CN117618667A - 一种膜修复用支架材料 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用生物材料领域,提供了一种膜修复用支架材料,采用丝素蛋白和单宁酸为主要原料,通过共轭亚油酸锌和醛基化透明质酸进行改性,采用冷冻干燥法制备ESF/O‑HA/CLA/TA复合支架,改善了SF/TA的多孔结构,有助于细胞的增殖,获得的生物支架粘弹性好、力学强度满足上颌窦黏骨膜生理要求。本发明的膜修复用支架材料通过粘附在骨壁和上颌窦黏骨膜上,促进上颌窦黏骨膜修复,为新骨形成提供密闭空间。通过使用该材料,减少了可吸收缝合线、膜钉、骨钉的使用,促进上颌窦黏骨膜修复,同时诱导骨缺损区骨量增加,为常规种植提供直接种植条件,提高种植体的初期稳定性,减少患者就医时间和频次。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料领域,具体为一种用于修复上颌窦黏骨膜的支架材料。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
上颌窦底提升,即将上颌窦底黏骨膜自上颌窦底及周围骨壁分离,形成一个隔离的空间,植入骨增量材料以增加上颌窦底骨高度,同期或分阶段植入种植体。上颌窦底提升是目前解决上颌后牙区种植手术时骨量不足的可靠办法,但技术敏感性较强,并发症发生风险较高。上颌窦底黏骨膜穿孔是最常见的并发症。上颌窦底内提升术,采用骨凿冲顶法进行穿牙槽嵴上颌窦底提升时,由于盲视下进行窦底提升操作及骨凿冲顶操作的创伤性,上颌窦底黏膜穿孔风险发生率高达21%。黏骨膜穿孔易产生骨增量材料移位,可能导致上颌窦开口堵塞、骨增量材料感染、上颌窦感染和种植体脱落等,增加患者就诊次数和费用。
根据上颌窦底提升并发症的专家共识:黏骨膜穿孔(第一版),黏骨膜穿孔后,应根据穿孔直径和位置给予相应处理,包括黏骨膜裂孔缝合、覆盖生物可吸收性胶原膜和富血小板纤维蛋白(PRF/CGF)等方法。操作过程中均需用到可吸收缝合线、膜钉、骨钉中的一种或几种,步骤繁琐。临床亟需一种操作简便快捷的可实现湿性粘附的上颌窦黏骨膜修复材料。
丝素蛋白(SF)具有良好的生物相容性和降解性,有利于细胞的早期粘附、增殖和分化,并具有良好的韧性、延展性和生物相容性。单宁酸(TA)的多酚结构使它对许多基材都具有亲和性,并且可以通过非共价键的形成牢牢地粘附在基材表面。丝素蛋白溶液与单宁酸溶液均匀混合并搅拌可形成黏胶,丝素蛋白分子中大量的酰胺键使其含有大量的亲核原子N和O,能与TA分子上的酚羟基形成氢键,是典型的疏水-多点氢键协同相互作用机制,具有强湿粘附性,但在进行疏水相互作用时出现的排水现象,观察到析出现象,材料内部无足够空间,细胞无法长入,不利于细胞的早期粘附、增殖和分化。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种上颌窦底黏骨膜修复材料,通过吸收血液或渗出液,粘附在骨壁和上颌窦黏骨膜上,减少了可吸收缝合线、膜钉、骨钉的使用,促进上颌窦黏骨膜修复,为新骨形成提供密闭空间。同时,除了窦壁骨髓细胞迁移的成骨细胞,上皮间充质转化、固有层的血管壁及骨膜层内的骨祖细胞可分化为成骨细胞促进新骨形成,也可以配合骨填充材料使用,为常规种植提供直接种植条件,提高种植体的初期稳定性,减少患者就医时间和频次。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一个方面,提供了一种膜修复用支架材料的制备方法,包括:
将氧化透明质酸溶液加入到酶解丝素蛋白(ESF)溶液中,调节体系pH至弱碱性,混合6~8h,倾倒至预冷的乙醇中,强力搅拌,直到沉淀物产生,离心、抽滤、透析、真空干燥,得到ESF/O-HA;
将ESF/O-HA水溶液的pH调节至弱酸性,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),混合均匀,再加入共轭亚油酸锌(CLA),超声混匀,得到ESF/O-HA/CLA溶液;
将单宁酸溶液,调节pH<6,加入到所述ESF/O-HA/CLA溶液,搅拌15~20min、超声20~60min,得到丝素蛋白基凝胶,透析冻干后得到ESF/O-HA/CLA/TA复合支架材料。
需要说明的是,pH调节剂为0.1M的盐酸或氢氧化钠溶液。
本发明采用酶解丝素蛋白和单宁酸为主要原料,通过共轭亚油酸锌和醛基化透明质酸进行改性,采用冷冻干燥法制备ESF/O-HA/CLA/TA复合支架,改善了SF/TA的多孔结构,有助于细胞的增殖,获得的生物支架粘弹性好、力学强度满足上颌窦黏骨膜生理要求。其中ESF作为支架材料的骨架,提供机械稳定性支持,延缓支架的生物降解,为骨诱导提供长期的稳定空间;O-HA通过与ESF交联,改善了HA降解快的缺点,而且还提高了支架的亲水性;TA的存在,赋予材料适宜的湿性粘附特性,减少了术后的缝合及骨钉、膜钉的使用;共轭亚油酸锌协同促进细胞增殖,并减少炎症反应。
共轭亚油酸具有促进细胞分裂、抗氧化、提高机体细胞免疫反应、减少炎症反应的作用,可促进创面修复;通过改善皮肤的天然屏障功能减少皮肤水分蒸发,起到保湿作用,并具有维持生物源类凝胶材料生物活性的作用。共轭亚油酸锌制备方法可采用专利CN116474160A所述的方法。透明质酸(HA)是脱细胞基质主要成分,能够被细胞表面受体识别,在特定情况下可以和这些受体相结合使得细胞能够更好的快速生长;结构中大量的羧基和羟基,使HA具有高度亲水性,保持组织的水分和保持脱细胞基质的物理形式,促进再上皮化过程。醛基化改性后保留了HA的优良特性,并可与ESF、组织中的氨基发生席夫碱反应。
TA与ESF通过疏水-多点氢键协同相互作用,由于在水溶液中丝素蛋白主要呈无规卷曲结构,重复链段并没有折叠,因此具有足够的柔性,可以将单宁酸分子包围起来,这大大增加了氢键结合的数量,粘附作用强。当长时间暴露于室温以及水中,ESF分子链依然有发生折叠的可能,因为ESF的β折叠片属于刚性结构,所以随着它的含量增加,支架材料的内聚力也随之增加,其降解速率也会随之降低,最终导致其粘附强度增加,同时通过控制β-折叠结构的含量对丝素蛋白材料在生物体内的降解速率进行调控。刚性支架材料对于上颌窦内气压的抵抗作用,以及对成骨空间的支撑作用较好,能够起到组织工程支架的作用。
在一些实施方式中,O-HA与ESF质量比为1:5~30。
在一些实施方式中,采用碱性蛋白酶对SF进行酶解,得到ESF;
ESF分子量范围会影响膜修复用支架材料的力学性能,因此,本发明对ESF分子量范围进行了摸索,在一些效果较优的实施方式中,ESF分子量为7~30kDa,可以获得更好地起到组织工程支架的作用。
HA的分子量范围对膜修复用支架材料生物相容性有较大影响,研究表明:大分子量的HA具有良好的生物相容性,为此,在一些效果较优的实施方式中,HA分子量为10~200kDa,以更好地促进生物发育和机体损伤修复。
大分子量的HA广泛分布于细胞外基质,主要功能有维持细胞水分,保证细胞完整性,提供适宜细胞的生长环境,维持细胞组织生长状态等,具有良好的生物相容性,使之在生物发育和机体损伤修复过程中发挥重要作用,但HA在人体内具有水溶性过强、代谢周期短等缺点。为克服这些缺点,本发明对HA进行交联,醛基化改性后保留了HA的优良特性,并可与ESF、组织中的氨基发生席夫碱反应。交联后形成的网状结构可以保证支架材料的弹性及缓冲应力作用。在一些实施方式中,O-HA氧化度为0.1~0.4。
在一些实施方式中,ESF/O-HA水溶液的质量浓度为1%~8%。
在一些实施方式中,共轭亚油酸锌与ESF/O-HA质量比为1:10~50。
在一些实施方式中,共轭亚油酸锌与EDC、NHS的摩尔比为1:0.1~0.6:0.1~1。
在一些实施方式中,单宁酸与ESF质量比为1:2~10。
共轭亚油酸盐与人体真皮中成纤维细胞共同培养,可提高Ⅰ型原胶原含量,且由于共轭亚油酸与人体天然皮脂分泌的脂肪酸十分接近,在维持皮肤天然屏障功能方面比其他油脂具有更好的效果,结合上颌窦黏骨膜的特殊构造及生理作用,本发明创造性地将共轭亚油酸盐和透明质酸用于上颌窦黏骨膜修复中,促进上颌窦黏骨膜功能恢复,并可以在受损部位补充水分并锁住水分。在一些实施方式中,共轭亚油酸锌的制备方法为将具有生物活性的共轭亚油酸与碱溶液和可溶性盐的混合溶液混合反应,制得共轭亚油酸盐溶液,并用酸调节共轭亚油酸盐溶液的pH值至5~8;所述可溶性盐为可溶性钙盐或可溶性锌盐。
将所述共轭亚油酸盐溶液加入生物源类凝胶材料中,共轭亚油酸盐与生物源类凝胶材料质量比为1:10~50,混合均匀反应后得到共轭亚油酸盐凝胶。
本发明还提供了上述的方法制备的膜修复材料。
本发明还提供了上述的膜修复材料在上颌窦黏骨膜修复中的应用。
本发明的有益效果
(1)本发明O-HA、TA均能与上颌窦黏骨膜及周围骨壁发生自组装,湿性粘附,修复并保护上颌窦黏骨膜,为新骨形成提供稳定的密闭空间。
(2)本发明通过控制ESF和O-HA的比例,延长支架降解时间,为牙种植术骨缺损区域增骨、种植体植入适应提供足够的时间,提高种植体初期稳定性,避免上颌窦黏骨膜的二次伤害。
(3)本发明的支架具有良好的三维结构,利于细胞粘附增殖,并保持湿润状态。
(4)本发明的支架力学强度符合上颌窦黏骨膜的生理要求,可以抵抗上颌窦内气压,对成骨空间的支撑作用较好,能够起到组织工程支架的作用。
(5)本发明制备方法简单、实用性强,易于推广。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1实施例1制备的支架材料实物图;
图2本发明制得支架材料的力学性能,其中A为弹性模量,B为压缩强度;
图3本发明制得支架材料的降解性能;
图4本发明制得支架材料对L929细胞增殖的影响。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合具体的实施例,对本发明做进一步的详细说明,应该指出,所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
步骤1、共轭亚油酸锌(CLA)凝胶制备
称取5g氢氧化钠、0.5g氯化锌溶于25mL水中搅拌均匀,待用;另量取100g亚油酸于250mL烧杯中,缓慢搅拌的作用下,少量多次的加入氢氧化钠和氯化锌混合液,1000rpm匀速搅拌,进行乳化反应,反应时温度为38℃。反应14天后,形成共轭亚油酸锌凝胶,pH显碱性,冰醋酸调至中性后,密封保存于玻璃瓶中,4℃冰箱储存待用。
步骤2、醛基化透明质酸制备
将10g HA(分子量为50~100kDa)和6g高碘酸钠的混合物溶于双蒸水中,避光冰浴3h。加入10mL的乙二醇30min后,反应停止。再加入5mL无水乙醇后,形成的O-HA立即析出。然后,通过2000rpm离心20min得到O-HA,在双蒸水中重新溶解,然后用双蒸水进行透析72h(截留分子量为5kD)。最后,透析液冻干,得到白色蓬松的O-HA,O-HA氧化度为0.24。
步骤3、丝素蛋白溶液制备
用容量瓶配置9.3M溴化锂溶液;然后将脱胶蚕丝按20%(w/v)的比例加至溴化锂溶液中;将烧杯置于60℃水浴锅中加热溶解脱胶蚕丝4h,充分溶解后,将溶液转移至截留分子量为7kDa的透析袋中,去离子水环境下透析3天,每天换2~3次水;透析结束后,将透析袋中的溶液在离心机中离心两次,除去不溶杂质,离心条件为20min,10000r/min;离心结束后,获得澄清丝素蛋白溶液,丝素蛋白溶液质量浓度为7%左右,丝素蛋白溶液的浓度通过烘干比重法获得,向上述丝素蛋白溶液中加入质量浓度为1‰的碱性蛋白酶Alcalase(体系中酶初始质量浓度为1‰),调节pH至8.5,55℃反应3h,反应结束后升温到100℃进行酶失活处理,得到酶解丝素蛋白溶液,将溶液转移至截留分子量为7kDa的透析袋中透析3天,透析结束后,将透析袋中的溶液-80℃预冷冻12h后,取出放入冷冻干燥机中干燥72h,制得酶解丝素蛋白海绵体。测得得到的酶解丝素蛋白分子量主要分布范围在7~30kDa。
步骤4、ESF/O-HA/CLA/TA复合支架材料制备
1)取步骤2制备的O-HA2g溶于200mL去离子水中,配置为质量浓度为1%的溶液,调节pH至8.0,室温下,逐滴滴加到400mL、质量浓度为5%酶解丝素蛋白去离子水溶液中,调节体系pH=8,持续温和搅拌6h,之后将溶液缓慢倾倒至预冷的乙醇中,强力搅拌,直到沉淀物产生,离心、抽滤、清洗、抽滤、真空干燥,得到ESF/O-HA。
2)取6g ESF/O-HA溶于100mL去离子水中,用0.1M的盐酸将体系调节pH至5.0~6.0后,依次加入EDC·HCl、NHS,搅拌均匀后,再加入步骤1制备的共轭亚油酸锌200mg,超声混匀后保持30min。共轭亚油酸锌与EDC、NHS的摩尔比为1:0.4:0.8。
3)制备质量分数为5%的单宁酸溶液20mL,调节pH至4.0,缓慢滴加到步骤2)制备的ESF/O-HA/CLA溶液中,搅拌15min,350W超声30min后,放入聚四氟乙烯模具中,于-80℃冰箱内预冷冻4h后,在-30℃维持6h,在-15℃维持24h,在25℃解析干燥4h,得到ESF/O-HA/CLA/TA复合支架样品1。
实施例2
步骤4、1)中ESF和O-HA的质量比为25:1,其余步骤同实施例1,制备支架样品2。
对比例1
步骤4、1)中ESF和O-HA的质量比为3:1,其余步骤同实施例1,制备支架样品3。
对比例2
与实施例1的不同之处在于,不添加共轭亚油酸锌,制备支架样品4。
对比例3
与实施例1的不同之处在于,不添加O-HA,制备支架样品5。
步骤1、丝素蛋白溶液制备
用容量瓶配置9.3M溴化锂溶液;然后将脱胶蚕丝按20%(w/v)的比例加至溴化锂溶液中;将烧杯置于60℃水浴锅中加热溶解脱胶蚕丝4h,充分溶解后,将溶液转移至截留分子量为7kDa的透析袋中,去离子水环境下透析3天,每天换2-3次水;透析结束后,将透析袋中的溶液在离心机中离心两次,除去不溶杂质,离心条件为20min,10000r/min;离心结束后,获得澄清丝素蛋白溶液,丝素蛋白溶液质量浓度为7%左右,丝素蛋白溶液的浓度通过烘干比重法获得,向上述丝素蛋白溶液中加入碱性蛋白酶Alcalase(体系中酶初始质量浓度为1‰),调节pH至8.5,55℃反应3h,反应结束后升温到100℃进行酶失活处理,得到酶解丝素蛋白溶液,将溶液转移至截留分子量为7kDa的透析袋中透析3天,透析结束后,将透析袋中的溶液-80℃预冷冻12h后,取出放入冷冻干燥机中干燥72h,制得酶解丝素蛋白海绵体。测得得到的酶解丝素蛋白分子量主要分布范围在7~30kDa。
步骤2、ESF/CLA/TA支架材料制备
1)制备质量浓度为5%的上述酶解丝素蛋白去离子水溶液120mL,用盐酸溶液将体系调节pH至5.0后,依次加入EDC·HCl、NHS,搅拌均匀后,再加入步骤1制备的共轭亚油酸锌200mg,超声混匀后保持30min。共轭亚油酸锌与EDC、NHS的摩尔比为1:0.4:0.8。
2)制备质量分数为5%的单宁酸溶液10mL,调节pH至4.0,缓慢滴加到1)制备的ESF/CLA溶液体系中,搅拌15min,350W超声30s后,将得到的复合凝胶于去离子水中透析60h,然后放入聚四氟乙烯模具中,于-80℃冰箱内预冷冻4h后,在-30℃维持6h,在-15℃维持24h,在25℃解析干燥4h,得到ESF/CLA/TA复合支架样品5。
对比例4
与实施例1的不同之处在于,采用质量浓度为1%的透明质酸溶液(HA分子量为50~100kDa)替代质量浓度为1%的O-HA溶液,得到支架样品6。
对比例5
与实施例1的不同之处在于,采用天然维生素E(VE)替代共轭亚油酸锌,得到支架样品7。
步骤、ESF/O-HA/VE/TA复合支架材料制备
1)取实施例1步骤2制备的O-HA 2g溶于200mL去离子水中,配置为质量浓度为1%的溶液,调节pH至8.0,室温下,逐滴滴加到400mL实施例1步骤3制备的质量浓度为5%酶解丝素蛋白去离子水溶液中,调节体系pH=8,持续温和搅拌6h,之后将溶液过滤,滤液缓慢倾倒至预冷的乙醇中,强力搅拌,直到沉淀物产生,离心、抽滤、清洗、抽滤、真空干燥,得到ESF/O-HA。
2)取6g ESF/O-HA溶于100mL去离子水中,用0.1M的盐酸将体系调节pH至5.0~6.0后,再加入VE 200mg,超声混匀得到ESF/O-HA/VE悬浊液。
3)制备质量分数为5%的单宁酸溶液20mL,调节pH至4.0,缓慢滴加到步骤2)制备的ESF/O-HA/VE悬浊液中,搅拌15min,350W超声30min后,放入聚四氟乙烯模具中,于-80℃冰箱内预冷冻4h后,在-30℃维持6h,在-15℃维持24h,在25℃解析干燥4h,得到ESF/O-HA/VE/TA复合支架样品7。
实验部分
1、复合支架的孔隙率
孔径、孔隙率、孔连结和孔形貌是多孔支架材料的基本要素。孔径大小作为支架结构中最重要的因素之一可以影响支架力学性能,调控细胞的粘附、增殖以及血管化和成骨分化。
如表1所示,通过在ESF中引入O-HA或HA,提高了结合水的能力,导致在冷冻干燥过程中形成高比表面积的多孔结构,提高了复合多孔支架的孔隙率。材料中孔隙数量越多,孔径越小,复合材料能够分散外界压力,也可以减缓材料内部裂纹的扩散,多孔结构有利于代谢废物以及营养物质的输送。样品1孔隙率高于样品6,推测原因为O-HA与其他组分交联程度大于HA,形成更多的多孔结构;随着O-HA比例的增大,孔隙率增大。
表1各组支架样品孔隙率检测结果
支架样品编号 | 质量比 | 孔隙率(%) |
1 | ESF:O-HA=10:1 | 84.94±5.45 |
2 | ESF:O-HA=25:1 | 80.37±9.85 |
3 | ESF:O-HA=3:1 | 90.16±8.62 |
4 | ESF:O-HA=10:1 | 82.75±9.24 |
5 | 无O-HA | 68.69±6.32 |
6 | ESF:HA=10:1 | 75.91±7.98 |
7 | ESF:O-HA=10:1 | 83.16±6.51 |
2、复合支架的力学性能评价
利用万能试验机在室温下测试了圆柱型材料样品的力学性能。每个样品的直径为25mm,高度为30mm。使用1000N的传感器以0.2mm/min的速度测试样品,直到60%的应变水平(n=8)。计算得到上述五种材料的弹性模量和压缩强度。
结果如图2所示。随着O-HA含量的增加,支架的抗压强度和弹性模量均有所提高。推测O-HA的引入增加了材料单位面积大分子链的数量,增强了材料的应力传递和应力分散能力。样品1与样品6相比,由于O-HA与其他组分交联程度大于HA,力学性能更好。
3、复合支架的降解性能
首先将各实施例、对比例制备的样品称重(W0),将其放于24孔板中,然后浸泡在含1mL 2U/mL蛋白酶-XIV的PBS溶液中,并置于120rpm/min,37℃恒温摇床内,分别于1、2、3、4、6和7d分别取出样品,超纯水清洗,冻干称重(W1)。剩余质量百分比的计算公式为:DR(%)=(W1/W0)×100%,每个样品平行做三次实验,求其平均值。
由图3可见,随着时间的增加,各组支架均有降解,其中样品5降解速率最快。加入O-HA后,复合支架随着时间的延长逐渐降解,降解速率随O-HA比例的增加而降低,这是由于复合支架的降解速率受体系中O-HA浓度的影响较大,进一步增加体系中O-HA的浓度会导致形成更加致密的网络结构,从而可以有效地固定和保护ESF的小β-折叠结构域。样品3降解最慢,第7天时剩余质量为41.25%,过多的O-HA会使材料降解时间延长。样品6与样品1相比,降解更快,推测原因是O-HA与其他组分交联程度大于HA。
4、复合支架的黏合性能评价
(1)按照YY/T0729.1-2009组织黏合剂粘接性能试验方法第1部分:搭接-剪切拉伸承载强度进行,选取新鲜猪皮为测试基底,37℃下通过万能试验机进行测试,评估各样品对基底材料的黏合性能。
结果:多次测量统计后发现(表2),支架材料中添加O-HA后,黏合性能略有降低,随着O-HA含量增加,黏合性能降低。样品4与样品1相比,组分中无共轭亚油酸锌油性成分,黏合性能更强;样品6与样品1相比,组分中用相同质量分数的HA代替O-HA,HA与ESF结合度低,使ESF可以更充分的与TA反应,黏合性强。
表2本发明制得支架材料拉伸应力统计表
组别 | 拉伸承载强度/(KPa) | 湿性拉伸承载强度/(KPa) |
样品1 | 19.81±1.09 | 17.54±0.98 |
样品2 | 21.62±2.14 | 19.16±1.85 |
样品3 | 15.14±0.65 | 13.85±1.02 |
样品4 | 20.93±1.42 | 18.81±1.94 |
样品5 | 27.19±2.95 | 24.87±2.68 |
样品6 | 24.15±3.15 | 21.78±2.07 |
样品7 | 20.06±1.95 | 17.96±1.83 |
(2)对于抗湿粘附性能的测试,在样品与新鲜猪皮接触后,转移至有水的玻璃皿中,并用一片载玻片压住使凝胶样品和新鲜猪皮之间保持接触,对在水中浸泡0.5h的样品的粘附力进行测试,测试方法同(1),结果见表2。可发现湿性环境下,拉伸承载强度略低于干性黏合,但可以满足上颌窦黏骨膜处黏合。
5、CCK-8法检测小鼠成纤维细胞(L929细胞)在复合支架上的增殖能力
取各样品裁成24孔板大小的圆片,紫外灭菌1h,放入24孔板,将L929细胞以2×104个/mL种植在样品表面,放入培养箱中在37℃、5%的CO2的条件下培养,培养期间定期每隔48小时更换一次培养基,分别在第1、4和7天采用CCK-8法评估L929细胞在复合支架上的增殖能力。
结果如图4所示,随着时间的增加,各组细胞从第1天至第7天均处于细胞数量增加的状态。在第1天各组间细胞数量无显著性差异,在第4天和第7天,样品1、样品2吸光度显著高于各对比例制得的样品,表明实施例制备的SF/O-HA/CLA/TA复合支架材料有利于L929细胞的粘附和增殖;而样品1吸光度显著高于样品4,这些结果表明共轭亚油酸锌有利于L929细胞的粘附和增殖;样品3第4、7天吸光度均低于其他组,推测O-HA占比过高,不利于细胞增殖;样品7在第4、7天吸光度低于样品1,但高于样品4,表明添加VE也可以促进细胞增殖,但效果不如添加共轭亚油酸锌。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种膜修复用支架材料的制备方法,其特征在于,包括:
将氧化透明质酸溶液加入到酶解丝素蛋白溶液中,调节体系pH至弱碱性,混合6~8h,倾倒至预冷的乙醇中,强力搅拌,直到沉淀物产生,离心、抽滤、透析、真空干燥,得到ESF/O-HA;
将ESF/O-HA水溶液的pH调节至弱酸性,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺,混合均匀,再加入共轭亚油酸锌,超声混匀,得到ESF/O-HA/CLA溶液;
将单宁酸溶液,调节pH<6,加入到所述ESF/O-HA/CLA溶液,搅拌15~20min、超声20~60min,得到丝素蛋白基凝胶,透析冻干后得到ESF/O-HA/CLA/TA复合支架材料。
2.如权利要求1所述的膜修复用支架材料的制备方法,其特征在于,O-HA与ESF质量比为1:5~30;
或,ESF分子量为7~30kDa;
或,HA分子量为10~200kDa。
3.如权利要求1所述的膜修复用支架材料的制备方法,其特征在于,O-HA氧化度为0.1~0.4。
4.如权利要求1所述的膜修复用支架材料的制备方法,其特征在于,ESF/O-HA水溶液的质量浓度为1%~8%。
5.如权利要求1所述的膜修复用支架材料的制备方法,其特征在于,共轭亚油酸锌与ESF/O-HA质量比为1:10~50。
6.如权利要求1所述的膜修复用支架材料的制备方法,其特征在于,共轭亚油酸锌与EDC、NHS的摩尔比为1:0.1~0.6:0.1~1。
7.如权利要求1所述的膜修复用支架材料的制备方法,其特征在于,单宁酸与ESF质量比为1:2~10。
8.如权利要求1所述的膜修复用支架材料的制备方法,其特征在于,共轭亚油酸锌的制备方法为将具有生物活性的共轭亚油酸与碱溶液和可溶性盐的混合溶液混合反应,制得共轭亚油酸盐溶液,并用酸调节共轭亚油酸盐溶液的pH值至5~8;所述可溶性盐为可溶性钙盐或可溶性锌盐;
将所述共轭亚油酸盐溶液加入生物源类凝胶材料中,共轭亚油酸盐与生物源类凝胶材料质量比为1:10~50,混合均匀反应后得到共轭亚油酸盐凝胶。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备的膜修复用支架材料。
10.权利要求9所述的膜修复用支架材料在上颌窦黏骨膜修复中的应用。
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