CN117625684A - 丹参SmWRKY33蛋白及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用 - Google Patents
丹参SmWRKY33蛋白及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用 Download PDFInfo
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公布了丹参SmWRKY33蛋白及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用。本发明具体地公开了氨基酸是SEQ ID No.1的蛋白质、编码基因、相关生物材料及其在调控植物抗逆性中的应用。本发明通过将来源于丹参的SmWRKY33基因导入受体丹参中，得到过表达SmWRKY33基因的转基因丹参植株，耐盐性鉴定和各项生理生化指标测定结果表明，其与未转基因对照丹参相比，过表达SmWRKY33基因的转基因丹参植株在盐胁迫条件下，能显著提高了丹参的抗逆性，本发明所提供的SmWRKY33蛋白及其编码基因在调控丹参耐盐中具有重要的理论意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及丹参SmWRKY33蛋白及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用。
背景技术
丹参(学名：Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，是我国的大宗药材之一。2020版《中华人民共和国药典》中记载丹参以干燥根茎入药，具有活血祛瘀，清心除烦，通经止痛等功效，用于治疗胸痹心痛，月经不调，心烦不眠等病症，临床上常用于心血管疾病的治疗。丹参的发挥药效的成分主要有两大类，其中包括水溶性的丹酚酸类化合物和脂溶性的丹参酮类化合物。此外，丹参生命周期短，基因组规模小，成为研究各种环境胁迫与表型响应的模型植物。随着丹参市场的不断扩大，需求量大量增加，野生丹参远不能满足市场需要。但在人工种植过程中，干旱会极大影响丹参的生长和品质。刘大会等通过研究不同土壤和水分对丹参植株的影响，结果发现严重干旱和过多水分会极大影响丹参植株生长，导致丹参酮成分和丹酚酸B含量与累积量大幅降低，进而影响丹参的产量和品质。因此，研如何提高丹参的抗旱性和耐盐性，培育丹参抗逆品种，成为一个热门的话题。
WRKY转录因子作为植物转录因子(TF)的一个大家庭，参与了植物在生长发育、防御调控和逆境反应等多种生物学过程，并在其中起着积极或消极的调节作用。WRKYs通常由两个结构组成，包括高度保守的WRKYGQK七肽结构域(位于其N端的WRKY结构域)和C端的锌指基序。WRKY结构域能和顺式作用元件W-box(C/T)TGAC(C/T)以及RAV1A和WLS元件特异性结合，说明它们具有不同的结合方式，并参与下游目的基因调控。Yang等从小麦克隆出TaWRKY1-2D基因，研究表明TaWRKY1-2D蛋白可能参与小麦中植物激素生物合成、转录后基因调控、代谢途径和蛋白激酶信号传导，调节下游基因的表达以影响小麦生长机制，表明TaWRKY1-2D基因可以提高小麦的耐旱性。Cai等从玉米中克隆出ZmWRKY17基因，结果发现ZmWRKY17在拟南芥中通过抑制一些ABA和逆境反应基因的表达，提高了对盐胁迫的敏感性，降低了对ABA的敏感性，以此来提高植物的耐盐性。Xiang等以拟南芥为模式植物，从中克隆出MFWRKY70基因，研究表明发现MFWRKY70基因定位于细胞核，通过该基因促进根系生长和保水，极大提高了根系对干旱、渗透和盐胁迫的耐受性，以及在应激条件下增强抗氧化酶系统和维持活性氧(ROS)稳态和膜脂稳定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物(如丹参)的抗逆性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：
D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；
D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育植物抗逆性的产品中的应用；
D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗逆植物中的应用；
D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗逆植物的产品中的应用；
D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质名称为SmWRKY33，可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基
酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白
(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质SmWRKY33的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质SmWRKY33的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质SmWRKY33且具有蛋白质SmWRKY33功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质SmWRKY33。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
所述调控基因表达的物质具体可为本文B1)-B3)中任一所述的生物材料。
进一步地，所述调控基因表达的物质可为提高或上调所述蛋白质SmWRKY33的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。
进一步地，所述调控基因表达的物质还可为抑制或降低或下调所述蛋白质SmWRKY33的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。
上述应用中，所述蛋白质SmWRKY33可来源于丹参(Salvia miltiorrhiza)。
进一步地，所述蛋白质SmWRKY33可为丹参抗逆相关蛋白SmWRKY33。
进一步地，所述蛋白质SmWRKY33可为丹参耐盐相关蛋白SmWRKY33。
本发明还提供了与所述蛋白质SmWRKY33相关的生物材料的应用，所述应用可为下
述任一种：
E1)与所述蛋白质SmWRKY33相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；
E2)与所述蛋白质SmWRKY33相关的生物材料在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；
E3)与所述蛋白质SmWRKY33相关的生物材料在培育抗逆植物中的应用；
E4)与所述蛋白质SmWRKY33相关的生物材料在制备培育抗逆植物的产品中的应用；
E5)与所述蛋白质SmWRKY33相关的生物材料在植物育种中的应用；
所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质SmWRKY33的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：
C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
SEQ ID No.2所示的DNA分子(SmWRKY33基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质SmWRKY33。
SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为蛋白质SmWRKY33编码基因(CDS)的核苷酸序列。
B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
B1)所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
本发明所述的蛋白质SmWRKY33的基因(SmWRKY33基因)可以为任意能够编码蛋白质SmWRKY33的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
所述表达盒包括启动子、编码所述蛋白SmWRKY33的核酸分子和终止子，所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子，所述终止子可为NOS终止子或OCS polyA终止子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pTOPO-Blunt载体和/或pCAMBIA1300载体。
可用现有的植物表达载体构建含有SmWRKY33基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用SmWRKY33基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因和荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SmWRKY33基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得抗逆性高于所述受体植物的抗逆植物。携带SmWRKY33基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。
所述重组载体具体可为重组载体pCB-SmWRKY33。
所述重组载体pCB-SmWRKY33是将pCAMBIA1300载体的限制性内切酶Kpn I和BamHI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCB-SmWRKY33表达序列表中SEQ ID No.1所示的SmWRKY33蛋白。
所述重组微生物可通过将所述重组载体导入微生物得到。
所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/pCB-SmWRKY33。
所述重组农杆菌EHA105/pCB-SmWRKY33是将所述重组载体pCB-SmWRKY33导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。
本发明还提供了一种培育抗逆植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质SmWRKY33的含量和/或活性，得到抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。
上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质SmWRKY33的含量和/或活性可通过提高目的植物中所述蛋白质SmWRKY33的编码基因的表达量实现。
上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质SmWRKY33的编码基因的表达量可通过将所述蛋白质SmWRKY33的编码基因导入所述目的植物实现。
上述方法中，所述抗逆植物可为抗逆性(如耐盐性)提高(上调)的植物。
上述方法中，所述蛋白质SmWRKY33的编码基因可为下述任一种：
F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质SmWRKY33的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入所述目的植物实现。
在本发明的一个实施方案中，所述培育抗逆植物的方法包括如下步骤：
(1)构建包含SEQ ID No.2所示DNA分子的重组载体；
(2)将步骤(1)构建的重组载体导入目的植物(如作物或丹参)中；
(3)经筛选和鉴定获得所述抗逆植物。
所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、生物射弹(biolistic)方法、电穿孔或in planta技术。
上述方法中，所述植物可为下述任一种：
G1)双子叶植物；
G2)唇形科植物；
G3)鼠尾草属植物；
G4)丹参组植物；
G5)丹参。
所述丹参具体可为丹参品种冀丹1号。
所述蛋白质SmWRKY33，和/或，所述生物材料也在本发明的保护范围内。
本文中，所述抗逆性可为耐盐性。
本文中，所述植物可为作物(如农作物)。
本发明还提供了所述培育抗逆植物的方法在创制抗逆植物中的应用，和/或，在植物育种或植物种质资源改良中的应用。
本文所述植物育种可为作物抗逆育种。
所述抗逆植物可为耐盐植物等但不限于此。
本文所述调控植物抗逆性可为上调(提高)或下调(降低)植物抗逆性。
进一步地，所述调控植物抗逆性可为上调(提高)或下调(降低)丹参的耐盐性。
本文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述SmWRKY33基因转化目的植物或将所述SmWRKY33基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明通过将来源于丹参(Salvia miltiorrhiza)的调控植物抗逆性的SmWRKY33基因导入到受体植物丹参品种冀丹1号中，得到了过表达SmWRKY33基因的转基因丹参植株，将转基因植株进行耐盐性鉴定，综合各项生理生化指标测定结果表明，与未转基因的对照丹参品种冀丹1号(WT)相比，过表达SmWRKY33基因的转基因丹参植株在盐胁迫条件下，均显著提高了丹参的抗逆性，即过表达SmWRKY33基因的转基因丹参植株的耐盐性显著提高。
实验证明，本发明的SmWRKY33蛋白及其编码基因SmWRKY33可以调控植物的耐盐性。利用本发明提供的丹参耐盐相关蛋白SmWRKY33及其编码基因能提高植物的抗逆性：在丹参中过表达SmWRKY33基因可提高丹参的耐盐性。因此，耐盐相关蛋白SmWRKY33及其编码基因在调控植物耐盐性中具有重要的理论意义和实用价值。
附图说明
图1为丹参拟转基因植株的PCR扩增结果。
图2为SmWRKY33基因在丹参转基因阳性植株中的表达情况。
图3为盐环境下转基因丹参植株的生长状态。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与耐盐相关的蛋白及其编码基因的获得
丹参(Salvia miltiorrhiza)SmWRKY33蛋白cDNA的克隆，以丹参品种冀丹1号为实验材料。
1、丹参总RNA提取
取0.1g丹参幼嫩叶片在液氮中研磨成粉状，加入2mL离心管，用TIANGEN的RNApreppure植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP432)提取丹参总RNA，试剂盒中包括：裂解液RL，去蛋白液RW1，漂洗液RW，RNase-Free ddH2O，RNase-Free吸附柱CR3，RNase-Free过滤柱CS，DNase I，缓冲液RDD，RNase-Free离心管，RNase-Free收集管。取10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260)和纯度(OD260/OD280)，提取的丹参品种冀丹1号总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，所得mRNA符合实验要求，可用于丹参SmWRKY33蛋白cDNA全长的克隆。
2、SmWRKY33蛋白cDNA的全长克隆
以本实验室构建的丹参转录组数据进行SmWRKY33基因的引物设计，进行SmWRKY33蛋白cDNA的全长克隆。
(1)SmWRKY33蛋白cDNA的全长克隆
根据丹参转录组数据库获得SmWRKY33基因的unigene序列，设计SmWRKY33基因的5′-端和3′-端引物进行PCR反应。引物序列如下：
引物1：5’-ATGGCTTCTTCTAGCGGAAGC-3’
引物2：5’-TCAGCTGAGGAAAGAGTCGAA-3’
PCR得到SmWRKY33基因ORF全长，回收后连接pTOPO-Blunt载体进行TA克隆，以M13F/M13R通用引物进行测序。
以上述提取的总RNA经QuantScript RTKit(TIANGEN，Beijing)反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1635bp长度的扩增片段。
经过测序，该PCR产物具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸，该序列所示的基因命名为SmWRKY33，该基因的编码区为序列表中SEQ ID No.2自5’端第1-1635位核苷酸；序列表中SEQ ID No.2由1635个碱基组成；该基因编码的蛋白命名为SmWRKY33，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No.1；序列表中SEQ ID No.1由544个氨基酸组成。
实施例2、丹参SmWRKY33蛋白在提高植物耐盐性的应用
1、植物表达载体的构建
根据丹参SmWRKY33蛋白cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物分别引入BamH I和Kpn I酶切位点，引物序列如下：
引物3：5’-GGTACC ATGGCTTCTTCTAGCGGAAGC-3’(下划线部分为Kpn I酶切位点)，
引物4：5’-GGATCC TCAGCTGAGGAAAGAGTCGAA-3’(下划线部分为BamH I酶切位点)。
以人工合成的序列表中SEQ ID No.2为模板，PCR扩增后，将产物连接到pTOPO-Blunt载体(购自北京艾德莱生物科技有限公司，产品目录号为CV16)上，命名为pTOPO-SmWRKY33载体，进行M13F/M13R的测序，保证丹参SmWRKY33蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。
用Kpn I和BamH I酶切表达载体pCambia1300-GFP，回收载体大片段，同时，用KpnI和BamH I酶切载体pTOPO-SmWRKY33，回收约1.6kb中间片段，将回收的载体大片段与约1.6kb中间片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01)，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，在载体pCambia1300的Kpn I和BamH I酶切位点间插入了序列表中SEQ IDNo.2自5′端第1位-第1635位所示的序列，说明重组载体构建正确，将重组载体命名为pCB-SmWRKY33。
2、植物表达载体转化农杆菌
(1)从-80℃低温冰箱中取出200μL EHA105感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的植物表达载体pCB-SmWRKY33，混匀。
(2)液氮冷冻1min，37℃温育5min。
(3)加入800μL LB液体培养基，28℃培养2-6h。
(4)取100μL菌液至LB固体培养基上(含100μg/mL利福平(Rif)、50μg/mL卡那霉素(Kan))，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28℃培养2d。
(5)取PCR鉴定呈阳性的单菌落，接种到含有100μg/mL Rif、50μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释50倍备用，即得到导入pCB-SmWRKY33载体的农杆菌菌液。
3、转SmWRKY33基因的丹参遗传转化及再生
用农杆菌介导的方法将SmWRKY33的cDNA的编码序列导入到丹参中。具体方法如下：
(1)取经过继代培养4-6周的丹参无菌苗叶片，在超净台中切下5×5的丹参叶盘(去掉主叶脉)，悬浮于上述步骤2制备好的EHA105/pCB-SmWRKY33农杆菌菌液中，10分钟后将侵染后的丹参叶盘接种培养在固体培养基(1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA的MS)上，28℃黑暗共培养3天。
(2)将共培养3天后的丹参叶盘用含有500mg/L Car、1.0mg/L6-BA、0.1mg/L NAA的MS液体培养基洗涤2次后，将丹参叶盘转至含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、100mg/LKam的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为28℃，每天13小时、3000lx的光照。培养4-6周后将丹参不定芽转移到含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、100mg/L Kam的1/2MS培养基进行不定根诱导，培养条件为为28℃，每天13小时、3000lx的光照。4-8周后行成完整的再生植株，得到拟转SmWRKY33基因的丹参植株。
(3)用CTAB法提取拟转基因丹参植株和丹参对照植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的引物为：引物5(带有载体序列)：5’-AATTCGAGCTCGGTACCATGGCTTCTTCTAGCGGAAGC-3’，引物6(带有载体序列)：5’-GTCGACTCTAGAGGATCCTCAGCTGAGGAAAGAGTCGAA-3’。在0.2mL Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均为1μL、模板DNA(50ng/μL)2μL、Taq DNA聚合酶1μL，加H2O至总体积20μL。反应程序为94℃变性4min，58℃复性1min，72℃延伸2min，共35个循环。
实验结果见图1(M为DNA分子Marker，W为水，P为质粒，WT为丹参品种冀丹1号野生型植株)，结果表明共获得4株转基因阳性植株，分别命名为OE1-OE4。将经鉴定为转基因的丹参植株扩繁，进行耐盐性鉴定及相关生理指标的测定。
4、检测SmWRKY33基因的相对表达量
将所有阳性转基因植株和对照植株进行继代培养，注意所有植株的培养环境和培养条件要保持一致。一段时间后取整株或相同部位的叶片提取RNA，对其进行反转录，对各株系进行SmWRKY33基因表达量的qRT-PCR测定。统一稀释各样品cDNA的浓度到100ng/μL，qRT-PCR所采用的设备为ABIPRISM 7500(操作软件为7500和7500Fast Real-Time PCRSystems,v2.0.1,USA)，参照全式金PerfectStart Green qPCR SuperMix试剂盒中说明书进行操作，20μL反应体系如下：10μLPerfectStart Green qPCR SuperMix，0.4μL引物-F，0.4μL引物-R，2.0μL cDNA(1ng)，7.2μL ddH2O。扩增条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s,共40个循环；4℃保存。每个反应3次重复，使用2-△△CT法分析丹参SmWRKY33基因表达量。
用于检测SmWRKY33基因的引物如下：
qSmWRKY33-F：5’-GACGACGAGCGACATAGACA-3’
qSmWRKY33-R：5’-GGTGATCACTGCCCTCAAGT-3’
用于检测Actin基因的引物如下：
SmActin-F：5’-TGCTGTGCTGAGGACGATAC-3’
SmActin-R：5’-CCATGAGCCTCCAAACCTAA-3’
SmWRKY33基因的相对表达量的测定结果见图2。结果表明，过表达SmWRKY33基因转基因丹参中SmWRKY33基因的表达量显著高于野生型(受体对照)丹参品种冀丹1号(WT)，差异具有显著性。SmWRKY33基因不但已顺利整合到受体的基因组上，而且能够在转基因丹参中正常转录表达。
5、转基因丹参耐盐性鉴定
5.1表型鉴定
将4株过表达SmWRKY33基因的丹参植株和对照丹参接种在培养基上(MS+IBA0.5mg/L+NAA 0.2mg/L)进行扩繁培养、温室培养一个月后进行盐胁迫，如图3所示，盐胁迫下，转SmWRKY33基因丹参的生长发育状态和生根情况优于对照丹参，鉴定结果表明过量表达SmWRKY33基因能够提供丹参的耐盐性。
5.2SOD、POD、ASA生理生化指标测定
将转基因丹参和对照在温室培养一个月后，用0.4％的NaCl进行逆境处理7天后，取处理叶片利用液氮磨碎，称取0.1g样品后加入1mL提取液，4℃低温离心10min，8000g，得到上清液。按SOD、POD、AsA试剂盒所给步骤进行测定(由苏州科铭生物技术有限公司提供)，每组处理3次重复，结果如表1-3所示。
表1SOD酶活测定
表2POD酶活测定
表3AsA含量测定
5.3MDA含量测定
将处理组的新鲜叶片用液氮磨碎，各取0.1g加入1mL 5％TCA溶液，3次生物学重复。离心机8000r·min-1、离心10min，取上清液，为丙二醛提取液。吸取400μL丙二醛提取液加入400μL提前配好的0.67％的硫代巴比妥酸溶液(TBA)，95℃水浴30min。空白为400ΜlTCA溶液。冷却后吸取200μL加入96孔板，分别测定450nm，532nm，600nm波长下的吸光度。
c/μmol/L＝6.45×(A532-A600)-0.56×A450
表4 MDA含量测定
综上，从表型和SOD、POD活性、MDA和AsA含量显示，过量表达SmWRKY33基因能够提高丹参的耐盐性，说明SmWRKY33蛋白及其编码的基因能够调控植物的抗逆性，尤其是提高植物的耐盐性。
Claims (9)
1.蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
D1)在增加植物耐逆性中的应用；
D2)在培育耐逆植物中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质
A2)在A1)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述抗逆性为提高植物抗盐性，所述植物为双子叶植物丹参。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双子叶植物为丹参。
3.应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
E1)与权利要求1-3中任一所述蛋白质相关的生物材料在增加植物耐盐性中的应用；
E2)与权利要求1-3中任一所述蛋白质相关的生物材料在培育耐盐植物中的应用；
所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码权利要求1-3中任一所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
所述植物为双子叶植物丹参。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B1)所述核酸分子为下述任一种：
C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
5.一种培育耐盐植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1-2中任一所述蛋白质的含量，得到耐盐性高于所述目的植物的耐盐性，所述植物为双子叶植物丹参。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1-2中任一所述蛋白质的含量通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求1-2中任一所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的编码基因为下述任一种：
F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
9.权利要求1-2中任一所述蛋白质，或权利要求3中的B1) - B4)所述的生物材料。
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