-CD1a CR2113的结合。抗体110和116不交叉阻断NA1/34，并因此可能代表不同的表位区域。这些抗体在皮肤中的体内LC上保持存在，并且甚至在迁移到淋巴结后也是如此。这是一种重要的增强，因为临床效果将更加持久。

通过这些数据，发明人证明了这种精制的抗-CD1a抗体组在预防和治疗炎性皮肤和粘膜病症(包括但不限于牛皮癣、皮炎、狼疮)以及用于治疗和/或预防一种或多种相关全身性疾病或病症、或全身性表现的一种或多种炎性药物反应中的潜力。对包括LC、T细胞和嗜中性粒细胞在内的广泛炎症级联的影响，特别是抗体110、116和16，将对炎性皮肤和粘膜疾病(包括牛皮癣、皮炎、狼疮和表现为炎性皮肤或粘膜疾病或病症的药物反应、或CD1a-表达恶性肿瘤)产生广泛影响。

总之，本发明人证明了改进的抗-CD1a抗体16、77a、110、111和116，通过阻断CD1a和/或改变CD1a+细胞的表型/功能，作为一种用于预防和治疗炎性皮肤和粘膜疾病或病症、或作为相关全身性疾病或病症、或全身性表现的炎性药物反应、或CD1a-表达恶性肿瘤的方法。

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本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考文献(如果尚未引用)，通过引用整体并入本文。

表11-序列ID

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任何上述DNA序列的下划线部分表示信号序列。

序列表

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<140> PCT/GB2022/051285

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Tyr Ala Ala Thr Leu Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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195 200 205

Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215 220

<210> 47

<211> 437

<212> PRT

<213> 智人

<400> 47

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Thr

85 90 95

Trp Tyr Trp Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser

115 120 125

Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr

165 170 175

Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr

180 185 190

Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val

210 215 220

Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val

225 230 235 240

Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile

245 250 255

Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val

260 265 270

Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

275 280 285

Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu

290 295 300

Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala

305 310 315 320

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro

325 330 335

Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys

340 345 350

Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr

355 360 365

Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr

370 375 380

Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu

385 390 395 400

Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser

405 410 415

Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser

420 425 430

His Ser Pro Gly Lys

435

<210> 48

<211> 217

<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

Ala Val Glu Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys

65 70 75 80

Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Ala Tyr Asp Ser Ser Ser

85 90 95

Tyr Gly Thr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr

100 105 110

Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn

145 150 155 160

Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Cys Thr Tyr

165 170 175

Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His

180 185 190

Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile

195 200 205

Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 49

<211> 443

<212> PRT

<213> 智人

<400> 49

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ile Ile Tyr Thr Thr Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Leu

85 90 95

Ala Thr Tyr Val Ser Pro Pro Thr Arg Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

210 215 220

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser

260 265 270

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

290 295 300

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

305 310 315 320

Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

325 330 335

Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

340 345 350

Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

355 360 365

Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala

370 375 380

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

385 390 395 400

Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly

405 410 415

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

420 425 430

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 50

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人

<400> 50

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Ser

20 25 30

Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu

65 70 75 80

Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys

85 90 95

Ser Ser Val Asp Cys Ala Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val

100 105 110

Lys Arg Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu

145 150 155 160

Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Cys Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr

180 185 190

Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr

195 200 205

Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215 220

<210> 51

<211> 429

<212> DNA

<213> 智人

<400> 51

aagcttgcca ccatggaatg gagctgggtc tttctcttct tcctgtcagt aactacagga 60

gtccattctg aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct tagtgaagcc tggagggtcc 120

ctgaaactct cctgtgcagc ctctggattc actttcagta actatgccat gtcttgggtt 180

cgccagactc cagagaagag gctggagtgg gtcgcagcca ttaatagtaa tggtggtagc 240

gcctactatc cagacactgt gaaggaccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300

accctgtacc tgcaaatgag cagtctgagg tctgaggaca cagccttgta ttactgtgca 360

agacgcttct actatgatta cggctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcaca 420

gtctcgagc 429

<210> 52

<211> 399

<212> DNA

<213> 智人

<400> 52

aagcttgcca ccatgtctgt ccccacccaa gtcctcggac tcctgctact ctggcttaca 60

gatgccagat gcgacattgt gctgacccaa tctccagctt ccctgtctgc atctgtggga 120

gaaactgtca ccatcacatg tcgagcaagt gagaatattg acagttattt agcatggtat 180

cagcagaaac agggaaaatc tcctcagctc ctggtctatg ctgcaacact cttagcagat 240

ggtgtgccat caaggttcag tggcagtgga tcaggcacac agtattctct caagatcaac 300

agcctgcagt ctgaagatgt tgcgagatat tactgtcaac attattatag ttctccgtgg 360

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaata aaacgtacg 399

<210> 53

<211> 417

<212> DNA

<213> 智人

<400> 53

aagcttgcca ccatggaatg gagctgggtc tttctcttct tcctgtcagt aactacagga 60

gtccattctc agtcggtgga ggagtccggg ggtcgcctgg tcacgcctgg gacacccctg 120

acactcacat gcacagtctc tggattctcc ctcagtagct atgcgatgag ctgggtccgc 180

caggctccag ggaaggggct ggaatggatc ggaatcatta gtagcagtgg taccacatac 240

tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atttccaaaa cctcgaccac ggtggatctg 300

aaaatcacca gtccgacaac cgaggacacg gccacctatt tctgtgccag agtcgattac 360

tatagtagtg gctggggtgg cttgtggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcgagc 417

<210> 54

<211> 418

<212> DNA

<213> 智人

<400> 54

aagcttcgaa gccaccatgg acacgagggc ccccactcag ctgctggggc tcctgctgct 60

ctggctccca ggtgccacat ttgccgttga aatgacccag actccagcct cgatgtctgc 120

cgctgtggga ggcacagtca ccatcaagtg ccaggccagt gaggacattt atagcaattt 180

ggcctggtat cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatg gtgcatccac 240

tctggcttct ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacag agtacactct 300

caccatcagc ggtgtgcagt gtgacgatgc tgccacttac tattgtcaat gcacttatga 360

tactagtagt tatggtaata ctttcggcgg agggaccgag atggtagtcg aacgtacg 418

<210> 55

<211> 423

<212> DNA

<213> 智人

<400> 55

aagcttgcca ccatggaatg gagctgggtc tttctcttct tcctgtcagt aactacagga 60

gtccattctc agtcggtgga ggagtccggg ggtcgcctgg tcacgcctgg gacacccctg 120

acactcacct gcacagtctc tggattctcc ctcagtagct atgcaatgat ctgggtccgc 180

caggctccag ggaaggggct ggaatggatc ggaatcatta atagtagtga taacacacac 240

tacgcgacct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgaccac ggtggatcta 300

aaaatcacca gtccgacaac cgaggacacg gccacctatt tctgtgccag agatccctac 360

gactatggtt atggttggta ctttgacttg tggggcccag gcaccctggt caccgtctcg 420

agc 423

<210> 56

<211> 427

<212> DNA

<213> 智人

<400> 56

aagcttcgaa gccaccatgg acacgagggc ccccactcag ctgctggggc tcctgctgct 60

ctggctccca ggtgccacat ttgcccaagt gctgacccag actccatccc ctgtgtctgc 120

agctgtggga ggcacagtca ccatcaactg ccaggccagt cagagtgttt ttaataacaa 180

aaatttagcc tggtatcagc agaaaccagg gcagcctccc aagctcctga tctacaaggc 240

atccactctg gcatctggcg tctcatcgcg gttcaaaggc agtggatctg ggacacagtt 300

cgctctcacc atcagcggcg tgcagtgtga cgatgctgcc acttactact gtcaaggcga 360

atttagttgt agtagtactg attgcgtgac tttcggcgga gggaccgagg tggtggtcaa 420

acgtacg 427

<210> 57

<211> 408

<212> DNA

<213> 智人

<400> 57

aagcttgcca ccatggaatg gagctgggtc tttctcttct tcctgtcagt aactacagga 60

gtccattctc agtcggtgga ggagtccggg ggtcgcctgg tcacgcctgg gacacccctg 120

acactcacct gcacagcctc tggattctcc ctcagtacct atgcaatgag ttgggtccgc 180

caggctccag ggaaggggct ggaatggatc ggaatcatta gtagtagtgg tagcacatac 240

tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgaccac ggtggatctg 300

aaaatcacca gtccgacaac cgaggacacg gccacctatt tctgtgccag agagacttgg 360

tactggttgg atctctgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcgagc 408

<210> 58

<211> 418

<212> DNA

<213> 智人

<400> 58

aagcttcgaa gccaccatgg acatgagggc ccccactcag ctgctggggc tcctgctgct 60

ctggctccca ggtgccacat ttgccgttga aatgacccag actccagcct cggtgtctgc 120

cgctgtggga ggcacagtca ccatcaattg ccaggccagt gaggacattt atagcaattt 180

ggcctggtat cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatg gtgcatccac 240

tctggcatct ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacag agtacactct 300

caccatcagc ggtgtgcagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtcaat gcgcttatga 360

tagtagtagt tatggtaccc ctttcggcgg agggaccgag gtggtggtca aacgtacg 418

<210> 59

<211> 426

<212> DNA

<213> 智人

<400> 59

aagcttgcca ccatggaatg gagctgggtc tttctcttct tcctgtcagt aactacagga 60

gtccattctc agtcggtgga ggagtccggg ggtcgcctgg tcacgcctgg gacacccctg 120

acactcacct gcacagtctc tggattctcc ctcagtaact atgcaatgag ctgggtccgc 180

caggctccag ggaaggggct ggaatggatc ggaatcattt atactactgg tttcacatac 240

tacgcgagct gggtgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgaccac ggtggacctg 300

aaaatcacca gtccgacaac cgaggacacg gccacctatt tctgtgccag agggctggct 360

acttatgtta gtcccccgac tcggttggat ctctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 420

tcgagc 426

<210> 60

<211> 427

<212> DNA

<213> 智人

<400> 60

aagcttcgaa gccaccatga acatgagggc ccccactcag ctgctggggc tcctgctgct 60

ctggctccca ggtgccacat ttgcccaagt gctgacccag actccatccc ctgtgtctgc 120

agctgtggga ggcacagtca ccatcaactg ccaggccagt cagagtattt ataatagcaa 180

aaatttagcc tggtatcagc agaaaccagg gcagcctccc aagctcctga tctattctgc 240

atccactctg gcatctgggg tcccatcgcg gttcaaaggc agtggatctg ggacacagtt 300

cactctcacc atcagcgacc tggagtgtga cgatgctgcc acttactact gtcaaggcga 360

atttagttgt agtagtgttg attgcgccac tttcggcgga gggaccgagg tggtggtcaa 420

acgtacg 427

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人

<400> 61

ggattcactt tcagtaacta tgccatgtct 30

<210> 62

<211> 51

<212> DNA

<213> 智人

<400> 62

gccattaata gtaatggtgg tagcgcctac tatccagaca ctgtgaagga c 51

<210> 63

<211> 33

<212> DNA

<213> 智人

<400> 63

cgcttctact atgattacgg ctggtttgct tac 33

<210> 64

<211> 33

<212> DNA

<213> 智人

<400> 64

cgagcaagtg agaatattga cagttattta gca 33

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 65

gctgcaacac tcttagcaga t 21

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人

<400> 66

caacattatt atagttctcc gtggacg 27

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人

<400> 67

ggattctccc tcagtagcta tgcgatgagc 30

<210> 68

<211> 48

<212> DNA

<213> 智人

<400> 68

atcattagta gcagtggtac cacatactac gcgagctggg cgaaaggc 48

<210> 69

<211> 33

<212> DNA

<213> 智人

<400> 69

gtcgattact atagtagtgg ctggggtggc ttg 33

<210> 70

<211> 33

<212> DNA

<213> 智人

<400> 70

caggccagtg aggacattta tagcaatttg gcc 33

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 71

ggtgcatcca ctctggcttc t 21

<210> 72

<211> 36

<212> DNA

<213> 智人

<400> 72

caatgcactt atgatactag tagttatggt aatact 36

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人

<400> 73

ggattctccc tcagtagcta tgcaatgatc 30

<210> 74

<211> 48

<212> DNA

<213> 智人

<400> 74

atcattaata gtagtgataa cacacactac gcgacctggg cgaaaggc 48

<210> 75

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人

<400> 75

gatccctacg actatggtta tggttggtac tttgacttg 39

<210> 76

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人

<400> 76

caggccagtc agagtgtttt taataacaaa aatttagcc 39

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 77

aaggcatcca ctctggcatc t 21

<210> 78

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人

<400> 78

caaggcgaat ttagttgtag tagtactgat tgcgtgact 39

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人

<400> 79

ggattctccc tcagtaccta tgcaatgagt 30

<210> 80

<211> 48

<212> DNA

<213> 智人

<400> 80

atcattagta gtagtggtag cacatactac gcgagctggg cgaaaggc 48

<210> 81

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人

<400> 81

gagacttggt actggttgga tctc 24

<210> 82

<211> 33

<212> DNA

<213> 智人

<400> 82

caggccagtg aggacattta tagcaatttg gcc 33

<210> 83

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 83

ggtgcatcca ctctggcatc t 21

<210> 84

<211> 36

<212> DNA

<213> 智人

<400> 84

caatgcgctt atgatagtag tagttatggt acccct 36

<210> 85

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人

<400> 85

ggattctccc tcagtaacta tgcaatgagc 30

<210> 86

<211> 48

<212> DNA

<213> 智人

<400> 86

atcatttata ctactggttt cacatactac gcgagctggg tgaaaggc 48

<210> 87

<211> 42

<212> DNA

<213> 智人

<400> 87

gggctggcta cttatgttag tcccccgact cggttggatc tc 42

<210> 88

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人

<400> 88

caggccagtc agagtattta taatagcaaa aatttagcc 39

<210> 89

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 89

tctgcatcca ctctggcatc t 21

<210> 90

<211> 39

<212> DNA

<213> 智人

<400> 90

caaggcgaat ttagttgtag tagtgttgat tgcgccact 39

Claims (28)

1.一种结合CD1a的抗体或其抗原结合片段，用于治疗或预防一种或多种炎性皮肤或粘膜疾病或病症、或一种或多种相关全身性疾病或病症、或一种或多种全身性表现的炎性药物反应、或一种或多种CD1a-表达恶性肿瘤。

2.一种抗体或其抗原结合片段，包含：

a)包含SEQ ID NO:35或与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:38或与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的轻链可变区；或

b)包含SEQ ID NO:3或与其具有至少80％同一性的序列的互补决定区CDR3的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:6与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的轻链可变区；或

c)包含SEQ ID NO:11或与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:14或与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的轻链可变区；或

d)包含SEQ ID NO:19或与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:22或与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的轻链可变区；或

e)包含SEQ ID NO:27或与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:30或与其具有至少80％同一性的序列的CDR3的轻链可变区。

3.一种抗体或其抗原结合片段，包含：

a)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:33的CDR1，

SEQ ID NO:34的CDR2，和SEQ ID NO:35的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列，和/或轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:36的CDR1，

SEQ ID NO:37的CDR2，和SEQ ID NO:38的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列；或

b)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:1的CDR1，

SEQ ID NO:2的CDR2，和SEQ ID NO:3的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列，和/或轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:4的CDR1，

SEQ ID NO:5的CDR2，和SEQ ID NO:6的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列；或

c)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:9的CDR1，

SEQ ID NO:10的CDR2，和SEQ ID NO:11的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列，和/或轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:12的CDR1，

SEQ ID NO:13的CDR2，和SEQ ID NO:14的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列；或

d)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:17的CDR1，

SEQ ID NO:18的CDR2，和SEQ ID NO:19的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列，和/或轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:20的CDR1，

SEQ ID NO:21的CDR2，和SEQ ID NO:22的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列；或

e)重链可变区，其包含：

SEQ ID NO:25的CDR1，

SEQ ID NO:26的CDR2，和SEQ ID NO:27的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列，和/或轻链可变区，其包含：

SEQ ID NO:28的CDR1，

SEQ ID NO:29的CDR2，和SEQ ID NO:30的CDR3，

或与其具有至少80％同一性的序列。

4.一种抗体或其抗原结合片段，包含：

e)包含SEQ ID NO:39或由SEQ ID NO:39组成的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:40或由SEQ ID NO:40组成的轻链可变区或与其具有至少80％同一性的序列；或

b)包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的轻链可变区或与其具有至少80％同一性的序列；或

c)包含SEQ ID NO:15或由SEQ ID NO:15组成的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:16或由SEQ ID NO:16组成的轻链可变区或与其具有至少80％同一性的序列；或

d)包含SEQ ID NO:23或由SEQ ID NO:23组成的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成的轻链可变区或与其具有至少80％同一性的序列；或

e)包含SEQ ID NO:31或由SEQ ID NO:31组成的重链可变区；和/或包含SEQ ID NO:32或由SEQ ID NO:32组成的轻链可变区或与其具有至少80％同一性的序列。

5.一种抗体或其抗原结合片段，包含：

a)包含SEQ ID NO:49或由SEQ ID NO:49组成的重链；和/或

包含SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成的轻链

或与其具有至少80％同一性的序列；或

b)包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成的重链；和/或包含SEQ ID NO:42或与由SEQ ID NO:42组成的轻链

或与其具有至少80％同一性的序列；或

c)包含SEQ ID NO:43或由SEQ ID NO:43组成的重链；和/或

包含SEQ ID NO:44或由SEQ ID NO:44组成的轻链

或与其具有至少80％同一性的序列；或

d)包含SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成的重链；和/或包含SEQ ID NO:46或由SEQID NO:46组成的轻链

或与其具有至少80％同一性的序列；或

e)包含SEQ ID NO:47或由SEQ ID NO:47组成的重链；和/或包含SEQ ID NO:48或由SEQID NO:48组成的轻链

或与其具有至少80％同一性的序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括ScFv或其它修饰形式。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段被修饰以稳定和/或延长半衰期；任选地，其中所述修饰是聚乙二醇化。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人类IgG1同种型或人类IgG4同种型或其它天然或修饰的同种型。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是双特异性的或多特异性的。

11.一种核酸，编码权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

12.一种载体，包含权利要求11所述的核酸。

13.根据权利要求12所述的载体，其中所述载体是表达载体、质粒或病毒载体。

14.一种宿主细胞，包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的核酸、和/或权利要求12或权利要求13所述的载体。

15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。

16.一种药物组合物，包含一种或多种权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的核酸、权利要求12或权利要求13所述的载体、和/或权利要求14或权利要求15所述的宿主细胞。

17.权利要求2-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的核酸、权利要求12或权利要求13所述的载体、权利要求14或权利要求15所述的宿主细胞、或权利要求16所述的药物组合物，用于在医药中应用。

18.一种或多种权利要求2-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、一种或多种权利要求11所述的核酸、一种或多种权利要求12或权利要求13所述的载体、一种或多种权利要求14或权利要求15所述的宿主细胞、或一种或多种权利要求16所述的药物组合物，用于在治疗或预防一种或多种炎性皮肤或粘膜疾病或病症、或一种或多种相关全身性疾病或病症、或一种或多种全身性表现的炎性药物反应、或CD1a-表达恶性肿瘤中应用。

19.根据权利要求18所述用于应用的一种或多种抗体或其抗原结合片段，其中所述一种或多种抗体或其抗原结合片段包含两种抗体或其抗原结合片段或者由两种抗体或其抗原结合片段组成，每种包含以下各项或由以下各项组成：

a)具有重链可变区和轻链可变区的第一抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含：

SEQ ID NO:33的CDR1、SEQ ID NO:34的CDR2和SEQ ID NO:35的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列，

该轻链可变区包含：

SEQ ID NO:36的CDR1、SEQ ID NO:37的CDR2和SEQ ID NO:38的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列；和

具有重链可变区和轻链可变区的第二抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含：

SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列，

该轻链可变区包含：

SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列；或

b)第一抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:39或由SEQ ID NO:39组成的重链可变区；和包含SEQ ID NO:40或由

SEQ ID NO:40组成的轻链可变区，或者与其具有至少80％同一性的序列；和

第二抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:7或由

SEQ ID NO:7组成的重链可变区；和包含SEQ ID NO:8或由SEQ IDNO:8组成的轻链可变区，或者与其具有至少80％同一性的序列；或

c)第一抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:49或由SEQ ID NO:49组成的重链；和包含SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成的轻链，或者与其具有至少80％同一性的序列；和

第二抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成的重链；和包含SEQ ID NO:42或由SEQ ID NO:42组成的轻链，或者与其具有至少80％同一性的序列。

20.根据权利要求18或权利要求19所述用于应用的一种或多种抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中：

a)所述一种或多种炎性皮肤或粘膜疾病或病症是下列中的一种或多种：

i)主要为嗜中性粒细胞性皮肤病，例如痤疮、泛发性脓疱性牛皮癣、斑块性牛皮癣、点滴状牛皮癣、掌跖脓疱病、SAPHO综合症、急性发热性中性粒细胞性皮肤病(斯威特综合症)、组织细胞样中性粒细胞性皮炎、手背中性粒细胞性皮肤病、坏疽性脓皮病、中性粒细胞性小汗腺炎、化脓性汗腺炎、持久性隆起性红斑、白塞氏病、肠相关性皮炎关节炎综合症、其它感染相关炎症、中性粒细胞性荨麻疹性皮肤病、栅栏状中性粒细胞肉芽肿性皮炎、匍形性回状红斑、中性粒细胞环形红斑、急性泛发性发疹性脓疱病(AGEP)、血管炎等；

ii)自身免疫性病症，例如结缔组织病(例如狼疮、皮肌炎、硬皮病/系统性硬化症、Churg Strauss综合症)、脂膜炎、血管炎、自身免疫性水疱病症(例如大疱性类天疱疮、天疱疮、线性IgA病)、疱疹样皮炎、乳糜泻、某些自身炎性疾病、白癜风、斑秃、普秃、全秃、脂膜炎、扁平苔藓、多形红斑、硬化性苔藓、其它苔藓样和多形红斑样疾病、牛皮癣关节炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、吉兰-巴雷综合症、横贯性脊髓炎、甲状腺炎、神经退行性疾病等；

iii)肥大细胞病症和嗜酸性粒细胞病症，例如Muckle Wells综合症、嗜酸性粒细胞增多和全身症状综合症、荨麻疹、血管性水肿、角结膜炎、食物过敏、其它过敏或特应性包括特应性皮炎、鼻炎、结膜炎、哮喘、嗜酸性食管炎和其它嗜酸性粒细胞性粘膜疾病、接触性皮炎等；

iv)移植物抗宿主病；以及

v)表现为炎性皮肤或粘膜疾病或病症的其它药物反应，包括史蒂文斯约翰逊综合症、中毒性表皮坏死松解症、具有嗜酸性粒细胞增多症和全身症状综合症(DRESS)和急性泛发性发疹性脓疱病(AGEP)的药物反应、多形红斑、大疱性、固定性药物以及表现为炎性皮肤或粘膜疾病或病症的其它药物反应；或

(b)所述一种或多种相关全身性疾病或病症、或全身性表现的一种或多种炎性药物反应是对Aldara(咪喹莫特)的炎症反应；或

(c)所述CD1a-表达恶性肿瘤是朗格汉斯细胞组织细胞增多症、T细胞淋巴瘤或胸腺瘤中的一种或多种。

21.根据权利要求20所述用于应用的一种或多种抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述一种或多种炎性皮肤或粘膜疾病或病症是牛皮癣、皮炎、红斑狼疮、或表现为炎性皮肤或粘膜疾病或病症的药物反应中的一种或多种。

22.根据权利要求14-21中任一项所述用于应用的一种或多种抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物组合物旨在单独给药或与一种或多种其它治疗剂联合给药。

23.根据权利要求22所述用于应用的一种或多种抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述一种或多种其它治疗剂选自包括以下各项的组：细胞毒性剂，抗炎剂例如类固醇，以及CAR-T细胞例如调节性或溶细胞性CAR-T细胞，或者表达或呈递一种或多种权利要求1-10中任一项所述的抗体或抗原结合片段的其它细胞。

24.一种或多种权利要求2-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的核酸、权利要求12或权利要求13所述的载体、权利要求14或权利要求15所述的宿主细胞、或权利要求16所述的药物组合物在制备用于治疗或预防一种或多种炎性皮肤或粘膜疾病或病症、或一种或多种相关全身性疾病或病症、或一种或多种全身性表现的炎性药物反应、或一种或多种CD1a-表达恶性肿瘤的药物中的用途。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种抗体或其抗原结合片段包含两种抗体或其抗原结合片段或者由两种抗体或其抗原结合片段组成，每种包含以下各项或由以下各项组成：

a)具有重链可变区和轻链可变区的第一抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含：

SEQ ID NO:33的CDR1、SEQ ID NO:34的CDR2和SEQ ID NO:35的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列，

该轻链可变区包含：

SEQ ID NO:36的CDR1、SEQ ID NO:37的CDR2和SEQ ID NO:38的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列；和

具有重链可变区和轻链可变区的第二抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含：

SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列，

该轻链可变区包含：

SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列；或

b)第一抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:39或由SEQ ID NO:39组成的重链可变区；和包含SEQ ID NO:40或由SEQ ID NO:40组成的轻链可变区，或者与其具有至少80％同一性的序列；和

第二抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成的重链可变区；和包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的轻链可变区，或者与其具有至少80％同一性的序列；或

c)第一抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:49或由SEQ ID NO:49组成的重链；和包含SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成的轻链，或者与其具有至少80％同一性的序列；和

第二抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成的重链；和包含SEQ ID NO:42或由SEQ ID NO:42组成的轻链，或者与其具有至少80％同一性的序列。

26.一种治疗受试者中的一种或多种炎性皮肤或粘膜疾病或病症、或一种或多种相关全身性疾病或病症、或一种或多种全身性表现的炎性药物反应、或一种或多种CD1a-表达恶性肿瘤的方法，包括向所述受试者给药有效量的一种或多种权利要求2-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的核酸、权利要求12或权利要求13所述的载体、权利要求14或权利要求15所述的宿主细胞、或权利要求16所述的药物组合物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种抗体或其抗原结合片段包含两种抗体或其抗原结合片段或者由两种抗体或其抗原结合片段组成，每种包含以下各项或由以下各项组成：

a)具有重链可变区和轻链可变区的第一抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含：

SEQ ID NO:33的CDR1、SEQ ID NO:34的CDR2和SEQ ID NO:35的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列，

该轻链可变区包含：

SEQ ID NO:36的CDR1、SEQ ID NO:37的CDR2和SEQ ID NO:38的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列；和

具有重链可变区和轻链可变区的第二抗体或其抗原结合片段，该重链可变区包含：

SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列，

该轻链可变区包含：

SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3，或与其具有至少80％同一性的序列；或

b)第一抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:39或由SEQ ID NO:39组成的重链可变区；和包含SEQ ID NO:40或由SEQ ID NO:40组成的轻链可变区，或者与其具有至少80％同一性的序列；和

第二抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成的重链可变区；和包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成的轻链可变区，或者与其具有至少80％同一性的序列；或

c)第一抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:49或由SEQ ID NO:49组成的重链；和包含SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成的轻链，或者与其具有至少80％同一性的序列；和

第二抗体或其抗原结合片段，具有：包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成的重链；和包含SEQ ID NO:42或由SEQ ID NO:42组成的轻链，或者与其具有至少80％同一性的序列。

28.一种监测诊断患有CD1a-表达恶性肿瘤的受试者中治疗功效或疾病状态的方法，包括：

i.提供获自所述受试者的生物样品；

ii.在治疗前、或在治疗之间的间隔、或在不存在治疗的时间间隔，确定一种或多种权利要求1-10中任一项所述的抗体或抗原结合片段与获自所述受试者的样品中CD1a-表达细胞的结合水平；

iii.在治疗后、或在治疗间隔之间、或在不存在治疗的时间间隔，如果肿瘤体积、或一种或多种本发明的抗体或抗原结合片段与CD1a-表达细胞的结合水平降低，则确定所述治疗有效、或疾病状态正在改善，任选地其中所述肿瘤体积或一种或多种权利要求2-10中任一项所述的抗体或抗原结合片段与CD1a-表达细胞的结合水平降低25％或更多。