CN117624404B - 一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺，包括下列步骤：1）葡聚糖硫酸酯的制备，2）成盐，3）精制，成盐后，向体系中加入还原性试剂，对体系进行60～80℃脱色2～5h；随后将完成脱色的反应液倾倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，烘干得到葡聚糖硫酸钠。本发明合成工艺步骤简单，容易操作，能够有效保证制备的葡聚糖硫酸钠具有良好的化学稳定性与生物活性，在对于诱发溃疡性结肠炎动物模型的构建中起到了缩短建立时间的积极作用。
Description
技术领域
本发明涉及化合物合成技术领域，尤其涉及一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺。
背景技术
葡聚糖硫酸钠（DextranSulfateSodiumSalt，以下简称“DSS”）是用于诱发模型动物溃疡性结肠炎最常见和最有效的化学诱导剂之一。DSS结肠炎模型也被广泛应用于结肠炎相关性结肠癌的研究，如长期溃疡性结肠炎患者发生结肠癌的情况。
DSS的分子量范围、化学稳定性（主要包括纯度、硫含量、旋光度）是影响产品性能的关键指标，因此，不断优化其化学合成工艺是提升产品生物活性的重要途径。
目前普遍认为，36000～50000是结肠炎模型建立的最佳DSS分子量范围。低于此分子量范围，其致炎性作用变弱，超过此分子量范围，吸收变困难，均影响造模效果。
目前DSS的化学合成工艺存在的主要问题是难以有效控制产品的分子量处于36000～50000范围，且成品化学稳定性不佳，在长时间储存过程（储存时间大于12个月）中易氧化而发黄，进而影响其纯度、硫含量、旋光度等关键指标，最终导致下游应用中生物活性的降低。
因此急需一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺来解决现有合成工艺中存在的缺陷。
发明内容
本发明提供一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺以解决上述背景技术中的问题。
本发明的方案是：
一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺，包括下列步骤：
1）葡聚糖硫酸酯的制备，低分子右旋糖酐与溶剂混合反应，体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，加入硫酸银后，分批加入磺化试剂，保温反应，将反应液倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，得到滤饼，滤饼真空干燥，得到葡聚糖硫酸酯；所述葡聚糖硫酸酯的化学反应式如下：
，
2）成盐，氮气保护下，控内温40～60℃，将葡聚糖硫酸酯溶解在去离子水中，滴加1M浓度的NaOH去离子水溶液，调节体系pH至10～12；
3）精制，成盐后，向体系中加入还原性试剂，对体系进行60～80℃脱色2～5h；随后将完成脱色的反应液倾倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，烘干得到葡聚糖硫酸钠；所述葡聚糖硫酸钠的化学反应式如下：
。
作为优选的技术方案，所述1）中低分子右旋糖酐为平均分子量2～4万的低分子右旋糖酐；所述1）中在20～25℃温度环境将所述低分子右旋糖酐与溶剂在氮气保护下加入反应瓶中混合，将体系升温至内温70～90℃，至体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，右旋糖酐全部溶解后，将内温降到50～60℃；
保温反应1～3h后控内温30～40℃，将上述反应液倾倒入醇类溶剂中，体系析出固体，抽滤，得到滤饼为白色或类白色松散粉末状固体葡聚糖硫酸酯，多次使用醇打浆，滤饼真空干燥。
作为优选的技术方案，所述1）中磺化试剂为三氧化硫、三氧化硫吡啶络合物、氨基磺酸、氯磺酸、发烟硫酸中的一种或者两种组合。
作为优选的技术方案，所述溶剂为甲酰胺、水、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或者两种组合。
作为优选的技术方案，所述醇类溶剂为C1～C4的醇类中的一种。
作为优选的技术方案，所述醇类试剂为甲醇或异丙醇中的一种。
作为优选的技术方案，所述还原性试剂为二氧化硫脲、保险粉、羟甲基磺酸钠中的一种。
本发明还公开了一种葡聚糖硫酸钠用于诱发溃疡性结肠炎动物模型的构建方法，包括下列步骤：
1）诱导急性结肠炎动物模型
选取成年动物正常饲养3～7天；使用本发明有效提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺合成的葡聚糖硫酸钠,配置成3～5%的葡聚糖硫酸钠溶液，将其自由饮5天观察，出现急性结肠炎体征;所述动物为小鼠；
2）诱导慢性结肠炎动物模型
选取成年动物正常饲养3～7天；使用本发明有效提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺合成的葡聚糖硫酸钠,配置成2～3%的葡聚糖硫酸钠溶液，将其自由饮3～5天观察症状体征；停止饮用2～3%的葡聚糖硫酸钠溶液，使用正常饮水3～5天；然后继续2～3%葡聚糖硫酸钠溶液自由饮3～5天后观察，出现慢性结肠炎体征；所述动物为小鼠。
作为优选的技术方案，每2天更换一次新配置的葡聚糖硫酸钠溶液，配置中使用本发明提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺合成的葡聚糖硫酸钠。
由于采用了上述技术方案一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺，包括下列步骤：1）葡聚糖硫酸酯的制备，低分子右旋糖酐与溶剂混合反应，体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，加入硫酸银后，分批加入磺化试剂，保温反应，将反应液倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，得到滤饼，滤饼真空干燥，得到葡聚糖硫酸酯；2）成盐，氮气保护下，控内温40～60℃，将葡聚糖硫酸酯溶解在去离子水中，滴加1M浓度的NaOH去离子水溶液，调节体系pH至10～12；3）精制，成盐后，向体系中加入还原性试剂，对体系进行60～80℃脱色2～5h；随后将完成脱色的反应液倾倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，烘干得到葡聚糖硫酸钠。
本发明的优点：
本发明合成过程中右旋糖酐磺化反应的催化剂硫酸银，可稳定控制产物的分子量范围在36000～50000这个目标范围内；本发明在精制过程中使用还原性试剂，经稳定性试验证明，可有效控制精制后产品长时间（大于18个月）室温存放条件下不被氧化而发黄，保证了其化学稳定性（纯度大于99%，硫含量18%-20%，旋光度85o-105o）及生物活性。
另外将本合成工艺制得的产品用于诱发模型动物溃疡性结肠炎时，可缩短造模时间，其中，诱导急性结肠炎模型的建立时间可缩短至1～2周，诱导慢性结肠炎模型的建立时间可缩短至2～3周。
附图说明
图1为本发明的实施例2小鼠体重对比图；
图2为本发明的实施例5的凝胶渗透色谱图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
一、DSS合成实施例：
1、葡聚糖硫酸酯的制备
1）在20～25℃及氮气保护下向将300g右旋糖酐和800g去离子水加入反应瓶中。将体系升温至内温70～75℃，至体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明。
2）右旋糖酐全部溶解后，将内温降到50～55℃，加入0.8g硫酸银作为反应催化剂，然后将500g发烟硫酸分批加入，之后保温反应2hrs。
3）控内温30～35℃，将上述反应液倾倒入2400g异丙醇中，体系析出固体，抽滤，得到滤饼为白色或类白色松散粉末状固体葡聚糖硫酸酯（可多次使用醇打浆），滤饼真空干燥。
2、葡聚糖硫酸钠的制备
1）成盐：氮气保护下，控内温50～60℃，将200g葡聚糖硫酸酯溶解在800g去离子水中，滴加1M浓度的NaOH去离子水溶液，调节体系pH至10～12。NaOH溶液滴加完毕后，体系黄色加深。
2）精制：成盐后，向体系中加入150g保险粉，对体系进行60-80℃脱色3hrs。随后将上述反应液倾倒入3000g异丙醇中，析出固体，抽滤，烘干得到精品。
二、本DSS用于诱发模型动物溃疡性结肠炎实施例如下：
1、诱导急性结肠炎模型
1）选取成年动物正常饲养7天；
2）使用5%DSS自由饮5天观察，出现急性结肠炎体征。
注：每2天更换一次新配置的DSS溶液，所述动物为小鼠。
2、诱导慢性结肠炎模型
1）选取成年动物正常饲养5天；
2）2%DSS自由饮5天观察症状体征；
3）停止饮用DSS，改正常饮水5天；
4）重复2%DSS自由饮5天观察，出现慢性结肠炎体征。
注：每2天更换一次新配置的DSS溶液，所述动物为小鼠。
实施例2
喂食本发明制备产品与对比产品（其中对比组1产品为Sigma Aldrich公司DSS产品、对比组2产品为上海翌圣公司DSS产品、对比组3产品为大连美仑生物公司DSS产品）对小鼠体重（急性结肠炎相关症状）的影响：
对小鼠正常喂食并自由饮用含有5%(wt/wt)的DSS水溶液，持续一周后处理。每天监测小鼠体重，记录变化趋势。图1中表示方法为SD标准差。
实施例3
1）葡聚糖硫酸酯的制备，低分子右旋糖酐与溶剂混合反应，体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，加入硫酸银后，分批加入磺化试剂，保温反应，将反应液倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，得到滤饼，滤饼真空干燥，得到葡聚糖硫酸酯；所述葡聚糖硫酸酯的化学反应结如下：
，
2）成盐，氮气保护下，控内温40℃，将葡聚糖硫酸酯溶解在去离子水中，滴加1M浓度的NaOH去离子水溶液，调节体系pH至10；
3）精制，成盐后，向体系中加入还原性试剂，对体系进行60℃脱色2h；随后将完成脱色的反应液倾倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，烘干得到葡聚糖硫酸钠；所述葡聚糖硫酸钠的化学反应式如下：
。
所述1）中低分子右旋糖酐为平均分子量2～4万的低分子右旋糖酐；所述1）中在20℃温度环境将所述低分子右旋糖酐与溶剂在氮气保护下加入反应瓶中混合，将体系升温至内温70℃，至体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，右旋糖酐全部溶解后，将内温降到50℃；
保温反应1h后控内温30℃，将上述反应液倾倒入醇类溶剂中，体系析出固体，抽滤，得到滤饼为白色或类白色松散粉末状固体葡聚糖硫酸酯，多次使用醇打浆，滤饼真空干燥。
所述1）中磺化试剂为三氧化硫与三氧化硫吡啶络合物组合。
所述溶剂为甲酰胺。
所述醇类试剂为甲醇。
所述还原性试剂为二氧化硫脲。
实施例4
1）葡聚糖硫酸酯的制备，低分子右旋糖酐与溶剂混合反应，体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，加入硫酸银后，分批加入磺化试剂，保温反应，将反应液倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，得到滤饼，滤饼真空干燥，得到葡聚糖硫酸酯；所述葡聚糖硫酸酯的化学反应式如下：
，
2）成盐，氮气保护下，控内温60℃，将葡聚糖硫酸酯溶解在去离子水中，滴加1M浓度的NaOH去离子水溶液，调节体系pH至12；
3）精制，成盐后，向体系中加入还原性试剂，对体系进行80℃脱色5h；随后将完成脱色的反应液倾倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，烘干得到葡聚糖硫酸钠；所述葡聚糖硫酸钠的化学反应式如下：
。
所述1）中低分子右旋糖酐为平均分子量2～4万的低分子右旋糖酐；所述1）中在25℃温度环境将所述低分子右旋糖酐与溶剂在氮气保护下加入反应瓶中混合，将体系升温至内温90℃，至体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，右旋糖酐全部溶解后，将内温降到60℃；
保温反应3h后控内温40℃，将上述反应液倾倒入醇类溶剂中，体系析出固体，抽滤，得到滤饼为白色或类白色松散粉末状固体葡聚糖硫酸酯，多次使用醇打浆，滤饼真空干燥。
所述1）中磺化试剂为氨基磺酸与氯磺酸组合。
作为优选的技术方案，所述溶剂为甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮组合。
所述醇类试剂为异丙醇。
所述还原性试剂为羟甲基磺酸钠。
实施例5
分子量证明试验
取实施例1中精制后的产品，通过GPC（凝胶渗透色谱法）测试相对分子量为46786道尔顿，详见图2，图2中横坐标为时间，纵坐标为信号强度，GPC的色谱柱就是将分子按照从大到小的先后顺序排列分离，分子量大的通过时间短，分子量小的通过时间长；图2中MV则是单位毫伏。
GPC结果如表1：
表1
。
实施例6
稳定性试验
取按照实施例1方法精制获得的100g产品，均匀散布于洁净的表面皿中，放入恒温恒湿箱中，维持温度20±5℃，湿度30±10％，分别于18、19、20个月后开箱观察，并与当天按照实施例1方法精制的产品进行对比，均未发现颜色改变。
Claims (4)
1.一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺，其特征在于，包括下列步骤：
1）葡聚糖硫酸酯的制备，低分子右旋糖酐与溶剂混合反应，体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，加入硫酸银后，分批加入磺化试剂，保温反应，将反应液倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，得到滤饼，滤饼真空干燥，得到葡聚糖硫酸酯；低分子右旋糖酐为平均分子量2～4万的低分子右旋糖酐；磺化试剂为三氧化硫、三氧化硫吡啶络合物、氨基磺酸、氯磺酸、发烟硫酸中的一种或者两种组合；所述葡聚糖硫酸酯的化学反应式如下：
，
2）成盐，氮气保护下，控内温40～60℃，将葡聚糖硫酸酯溶解在去离子水中，滴加1M浓度的NaOH去离子水溶液，调节体系pH至10～12；
3）精制，成盐后，向体系中加入还原性试剂，对体系进行60～80℃脱色2～5h；随后将完成脱色的反应液倾倒入醇类溶剂中，析出固体，抽滤，烘干得到葡聚糖硫酸钠；还原性试剂为二氧化硫脲、保险粉、羟甲基磺酸钠中的一种；所述葡聚糖硫酸钠的化学反应式如下：
。
2.如权利要求1所述一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺，其特征在于：所述1）中在20～25℃温度环境将所述低分子右旋糖酐与溶剂在氮气保护下加入反应瓶中混合，将体系升温至内温70～90℃，至体系由白色浑浊逐渐变得澄清透明，右旋糖酐全部溶解后，将内温降到50～60℃；
保温反应1～3h后控内温30～40℃，将上述反应液倾倒入醇类溶剂中，体系析出固体，抽滤，得到滤饼为白色或类白色松散粉末状固体葡聚糖硫酸酯，多次使用醇打浆，滤饼真空干燥。
3.如权利要求1或2所述一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺，其特征在于：所述溶剂为甲酰胺、水、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或者两种组合。
4.如权利要求1所述一种提升葡聚糖硫酸钠化学稳定性与生物活性的合成工艺，其特征在于：所述醇类溶剂为C1～C4的醇类中的一种。
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