CN117616132A - 基于nad(p)依赖性脱氢酶和黄递酶的一次性电化学生物传感器 - Google Patents

基于nad(p)依赖性脱氢酶和黄递酶的一次性电化学生物传感器 Download PDF

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Abstract

一种一次性生物传感器，所述一次性生物传感器包括：感测表面，所述感测表面至少具有工作电极部分和参比电极部分；第一试剂，所述第一试剂设置在所述工作电极部分上，从而形成工作电极，所述第一试剂包含NAD(P)依赖性脱氢酶、NAD(P)+、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂；以及参比电极材料，所述参比电极材料设置在所述参比电极部分上，从而形成参比电极。

Description

基于NAD(P)依赖性脱氢酶和黄递酶的一次性电化学生物传 感器
发明背景
1.发明领域
本发明总体涉及电化学生物传感器。具体地，本发明涉及使用脱氢酶作为催化剂来测定各种分析物的电化学生物传感器。
2.现有技术描述
存在许多测量各种分析物(包括但不限于葡萄糖、谷氨酸盐、乳酸盐、胆固醇、d-羟基丁酸盐、甘油、苹果酸盐、亮氨酸、醇等)的电化学传感器。一些电化学传感器被设计用于液体测量，并且一些被设计用于气体测量。
那些被设计用于液体测量的电化学传感器通常包括工作电极、参比电极和任选的反电极，并且还涉及使用相应氧化酶作为催化剂以用于执行分析。例如，测量葡萄糖时使用葡萄糖氧化酶，测量谷氨酸盐时使用谷氨酸氧化酶等。此外，处于其还原态的氧化还原调节剂参与化学反应，所述化学反应将氧化还原调节剂转化为其氧化态，以产生与被测量的分析物的量成比例的电流。
那些被设计用于气体测量的电化学传感器通常包括工作(或感测)电极、反电极，并且通常包括参比电极。这些电极被封装在与液体电解质接触的传感器外壳中。工作电极位于膜的内面上，所述膜对气体是多孔的，但对电解质是不可透过的。对于任何可由电化学传感器检测的气体，气体必须是电活性的。气体扩散到传感器中并穿过膜到达工作电极。当气体到达工作电极时，发生电化学反应；根据气体类型，发生氧化或还原。例如，一氧化碳可被氧化成二氧化碳，或者氧气可被还原成水。氧化反应导致电子通过外部电路从工作电极流向反电极。
相反地，还原反应导致电子从反电极流向工作电极。这种电子流构成了电流，所述电流与气体浓度成比例。相关联的仪器中的电子器件检测并放大电流并根据校准调整输出。然后，仪器显示气体浓度，例如有毒气体传感器显示百万分率(ppm)，并且氧气传感器显示体积百分比。大多数醇也是电活性的，这意味着它们在电荷转移步骤中经历氧化态的变化，或者化学键的断裂或形成。在开发醇燃料电池方面已经做了相当多的工作，并且由警察机构使用的几种醇呼吸计(即呼吸测醉仪)基于电化学传感器。
大多数呼吸测醉仪使用燃料电池传感器技术或半导体氧化物传感器技术来测量人血液中的血液醇含量(BAC)。燃料电池传感器依靠氧化呼吸样品中的醇的电化学过程。氧化产生电流，呼吸测醉仪测量所述电流以测定BAC。电流的强度对应于样品中存在的醇的体积。半导体氧化物传感器使用氧化锡物质来测量BAC。二氧化锡传感器用加热线圈加热钢网膜，并且当呼出的醇碰到加热的膜时，电阻发生变化。传感器电阻的变化被测量为固定或可变电阻器两端的输出电压的变化。传感器电阻与醇浓度之间存在直接关系。采用半导体传感器技术的呼吸测醉仪不如采用燃料电池传感器的呼吸测醉仪准确，并且其价格也更便宜。
发明内容
过去测量全血中醇浓度的工作很少。如先前所提及的，最常见的醇测量技术是呼吸测醉仪行业。尽管现有技术中已经提到使用醇脱氢酶来测量血液中的醇浓度，但由于此类传感器的各种缺点，醇传感器在一次性传感器中的使用是不实际的。这些缺点包括传感器保存期稳定性、响应灵敏度、浓度范围以及还原形式的可用氧化还原调节剂的数量。在不使用更复杂的储存要求的情况下，传感器保存期稳定性对于商业产品来说不够长。响应灵敏度较低，因此准确度会受到损害。浓度范围的低端也受到损害。
本发明是一种基于NAD(P)依赖性脱氢酶和黄递酶的一次性电化学生物传感器。黄递酶是能够氧化还原形式的NAD和NADP(诸如二磷酸和三磷酸吡啶核苷酸)的黄素蛋白酶。由于包括黄递酶，因此可使用氧化形式的氧化还原调节剂。通过使用氧化形式的氧化还原调节剂提供了多种优点。氧化还原调节剂以其氧化形式的使用相比其对应的还原形式在周围环境中更稳定，因此有益于一次性生物传感器的保存期稳定性。另一个优点是一次性生物传感器将产生更灵敏的响应。另一个优点是一次性生物传感器能够测量非常低浓度的被测量的分析物。另一个优点是氧化形式的氧化还原调节剂相比还原形式的氧化还原调节剂有更多的选择。另一个优点是氧化形式的氧化还原调节剂在周围环境中相比还原形式的氧化还原调节剂在相同环境中更稳定。此优点转化为一次性生物传感器不需要特殊的储存要求，如使用还原形式的氧化还原调节剂的一次性生物传感器所需的储存要求，以表现出相似的保存期稳定性。
本发明的一个目的是提供一种用于全血的一次性生物传感器，其具有良好的保存期稳定性而不需要特殊的储存条件。
本发明的另一个目的是提供一种用于全血的一次性生物传感器，其具有相比常规的一次性生物传感器更灵敏的响应。
本发明的另一个目的是提供一种用于全血的一次性生物传感器，其能够测量非常低浓度的感兴趣的物质/分析物。
本发明通过提供具有更长保存期稳定性、更灵敏响应以及测量非常低浓度的感兴趣物质/分析物的能力的一次性生物传感器来实现这些和其他目标。
在本发明的一个实施方式中，所述一次性生物传感器包括：感测表面，所述感测表面至少具有工作电极和参比电极；第一试剂，所述第一试剂设置在工作电极部分上，从而形成所述工作电极，所述第一试剂包含NAD(P)依赖性脱氢酶、NAD(P)+、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂；以及参比电极材料，所述参比电极材料设置在参比电极部分上，从而形成所述参比电极。
在本发明的另一个实施方式中，所述一次性生物传感器还包括：空白电极和第二试剂，所述第二试剂设置在空白电极部分上，从而形成所述空白电极，所述第二试剂包含NAD(P)+、黄递酶、氧化形式的氧化还原调节剂并且不含脱氢酶。
在本发明的一个实施方式中，用于形成所述参比电极的所述参比材料是Ag-AgCl或参比基质中的一者，所述参比基质包含选自由以下项组成的组的化学氧化试剂：还原形式的氧化还原调节剂、氧化形式的氧化还原调节剂以及还原形式的氧化还原调节剂和氧化形式的氧化还原调节剂的混合物。
在一个实施方式中，所述NAD(P)依赖性脱氢酶是以下项中的一者：醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、D-3-羟基丁酸脱氢酶、甘油脱氢酶、苹果酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶。
在一个实施方式中，所述氧化形式的所述氧化还原调节剂包括金属化合物或有机氧化还原化合物。
在一个实施方式中，所述氧化形式的所述氧化还原调节剂包括以下项中的至少一者：铁氰化钾、铁氰化钠、二茂铁及其衍生物、钌化合物诸如氯化六氨合钌(III)及其衍生物、锇络合物、1,10-菲咯啉-5,6-二酮、梅尔多拉蓝、四硫富瓦烯7,7,8,8-四氰基醌二甲烷、氢醌、二氯酚根苯酚、对苯醌、邻苯二胺和3,4-二羟基苯甲醛。
在一个实施方式中，所述第一试剂还包括聚合物、表面活性剂和缓冲剂。在另一个实施方式中，所述第一试剂还包括任选的填充试剂。
在一个实施方式中，所述第二试剂还包括聚合物、表面活性剂和缓冲剂。在另一个实施方式中，所述第二试剂还包括任选的填充试剂。
在本发明的另一个实施方式中，所述一次性生物传感器还包括：由电绝缘材料制成的基底层，所述基底层上勾画有至少两个电路，设置在所述基底层上的由电绝缘材料制成的通道形成层，以及设置在所述通道形成层上的由电绝缘材料制成的覆盖层。所述至少两个电路中的每一个沿着所述基底层纵向延伸，并且所述至少两个电路中的每一个都具有在基底层近侧端部部分和基底层远侧端部部分中的每一者处形成的导电接触垫，并且导电迹线将所述基底层近侧端部部分处的所述导电接触垫与所述基底层远侧端部部分处的对应导电垫电耦合。所述基底层远侧端部部分处的一个导电垫形成所述工作电极，并且所述基底层远侧端部部分处的另一个所述导电垫形成所述参比电极。所述通道形成层具有从通道层远端延伸预定距离的狭槽，所述预定距离足以暴露所述基底层远侧端部部分处的每个导电垫。所述通道形成层具有相比所述基底层的长度更短的长度，使得暴露所述基底近侧端部部分处的每个导电垫。设置在所述通道形成层上的所述覆盖层产生由所述通道形成层的所述狭槽勾画的样品室。所述覆盖层具有与覆盖层远端间隔开的通风开口，其中所述通风开口至少部分地与所述样品室连通。
在一个实施方式中，所述一次性生物传感器还包括：试剂保持层，所述试剂保持层位于所述基底层与所述通道形成层之间。所述试剂保持层在试剂保持层远端具有至少两个贯穿开口，其中所述至少两个贯穿开口中的一个与所述工作电极重合，并且所述至少两个贯穿开口中的另一个与所述参比电极重合。
在一个实施方式中，所述基底层具有沿着所述基底层纵向延伸的第三电路。所述第三电路具有在所述基底层近侧端部部分和所述基底层远侧端部部分中的每一者处形成的导电接触垫，并且导电迹线将所述基底层近侧端部部分处的所述导电接触垫与所述基底层远侧端部部分处的对应导电垫电耦合，从而形成空白电极。所述空白电极位于所述通道形成层的所述狭槽内。
在一个实施方式中，所述试剂保持层具有第三贯穿开口，其中所述第三贯穿开口与空白电极重合。
在一个实施方式中，公开了一种制造基于NADP依赖性脱氢酶和黄递酶的一次性生物传感器的方法。所述方法包括：提供感测表面，所述感测表面至少具有工作电极部分和参比电极部分；将第一试剂设置在所述工作电极部分上并且对形成第一电极基质的所述第一试剂进行干燥，从而产生工作电极；以及将参比电极材料设置在所述参比电极部分上，从而形成参比电极。所述第一试剂包含NAD(P)依赖性脱氢酶、NAD(P)+、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂。所述参比电极材料是Ag-AgCl或参比电极试剂中的一者，所述参比电极试剂至少包含选自由以下项组成的组的化学氧化试剂：还原形式的氧化还原调节剂、氧化形式的氧化还原调节剂以及还原形式的氧化还原调节剂和氧化形式的氧化还原调节剂的混合物，并且对所述参比电极试剂进行干燥，从而形成参比电极基质。
在另一个实施方式中，形成所述第一试剂包括：将预定量的所述NAD(P)依赖性脱氢酶、预定量的NAD+、预定量的黄递酶和预定量的氧化形式的氧化还原调节剂添加到预定量的水中。
在另一个实施方式中，所述方法包括：测量0.1克至0.5克的所述NAD(P)依赖性脱氢酶；测量0.02克至0.1克的所述NADP+；测量0.02克至0.5克的所述黄递酶；测量0.1克至0.5克的所述氧化形式的氧化还原调节剂；以及将所述NAD(P)依赖性脱氢酶、所述NAD(P)+、所述黄递酶和所述氧化还原调节剂添加到10毫升的水中。
在一个实施方式中，所述方法包括：测量0.2克至0.4克的所述NAD(P)依赖性脱氢酶；测量0.05克的所述NADP+；测量0.05克至0.2克的所述黄递酶；测量0.3克的所述氧化形式的氧化还原调节剂；以及将所述NAD(P)依赖性脱氢酶、所述NAD(P)+、所述黄递酶和所述氧化还原调节剂添加到10毫升的水中。
图式简单描述
图1是本发明的一次性生物传感器的一个实施方式的放大前透视图。
图2是图1所示的一次性生物传感器的分解透视图。
图3是本发明的一次性生物传感器的另一个实施方式的放大前透视图。
图4是图3所示的一次性生物传感器的分解透视图。
图5是本发明的一次性生物传感器的另一个实施方式的放大前透视图。
图6是图5所示的一次性生物传感器的放大俯视图。
图7是表1中数据的图示，示出使用结合氢化酶、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂铁氰化钾的醇生物传感器的醇生物传感器电流对醇浓度的结果。
图8是表2中数据的图示，示出使用结合氢化酶、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂氯化六氨合钌(III)的醇生物传感器的醇生物传感器电流对醇浓度的结果。
图9是表3中数据的图示，示出结合氢化酶、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂铁氰化钾的醇生物传感器的精度测试结果。
图10是表4中数据的图形表示，其示出包含氢化酶、黄递酶和氧化的氧化还原调节剂铁氰化钾的醇生物传感器对包含氢化酶、不含黄递酶和还原形式的氧化还原调节剂1,10-菲咯啉-5,6-二酮的醇生物传感器的结果的比较。
图11是表5中数据的图示，示出包含氢化酶、黄递酶和氧化的氧化还原调节剂铁氰化钾的醇生物传感器对包含氢化酶、不含黄递酶和还原形式的氧化还原调节剂1,10-菲咯啉-5,6-二酮的醇生物传感器的长期储存稳定性。
发明详述
本发明的优选实施方式如图1至图11所示。图1示出本发明的一个实施方式。一次性生物传感器10是多层、一体式生物传感器，其具有层合体12、电极端部部分14、电极端部14a、电接触端部部分16、电接触端部16a和通风开口52。电极端部部分14包括位于电极端部14a处的样品入口18与通风开口52之间的样品室17。电接触端部部分16具有至少三个电耦合垫16b、16c和16d，它们与位于样品测试室17内的相应电极电接触。在此实施方式中，一次性生物传感器10具有30mm(1.2英寸)的长度和5.5mm(0.22英寸)的宽度，然而此类尺寸是非限制性的。
现在转向图2，层合体12包括基底层20、试剂保持层30、通道形成层40和盖50。层合体12的所有层都由介电材料制成，优选地由塑料制成。优选的介电材料的示例是聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、尼龙、聚氨酯、硝酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、聚酯、聚酰亚胺、聚丙烯、聚乙烯和聚苯乙烯。
基底层20具有导电层21，在所述导电层上勾画了三个导电路径22、24和26。导电路径22、24、26可通过划线或刻划导电层21来形成。替代地，基底层20可以是电介质材料，在所述电介质材料上丝网印刷有导电路径22、24、26。可使用一片金聚酯膜并切割成如图2所示的形状，从而形成一次性生物传感器10的基底层20。
导电层21的划线或刻划可通过机械地充分划线导电层21来完成，以产生三个独立的导电路径22、24、26。本发明的优选划线或刻划方法通过使用二氧化碳激光器、YAG激光器或准分子激光器来完成。刻划线非常细，但足以产生三个独立的电路径。导电层21可由任何导电材料(诸如例如金、氧化锡/金、钯、其他贵金属或其氧化物、或碳膜组合物)制成。优选的导电材料是金或氧化锡/金。附加的刻划线28(放大且不按比例；仅出于说明的目的)可沿着基底层20的外边缘形成，在所述外边缘处导电层被移除，以避免可能引起噪声信号的可能的静电问题。然而，应当理解，刻划线28对于一次性生物传感器10的功能不是必需的。用于基底层20的优选导电材料是金或氧化锡/金涂覆的聚酯膜。
试剂保持层30具有暴露第一导电路径22的一部分的第一电极开口32、暴露第二导电路径24的一部分的第二电极开口34以及暴露第三导电路径26的一部分的第三电极开口36。试剂保持层30由塑料材料制成，优选地是可从宾夕法尼亚州格伦洛克的AdhesiveResearch有限公司或Global Instrument Corporation(GIC)(中国台湾)获得的医用级单面粘合带。用于本发明的带的可接受的厚度在约0.001英寸(0.025mm)至约0.005英寸(0.13mm)的范围内。优选的厚度约为0.003英寸(0.075mm)。应当理解，不需要使用带。试剂保持层30可由塑料片制成，并且可涂覆有压敏粘合剂、光致聚合物、超声粘合到基底层20、丝网印刷到基底层20上、或者3D打印到基底层20上以实现与使用上述聚酯带相同的结果。
三个电极开口32、34和36分别暴露每个导电路径22、24、26的一部分，从而限定工作电极部分20W、参比电极部分20R和空白电极部分20B，所述电极部分又分别限定电极井W、R和B并且容纳化学试剂，从而形成工作电极(W)、参比电极(R)和空白电极(B)。优选地，电极井W装载有NAD(P)依赖性脱氢酶、黄递酶和氧化形式的调节剂，所述NAD(P)依赖性脱氢酶能够催化涉及酶的衬底或与酶具有催化反应性的衬底的反应，所述氧化形式的调节剂能够转移在酶催化的反应与工作电极之间转移的电子，以产生表示酶或衬底活性的电流(其在公开待测量的示例中表示醇)，以及至少一种聚合物粘合剂。空白电极井B装载有与电极井W类似的化学物质，但不含脱氢酶。一种或多种化学组分，诸如附加的聚合物、稳定剂和填充剂可任选地包括在试剂基质中。将参比试剂基质装入电极井R中。
优选地，参比基质至少包含化学氧化试剂，诸如还原形式的氧化还原调节剂、氧化形式的氧化还原调节剂、或还原形式和氧化形式的氧化还原调节剂的混合物。例如，当使用优选的导电涂层材料时，可装载铁氰化钾或亚铁氰化钾或铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合物，以使参比电极起作用。可以制备铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合物，使得铁氰化钾浓度在高达约10％的范围内，而亚铁氰化钾浓度在高达约5％的范围内。替代地，参比电极(电极井R)可装载有Ag/AgCl层(例如，通过施加Ag/AgCl油墨或通过溅射涂覆(a)Ag层，然后氯化Ag或(b)Ag层上的AgCl层)或不需要氧化还原调节剂正常发挥作用的其他参比电极材料。应当指出的是，通道中工作电极、参比电极和空白电极的位置布置对于从传感器获得可用结果并不重要。
试剂保持开口的大小优选制成尽可能小，以便使一次性生物传感器的样品室尽可能短，从而最小化每次测试测量所需的样品的体积。三个试剂保持/电极开口32、34和36彼此对准并且彼此间隔约0.02英寸(0.508mm)至约0.05英寸(1.27mm)。圆形试剂容纳开口仅用于说明目的。应当理解，试剂保持开口的形状和电极中的每一个之间的距离并不重要。事实上，试剂保持开口的表面积可彼此不同，只要一个传感器与另一个传感器的表面积比率保持基本上恒定。
通道中工作电极、衬底电极和参比电极的位置布置对于从一次性生物传感器获得可用结果并不重要。样品流体通道内可能的电极布置可以是W-B-R、W-R-B、R-W-B、B-W-R、B-R-W或R-B-W，所列的布置是电极从层合体12的样品入口18到通风开口52出现。发现优选的位置是W-R-B；也就是说，当流体样品进入层合体12的采样端14时，流体样品将首先覆盖工作电极，然后是参比电极，并且然后是空白电极。
三个电极各自与单独的对应电耦合垫电接触。单独的对应电耦合垫被暴露以用于与读取设备进行电连接。
通道形成层40具有位于电极端部部分14处的通道凹口42。通道凹口42的长度使得当通道形成层40层合到试剂保持层30时，电极区域W、R和B位于由通道凹口42限定的空间内。通道凹口42的长度、宽度和厚度限定毛细管室容积。通道形成层40层合到试剂保持层30。与试剂保持层30类似，通道形成层40可由塑料片制成，并且可涂覆有压敏粘合剂、光致聚合物、超声粘合到试剂保持层30、丝网印刷到试剂保持层30上，或3D打印到试剂保持层30上。
通道形成层40由塑料材料制成，优选地是可从宾夕法尼亚州格伦洛克的AdhesiveResearch有限公司或Global Instrument Corporation(中国台湾)获得的医用级双面压敏粘合带。带的厚度优选地在约0.001英寸(0.025mm)至约0.010英寸(0.25mm)的范围内。通道凹口42可用激光器或通过模切(优选的方法)制成。通道凹口42的长度为约0.22英寸(5.7mm)至约0.250英寸(6.4mm)，宽度为约0.05英寸(1.3mm)至约0.07英寸(1.8mm)，并且厚度为约0.0039(0.1mm)至约0.009英寸(0.225mm)。应当理解，通道凹口42的厚度和大小并不重要。
层合到通道形成层40的盖50具有与一次性生物传感器10的电极端部14a间隔开的通风开口52，以确保样品室17中的样品将完全覆盖电极区域W、R和B。通风开口52定位在盖50中，使得它将暴露通道凹口42的部分并且在通道凹口42的封闭端部处或附近部分地覆盖所述通道凹口。通风开口52可以是任何形状，但被示出为尺寸为约0.08英寸(2mm)×约0.035英寸(0.9mm)的矩形。盖50的优选材料是聚酯膜。为了促进样品流体在样品室17内的毛细管作用，期望聚酯膜在聚酯膜的形成毛细管室的此部分上具有高亲水性表面。可使用来自3M或GIC的透明膜。盖50可任选地包括入口凹口54，以防止当将血液样品施加到样品室17时无意地阻塞样品入口18(这可阻止样品流体向电极的正确转移)。
图3示出3层一次性生物传感器10'。与4层实施方式类似，一次性生物传感器10'具有层合体12、电极端部部分14、电接触端部部分16和通风开口52。电极端部部分14包括在样品入口18与通风开口52之间的样品室17。电接触端部部分16具有三个离散的电耦合垫16b、16c和16d。
从图4可看出，层合体12包括基底层20、通道形成层40和盖50。如前所述，层合体12的所有层都由介电材料制成，优选地由塑料制成。与4层实施方式不同，3层实施方式中没有单独的试剂保持层。通道形成层40还勾画其中预定量的试剂混合物被设置在导电路径上作为分别在工作电极、参比电极和任选的空白电极上的三个不同的试剂基质涂层的区域。
现在转向图5，示出本发明的另一个实施方式，其示出一次性生物传感器430。一次性生物传感器430具有层合体432、样品接收井434和电接触端部436。层合体432具有基底层450和盖460。盖460具有样品开口462，当与基底层450组合时，所述样品开口形成样品接收井434。基底层450具有至少三个电路径452、454和456，所述三个电路径具有在电接触端部436处暴露以用于连接到计量设备(未示出)的第一部分和由样品接收井434暴露的第二部分。
由样品接收井434暴露的电路径452、454和456的第二部分产生至少工作电极W、空白电极B和至少参比/反电极R。第一试剂混合物470包含先前针对工作电极描述的设置在工作电极W上的混合物。第二试剂混合物472包含先前针对空白电极描述的设置在空白电极B上的混合物。参比/反电极R可包含先前公开的任何参比材料474。在本发明的此实施方式中，样品接收井434既用作样品入口又用作样品室，以用于接收诸如血液的流体样品以测定血液样品中的分析物。
应当理解，本文所公开的任何实施方式中的导管路径可由任何防腐蚀金属制成。诸如例如碳糊或碳墨的碳沉积物也可用作导管路径，所有这些都是本领域普通技术人员所熟知的。
化学试剂
酶
本发明的一次性生物传感器在工作电极W的试剂基质中至少包括化学试剂，所述化学试剂根据试剂基质中使用的脱氢酶消耗待测量的分析物。作为非限制性示例，当待测量的分析物是乙醇时，将使用醇脱氢酶。当待测量的分析物是谷氨酸盐时，另一个非限制性示例将是谷氨酸脱氢酶。如果血液样品包含干扰物，则空白电极在本发明中对于准确测定体液中的醇浓度是必不可少的。如前所述，使用这种空白电极有助于区分由乙醇引起的氧化电流与由样品流体中的其他可氧化物质引起的氧化电流。继续以醇为例，可从密苏里州圣路易斯的Sigma Chemical Company或新泽西州莱克伍德的Worthington BiochemicalCorporation商购获得的醇脱氢酶用于制备醇工作电极。例如，试剂混合物中醇脱氢酶的浓度在5mg/ml至100mg/ml的范围内，优选地在10mg/ml至50mg/ml的范围内，并且更优选在20mg/ml至40mg/ml的范围内。
黄递酶
黄递酶是工作电极试剂基质的重要组成部分。黄递酶是黄素蛋白类型的酶并且能够氧化还原形式的辅酶NAD。试剂基质中黄递酶的浓度在2mg/ml至50mg/ml的范围内，优选地在5mg/ml至20mg/ml的范围内。
化学氧化试剂
化学氧化试剂诸如氧化还原调节剂包括在一次性生物传感器中。优选使用氧化形式的氧化还原调节剂。还期望还原形式的调节剂能够在所施加的电位下在电极表面处被电化学氧化。还期望调节剂在试剂基质中稳定。当用于参比电极时，还期望调节剂能够使参比电极正常发挥作用。氧化还原调节剂可选自但不限于各种金属化合物和有机氧化还原化合物。可接受的氧化还原调节剂的示例包括：铁氰化钾(或钠)、二茂铁及其衍生物、铜化合物、亚硝酸盐化合物、钌化合物诸如氯化六氨合钌(III)及其衍生物和锇络合物、1,10-菲咯啉-5,6-二酮、梅尔多拉蓝、四硫富瓦烯7,7,8,8-四氰基醌二甲烷、四硫富瓦烯、TCNQ、氢醌、二氯酚根苯酚、对苯醌、邻苯二胺、3,4-二羟基苯甲醛等。优选的调节剂是铁氰化钾或氯化六氨合钌(III)。试剂混合物中铁氰化钾的浓度优选地在0.5％至10％的范围内，优选地在1％至5％的范围内，并且更优选地在试剂混合物的3％(w/w)的量内。试剂混合物中氯化六氨合钌(III)的浓度优选地在0.5％至5％的范围内，更优选在1％至2％的范围内。
酶辅因子
包括在一次性生物传感器10、10'、430的试剂基质中的酶辅因子是有机辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD)，由于使用了脱氢酶和黄递酶而使用它。试剂基质中辅因子的浓度在0.1％至2％的范围内，优选在0.2％至1％的范围内，并且更优选等于0.5％(w/w)。
聚合物
在试剂基质中用作粘合剂的聚合物应该是充分水溶性的，并且还应该能够将试剂中的所有其他化学物质稳定和粘合到电极区域中的导电表面层。合适的聚合物包括但不限于低分子量和高分子量聚环氧乙烷(PEO)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素(CMC)和聚氨基酸。试剂粘合剂可以是单一聚合物或优选浓度范围为约0.02％(w/w)至约7.0％(w/w)的聚合物的组合。本发明的试剂基质中优选的粘合剂是聚环氧乙烷(PEO)和甲基纤维素的组合。PEO的分子量范围为数千至数百万，可从美国纽约的Scientific Polymer Products获得。试剂基质中PEO的浓度优选地为约0.04％(w/w)至约2％(w/w)。以Methocel 60HG(美国威斯康星州密尔沃基的FlukaChemicals，目录号64655)的商品名获得的甲基纤维素在试剂基质中的浓度优选地在约0.02％(w/w)至约5％(w/w)的范围内。
表面活性剂
表面活性剂可任选地包括在试剂混合物中以促进试剂混合物分配到电极区域中。当样品流体进入一次性生物传感器的样品通道时，表面活性剂还有助于快速溶解干化学试剂。选择表面活性剂的量和类型以确保先前提及的功能并避免对酶的变性作用。表面活性剂可选自但不限于各种阴离子、阳离子、非离子和两性离子洗涤剂。可接受的表面活性剂的示例是聚氧乙烯醚、吐温20、胆酸钠水合物、十六烷基吡啶一水合物和CHAP。优选的表面活性剂是聚氧乙烯醚。更优选地，它是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇并且可以商标名Triton X-100获得。试剂混合物中Triton X-100的浓度优选地为约0.01％(w/w)至约2％。
缓冲剂
任选地，缓冲剂可以与干燥形式的氧化还原调节剂一起存在于本发明的传感器条中。缓冲剂以足够的量存在以便基本上维持试剂混合物的pH。合适的缓冲剂的示例包括柠檬酸、磷酸盐、Tris等。在本发明中，缓冲剂的pH优选地在约5.0至约8.5的范围内。
填充试剂
优选地将任选的水溶性填充剂和非活性成分添加到试剂混合物/基质中。当电极形成层用于包含试剂基质时，使用填充剂是有利的，使得当样品流体填充毛细管通道时，电极形成层中的电极开口不会截留气泡。各种糖诸如例如海藻糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、果糖、蔗糖、乳糖、乳糖醇、山梨糖醇、木糖醇、烟酰胺、麦芽糖等，可被添加到试剂混合物中，只要它们不与其他成分反应并且在电极表面上是非活性的。填充剂可以是一种化学物质或化学物质的组合。试剂混合物中填充剂的量在约1％至约15％(w/w)的范围内。
制备生物传感器
从以上描述可推断，基于NAD(P)依赖性脱氢酶和黄递酶的一次性电化学生物传感器的制备如下。
具有导电层21的基底层20如前所述形成并划线。通道形成层40如上所述形成并层合到基底层20。将预定量的第一试剂设置在工作电极部分20W上并干燥以形成工作电极W。将预定参比材料设置在参比电极部分20R上，从而形成参比电极R。在参比使用参比电极试剂的情况下，将预定量的参比试剂设置在参比电极部分20R上并对其进行干燥。在形成工作电极W和参比电极R之后，然后将覆盖层50层合到通道形成层40，使得通道凹口42定位成使得工作电极W和参比电极R定位在通道凹口42和通风开口52内，使得其至少部分覆盖通道凹口42的部分。
在包括试剂保持层30的实施方式中，将试剂保持层30直接设置在基底层20的导电层21上，使得贯穿开口32、34和任选地36暴露工作电极部分20W、参比电极部分20R和任选地空白电极部分20B。将预定量的第一试剂设置到贯穿开口32中并干燥以形成工作电极W。将预定参比材料设置在贯穿开口34中，从而形成参比电极R。在参比使用参比电极试剂的情况下，将预定量的参比试剂设置在贯穿开口34中并对其进行干燥。然后，将通道形成层40层合到试剂保持层30，使得贯穿开口32、34和任选地36驻留在通道凹口42内。然后，如前所述，将覆盖层50层合到通道形成层40。
血液样品中醇的测定
尽管下面的示例提供了用于测定血液样品中的醇的数据，但本领域普通技术人员应当理解，如前所公开的，血液中的其他分析物，诸如谷氨酸盐、葡萄糖、乳酸盐、胆固醇、羟基丁酸盐、甘油、苹果酸盐、亮氨酸等，也可使用合适的脱氢酶和黄递酶来测定，使得这些一次性生物传感器也具有先前所公开的优点。
对于醇生物传感器，当血液样品包含醇(在示例性情况下，醇是乙醇)时，发生的基本化学反应如下。
其中Medox是氧化形式的调节剂，Medred是还原形式的调节剂，并且e表示在电极表面处生成电流的电子。
对于醇生物传感器，工作电极和参比电极之间的偏置电位在100mv至500mv的范围内，优选地在300mV至400mV的范围内。范围内的电压值并不重要，但必须是恒定的。工作电极和参比电极之间的偏置电位导致调节剂在电极表面从还原态变为氧化态(见等式3)，并且从而基于血液中的醇浓度生成电流。
血液样品中醇的浓度值是使用血液分析仪获得的，所述血液分析仪被称为Dimension RxL化学分析仪，由纽约柏油村的Siemens Healthcare Diagnostics有限公司出售。使用CH Instruments恒电位仪，型号为CHI 812B或型号为CHI 660A获得来自分析物测试条的测试数据。
使用具有黄递酶和K3Fe(CN)6作为试剂基质中的调节剂的醇生物传感器进行醇测 定的测试数据
为了测定血液醇浓度与基于醇生物传感器的响应之间的线性响应，测试使用了9种不同浓度水平的乙醇。水平为0％、0.01％、0.02％、0.04％、0.08％、0.12％、0.16％、0.2％和0.25％。针对这些乙醇水平制备样品，并对每个乙醇浓度执行电流测量。对于每次测量，使用新的醇生物传感器条。表1示出在乙醇生物传感器具有包括乙醇脱氢酶、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂的工作电极试剂基质的情况下测定醇所获得的测试数据。氧化形式的氧化还原调节剂是铁氰化钾调节剂。
表1
醇浓度(％) 响应电流(uA)
0 0
0.01 0.095
0.02 0.185
0.04 0.397
0.08 0.809
0.12 1.214
0.16 1.538
0.2 1.847
0.25 2.259
图7示出工作电极(即基于乙醇脱氢酶的电极)对不同醇浓度的所测量电流响应。在测试的整个醇浓度范围内，电流响应与乙醇浓度呈线性关系。
使用醇生物传感器进行醇测定的测试数据，其中黄递酶和氯化六氨合钌(III)作 为试剂基质中的调节剂
除了一个更高的浓度水平之外，本示例中使用的醇浓度水平和数量与先前示例相同。也就是说，水平为0％、0.01％、0.02％、0.04％、0.08％、0.12％、0.16％、0.2％、0.25％和0.35％。针对这些乙醇水平制备样品，并对每个乙醇浓度执行电流测量。对于每次测量，使用新的醇生物传感器条。表1示出在乙醇生物传感器使用氯化六氨合钌(III)调节剂的情况下测定醇所获得的测试数据。
表2
醇浓度(％) 响应电流(uA)
0 0
0.01 0.106
0.02 0.198
0.04 0.412
0.08 0.861
0.12 1.225
0.16 1.598
0.2 2.034
0.25 2.493
0.35 3.354
图8示出工作电极(即基于乙醇脱氢酶的电极)对不同醇浓度的所测量电流响应。在测试的整个醇浓度范围内，电流响应与乙醇浓度呈线性关系。
使用黄递酶的乙醇生物传感器的精度测试结果，其中K3Fe(CN)6作为试剂基质中的 调节剂
为了测定乙醇生物传感器的精度响应，此测试使用2种不同浓度水平的乙醇。水平为0.05％和0.18％。针对这些乙醇水平制备样品，并对每个乙醇浓度执行电流测量。对于每次浓度水平测量，使用20个新的醇生物传感器条。表3示出在乙醇生物传感器使用黄递酶和铁氰化钾调节剂的情况下测定醇所获得的测试数据。
表3
/>
图9示出工作电极(即基于乙醇脱氢酶的电极)对两个醇浓度的所测量电流响应。对于每个醇浓度，20个乙醇生物传感器的平均值分别为0.543和1.721。百分比的变异系数分别为1.55和1.81。测试数据指示，一个醇生物传感器对另一个的响应相对精确。
醇生物传感器在氧化调节剂和还原调节剂之间的响应比较
为了测定血液醇浓度与基于(1)使用黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂的醇生物传感器和(2)使用还原形式的氧化还原调节剂且不含黄递酶的醇生物传感器的响应之间的灵敏度响应，测试使用9种不同浓度水平的乙醇。水平为0％、0.01％、0.02％、0.04％、0.08％、0.12％、0.16％、0.2％和0.25％。如前所述，在一组醇生物传感器中使用的氧化调节剂是铁氰化钾。醇生物传感器的对照组中的还原调节剂是还原形式的1,10-菲咯啉-5,6-二酮。
对于具有还原形式的氧化还原调节剂1,10-菲咯啉-5,6-二酮且不含黄递酶的醇生物传感器，当血液样品包含醇(在示例性情况下，醇是乙醇)时，发生的基本化学反应如下。
NAD(P)H+Medred----------＞NAD(P)+Medox 等式2a
其中Medox是氧化形式的调节剂，并且Medred是还原形式的调节剂。
对于这种具有还原形式的氧化还原调节剂而没有黄递酶的醇生物传感器，工作电极和参比电极之间的偏置电位在-50mv至-300mv的范围内，优选地在-100mV至-200mV的范围内。范围内的电压值并不重要，但必须是恒定的。工作电极和参比电极之间的偏置电位导致对照组中的调节剂在电极表面从氧化态变为还原态(见等式3a)，并且从而基于血液中的醇浓度生成电流。
针对以上提到的乙醇水平制备样品，并针对每个生物传感器组的每个乙醇浓度执行电流测量。对于每次测量，使用新的醇生物传感器。表4示出使用上述不同组乙醇生物传感器测定醇所获得的响应比较测试数据。
表4
图10示出针对每个醇生物传感器组的工作电极(即基于乙醇脱氢酶的电极)对不同醇浓度的所测量电流响应。在针对每个醇生物传感器组测试的整个醇浓度范围内，电流响应与乙醇浓度呈线性关系。然而，当使用氧化形式的调节剂和还原形式的调节剂的醇脱氢酶时，灵敏度指示严重的差异。如图标所示，具有氧化形式的调节剂和黄递酶的醇生物传感器在0至2.6微安范围内具有更灵敏的响应，相比之下，对于还原形式的调节剂且不含黄递酶的醇生物传感器在0至0.8微安范围内具有更灵敏的响应。由于响应更加灵敏，测量的准确度也提高。从以上方程式，本领域技术人员将认识到，当使用还原形式的调节剂时，黄递酶的存在不会影响反应，因为还原形式的调节剂失去NAD(P)H的电子，形成NAD(P)和氧化形式的调节剂。
醇生物传感器储存稳定性
为了测定包括NAD(P)依赖性脱氢酶、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂的醇生物传感器和使用还原形式的氧化还原调节剂且不含黄递酶的醇生物传感器的稳定性，对醇生物传感器执行为期12个月的比较。用新的醇传感器在乙醇浓度为0.15％的样品上读取每个读数。如前所述，在一组醇生物传感器中使用的氧化调节剂是铁氰化钾。醇生物传感器的对照组中的还原形式的调节剂是还原形式的1,10-菲咯啉-5,6-二酮。
对于使用黄递酶和铁氰化钾作为电子调节剂的醇生物传感器，工作电极和参比电极之间的偏置电位在100mv至500mv的范围内，优选地在300mV至400mV的范围内。对于具有还原形式的氧化还原调节剂1,10-菲咯啉-5,6-二酮且不含黄递酶的醇生物传感器，工作电极和参比电极之间的偏置电位在-50mV至-300mV的范围内，优选地在-100mV至-200mV的范围内。
针对以上提到的乙醇水平制备样品，并针对每个生物传感器组的0.15％浓度执行电流测量。对于每次测量，使用新的醇生物传感器。表5示出使用上述不同组乙醇生物传感器测定醇所获得的响应比较测试数据。
表5
图11示出在环境储存条件下，针对每个醇生物传感器组的工作电极(即基于乙醇脱氢酶的电极)的所测量电流响应。对于具有NAD(P)依赖性脱氢酶、氧化形式的氧化还原调节剂和黄递酶的醇生物传感器组，在整个12个月的时间段内，电流响应对乙醇浓度是稳定的。如以上图示和表5所示，对于具有还原形式的氧化还原调节剂且不含黄递酶的醇生物传感器组，电流响应在整个12个月的时间段内降低。事实上，很明显，在储存4th个月后，具有还原形式的氧化还原调节剂且不含黄递酶的醇生物传感器的电流响应开始下降，并且随着生物传感器变得越老，下降越快。如图表所示，具有还原形式的调节剂且不含黄递酶的醇生物传感器的响应从4个月储存寿命时的0.571微安(或平均0.574微安)降低到12个月储存寿命时的0.398微安。总之，醇生物传感器的反应随着年龄的增长而降低。
尽管本文中已描述本发明的优选实施方式，但以上描述仅为说明性的。各别领域技术人员将了解本文所揭露的本发明的其他修改，并且认为所有此类修改在如由附加权利要求书界定的本发明的范围内。

Claims (18)

1.一种一次性生物传感器，其包括：
感测表面，所述感测表面至少具有工作电极部分和参比电极部分；
第一试剂，所述第一试剂设置在所述工作电极部分上，从而形成工作电极，所述第一试剂包含NAD(P)依赖性脱氢酶、NAD(P)+、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂；以及
参比电极材料，所述参比电极材料设置在所述参比电极部分上，从而形成参比电极。
2.如权利要求1所述的一次性生物传感器，其中所述感测表面还包括空白电极部分和第二试剂，所述第二试剂设置在所述空白电极部分上，从而形成所述空白电极，所述第二试剂包含NAD(P)+、黄递酶、氧化形式的氧化还原调节剂并且不含脱氢酶。
3.如权利要求1所述的一次性生物传感器，其中所述参比材料是Ag-AgCl或参比基质中的一者，所述参比基质至少包含选自由以下项组成的组的化学氧化试剂：还原形式的氧化还原调节剂、氧化形式的氧化还原调节剂以及还原形式的氧化还原调节剂和氧化形式的氧化还原调节剂的混合物。
4.如权利要求1所述的一次性生物传感器，其中所述NAD(P)依赖性脱氢酶是以下项中的一者：醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、胆固醇脱氢酶、D-3-羟基丁酸脱氢酶、甘油脱氢酶、苹果酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶。
5.如权利要求1所述的一次性生物传感器，其中所述氧化形式的所述氧化还原调节剂包括金属化合物或有机氧化还原化合物。
6.如权利要求1所述的一次性生物传感器，其中所述氧化形式的所述氧化还原调节剂包括以下项中的至少一者：铁氰化钾、铁氰化钠、二茂铁及其衍生物、钌化合物诸如氯化六氨合钌(III)及其衍生物、锇络合物、1,10-菲咯啉-5,6-二酮、梅尔多拉蓝、四硫富瓦烯7,7,8,8-四氰基醌二甲烷、氢醌、二氯酚根苯酚、对苯醌、邻苯二胺和3,4-二羟基苯甲醛。
7.如权利要求1所述的一次性生物传感器，其中所述第一试剂还包括聚合物、表面活性剂和缓冲剂。
8.如权利要求7所述的一次性生物传感器，其中所述第一试剂还包括填充试剂。
9.如权利要求2所述的一次性生物传感器，其中所述第二试剂还包括聚合物、表面活性剂和缓冲剂。
10.如权利要求9所述的一次性生物传感器，其中所述第二试剂还包括填充试剂。
11.如权利要求1所述的一次性生物传感器，进一步包括：
由电绝缘材料制成的基底层，所述基底层上勾画有至少两个电路，所述至少两个电路中的每一个沿着所述基底层纵向延伸，其中所述至少两个电路中的每一个都具有在基底层近侧端部部分和基底层远侧端部部分中的每一者处形成的导电接触垫，并且导电迹线将所述基底层近侧端部部分处的所述导电接触垫与所述基底层远侧端部部分处的对应导电垫电耦合，其中所述基底层远侧端部部分处的一个导电垫形成所述工作电极，并且所述基底层远侧端部部分处的另一个导电垫形成所述参比电极；
设置在所述基底层上的由电绝缘材料制成的通道形成层，所述通道形成层具有从通道层远侧端部延伸预定距离的狭槽，所述预定距离足以暴露所述基底层远侧端部部分处的每个导电垫，所述通道形成层具有相比所述基底层的长度更短的长度，使得暴露所述基底近侧端部部分处的每个导电垫；以及
设置在所述通道形成层上的由电绝缘材料制成的覆盖层，所述覆盖层与所述通道形成层的所述狭槽一起产生样品室，所述覆盖层具有与覆盖层远侧端部间隔开的通风开口，其中所述通风开口至少部分地与所述样品室连通。
12.如权利要求11所述的一次性生物传感器，进一步包括试剂保持层，所述试剂保持层位于所述基底层与所述通道形成层之间，所述试剂保持层在试剂保持层远侧端部处具有至少两个贯穿开口，其中所述至少两个贯穿开口中的一个与所述工作电极重合，并且所述至少两个贯穿开口中的另一个与所述参比电极重合。
13.如权利要求11所述的一次性生物传感器，其中所述基底层具有沿着所述基底层纵向延伸的第三电路，其中所述第三电路具有在所述基底层近侧端部部分和所述基底层远侧端部部分中的每一个处形成的导电接触垫，并且导电迹线将所述基底层近侧端部部分处的所述导电接触垫与所述基底层远侧端部部分处的对应导电垫电耦合，从而形成空白电极，其中所述空白电极位于所述通道形成层的所述狭槽内。
14.如权利要求13所述的一次性生物传感器，其中所述试剂保持层具有第三贯穿开口，其中所述第三贯穿开口与所述空白电极重合。
15.一种制造基于NADP依赖性脱氢酶和黄递酶的一次性生物传感器的方法，所述方法包括：
提供感测表面，所述感测表面至少具有工作电极部分和参比电极部分；
将第一试剂设置在所述工作电极部分上，所述第一试剂包含NAD(P)依赖性脱氢酶、NADP+、黄递酶和氧化形式的氧化还原调节剂，并且对形成第一电极基质的所述第一试剂进行干燥，从而产生工作电极；
将参比电极材料设置在所述参比电极部分上，从而形成参比电极，其中所述参比电极材料是Ag-AgCl或参比电极试剂中的一者，所述参比电极试剂至少包含选自由以下项组成的组的化学氧化试剂：还原形式的氧化还原调节剂、氧化形式的氧化还原调节剂以及还原形式的氧化还原调节剂和氧化形式的氧化还原调节剂的混合物，并且对所述参比电极试剂进行干燥，从而形成参比电极基质。
16.如权利要求15所述的方法，进一步包括：形成所述第一试剂，所述形成所述第一试剂包括：将预定量的所述NAD(P)依赖性脱氢酶、预定量的NADP+、预定量的黄递酶和预定量的氧化形式的氧化还原调节剂一起添加在预定量的水中。
17.如权利要求16所述的方法，进一步包括：
测量0.1克至0.5克的所述NAD(P)依赖性脱氢酶；
测量0.02克至0.1克的所述NAD(P)+；
测量0.02克至0.5克的所述黄递酶；
测量0.1克至0.5克的所述氧化形式的氧化还原调节剂；以及
将所述NAD(P)依赖性脱氢酶、所述NAD(P)+、所述黄递酶和所述氧化还原调节剂添加到10毫升的水中。
18.如权利要求16所述的方法，进一步包括：
测量0.2克至0.4克的所述NAD(P)依赖性脱氢酶；
测量0.05克的所述NAD(P)+；
测量0.05克至0.2克的所述黄递酶；
测量0.3克的所述氧化形式的氧化还原调节剂；以及
将所述NAD(P)依赖性脱氢酶、所述NAD(P)+、所述黄递酶和所述氧化还原调节剂添加到10毫升的水中。
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