CN117630077A - 一种基于19f核磁共振检测蛋白质羰基化的方法 - Google Patents
一种基于19f核磁共振检测蛋白质羰基化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117630077A CN117630077A CN202311624520.5A CN202311624520A CN117630077A CN 117630077 A CN117630077 A CN 117630077A CN 202311624520 A CN202311624520 A CN 202311624520A CN 117630077 A CN117630077 A CN 117630077A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- carbonylation
- nuclear magnetic
- solution
- fluorobenzoyl hydrazine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- UIVXXFYJRYVRKJ-UHFFFAOYSA-N 4-fluorobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=C(F)C=C1 UIVXXFYJRYVRKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 88
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000012565 NMR experiment Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108091006003 carbonylated proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical group [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims description 12
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 9
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 8
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 9
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 23
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxynonenal Chemical compound CCCCCC(O)C=CC=O JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 13
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 5
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 4
- YSULOORXQBDPCU-UHFFFAOYSA-N 2-(trimethylazaniumyl)ethanehydrazonate;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CC(=O)NN YSULOORXQBDPCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001225 nuclear magnetic resonance method Methods 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
- G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
- G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/30—Assessment of water resources
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- High Energy & Nuclear Physics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，本发明利用4‑氟苯甲酰肼检测蛋白质中的羰基化，4‑氟苯甲酰肼由于其特殊结构可以与羰基化的蛋白质结合，通过19F NMR实验检测结合态4‑氟苯甲酰肼的NMR信号，反应出待测蛋白质是否发生了羰基化，以及羰基化修饰的程度。该方法具有简单、操作简单易行、检测成本低、安全无毒以及无背景干扰等优点，可准确快速地检测出患者血浆蛋白质的羰基化程度。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质羰基化分析测定技术领域，具体涉及一种基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法。
背景技术
研究表明许多疾病，如慢性肾衰竭、动脉粥样硬化，都与氧化应激所产生的活性氧关系密切。当细胞受到外界有害因素刺激时，线粒体中的活性氧量急剧增加。随着活性氧的积累，某些蛋白质的功能会受到很大影响。鉴于活性氧的产生涉及多种来源，以及酶促和非酶促氧化剂防御的多样性，氧化应激的条件通常是基于大分子存在过量氧化损伤的推断。在众多氧化产物中，蛋白质的羰基化是用于推断氧化应激的最广泛使用的损伤类型。在病理或衰老状态下，蛋白酶体和溶酶体降解羰基蛋白的能力下降，导致羰基蛋白降解不完全，然后羰基蛋白在细胞内积累，降低细胞活力，损伤细胞和组织，诱发病理变化，甚至导致细胞死亡。羰基化修饰的蛋白质具有非酶促、不可逆、化学性质相对稳定、形成较早等特点，因此羰基蛋白被认为是测量细胞损伤、衰老和一些年龄相关疾病中氧化应激水平的生物标志物。当蛋白质的羰基化达到一定的临界点时，将会引起相应的生理和病理变化，因此，对蛋白质羰基化程度进行检测显得更为重要。
由于羰基没有可区分的紫外或可见、分光光度吸收/荧光特性，因此只能使用特定的化学探针来检测和定量，即通过一些特殊的化学试剂与羰基特异性结合，对其进行保护，然后通过相应的实验手段检测衍生试剂的信息，从而得到羰基蛋白的信息。目前已经开发了几种探针来检测蛋白质羰基化程度，应用较为广泛的是2,4二硝基苯肼(DNPH)。DNPH分析是一种方法的早期应用。DNPH作为衍生化试剂，这种基于酰亚胺的反应在DNPH和蛋白质的羰基之间形成一个腙，在375nm处产生强烈的紫外线吸收。然而，DNPH难溶，在溶液中容易不稳定，通常需要强酸来溶解，这反过来又会导致蛋白质变性和沉淀。此外，一些蛋白(如细胞色素c)在375nm附近的紫外吸收可能会干扰结果，而且DNPH有毒、易燃和易爆的缺点，也使得实验存在一定的危险性。
近年来，Lynn Gennar等人使用吉拉德试剂T(GRT)和质谱技术对羰基化蛋白质进行检测，并能够检测单克隆抗体上的羰基修饰位点。目前方法的主要局限是由于实验中所需的GRP或GRT含量通常比样品含量大1万多倍，导致反应效率低。在后期阶段需要进行多次分离操作，这种低效率可能导致实验不准确，并且该方法在混合生物样品中的适用性可能有限。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，本发明该方法利用4-氟苯甲酰肼作为探针，采用一维19F核磁共振谱来快速检测蛋白质是否发生羰基化修饰，操作简单，准确度和精确度高。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，包括如下步骤：
S1、将蛋白质溶解于磷酸盐缓冲液中，配制成蛋白质溶液；
S2、将4-氟苯甲酰肼溶解于二甲基亚砜中，配制成4-氟苯甲酰肼溶液；
S3、将H2O2加入到蛋白质溶液中，静置反应15-30min，除去多余的H2O2，得到羰基化蛋白质溶液；
S4、将4-氟苯甲酰肼溶液加入到羰基化蛋白质溶液中，4-氟苯甲酰肼与蛋白质的摩尔比为1:300-600，在25-37℃下反应2-4h，反应完成后，去除游离的4-氟苯甲酰肼，得到待测样品溶液；
S5、向待测样品溶液中加入锁场试剂，随后转移到核磁管中进行19F NMR实验，得到一维19F核磁谱图，在一维19F核磁谱图上，除了游离态4-氟苯甲酰肼的NMR信号外，还出现了结合态4-氟苯甲酰肼的NMR信号，根据结合态4-氟苯甲酰肼的NMR信号，可以判断蛋白质发生了羰基化修饰，并且根据结合态4-氟苯甲酰肼NMR信号的强度，可以推断出蛋白质的羰基化程度。
进一步，所述的磷酸盐缓冲液为pH＝5.0的磷酸钠缓冲液。
进一步，所述的蛋白质溶液中蛋白质浓度为0.01-0.1mM。
进一步，所述步骤S3中，将H2O2加入到蛋白质溶液中，H2O2的终浓度为0.1-0.5mM。
进一步，所述步骤S3中，H2O2通过脱盐柱去除。
进一步，所述步骤S4中，将4-氟苯甲酰肼溶液加入到羰基化蛋白质溶液中，4-氟苯甲酰肼的终浓度为4-6mM。
进一步，所述步骤S4中，游离的4-氟苯甲酰肼通过脱盐柱去除或浓缩管超滤去除。
进一步，所述的锁场试剂为重水。进一步，所述的蛋白质为纯蛋白质或者从生物学样品中提取出的蛋白质。
与现有技术相比，本发明的优点与有益效果在于：
1、本发明利用4-氟苯甲酰肼检测蛋白质中的羰基化，4-氟苯甲酰肼由于其特殊结构可以与羰基化的蛋白质结合，通过19F NMR实验检测结合态4-氟苯甲酰肼的NMR信号，反应出待测蛋白质是否发生了羰基化，以及羰基化修饰的程度，具体的机理如图1所示。实验结果表明，4-氟苯甲酰肼结合了羰基化蛋白和未结合羰基化蛋白的19F信号清晰分散，很容易对蛋白质羰基化修饰程度做出判断。
2、该方法只需将待测蛋白质和4-氟苯甲酰肼探针进行反应，除去未反应的4-氟苯甲酰肼，加入少量的锁场试剂，转移到核磁管中进行19F NMR实验即可检测。可见，该方法具有简单、操作简单易行、检测成本低、安全无毒以及无背景干扰等优点，可准确快速地检测出患者血浆蛋白质的羰基化程度。
3、本发明适用于检测复杂体系中蛋白质的羰基化水平，从而可以判断相关疾病的氧化损伤程度，如慢性肾衰竭，阿尔兹海默症等。
附图说明
图1为羰基化修饰蛋白质与4-氟苯甲酰肼的结合后被NMR检测的机理示意图。
图2为实施例1中4-氟苯甲酰肼结合羰基化细胞色素c的一维19F核磁谱图。
图3为实施例2中4-氟苯甲酰肼结合羰基化人血清白蛋白的一维19F核磁谱图。
图4为实施例3中4-羟基壬烯醛与4-氟苯甲酰肼反应产物的一维19F核磁谱图。
图5为肾衰竭临床2期和5期患者的血浆蛋白质羰基化程度的比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1、称取适量的细胞色素c，溶解于20mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)中，配制成细胞色素c浓度为0.01mM的细胞色素c溶液。
2、将4-氟苯甲酰肼溶解于二甲基亚砜中，配制成4-氟苯甲酰肼溶液。
3、分别取5mL的细胞色素c溶液到15mL EP管A和15mL EP管B中。将EP管A中的细胞色素c做如下处理：往EP管A加入H2O2，H2O2的终浓度为0.5mM，接着静置反应30min，反应完成后，通过脱盐柱除去多余的H2O2，最后向EP管A中加入磷酸钠缓冲液(pH＝5.0)，使EP管A的液体体积恢复至5mL，得到羰基化细胞色素c溶液。EP管B中的细胞色素c不做任何处理，作为对照。
4、分别取适量4-氟苯甲酰肼溶液加入到EP管A和EP管B中并混匀，EP管A和EP管B中4-氟苯甲酰肼的终浓度均为5mM，将EP管A和EP管B中的反应液做如下处理：置于37℃下静置反应3h，反应完成后，通过脱盐柱(洗脱液为20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0))完全除去游离的4-氟苯甲酰肼或通过10kDa浓缩管超滤2-3次去除大部分4-氟苯甲酰肼(第2次、第3次超滤时用pH 7.0磷酸钠缓冲液代替pH 5.0磷酸钠缓冲液)，随后浓缩至液体体积为450μL。经过上述处理后，分别得到实验样品和对照样品。
5、将实验样品和对照样品分别做如下处理：加入50μL的重水，混匀后转移至5mm的核磁管用进行19F NMR实验。使用TopSpin 4.0软件对实验数据进行处理，得到羰基化细胞色素c与4-氟苯甲酰肼结合以及细胞色素c未与4-氟苯甲酰肼结合的一维19F核磁谱图，如图2所示。
由图2可知，4-氟苯甲酰肼上仅有一个氟，因此，在一维19F NMR谱图上只有一个游离态4-氟苯甲酰肼的NMR信号(-108.0ppm)。当4-氟苯甲酰肼与没有发生羰基化修饰的细胞色素c混合，由于没有发生反应，因此仍然只有一个游离态4-氟苯甲酰肼的NMR信号，并且将细胞色素c完全纯化后再进行检测也没有其他的19F NMR信号。而当细胞色素c用H2O2氧化并彻底去除H2O2后，再与4-氟苯甲酰肼混合孵育后完全去除游离的4-氟苯甲酰肼，将得到的羰基化细胞色素c进行实验，19F NMR谱上-106.2ppm处出现了一个较宽的信号，该信号为结合在羰基化细胞色素c上的4-氟苯甲酰肼的信号，表明细胞色素c氧化发生了羰基化修饰并被成功检测到。当仅仅通过超滤2-3次不能完全分离4-氟苯甲酰肼时，可以明显观察到结合态4-氟苯甲酰肼与游离态4-氟苯甲酰肼的信号2个19F NMR信号，可以轻易区分。此外，由于细胞色素c中没有任何19F的信号，因此不会有背景干扰。
本实施例中用19F核磁共振方法检测细胞色素c羰基化实际上是检测细胞色素c上某些发生羰基化的氨基酸，因此，本发明以细胞色素c为例来检测该方法的有效性。
实施例2
1、称取适量的人血清白蛋白HAS，溶解于20mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)中，配制成人血清白蛋白浓度为0.01mM的人血清白蛋白溶液。
2、将4-氟苯甲酰肼溶解于二甲基亚砜中，配制成4-氟苯甲酰肼溶液。
3、分别取5mL的人血清白蛋白溶液到15mL EP管C和15mL EP管D中。将EP管C中的人血清白蛋白做如下处理：往EP管C加入H2O2，H2O2的终浓度为0.5mM，接着静置反应30min，反应完成后，通过脱盐柱除去多余的H2O2，最后向EP管C中加入磷酸钠缓冲液(pH 5.0)，使EP管C的液体体积恢复至5mL，得到羰基化人血清白蛋白溶液。EP管D中的人血清白蛋白不做任何处理，作为对照。
4、分别取适量4-氟苯甲酰肼溶液加入到EP管C和EP管D中并混匀，EP管C和EP管D中4-氟苯甲酰肼的终浓度均为5mM，将EP管C和EP管D中的反应液做如下处理：置于37℃下静置反应3h，反应完成后，通过脱盐柱(洗脱液为20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0))完全除去游离的4-氟苯甲酰肼或通过10kDa浓缩管超滤2-3次去除大部分4-氟苯甲酰肼，随后浓缩至液体体积为450μL。经过上述处理后，分别得到实验样品和对照样品。
5、将实验样品和对照样品分别做如下处理：加入50μL的重水，混匀后转移至5mm的核磁管用进行19F NMR实验。使用TopSpin 4.0软件对实验数据进行处理，得到羰基化人血清白蛋白与4-氟苯甲酰肼结合以及人血清白蛋白未与4-氟苯甲酰肼结合的一维19F核磁谱图，如图3所示。
由图3可知，当HSA没有发生羰基化修饰时，19F核磁谱图上只有游离态4-氟苯甲酰肼的信号，当HSA发生羰基化后，增加了一个结合态的4-氟苯甲酰肼的信号，据此可以判断出HSA与H2O2混合后发生了羰基化修饰。
另外，细胞色素c的分子量只有12kDa，而HSA的分子量约为65kDa，这表明4-氟苯甲酰肼对于不同种类、不同分子量大小的蛋白质均起到了非常好的检测效果。
本实施例中用19F核磁共振方法检测人血清白蛋白羰基化实际上是检测人血清白蛋白上某些发生羰基化的氨基酸，因此，本发明以人血清白蛋白为例来检测该方法的有效性。
实施例3
1、称取适量的4-羟基壬烯醛，溶解于20mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)中，配制成4-羟基壬烯醛浓度为0.01mM的4-羟基壬烯醛溶液。
2、将4-氟苯甲酰肼溶解于二甲基亚砜中，配制成4-氟苯甲酰肼溶液。
3、将4-氟苯甲酰肼溶液加入4-羟基壬烯醛溶液中，使4-氟苯甲酰肼的终浓度均为0.1mM，混匀后置于37℃下静置反应3h，反应完成后，将所得的混合产物浓缩至体积为450μL，得到待测样品。
5、向待测样品中加入50μL的重水，混匀后转移至5mm的核磁管用进行19F NMR实验，使用TopSpin 4.0软件对实验数据进行处理，得到4-羟基壬烯醛与4-氟苯甲酰肼反应产物的一维19F核磁谱图，如图4所示。
由图4可知，当4-羟基壬烯醛与4-氟苯甲酰肼反应后，可以看到结合态的4-氟苯甲酰肼的NMR信号，且该信号可与游离态的4-氟苯甲酰肼的NMR信号轻易区分。据此可以判断出4-氟苯甲酰肼可以结合到4-羟基壬烯醛上并被检测到。
另外，细胞色素c的分子量只有12kDa，而HSA的分子量约为65kDa，这表明4-氟苯甲酰肼对于不同种类、不同分子量大小的蛋白质均起到了非常好的检测效果。
本实施例中用19F核磁共振方法检测氧化应激时血清中含量升高的小分子醛类4-羟基壬烯醛，因此，本发明以4-羟基壬烯醛为例来检测该方法的有效性。
实施例4
1、吸取适量的肾衰竭临床2期患者的血浆，用20mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)稀释10倍，得到血浆样品A；
2、吸取适量的肾衰竭临床5期患者的血浆，用20mM磷酸钠缓冲液(pH 5.0)稀释10倍，得到血浆样品B；
3、将4-氟苯甲酰肼溶解于二甲基亚砜中，配制成4-氟苯甲酰肼溶液。
4、将血浆样品A和血浆样品B分别做如下处理：将4-氟苯甲酰肼溶液加入血浆样品中，使4-氟苯甲酰肼的终浓度均为5mM，混匀后置于37℃下静置反应3h，反应完成后，通过10kDa浓缩管超滤2-3次去除大部分4-氟苯甲酰肼，随后浓缩至液体体积为450μL。经过上述处理后，分别得到实验样品A和实验样品B。
5、将实验样品A和实验样品B分别做如下处理：加入50μL的重水，混匀后转移至5mm的核磁管用进行19F NMR实验。使用TopSpin 4.0软件对实验数据进行处理得到血浆样品A与4-氟苯甲酰肼结合以及血浆样品B与4-氟苯甲酰肼结合的一维19F核磁谱图，如图5所示。
由于肾衰竭患者血浆中的成分复杂，19F谱上出现了多个NMR信号，除去游离态4-氟苯甲酰肼的NMR信号，将其他NMR信号进行积分处理，通过氟化钠定标，即可比较血浆蛋白羰基化程度的强弱。从图5中可以看出，肾衰竭临床5期患者的积分强度明显大于2期患者，据此可以判断出临床5期患者血浆中蛋白质的羰基化程度大于临床2期患者，这与临床诊断的结果也是相符的，表明本发明的方法的有效性。
另外，由于临床血浆样本里的成分十分复杂，加入到血浆中的4-氟苯甲酰肼可能会与多种羰基化的物质有结合，至于19F NMR谱上-109.5-116.5ppm处的信号，我们暂时也不清楚具体结合的蛋白种类，因此统一归属为结合态的4-氟苯甲酰肼的信号。
Claims (9)
1.一种基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、将蛋白质溶解于磷酸盐缓冲液中，配制成蛋白质溶液；
S2、将4-氟苯甲酰肼溶解于二甲基亚砜中，配制成4-氟苯甲酰肼溶液；
S3、将H2O2加入到蛋白质溶液中，静置反应15-30min，除去多余的H2O2，得到羰基化蛋白质溶液；
S4、将4-氟苯甲酰肼溶液加入到羰基化蛋白质溶液中，4-氟苯甲酰肼与蛋白质的摩尔比为1:300-600，在25-37℃下反应2-4h，反应完成后，去除游离的4-氟苯甲酰肼，得到待测样品溶液；
S5、向待测样品溶液中加入锁场试剂，随后转移到核磁管中进行19F NMR实验，得到一维19F核磁谱图，在一维19F核磁谱图上，除了游离态4-氟苯甲酰肼的NMR信号外，还出现了结合态4-氟苯甲酰肼的NMR信号，根据结合态4-氟苯甲酰肼的NMR信号，可以判断蛋白质发生了羰基化修饰，并且根据结合态4-氟苯甲酰肼NMR信号的强度，可以推断出蛋白质的羰基化程度。
2.根据权利要求1所述的基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液为pH＝5.0的磷酸钠缓冲液。
3.根据权利要求1所述的基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于：所述的蛋白质溶液中蛋白质浓度为0.01-0.1mM。
4.根据权利要求1所述的基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于：所述步骤S3中，将H2O2加入到蛋白质溶液中，H2O2的终浓度为0.1-0.5mM。
5.根据权利要求1所述的基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于：所述步骤S3中，H2O2通过脱盐柱去除。
6.根据权利要求1所述的基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于：所述步骤S4中，将4-氟苯甲酰肼溶液加入到羰基化蛋白质溶液中，4-氟苯甲酰肼的终浓度为4-6mM。
7.根据权利要求1所述的基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于：所述步骤S4中，游离的4-氟苯甲酰肼通过脱盐柱去除或浓缩管超滤去除。
8.根据权利要求1所述的基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于：所述的锁场试剂为重水。
9.根据权利要求1所述的基于19F核磁共振检测蛋白质羰基化的方法，其特征在于：所述的蛋白质为纯蛋白质或者从生物学样品中提取出的蛋白质。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311624520.5A CN117630077A (zh) | 2023-11-30 | 2023-11-30 | 一种基于19f核磁共振检测蛋白质羰基化的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311624520.5A CN117630077A (zh) | 2023-11-30 | 2023-11-30 | 一种基于19f核磁共振检测蛋白质羰基化的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117630077A true CN117630077A (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=90028315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311624520.5A Pending CN117630077A (zh) | 2023-11-30 | 2023-11-30 | 一种基于19f核磁共振检测蛋白质羰基化的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117630077A (zh) |
-
2023
- 2023-11-30 CN CN202311624520.5A patent/CN117630077A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qu et al. | Validated quantitation of underivatized amino acids in human blood samples by volatile ion-pair reversed-phase liquid chromatography coupled to isotope dilution tandem mass spectrometry | |
| Jing et al. | Rapid and selective determination of urinary lysozyme based on magnetic molecularly imprinted polymers extraction followed by chemiluminescence detection | |
| Jensen et al. | Hydrogen exchange: a sensitive analytical window into protein conformation and dynamics | |
| JP7431933B2 (ja) | 質量分析を使用する低存在量のポリペプチドの絶対定量のための方法 | |
| Chen et al. | Elevated levels of oxidative nucleic acid modification markers in urine from gastric cancer patients: quantitative analysis by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
| Haiber et al. | Two-dimensional NMR studies of size fractionated Suwannee River fulvic and humic acid reference | |
| CN115678994A (zh) | 一种生物标志物组合、含其的试剂及其应用 | |
| EP2052254A2 (de) | Biomarker für leberentzündung | |
| Supraja et al. | Label-free, ultrasensitive and rapid detection of FDA-approved TBI specific UCHL1 biomarker in plasma using MWCNT-PPY nanocomposite as bio-electrical transducer: A step closer to point-of-care diagnosis of TBI | |
| JP2022514379A (ja) | Ｌｃ－ｍｓｍｓを使用してテストステロンを測定するための方法 | |
| El Hamd et al. | An integrative analytical approach designed for feasible tranexamic acid assay using O‐phthalaldehyde as a fluorogenic probe: applications to tablets, ampoules, and urine | |
| CN117630077A (zh) | 一种基于19f核磁共振检测蛋白质羰基化的方法 | |
| Tremblay et al. | Adding polyvinylpyrrolidone to low level protein samples significantly improves peptide recovery in FASP digests: An inexpensive and simple modification to the FASP protocol | |
| CN116973488A (zh) | 一种血清中25-羟基维生素d的检测方法 | |
| Tuchtenhagen et al. | A novel approach for the determination of exchangeable copper in serum using protein precipitation | |
| Ranganathan et al. | Assessment of protein stability in cerebrospinal fluid using surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry protein profiling | |
| WO2020167411A1 (en) | Calibrators and controls for the determination of percent glycated hemoglobin in a patient's liquid test sample | |
| US8729464B2 (en) | Method for determining stage of chronic kidney disease, device therefor and method for operating the same | |
| Laurichesse et al. | Histamine quantification in human plasma using high resolution accurate mass LC–MS technology | |
| CN112898970A (zh) | 一种用于检测黄体酮碳点的制备及应用 | |
| Beeren et al. | Supramolecular chemical shift reagents inducing conformational transitions: NMR analysis of carbohydrate homooligomer mixtures | |
| Yi et al. | High-throughput carbonyl content method of therapeutic mAb using size-exclusion chromatography with ultraviolet and fluorescence detection | |
| Vuckovic et al. | 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy-based methods for the quantification of proteins in urine | |
| KR20150109995A (ko) | Ｌｃ-ｍｓ／ｍｓ를 이용한 생체시료 내 포르피린 검출 방법 | |
| CN115144517B (zh) | 一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |