CN117618557A - 一种噬菌体介导靶向光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种噬菌体介导靶向光敏剂及其制备方法和应用，解决了现有噬菌体靶向抗菌剂利用基因工程基因编辑手段，制备复杂缓慢，成本较高的技术问题。本发明通过带有氨基的光敏分子与头部外壳蛋白带有羧基的噬菌体见得酰胺反应将两者进行偶联，得到一种噬菌体疗法和光动力疗法协同抗菌兼具靶向功能的噬菌体抗菌偶联物。
Description
技术领域
本发明属于材料技术领域，具体涉及一种噬菌体介导靶向光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素是临床细菌感染治疗中常见的使用药物，然而即使是窄谱的抗生素也可能会对人体正常微生物或细胞造成损伤，从而诱发其他疾病如肠胃炎、过敏等。除此之外，抗生素滥用导致的耐药菌进化危机也难以避免。
噬菌体是以细菌为宿主的细菌病毒，其与细菌的结合具有严格的特异靶向性，因此噬菌体不会对非靶向微生物或细胞造成影响。利用噬菌体所实现的噬菌体抗菌疗法与抗生素疗法相比具有不易损伤有益微生物或正常细胞、不易诱导细菌耐药性产生等优点。
现今，研究人员开发出了新型噬菌体靶向抗菌，将噬菌体疗法与光敏剂疗法相结合，光疗因其侵袭小、不易产生耐药等优点而被认为是最有前途的微生物感染治疗策略之一，比如：刘家宝.光敏剂的热增强细菌渗透及抗菌应用[D].东南大学.2022.DOI:10.27014/d.cnki.gdnau.2022.000805。然而目前已开发出的新型噬菌体靶向抗菌剂多为利用基因工程基因编辑手段，以获得效果更显著的靶向噬菌体。该方法实验步骤相对复杂，进程缓慢，且所使用的光敏剂与噬菌体价格昂贵，若应用于实际生产中存在成本高昂的问题。
鉴于此，本发明研究团队认为有必要开发一种制备方便快捷、成本较低的具有高杀菌效力、可控的噬菌体靶向抗菌剂，为噬菌体靶向抗菌剂在临床上能够成功应用提供一种新方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有噬菌体靶向抗菌剂利用基因工程基因编辑手段，制备复杂缓慢，成本较高的不足之处，提供了一种噬菌体介导靶向光敏剂及其制备方法和应用，该发明能够方便快捷且低成本地实现光动力疗法与噬菌体疗法结合的协同高效对抗细菌感染。
本发明的构思：
为此，本发明研究团队对于噬菌体和光敏分子进行了深入地研究，噬菌体(Bacteriophage，Phage)作为一种细菌病毒，由头部蛋白质外壳包裹内部的遗传物质组成，大部分噬菌体还有尾部，尾部为噬菌体提供特异性识别细菌的功能。因此，根据噬菌体特有的结构和功能，本发明研究团队拟对噬菌体进行改良，通过查询噬菌体头部外壳蛋白氨基酸序列，利用噬菌体头部外壳蛋白上氨基酸侧链中含量最丰富的羧基功能基团和光敏分子上的氨基官能团发生酰胺反应形成化学键，以此将光敏分子偶联在噬菌体的头部外壳蛋白上，将光敏分子的光动力功能与之进行结合，构建噬菌体抗菌偶联物(Phage-antimicrobial conjugates，PACs)。噬菌体靶向到相应的细菌处，光敏分子在被最大吸收波长的光波照射激发后，会在被激发到三重态后与周围底物(如蛋白质、磷脂)或氧气反应生成活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，ROS会对细胞膜和DNA造成损伤以破坏细菌或细胞结构，通过这种途径来治疗细菌感染。
基于上述发明构思，为了实现发明目的，本发明提供如下解决方案：
一种噬菌体介导靶向光敏剂，其特殊之处在于：噬菌体头部的外壳蛋白上通过酰胺反应偶联有光敏分子；所述噬菌体为头部外壳蛋白含有羧基基团的噬菌体；所述光敏分子为含有氨基基团的光敏分子；通过两者的偶联生成所需噬菌体介导靶向光敏剂。上述噬菌体介导靶向光敏剂即一种噬菌体疗法和光动力疗法协同抗菌兼具靶向功能的噬菌体抗菌偶联物(Phage-antimicrobial conjugates，PACs)，其由三部分组成——噬菌体、光敏分子以及将两者连接的连接臂(即化学键)。
进一步地，所述噬菌体为靶向大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)ATCC 11303的T4噬菌体，当然也可选用T1或T7；所述光敏分子为氨基化的Rose Bengal。本发明之所以选用靶向大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)ATCC 11303的T4噬菌体，是通过NationalCenter for Biotechnology Information对T4噬菌体主要头部蛋白和尾丝蛋白的氨基酸序列进行调研，结果显示，在T4噬菌体的蛋白质中，羧基和氨基的含量远高于其他基团如巯基和酚羟基，其头部外壳蛋白(主要是gp23、gp22等蛋白)上羧基的含量高于氨基，而尾丝蛋白(主要是gp34、gp36、gp37等蛋白)的羧基含量低于氨基。因此，为保证有更多的分子结合到噬菌体上且尽量避免影响尾部特异性识别功能，选择了在头部蛋白上较多的羧基作为结合位点，使光敏分子和T4噬菌体上发生反应，将光敏分子偶联到T4噬菌体的蛋白质上。考虑到本发明光敏剂后续的应用，不仅需要能够展现出良好的抗菌性能，还需要具有一定的生物安全性能，因此在光敏剂的选择上也进行了重点选择，本发明选择Rose Bengal(RB)作为光敏分子，一方面，孟加拉红(RB)作为一种阴离子水溶性黄蒽染料，不仅可作为食品着色剂，还能够在用绿光照射时将氧分子光催化转化为单线态氧，相较于其他光敏剂，它已被用作癌症化疗的光动力敏化剂(被Food and Drug Administration批准作为某些癌症的孤儿药)以及局部眼科诊断，可见RB具有更小的副作用，具有一定的安全性；另一方面，RB具有较高的量子产率(Φ＝0.76)，最大吸收光波长在548nm左右，在光照后通过Ⅱ型反应产生对细菌更具破坏力的单线态氧1O2；因此，RB作为一种较为理想的光敏分子，被选择为本发明中PACs的协同抗菌成分。另外，RB的分子结构中有一个具有反应活性的羧基，而在前述内容中明确了需要利用T4噬菌体蛋白质上的羧基作为偶联位点，羧基与羧基之间无法反应，意味着RB无法直接被利用于本发明设计的PACs中，因此，需对PB进行改性(氨基化改性)，使其能够与T4噬菌体偶联。
上述噬菌体介导靶向光敏剂的制备方法，其特殊之处在于，步骤如下：
取已知效价的噬菌体溶液，将噬菌体溶液的pH调节至6.5-7.5(该pH范围内，噬菌体的稳定性最好，即活性和效价最稳定)，并使用催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)进行活化，之后根据噬菌体溶液效价，加入适量光敏分子的二甲基亚砜溶液(即带有氨基基团的光敏分子的二甲基亚砜溶液)，混合均匀后，在低温摇床4～37℃下进行反应，反应结束后，透析得到噬菌体介导靶向光敏剂。
进一步地，所述噬菌体溶液选用T4噬菌体溶液；
所述光敏分子选用氨基化的Rose Bengal；其中，Rose Bengal的氨基化过程具体如下：
将Rose Bengal和溴乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF，该反应溶剂溶解性、稳定性好，不会和原料发生反应)中，加热反应，待反应结束，减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，并依次在无水乙醚和水中多次洗涤(以去除反应残留或产生的副产物如光敏分子或HBr等)，过滤后在甲醇中重结晶，在真空中除去残余甲醇，得到改性后的光敏分子RB-NH2；如若选用自身带有氨基基团的光敏分子，则不需要进行对光敏分子进行氨基化改性这一过程；
所述光敏分子的二甲基亚砜溶液为RB-NH2的二甲基亚砜溶液，摩尔浓度为1.0mM；
将噬菌体溶液和光敏分子的二甲基亚砜溶液混合均匀后，低温摇床反应36～48h，待反应结束后，透析得到噬菌体介导靶向光敏剂Phage-RB；该噬菌体抗菌偶联物Phage-RB保留了噬菌体靶向细菌的功能，因此Phage-RB可靶向吸附到特定细菌上，当Phage-RB聚集在细菌表面后，通过特定波长激光进行照射，可实现光动力疗法快速杀灭细菌，实现具有靶向功能的噬菌体疗法和光动力疗法协同抗菌。
进一步地，在对Rose Bengal进行氨基化过程，所述Rose Bengal、溴乙胺和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1∶1.5∶130，反应温度为75～85℃，反应时间为6～8h，期间使用薄层色谱分析法检测反应进程；反应完成后依次在无水乙醚和超纯水中搅拌洗涤至少18h，期间更换2～3次无水乙醚和超纯水。
进一步地，调节pH时，首先利用pH为5.5的PBS缓冲液调节噬菌体溶液pH至6.0，再利用pH为8.5的PBS缓冲液将溶液pH调节至目标pH；
所述透析是指在透析袋中进行透析，时间为24～36h，通过紫外-可见吸收光谱监测透析进程，期间更换透析液2～3次。
同时，本发明还提供了上述噬菌体介导靶向光敏剂制备治疗细菌感染的抗菌剂中的应用，以及在制备杀灭细菌的光动力制剂中的应用。
进一步地，所述细菌为大肠杆菌E.coli ATCC 11303或大肠杆菌ER 2738。
基于上述应用，本发明提供了一种抗菌剂，其特殊之处在于，其有效成分为上述噬菌体介导靶向光敏剂。
一种光动力制剂，其特殊之处在于：其有效成分为上述噬菌体介导靶向光敏剂。
本发明原理：
为了使带有氨基的光敏分子与头部外壳蛋白带有羧基的噬菌体偶联(比如：RB与T4)，本发明首先对光敏分子进行氨基化修饰这一功能化改性，具体是用溴乙胺一端上的溴和光敏分子上的羧基发生取代反应形成酯键，使得溴乙胺另一端的氨基被引入到光敏分子上生成氨基化的光敏分子(比如：RB-NH2)，随后在噬菌体最佳稳定温度范围(4～37℃，优选37℃)和pH(6.5-7.5，优选7.5)条件内，利用氨基化的光敏分子上的氨基和噬菌体蛋白质上的含量较多的羧基进行反应，通过生成酰胺键实现改性后的光敏分子和噬菌体偶联，成功构建噬菌体抗菌偶联物。
本发明的优点：
1.本发明制备噬菌体靶向抗菌剂相比于其他新型噬菌体靶向抗菌剂，利用工艺流程相对简单的酰胺化反应，选择价格相对低廉的光敏分子，解决了目前噬菌体靶向抗菌剂制备复杂缓慢，成本较高的问题，有利于噬菌体靶向抗菌剂在临床上广泛应用。
2.本发明利用具有严格特异靶向性的噬菌体构建噬菌体介导靶向光敏剂(比如：Phage-RB)，因此，光敏剂可以靶向到特定的细菌上(比如：选择的噬菌体为T4噬菌体，只对大肠杆菌E.coli ATCC 11303和ER 2738有杀灭效果，而对肺炎克雷伯菌K.pneumoniaeATCC 13883无杀灭效果)，相比广谱抗菌剂，不仅避免了对人体有益微生物群和正常细胞组织的损伤，降低了毒副作用，还可实现治疗目标可控的效果。
3.本发明相比于使用传统游离光敏分子治疗，可以提高光敏分子在细菌表面的浓度，提高光动力疗效。本发明的噬菌体介导靶向光敏剂将光敏分子氨基化改性后偶联在噬菌体上，因此，当噬菌体靶向特异性结合到细菌表面后，光敏分子也随着噬菌体在细菌表面聚集，相比于使用等浓度游离光敏分子治疗，被结合在噬菌体上的光敏分子能够定向聚集在细菌周围，光照射激发后在细菌周围产生的ROS更高，对细菌的破坏力更强。
4.本发明相比于使用传统游离光敏分子治疗，在达到相同治疗效果条件下，本发明的噬菌体介导靶向光敏剂可以降低光敏分子的用量，从而降低光敏分子的暗毒性。以本发明中的Phage-RB为例，在抗非耐药大肠杆菌E.coli ATCC 11303时可将游离RB-NH2的用量降低至1/92，在抗耐药大肠杆菌ER 2738时可将游离RB-NH2的用量降低至1/4。
附图说明
图1是本发明中Phage-RB的实现方案；
图2是本发明中Phage-RB的靶向、协同杀菌功能实现示意图；
图3是本发明培育并用于构建PACs的T4噬菌体，通过使用透射电子显微镜拍出的结构形貌图像；
图4是测得T4噬菌体的在不同感染复数孵育后所得噬菌体浓度；
图5是测得T4噬菌体溶液在不同温度下孵育1h后的噬菌体浓度；
图6是测得T4噬菌体溶液在不同pH下孵育1h后的噬菌体浓度；
图7是通过抑菌圈实验测试T4噬菌体的靶向性；
图8是溴乙胺、RB、RB-NH2的核磁共振氢谱图；
图9是RB-NH2的质谱图；
图10是溴乙胺、RB和RB-NH2的紫外-可见吸收光谱；
图11是RB和RB-NH2的光动力性能测试；
图12是RB-NH2的紫外-可见吸收标准曲线；
图13是用双层平板法测试Phage-RB中噬菌体效价的平板图；
图14是Phage-RB的紫外-可见吸收光谱图；
图15是用LIVE/DEAD实验验证Phage-RB的靶向抗菌性；
图16是不同材料(PBS、RB-NH2、Phage-RB)的抗非耐药大肠杆菌E.coli ATCC11303实验的结果；
图17是不同材料(PBS、RB-NH2、Phage-RB)的抗非耐药大肠杆菌E.coli ATCC11303实验的菌落平板图；
图18是Phage-RB的抗耐药大肠杆菌ER 2738实验的结果；
图19是Phage-RB的抗耐药大肠杆菌ER 2738实验的菌落平板图；
图20是游离RB-NH2的抗非耐药大肠杆菌E.coli ATCC 11303实验的结果；
图21是游离RB-NH2的抗非耐药大肠杆菌E.coli ATCC 11303实验的菌落平板图；
图22是游离RB-NH2的抗耐药大肠杆菌ER 2738实验的结果；
图23是游离RB-NH2的抗耐药大肠杆菌ER 2738实验的菌落平板图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的内容做进一步的详细描述：
工艺路线：
噬菌体的复苏与制备：通过液体复苏法(将冻干粉形式的噬菌体进行复苏或对复苏后的噬菌体进行扩大增殖)和双层平板法(计算噬菌体溶液浓度的方法)对所选择噬菌体的冻干粉进行培育，其中液体培养法的适宜条件为10mL的LB液体培养基、37℃、180～220rpm和2～3天的摇床复苏，双层平板法的实现方式为对复苏后的噬菌体溶液进行梯度稀释后，混匀在47～53℃的0.7％琼脂含量的LB琼脂中，混匀后倾倒在已凝固的1.5％琼脂含量的LB琼脂上，倒置在37℃中孵育6～10h。根据梯度稀释倍数和平板上噬菌体数量，计算噬菌体溶液浓度。随后对噬菌体的生物学性能进行测试，如最高感染复数、温度和pH稳定性、靶向性等进行测试。
光敏分子的改性：对可在特定激光照射下产生活性氧的光敏分子进行改性，改性的目的是为光敏分子上连接氨基基团，便于和噬菌体蛋白质上的羧基基团进行偶联。通过核磁共振氢谱图、紫外-可见吸收光谱、质谱等方式判断改性是否成功，并测试改性后光敏分子的光动力性能。
噬菌体抗菌偶联物的构建：通过化学键的构建，将改性后的光敏分子和噬菌体蛋白在催化剂的催化下进行偶联，透析后，对所获得噬菌体抗菌偶联物的靶向性、抗菌性进行评估。
具体实施例如下：
以烈性噬菌体T4噬菌体为例，本发明提出一种采用光敏分子Rose Bengal改性后和T4噬菌体偶联制备噬菌体抗菌偶联物Phage-RB的方法，Phage-RB的构建方式如图1所示，功能实现方案如图2所示，
噬菌体抗菌偶联物Phage-RB的构建包括以下步骤：
噬菌体的复苏与制备：本发明选用烈性噬菌体T4噬菌体进行偶联，探索获得高效价T4噬菌体的条件，测试T4噬菌体的生物学性能如最佳感染复数(Multiplicity ofinfection，MOI)、温度和pH稳定性、靶向性等，为噬菌体的进一步和光敏分子偶联提供基础。如图3所示是所培养T4噬菌体在透射电子显微镜下所观察到的形貌图，呈蝌蚪状，主要由头部和尾部组成。如图4所示为对T4噬菌体的最佳感染复数进行测试，可知当最佳感染复数为10-1时，获得噬菌体扩增后的浓度最高，因此10-1为噬菌体的最佳感染复数。如图5和图6为分别对T4噬菌体的温度和pH稳定性进行测试，可知噬菌体稳定性的最佳温度和pH条件分别为37℃和7.5。如图7中对T4噬菌体靶向性验证所示，T4噬菌体对大肠杆菌E.coli ATCC11303和ER 2738有靶向杀灭作用，而对非大肠杆菌的肺炎克雷伯菌K.pneumoniae ATCC13883无杀灭作用。
光敏分子的改性：对光敏分子改性至使其带偶联所需基团，本发明中使用溴乙胺一端上的溴和Rose Bengal(RB)上的羧基发生取代反应形成酯键，使得溴乙胺另一端的氨基被引入到RB上生成RB-NH2。具体的实施方案为：将RB、溴乙胺和DMF以摩尔比为1∶1.5∶130混合均匀，在75～85℃中反应6～8h(分别进行75℃反应8h、80℃反应7h、85℃反应6h三组试验)，期间使用薄层色谱分析法检测反应进程。反应结束后，通过减压蒸馏除去DMF，并先后在100mL的无水乙醚和超纯水中搅拌18h，期间更换3次无水乙醚和超纯水。紧接着，过滤后在甲醇中重结晶，在真空中除去残余甲醇，得到暗红色固体粉末——改性后的光敏分子RB-NH2。光敏分子改性完成后，本发明使用核磁共振氢谱、紫外-可见吸收光谱、质谱进一步确认其成功改性(如图8～10所示)，并测试光敏分子的光动力性能，根据图11可知，改性后的RB-NH2的光动力性能无明显变化，仍保持良好的光致活性氧性能。
噬菌体抗菌偶联物的构建：需要将噬菌体和改性后的光敏分子进行偶联，本发明中使用的噬菌体是T4噬菌体，使用的改性后光敏分子是RB-NH2。本发明的设计中需要使用RB-NH2上的氨基和T4噬菌体上的羧基发生缩合反应，生成酰胺键，实现RB-NH2和T4噬菌体的偶联。具体的实施方案为：取已知效价的T4噬菌体溶液，依次利用pH为5.5和8.5的PBS缓冲液调控反应溶液的pH值至7.5，经EDC和Sulfo-NHS活化后，根据噬菌体溶液的效价加入适量的摩尔浓度为1.0mM的RB-NH2的二甲基亚砜溶液(称取RB-NH2 1.016mg溶于1mL DMSO中)，混匀后，在低温摇床4～37℃下反应36～48h(分别进行4℃下反应48h、37℃下反应36h、15℃下反应44h、22℃下反应42h、30℃下反应40h五组试验)。反应结束后，在透析袋中透析24～36h(上述五组试验分别透析24h、36h、28h、32h、30h)，通过紫外-可见吸收光谱监测透析进程，期间更换透析液3次。结束后分别通过双层平板法和标准曲线法计算Phage-RB偶联物中的Phage和RB-NH2的有效浓度(即对于噬菌体抗菌偶联物上的光敏分子浓度，采用标准曲线法进行浓度测定，而对于噬菌体抗菌偶联物上的噬菌体效价则采用双层平板法进行效价测定)，最后将Phage-RB保存在4℃中。根据图12的标准曲线和图13的Phage-RB双层平板图可知所制备Phage-RB的浓度为8.2×108(3.48)PFU/mL(μM)。
噬菌体抗菌偶联物抗菌性能评估：首先通过LIVE/DEAD实验测试Phage-RB的靶向抗菌性能，如图15所示，Phage-RB对大肠杆菌E.coli ATCC 11303和ER 2738有靶向杀灭作用，而对非大肠杆菌的肺炎克雷伯菌K.pneumoniae ATCC 13883无杀灭作用。采用平板计数法对Phage-RB的抗菌性能进行评估，如图16所示，Phage-RB对E.coli ATCC 11303的抗菌效果远高于游离光敏分子RB-NH2和PBS对E.coli ATCC 11303的抗菌效果，当Phage-RB浓度为4.10×107(0.174)PFU/mL(μM)时，在30D+30L处理下(Phage-RB和细菌在黑暗下孵育30分钟后，继续在532nm的激光下照射30分钟)E.coli ATCC 11303存活率仅为3.36％，展现出良好的抗菌性能，类似地，测试了Phage-RB对耐药大肠杆菌ER 2738的抗菌性能，如图18所示，当Phage-RB的浓度分别为2.05×108(0.87)和4.10×108(1.74)PFU/mL(μM)时，ER 2738的存活率仅为4.24％和0％，展现出良好的抗耐药大肠杆菌性能。为了量化Phage-RB降低光敏分子RB-NH2的用量，对游离RB-NH2分别对E.coli ATCC 11303和ER 2738处理后，能够达到和Phage-RB相同抗菌效力时(即细菌存活率为3.36％或4.24％)，所需游离RB-NH2的浓度，如图20所示，当游离RB-NH2浓度为16μM时，E.coli ATCC 11303的存活率为2.42％，与Phage-RB浓度为4.10×107(0.174)PFU/mL(μM)时所达到的3.36％相近，此时Phage-RB中结合的RB-NH2浓度仅为游离RB-NH2浓度的1/92。类似地，如图22所示，当游离RB-NH2浓度为3.48μM时，ER 2738的存活率为4％，与Phage-RB浓度为2.05×108(0.87)PFU/mL(μM)时所达到的4.24％相近，此时Phage-RB中结合的RB-NH2浓度仅为游离RB-NH2浓度的1/4，结果表明双效协同的Phage-RB能够降低光敏分子RB-NH2的用量，避免暗毒性。
以上结果均证明Phage-RB有良好的靶向抗菌性能，且可有效对抗耐药大肠杆菌，并且该噬菌体抗菌偶联物可有效降低光敏分子RB-NH2的用量。
对于功能方面，本发明设计的Phage-RB能够实现靶向特定细菌(大肠杆菌)、噬菌体疗法与光动力疗法协同治疗。具体的治疗过程为：首先，在前30min中Phage-RB中的噬菌体会通过尾部识别特异性靶向结合到细菌感染部位的细菌上，与此同时，被偶联在噬菌体上的RB-NH2也会随着噬菌体与细菌的结合在细菌表面聚集，使得RB-NH2在细菌表面的浓度大大提高。紧接着，在接下来的30min中，使用532nm的激光照射感染部位，该波长的激光会激发细菌表面的Phage-RB产生单线态氧1O2，其能够直接对细菌的蛋白质、细胞膜造成破坏，从而杀灭细菌。
可见，本发明制备的噬菌体介导靶向光敏剂所采用的方法更加简单，操作钢架简便，且使用的原料成本更低，具有很好的推广前景。
Claims (10)
1.一种噬菌体介导靶向光敏剂，其特征在于：噬菌体头部的外壳蛋白上偶联有光敏分子；
所述噬菌体为头部外壳蛋白含有羧基基团的噬菌体；
所述光敏分子为含有氨基基团的光敏分子。
2.根据权利要求1所述噬菌体介导靶向光敏剂，其特征在于：
所述噬菌体为靶向大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)的T4噬菌体、T1噬菌体，或T7噬菌体；
所述光敏分子为氨基化的Rose Bengal。
3.权利要求1或2任一所述噬菌体介导靶向光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
取已知效价的噬菌体溶液，将噬菌体溶液的pH调节至6.5-7.5，并使用催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)进行活化，之后根据噬菌体溶液效价，加入光敏分子的二甲基亚砜溶液，混合均匀后，在低温摇床4～37℃下进行反应，反应结束后，透析得到噬菌体介导靶向光敏剂。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：
所述噬菌体溶液选用T4噬菌体溶液；
所述光敏分子选用氨基化的Rose Bengal；其中，Rose Bengal的氨基化过程具体如下：
将Rose Bengal和溴乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加热反应，待反应结束，减压蒸馏除去N,N-二甲基甲酰胺，并依次在无水乙醚和水中多次洗涤，过滤后在甲醇中重结晶，在真空中除去残余甲醇，得到改性后的光敏分子RB-NH2；
所述光敏分子的二甲基亚砜溶液为RB-NH2的二甲基亚砜溶液，摩尔浓度为1.0mM；
将噬菌体溶液和光敏分子的二甲基亚砜溶液混合均匀后，低温摇床反应36～48h，待反应结束后，透析得到噬菌体介导靶向光敏剂Phage-RB。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：
在对Rose Bengal进行氨基化的过程中，所述Rose Bengal、溴乙胺和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1∶1.5∶130，反应温度为75～85℃，反应时间为6～8h，期间使用薄层色谱分析法检测反应进程；反应完成后依次在无水乙醚和超纯水中搅拌洗涤至少18h，期间更换2～3次无水乙醚和超纯水。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：
调节pH时，首先利用pH为5.5的PBS缓冲液调节噬菌体溶液pH至6.0，再利用pH为8.5的PBS缓冲液将溶液pH调节至目标pH；
所述透析是指在透析袋中进行透析，时间为24～36h，通过紫外-可见吸收光谱监测透析进程，期间更换透析液2～3次。
7.权利要求1或2所述噬菌体介导靶向光敏剂在制备治疗细菌感染的抗菌剂中或者在制备杀灭细菌的光动力制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：
所述细菌为大肠杆菌E.coliATCC 11303或大肠杆菌ER 2738。
9.一种抗菌剂，其特征在于：其有效成分为权利要求1或2所述噬菌体介导靶向光敏剂。
10.一种光动力制剂，其特征在于：其有效成分为权利要求1或2所述噬菌体介导靶向光敏剂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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