CN117612599A - 用于空间组学分析的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于空间组学分析的装置和方法。针对目前基于微流控的空间组学技术方案存在的问题，本发明提出利用蛇形管道微流控装置结合多轮DNA标记反应对基片进行高效的空间标记，既可以将多个核酸阵列拼接在一起分析，进而实现大面积组织切片的空间组学分析，也可以同时处理多个空间组学样本，有效提高分析通量。其中，本发明的“拼接芯片技术”，其实现的效果近似于在液晶显示器领域中用多个较小的液晶显示器拼接成一个更大的显示器来显示更大的图像。

Description

用于空间组学分析的装置和方法

技术领域

本发明涉及空间组学分析法，具体地涉及空间组学多区域拼接和高通量的空间组学样本处理，特别是用蛇形管道微流控装置和多轮DNA标记反应进行空间组学的多区域拼接，以及利用蛇形管道微流控装置和多轮DNA标记反应进行高通量的空间组学样本处理，再通过测序技术对组织的空间分子图谱进行分析。

背景技术

动物个体是由数万亿个细胞组成的复杂系统，不同的细胞在特定的空间位置与其周围微环境协同作用进而维持器官的功能。研究器官组织中细胞的空间分布及其分子表达图谱对于研究和理解肿瘤生物学、细胞生物学、发育生物学等来说至关重要。而空间组学技术能获得细胞在组织生理环境下的空间分子图谱特征，如转录组图谱、表观组学图谱、蛋白质组学图谱等，是研究组织空间生物学功能的重要技术手段。

目前已报道了多种方法用于空间组学研究，例如采用自动化微量点样装置制备核酸微阵列芯片并用于空间转录组分析的技术，如将测序微球平铺于载玻片并结合原位测序技术制备核酸阵列芯片用于空间转录组和基因组分析的技术，以及利用微流控技术和确定性条形码策略正交标记mRNA来分析空间转录组的技术。因其灵活性和多用途的特点使得基于微流控的确定性条形码技术成为空间组学技术中重要的方法。然而，基于微流控的确定性条形码技术在高分辨率条件下难以对大面积组织进行空间标记，例如在15微米分辨率下50个平行通道的A和B芯片仅可标记1.5×1.5平方毫米的组织，而许多器官和组织都在厘米级甚至更大。

因此，目前基于微流控的空间组学技术最主要的问题是难以在高分辨率条件下对大面积组织切片进行空间标记。在已报道的方法中，想要增加点阵的微点数则需增加芯片的通道数。例如，将阵列的微点数从50×50变为200×200则需要分别将微流控芯片A和B的通道数增加至200条。通过增加微流控芯片通道数的方式来增加点阵的微点虽然直接但是会带来诸多问题。首先，随着微流控芯片通道的增加，对应的核酸标签数也在增加，这会显著增加合成核酸标签的成本；其次，由于微流控芯片硅片尺寸的限制，使得微流控芯片上可以增加的通道数也非常有限，进而限制了点阵的微点数。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提出利用蛇形管道微流控装置结合多轮DNA标记反应对组织切片进行高效的空间标记，通过将多个核酸阵列拼接在一起分析，进而实现大面积组织切片的空间组学分析，以及利用蛇形管道微流控装置和多轮DNA标记反应进行高通量的空间组学样本处理。其中，本发明的大面积组织分析技术简称作“拼接芯片技术”，其实现的效果近似于在液晶显示器领域中用多个较小的液晶显示器拼接成一个更大的显示器来显示更大的图像。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于空间组学多区域拼接的核酸阵列装置，其包括在芯片基底上设置的分子阵列，所述分子阵列包括：

沿第一方向平行设置的由带A标签的分子点组成的x个行，其中，x为10-500的整数，优选30-300，进一步优选50-200，如50、60、70、80、90、100、120、200、250、300等；

沿第二方向平行设置的由带B标签的分子点组成的y个列，其中，y为10-500的整数，优选30-300，进一步优选50-200，如50、60、70、80、90、100、120、200、250、300等；和

所述分子阵列包含z个由带有C标签的分子点组成的子阵列，其中，z为2-100的整数，优选2-50，更优选2-30，进一步优选2-20，如2、3、6、8、9、12、16、25、30、36等；

其中，所述x个行包含行数为m的多个行组；和/或所述y个列包含列数为n的多个列组，其中，m和n各自分别为2-100的整数，优选2-50、2-30，如2、3、6、9等。所述子阵列的行数为m以下和列数为n以下。

在某些实施方案中，根据第一方面所述的用于空间组学多区域拼接的阵列装置，其中，每个行内的分子点对应的A标签相同，但不同行之间的分子点对应的A标签不同，分别标记为A1至Ax；每个列内的分子点对应的B标签相同，但不同列之间的分子点对应的B标签不同，分别标记为B1至By；每个子阵列内的分子点的C标签相同，但不同子阵列之间的C标签不同，分别标记为C1至Cz。

在某些实施方案中，根据第一方面所述的用于空间组学多区域拼接的阵列装置，其中，所述分子阵列的不同行之间的间隔为1-1000微米，优选5-800微米，更优选5-600微米，还优选12-400微米，15-300微米，15-200微米，15-150微米，25-100微米，35-80微米，50-60微米；和/或不同列之间的间隔为1-1000微米，优选5-800微米，更优选5-600微米，还优选12-400微米，15-300微米，15-200微米，15-150微米，25-100微米，35-80微米，50-60微米。

在某些实施方案中，根据第一方面所述的用于空间组学多区域拼接的阵列装置，其中，不同行组之间的间隔为5-10000微米，优选10-4000微米，更优选30-3000微米，进一步优选90-2000，还优选300-1500微米，500-1000微米，如60微米、90微米、120微米、300微米、900微米、1200微米、1500微米，2000微米；和/或不同列组之间的间隔为5-10000微米，优选10-4000微米，更优选30-3000微米，进一步优选90-2000，还优选300-1500微米，500-1000微米，如60微米、90微米、120微米、300微米、900微米、1200微米、1500微米，2000微米。

在某些实施方案中，行组之间的间隔大于行之间的间隔，和/或列组之间的间隔大于列之间的间隔。

本发明的第二方面，提供一种用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其中，所述微流控装置组件包括多个不同的微流体装置，如第一微流体装置、第二微流体装置和第三微流体装置。

在某些实施方案中，根据本发明第二方面所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其中，所述第一微流体装置包括进样孔区、出样孔区和蛇形管道组区；其中：

所述进样孔区域设置有若干进样孔，用于存储独立的试剂；

所述出样孔区域设置有若干出样孔，用于对应进样孔试剂的收集；

所述第一微流体装置包含若干微通道，每个微通道两端分别连接一个进样孔和一个出样孔，相邻通道由通道壁隔开；

所述蛇形管道区中，若干微通道平行排布形成第一通道组，第一通道组沿第一方向流动，第一通道组的流动方向存在i次180°转向，转向次数i在1-50间，优选2-45、3-40、4-35、5-30、6-25、7-20、8-15等，进而形成第一通道组区，其包含多个以一定间距重复的第一通道组，通道的间距d1在5-10000微米，优选10-4000微米，更优选30-3000微米，进一步优选90-2000，还优选300-1500微米，500-1000微米，如60微米、90微米、120微米、300微米、900微米、1200微米、1500微米，2000微米。

在某些实施方案中，根据本发明第二方面所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其中，所述第二微流体装置包括进样孔区、出样孔区和蛇形管道组区；其中：

所述进样孔区域设置有若干进样孔，用于存储独立的试剂；

所述出样孔区域设置有若干出样孔，用于对应进样孔试剂的收集；

所述第二微流体装置包含若干微通道，每个微通道两端分别连接一个进样孔和一个出样孔，相邻通道由通道壁隔开；

所述蛇形管道区中，若干微通道平行排布形成第二通道组，第二通道组沿第二方向流动，第二通道组的流动方向存在j次180°转向，转向次数j在1-50间，优选2-45、3-40、4-35、5-30、6-25、7-20、8-15等，进而形成第二通道组区，其包含多个以一定间距重复的第二通道组，通道的间距d2在5-10000微米，优选10-4000微米，更优选30-3000微米，进一步优选90-2000，还优选300-1500微米，500-1000微米，如60微米、90微米、120微米、300微米、900微米、1200微米、1500微米，2000微米。

在某些实施方案中，根据本发明第二方面所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其中，所述第三微流体装置包括多个方形进样孔，所述方形进样孔间设置有间隔。

优选地，所述方形进样孔的布局与所述第一、第二微流体装置相交后的子矩阵一致。

优选地，所述方形进样孔的面积(U×W)与所述第一、第二微流体装置正交后的子矩阵面积相等或不等。

在某些实施方案中，根据本发明第二方面所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其中，其材料包括聚二甲基硅氧烷、二氧化硅、硅和/或聚苯乙烯等。

在某些实施方案中，根据本发明第二方面所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其中，第一流动方向与第二流动方向相交，优选地为垂直。

在某些实施方案中，根据本发明第二方面所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其中，所述微流体装置组件包含5-500个，优选10-400个，更优选20-300个，还优选25-250，进一步优选30-200个，如50个、60个、80个、100个、120个、140个、160个、180个宽度可变的微通道，通道宽度在1-1000微米，优选10-250微米，15-200微米，20-150微米，30-100微米，如10微米、15微米、25微米、35微米、50微米、100微米等，通道壁的宽度在1-1000微米，优选10-250微米，15-200微米，20-150微米，30-100微米，如10微米、15微米、25微米、35微米、50微米、100微米等,每个通道具有入口和出口，入口直径可大于出口。

本发明的第三方面，提供一种空间组学多区域拼接的方法，其利用微流控装置组件结合多轮DNA标记反应进行多区域空间组学的拼接，再通过测序技术对组织的空间分子图谱进行分析，具体步骤如下：

(1)利用第一微流体装置将带有修饰基团的核酸标签分子A递送至基片的蛇形盘管区域，其中基片表面带有活性功能基团可与核酸分子A的修饰基团反应；

(2)利用第二微流体装置将核酸标签分子B递送至基片的蛇形盘管区域，使所述核酸标签分子B连接到核酸分子A末端；

(3)利用第三微流体装置将核酸标签分子C递送至基片的蛇形盘管区域，使所述核酸标签分子C连接到核酸分子B末端；

(4)将组织切片样本贴于基片的蛇形盘管区域，释放组织样品中的分析物并被核酸标签分子C捕获；和

(5)利用测序技术获取分析物的信息以及对应分析物上A、B、C分子的信息，并还原出分析物的空间信息和丰度信息。

在某些实施方案中，根据本发明第三方面所述的方法，其中：步骤(1)中所述核酸标签分子A有x种，x的数值与行数一致，优选x的范围在5-500，每种A分子都有特定的核酸序列作为空间定位信息，同时每个A分子还含有PCR扩增序列以及与桥梁分子L1互补配对的核酸序列。

在某些实施方案中，根据本发明第三方面所述的方法，其中：步骤(1)中所述核酸标签分子A带有的功能基团包括氨基、羧基、环氧基、巯基、醛基、生物素和/或丙烯酰胺等。

在某些实施方案中，根据本发明第三方面所述的方法，其中：步骤(1)中所述基片的材料包括二氧化硅、氧化铟锡、硅和聚甲基丙烯酸甲酯中的一种。

在某些实施方案中，根据本发明第三方面所述的方法，其中：步骤(1)中所述基片表面的活性功能基团包括但不限于氨基、羧基、环氧基、巯基、醛基中的一种；

在某些实施方案中，根据本发明第三方面所述的方法，其中：步骤(2)中所述核酸标签分子B有y种，y的数值与列数一致，优选地，y的范围在5-500，每种B分子都有特定的核酸序列作为空间定位信息，以及与桥梁分子L1和L2互补配对的核酸序列；

在某些实施方案中，根据本发明第三方面所述的方法，其中：步骤(3)中所述核酸标签分子C有z种，z的数值与子阵列数一致，优选地，z的范围在2-100，每种C分子都含有与桥梁分子L2互补配对的核酸序列，与特定核酸捕获序列优选为PolyT，唯一分子标识符(UMI)序列，以及特定的核酸序列作为空间定位信息。

在某些实施方案中，根据本发明第三方面所述的方法，其中，经过第一微流体装置的x种A分子标记以及第二微流体装置的y种B分子标记，可形成多个重复的x×y矩阵，再利用第三微流体装置的z种C分子标记便可区分这些重复的x×y矩阵，进而得到一个x×y×z的大矩阵。

本发明的第四方面，提供一种高通量的空间组学方法，其特征在于，利用微流控装置组件结合多轮DNA标记反应，在同一个基片上同时处理多个空间组学样本，再通过测序技术对组织的空间分子图谱进行分析，具体步骤如下：

(1)利用第一微流体装置将带有修饰基团的核酸标签分子D递送至基片的蛇形盘管区域，其中基片表面带有活性功能基团可与核酸分子D的修饰基团反应；

(2)利用第二微流体装置将核酸标签分子E递送至基片的蛇形盘管区域，使所述核酸标签分子E连接到核酸分子D末端；

(4)将组织切片样本贴于基片的蛇形盘管区域，利用第三微流体装置将不同区域的组织分隔开，释放组织样品中的分析物并被核酸标签分子E捕获；

(5)分别用样本对应的引物扩增测序文库，进而区分不同样本；

(6)利用测序技术获取分析物的信息以及对应分析物上D和E分子的信息，并还原出分析物的空间信息和丰度信息。

在某些实施方案中，根据本发明第四方面所述的方法，其中：步骤(1)中所述核酸标签分子D有x种，x的数值与行数一致，每种D分子都有特定的核酸序列作为空间定位信息，同时每个D分子还含有PCR扩增序列以及与桥梁分子L3互补配对的核酸序列。

在某些实施方案中，根据本发明第四方面所述的方法，其中：步骤(1)中所述核酸标签分子D带有的功能基团包括氨基、羧基、环氧基、巯基、醛基、生物素和/或丙烯酰胺。

在某些实施方案中，根据本发明第四方面所述的方法，其中：步骤(2)中所述核酸标签分子E有y种，y的数值与列数一致，每种E分子都有特定的核酸序列作为空间定位信息，以及与桥梁分子L3互补配对的核酸序列,与特定核酸捕获序列优选为PolyT，唯一分子标识符(UMI)序列，以及特定的核酸序列作为空间定位信息；

在某些实施方案中，根据本发明第三和第四方面所述的方法，其中，将一个组织切片贴于基片的蛇形盘管区域，或者将多个相同或不同组织类型的切片贴于同一基片蛇形盘管的不同位置。

在某些实施方案中，根据本发明第三和第四方面所述的方法，其中，所述释放的分析物包括RNA分子、DNA分子、蛋白质和代谢物中的一种或多种。

本发明某些实施方案显著提高核酸分子标签的利用率，进而降低合成核酸分子标签的成本。例如，同样制备一个有4.4万个微点的阵列，基于传统微流控正交方案需要420种核酸标签分子，而本发明仅需147种核酸标签分子。

本发明某些实施方案显著提高空间转录组芯片的面积，以分析大面积组织的空间图谱。由于微流控装置的局限，传统基于微流控装置的方案难以达到厘米级的空间转录组分析，而本发明的蛇形盘管的设计结合多轮核酸连接技术巧妙的增加了芯片标记的面积，进而实现了大面积组织的空间组学分析。

本发明某些实施方案提高空间组学样本制备通量，降低样本间的批次效应。本发明还可以在一张基片上同时实现做多种组织的空间组学分析，进而显著降低由于样本制备过程中引入的批次效应。

附图说明

图1为利用蛇形盘管微流控装置和3轮核酸标记反应对大面积组织切片进行空间组学分析的流程图。

图2为示例性具体实施例中一种微流体装置的结构示意图。(图2A)为第一微流体装置的整体结构图；(图2B)为图2A中圆圈标示部分放大后的结构示意图。注：1为进样孔区域，2为蛇形通道区域，3为出样孔区域，21为第一蛇形区域，22为第二蛇形区域，23为第三蛇形区域，d1为相邻两蛇形区域的间距。

图3为示例性具体实施例中一种微流体装置的结构示意图。(图3A)为第二微流体装置的整体结构图；(图3B)为图3A中圆圈标示部分放大后的结构示意图。注：1为进样孔区域，2为蛇形通道区域，3为出样孔区域，21为第一蛇形区域，22为第二蛇形区域，23为第三蛇形区域，d2为相邻两蛇形区域的间距。

图4为示例性具体实施例中一种微流体装置的结构示意图。(图4A)为第一、第二微流体装置正交后形成的点阵示意；(图4B)为第三微流体装置的结构图。

图5为利用蛇形盘管微流控装置和多轮核酸连接反应制备核酸点阵的荧光图。

图6为利用双色荧光实验评估相邻子矩阵间核酸标签分子的交叉污染情况。

图7为不同方法核酸标签分子利用效率对比图。

图8为出生三天幼龄小鼠的空间转录组测序结果图。(图8A)为幼龄小鼠转录组测序数据的无监督聚类图；(图8B)为幼龄小鼠转录组测序数据无监督聚类的空间映射图。

图9为示例性具体实施例中一种15微米分辨率的微流体装置结构示意图。注：1为进样孔区域，2为蛇形通道区域，3为出样孔区域，21为第一蛇形区域，22为第二蛇形区域，23为第三蛇形区域，d1为相邻两蛇形区域的间距。

图10为利用传统微流控空间组学技术和本发明的技术分别对小鼠大脑切片进行空间转录组分析的结果图。

图11为示例性具体实施例中一种50微米分辨率的微流体装置结构示意图。

图12为在同一个基片上同时分析9种类型组织的空间转录组结果图。

图13为对比评估本发明示例性方法和传统方法批次效应的结果图。(图13A)评估方案的示意图；(图13B)为四个切片空间转录组的相关性图；(图13C)为无监督聚类分析玻片间和玻片内连续切片的批次效应。

图14为示例性具体实施例中一种25微米分辨率的微流体装置结构示意图。注：1为进样孔区域，2为蛇形通道区域，3为出样孔区域，21为第一蛇形区域，22为第二蛇形区域，23为第三蛇形区域，24为第四蛇形区域，25为第五蛇形区域，d3为相邻方形进样孔的间距。

图15为示例性具体实施例中一种50微米分辨率的微流体装置结构示意图。注：1为进样孔区域，2为蛇形通道区域，3为出样孔区域，21为第一蛇形区域，22为第二蛇形区域，23为第三蛇形区域，d3为相邻方形进样孔的间距。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本文中，术语“空间组学”是指将组学与空间信息相结合的研究方法。在组学中研究对象可以是基因、蛋白质、代谢产物等生物分子，而空间信息则是指这些分子在细胞、组织和器官中的分布和相互作用。通过对这些高维数据的分析，可以揭示生物系统的结构和功能，从而为疾病诊断、治疗和药物研发提供新的思路和方法。本文中，空间组学包括但不限于转录组图谱、表观组学图谱、蛋白质组学图谱等。

本文中，术语“通道”与“微通道”具有相同含义，除非另有说明，均指在基材上形成的细长凹槽结构。

本文中，术语“通道组”与“蛇形区域”具有相同含义，均是指由若干微通道的一部分平行排布所形成的一组通道。优选地，通道组内各通道之间的间隔相等。

本文中，术语“通道组区”与“蛇形管道区”具有相同含义，均是指由若干个通道组或蛇形区域组成的区域。不同通道组区之间的间隔与通道组内通道之间的间隔可以相等或不等。优选地，不同通道组区之间的间隔与通道之间的间隔不等，从而能够更有利于区分不同通道组。

实施例1

本实施例通过蛇形盘管微流控装置和3轮核酸连接反应对大面积的组织切片进行空间分子标记，再通过测序技术获得对应组织中被标记生物分子的二维位置信息和生物学信息，进而实现大面积生物组织切片的空间生物分子图谱分析。如图1所示，本实施例利用本发明的方法对刚出生3天的幼龄小鼠进行空间转录组分析，展示了在50微米空间分辨率下厘米级大组织切片的空间转录组分析。

一、本实施例的芯片设计

如图2和图3所示，本实施例芯片设计的第一微流体装置和第二流体装置各自含有70个平行的微流体通道，通道的宽度为50微米，相邻两个通道被50微米通道壁隔开。第一微流体装置和第二流体装置的70个平行通道往复回折2次形成蛇形盘管区，进而形成3个重复的通道密集区，相邻两个通道密集区的间距为300微米。第一微流体装置和第二流体装置的通道在蛇形盘管区域正交。

如图4所示，本实施例进一步设计第三微流体装置3×3个矩形进样孔，进样孔的面积为7.05×7.05平方毫米，进样孔间的间隔为0.2毫米。本实施例设计的微流体装置均采用软光刻法加工而成，芯片的材料为PDMS(聚二甲基硅氧烷)。

二、利用蛇形盘管微流控装置制备微阵列芯片

准备70种5’端带有氨基修饰的核酸标签分子A，每种A分子带有的核酸序列标签不同。分别将70种A核酸分子与EDC/NHS(碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)溶液混合并配制成浓度为10微摩尔的核酸溶液。将第一微流体装置与表面修饰有羧基基团的载玻片贴合，然后向第一微流体装置的进样孔分别加入70种核酸分子A的EDC/NHS混合液，负压驱动核酸混合泳进入装置通道中，待其反应2小时(第一微流体装置见图2)。

准备70种5’端带有磷酸基团修饰的核酸标签分子B以及桥梁核酸分子L1，每种B分子带有的核酸序列标签不同。分别将B分子与桥梁分子L1等体积混合后，再加热处理该液体使B分子与L1分子杂交形成B-L1杂交核酸分子。分别将70种B-L1分子与T4连接酶混合后得到70种B-L1-T4混合液并置于4℃待用。移除核酸分子A的混合液，揭下第一微流体装置，将连接有核酸分子A的载玻片放置到清洗液(2X SSC和0.1％ SDS)中清洗30min以洗掉载玻片表面没有共价结合的A分子。将第二微流体装置与清洗后的载玻片贴合，然后向第二微流体装置的进样口分别加入70种B-L1-T4混合液。负压驱动核酸混合泳进入装置通道中，待其反应2小时(第二微流体装置见图3)。

准备9种5’端带有磷酸基团修饰的核酸标签分子C以及桥梁核酸分子L2，每种C分子带有的核酸序列标签不同且每个分子3’末端带有PolyT。分别将C分子与桥梁分子L2等体积混合后，再加热处理该液体使C分子与L2分子杂交形成C-L2杂交核酸分子。分别将9种C-L2分子与T4连接酶混合后得到9种C-L2-T4混合液并置于4℃待用。移除核酸分子B的混合液，揭下第二微流体装置，将连接有核酸分子A-B的载玻片放置到清洗液(2X SSC和0.1％SDS)中清洗30min以洗掉载玻片表面没有共价结合的分子。将第三微流体装置与清洗后的载玻片贴合，然后向第三微流体装置的进样口分别加入9种C-L2-T4混合液，待其反应2小时。反应结束后用清洗液清洗载玻片(第三微流体装置见图4)。

至此，获得一个核酸点阵，该点阵由4.41万个核酸点组成(70×70×9)。图5展示了本实施例获得的核酸点阵荧光图。该点阵由9个子点阵组成(由9种C核酸区分)，每个子点阵由4900个50微米大小的核酸点组成(70×70)。利用双色荧光实验评估了该矩阵的不同子阵列之间是否存在交叉污染，图6结果表明本发明中不同子矩阵间不存在核酸标签的串扰和交叉污染。在本实施例中仅用147种核酸标签分子即可制备总面积在21.6×21.6平方毫米的核酸阵列芯片，其面积远大于同样基于微流控装置制备的核酸阵列芯片，以上结果表明本发明对于核酸标签分子的利用率远大于已报道的技术(图7)。

三、空间转录组测序分析刚出生3天的幼龄小鼠

用包埋剂OCT对刚出生3天的幼龄小鼠(P3)进行包埋并用液氮速冻并-80℃保存。P3小鼠样本在Leica切片机中平衡30分钟后被切成10微米厚的切片，并将切片贴于微阵列芯片的核酸区域。将切片置于甲醇中并在-20℃条件下脱水固定半个小时，然后再用异丙醇溶液处理组织。并用苏木精-伊红染色试剂盒(H&E染色，索莱宝)对组织进行染色，染色步骤参考试剂盒说明书进行。H&E染色结束后用全景扫描显微镜对组织进行成像分析。

将载玻片与孵育夹具组装在一起后，向组织表面加入600μl的透化试剂(胃蛋白酶)并在37℃下孵育12分钟。结束后再用600μl 0.1X SSC溶液润洗组织表面并重复一次，移除组织表面的润洗液后再向组织表面加入600μl的原位反转录溶液，原位反转录溶液的成分如下：120μl 5X的反转录缓冲液、120μl的ficoll溶液、60μl的dNTP溶液、30μl的反转录酶、30μl的RNA酶抑制剂、15μl的TSO引物、225μl的无酶水。将加入反转录溶液后的孵育夹具置于42℃条件下孵育90分钟。孵育结束后移除反转录溶液并用0.1X SSC溶液润洗组织，再加入600μl的蛋白酶K溶液在50℃条件下孵育45分钟以消化裂解组织。组织移除后用0.1XSSC溶液润洗玻片清除残余的组织，再向孵育仓中加入600μl 0.08M的KOH溶液并孵育10分钟以收集反转录组的cDNA产物。将收集的cDNA溶液转移至1.5ml的EP管中，再向其加入85μl的Tris-HCl缓冲液(pH8.0，1M)以中和KOH溶液。

取1μl中和后的cDNA溶液做荧光定量PCR确定cDNA扩增所需的循环数。荧光定量溶液根据翌圣Hieff qPCR SYBR Green Master mix说明书配制，qPCR扩增程序根据说明书设定。采用Kapa Biosystems HiFi Hotstart Readymix对cDNA产物进行扩增，扩增体系和扩增程序根据说明书进行。在扩增结束后用贝克曼的纯化磁珠对扩增产物进行纯化和回收，并采用Qubit检测扩增产物的浓度，采用安捷伦2100毛细管电泳仪对扩增产物的片段长度进行分析。最后采用NEB的DNALibrary Prep Kit for illumina试剂盒对扩增产物进行测序文库构建，并采用二代测序技术获得测序数据。

在获得二代测序数据后，利用生物信息学分析流程进行分析。在测得的基因表达数据中根据其核酸标签A和B序列信息可以获得9个完全一样的空间矩阵，每个空间矩阵含有4900个点，再根据核酸标签C的序列信息便可进一步区分这9个矩阵的位置信息，进而获得一个完整的小鼠切片空间表达点阵(70×70×9)。图8展示了本实施例获得的幼龄小鼠切片空间转录组图谱。

实施例2

本实施例通过蛇形盘管微流控装置和3轮核酸连接反应对大面积的组织切片进行高分辨率(15微米)空间分子标记，再通过测序技术获得对应组织中被标记生物分子的二维位置信息和生物学信息，进而实现大面积生物组织切片的空间生物分子图谱分析。本实施例利用本发明的方法对小鼠半脑进行空间转录组分析，展示了在15微米空间分辨率下大组织切片的空间转录组图谱。

一、芯片设计：

如图9所示，本实施例设计的第一微流体装置和第二流体装置含有70个平行的微流体通道，通道的宽度为15微米，相邻两个通道被15微米通道壁隔开。第一微流体装置和第二流体装置的70个平行通道往复回折2次，在蛇形盘管区形成3个重复的通道密集区，相邻两个通道密集区的间距为90微米。第一微流体装置和第二流体装置的通道在蛇形盘管区域正交。本实施例设计的第三微流体装置3×3个矩形进样孔，进样孔的面积为2.11×2.11平方毫米，进样孔间的间隔为0.07毫米。本实施例设计的第一微流体装置、第二流体装置和第三流体装置均采用软光刻法加工而成，芯片的材料为PDMS(聚二甲基硅氧烷)。

二、利用蛇形盘管微流控装置制备微阵列芯片

本实施例中微阵列芯片的制备步骤、试剂和条件等与实施例1一致。在本实施例中利用本发明的技术成功制备了空间分辨率在15微米，面积在6.48×6.48平方毫米的核酸点阵，该点阵包含4.41万个核酸微点。

近单细胞空间分辨率分析小鼠半脑的空间转录组图谱：本步骤所用试剂的体积为实施例1的九分之一，其余实验步骤、实验条件、试剂种类、数据分析流程等均与实施例1一致。图10对比了传统方法和本发明的差异，结果表面在核酸标签分子接近的情况下本发明可分析的组织面积是传统方法的至少9倍。

实施例3

本实施例通过蛇形盘管微流控装置和2轮核酸连接反应在同一玻片上对9种类型组织同时进行空间转录组分析。相比于在一张玻片只分析一个组织，在一个玻片上同时分析9片组织有利于降低实验的批次效应，提高实验的通量。

一、芯片设计：

如图11所示，本实施例设计的第一微流体装置和第二流体装置含有70个平行的微流体通道，通道的宽度为50微米，相邻两个通道被50微米通道壁隔开。第一微流体装置和第二流体装置的70个平行通道往复回折2次，在蛇形盘管区形成3个重复的通道密集区，相邻两个通道密集区的间距为1500微米。第一微流体装置和第二流体装置的通道在蛇形盘管区域正交。本实施例涉及的第三微流体装置3×3个矩形进样孔，进样孔的面积为7.5×7.5平方毫米，进样孔间的间隔为1毫米。本实施例涉及的第一微流体装置、第二流体装置和第三流体装置均采用软光刻法加工而成，芯片的材料为PDMS(聚二甲基硅氧烷)；

二、用蛇形盘管微流控装置制备微阵列芯片

如图11所示，本实施例设计的第三微流体装置3×3个矩形进样孔，进样孔的面积为7.5×7.5平方毫米，进样孔的间隔为1毫米。本实施例设计的微流体装置均采用软光刻法加工而成，芯片的材料为PDMS(聚二甲基硅氧烷)。

三、在同一张玻片同时分析9种小鼠组织的空间转录组

本步骤所涉及的9种小鼠组织类型包括：小脑、嗅球、结肠、胎盘、肺、心脏、肝、脾、肾。分别切片并将组织切片依次贴于空间转录组玻片的子矩阵区域，每一个子矩阵对应一种组织类型。每个子矩阵所需的试剂量、试剂种类、实验步骤、数据分析等与实施例2一致，在构建测序文库时，每一种组织对应一种扩增引物以区分不同的组织。最终9种组织的空间转录组图谱如图12所示。

四、空间转录组批次效应评估

本发明对比了本发明的方法与传统方法的批次效应差异。首先是利用本发明的方法在同一张玻片上同时分析多个连续组织切片的空间转录组，作为对比，用传统方法将多个连续切片分别放于多个玻片中做空间转录组分析。如图13所示，本发明的样本批次效应显著低于传统方法的批次效应。

实施例4

如图14所示，本实施例芯片设计的第一微流体装置和第二流体装置各自含有121个平行的微流体通道，蛇形区域的通道宽度为25微米，相邻两个通道被25微米通道壁隔开。第一微流体装置的121个平行通道往复回折4次形成5个重复的蛇形盘管区，相邻两个通道密集区的间距为150微米。第二微流体装置的121个平行通道往复回折2次形成3个重复的蛇形盘管区，相邻两个通道密集区的间距为150微米。第一微流体装置和第二流体装置的通道在蛇形盘管区域正交。

如图14所示，本实施例进一步设计第三微流体装置5×3个矩形进样孔，进样孔的面积为6.1×6.1平方毫米，进样孔间的间隔为0.05毫米。本实施例设计的微流体装置均采用软光刻法加工而成，芯片的材料为PDMS(聚二甲基硅氧烷)。

实施例5

如图15所示，本实施例芯片设计的第一微流体装置和第二流体装置各自含有70个平行的微流体通道，蛇形区域的通道宽度为50微米，相邻两个通道被50微米通道壁隔开。为了充分利用空间，第一、第二装置的进样孔和出样孔大小不同，具体的尺寸包括进样孔的直径为2毫米，出样孔的直径为1毫米。第一微流体装置的70个平行通道往复回折3次形成3个重复的蛇形盘管区，相邻两个通道密集区的间距为1.2毫米。第二微流体装置的70个平行通道没有往复回折。第一微流体装置和第二流体装置的通道在蛇形盘管区域正交。

如图14所示，本实施例进一步设计第三微流体装置3×1个矩形进样孔，进样孔的面积为7.2×7.2平方毫米，进样孔间的间隔为0.8毫米。本实施例设计的微流体装置均采用软光刻法加工而成，芯片的材料为PDMS(聚二甲基硅氧烷)。

Claims (25)

1.一种用于空间组学多区域拼接的核酸阵列装置，其特征在于，包括在芯片基底上设置的分子阵列，所述分子阵列包括：

沿第一方向平行设置的由带A标签的分子点组成的x个行，其中，x为10-500的整数；

沿第二方向平行设置的由带B标签的分子点组成的y个列，其中，y为10-500的整数；和

所述分子阵列包含z个由带有C标签的分子点组成的子阵列，其中，z为2-100的整数；

其中，所述x个行包含行数为m的多个行组；和/或所述y个列包含列数为n的多个列组，其中，m和n各自分别为2-100的整数，所述子阵列的行数为m以下和列数为n以下。

2.根据权利要求1所述的用于空间组学多区域拼接的阵列装置，其特征在于，每个行内的分子点对应的A标签相同，但不同行之间的分子点对应的A标签不同，分别标记为A1至Ax；每个列内的分子点对应的B标签相同，但不同列之间的分子点对应的B标签不同，分别标记为B1至By；每个子阵列内的分子点的C标签相同，但不同子阵列之间的C标签不同，分别标记为C1至Cz。

3.根据权利要求1所述的用于空间组学多区域拼接的核酸阵列装置，其特征在于，所述分子阵列的不同行之间的间隔为1-1000微米，和/或不同列之间的间隔为1-1000微米。

4.根据权利要求1所述的用于空间组学多区域拼接的核酸阵列装置，其特征在于，不同行组之间的间隔为5-10000微米，和/或不同列组之间的间隔为5-10000微米。

5.一种用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其特征在于，所述微流控装置组件包括：第一微流体装置、第二微流体装置和第三微流体装置。

6.根据权利要求5所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其特征在于，所述第一微流体装置包括进样孔区、出样孔区和蛇形管道组区；其中：

所述进样孔区域设置有若干进样孔，用于存储独立的试剂；

所述出样孔区域设置有若干出样孔，用于对应进样孔试剂的收集；

所述第一微流体装置包含若干微通道，每个微通道两端分别连接一个进样孔和一个出样孔，相邻通道由通道壁隔开；

所述蛇形管道区中，若干微通道平行排布形成第一通道组，第一通道组沿第一方向流动，第一通道组的流动方向存在i次180°转向，转向次数i在1-50间，进而形成多个有一定间距的重复的第一通道组区，通道组的间距d1在5-10000微米。

7.根据权利要求5所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其特征在于，所述第二微流体装置包括进样孔区、出样孔区和蛇形管道组区；其中：

所述进样孔区域设置有若干进样孔，用于存储独立的试剂；

所述出样孔区域设置有若干出样孔，用于对应进样孔试剂的收集；

所述第二微流体装置包含若干微通道，每个微通道两端分别连接一个进样孔和一个出样孔，相邻通道由通道壁隔开；

所述蛇形管道区中，若干微通道平行排布形成第二通道组，第二通道组沿第二方向流动，第二通道组的流动方向存在j次180°转向，转向次数j在1-50间，进而形成多个有一定间距的重复的第二通道组区，通道的间距d2在5-10000微米。

8.根据权利要求5所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其特征在于，所述第三微流体装置包括多个方形进样孔，所述方形进样孔间设置有间隔；

优选地，所述方形进样孔的布局与所述第一、第二微流体装置相交后的子矩阵一致；

优选地，所述方形进样孔的面积(U×W)与所述第一、第二微流体装置相交后的子矩阵面积相等或不等。

9.根据权利要求5所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其特征在于，其材料包括聚二甲基硅氧烷、二氧化硅、硅和/或聚苯乙烯等。

10.根据权利要求6或7所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其特征在于，第一流动方向与第二流动方向相交，选优地为垂直。

11.根据权利要求6或7所述的用于空间组学多区域拼接的微流控装置组件，其特征在于，所述微流体装置组件包含5-500个宽度可变的微通道，通道宽度在1-1000微米，以及宽度可变的通道壁，宽度范围在1-1000微米，并且每个通道具有入口和出口，入口直径大于出口。

12.一种空间组学多区域拼接的方法，其特征在于，利用微流控装置组件结合多轮DNA标记反应进行多区域空间组学的拼接，再通过测序技术对组织的空间分子图谱进行分析，具体步骤如下：

(1)利用第一微流体装置将带有修饰基团的核酸标签分子A递送至基片的蛇形盘管区域，其中基片表面带有活性功能基团可与核酸分子A的修饰基团反应；

(2)利用第二微流体装置将核酸标签分子B递送至基片的蛇形盘管区域，使所述核酸标签分子B连接到核酸分子A末端；

(3)利用第三微流体装置将核酸标签分子C递送至基片的蛇形盘管区域，使所述核酸标签分子C连接到核酸分子B末端；

(4)将组织切片样本贴于基片的蛇形盘管区域，释放组织样品中的分析物并被核酸标签分子C捕获；和

(5)利用测序技术获取分析物的信息以及对应分析物上A、B、C分子的信息，并还原出分析物的空间信息和丰度信息。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述核酸标签分子A有x种，x的数值与行数一致，每种A分子都有特定的核酸序列作为空间定位信息，同时每个A分子还含有PCR扩增序列以及与桥梁分子L1互补配对的核酸序列。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述核酸标签分子A带有的功能基团包括氨基、羧基、环氧基、巯基、醛基、生物素和/或丙烯酰胺。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述核酸标签分子B有y种，y的数值与列数一致，每种B分子都有特定的核酸序列作为空间定位信息，以及与桥梁分子L1和L2互补配对的核酸序列。

16.根据权利要求12所述方法，其特征在于：步骤(3)中所述核酸标签分子C有z种，z的数值与子阵列数一致，每种C分子都含有与桥梁分子L2互补配对的核酸序列，与特定核酸捕获序列优选为PolyT，唯一分子标识符(UMI)序列，以及特定的核酸序列作为空间定位信息。

17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，经过第一微流体装置的x种A分子标记以及第二微流体装置的y种B分子标记，可形成多个重复的x×y矩阵，再利用第三微流体装置的z种C分子标记便可区分这些重复的x×y矩阵，进而得到一个x×y×z的大矩阵。

18.一种高通量的空间组学方法，其特征在于，利用微流控装置组件结合多轮DNA标记反应，在同一个基片上同时处理多个空间组学样本，再通过测序技术对组织的空间分子图谱进行分析，具体步骤如下：

(1)利用第一微流体装置将带有修饰基团的核酸标签分子D递送至基片的蛇形盘管区域，其中基片表面带有活性功能基团可与核酸分子D的修饰基团反应；

(2)利用第二微流体装置将核酸标签分子E递送至基片的蛇形盘管区域，使所述核酸标签分子E连接到核酸分子D末端；

(4)将组织切片样本贴于基片的蛇形盘管区域，利用第三微流体装置将不同区域的组织分隔开，释放组织样品中的分析物并被核酸标签分子E捕获；

(5)分别用样本对应的引物扩增测序文库，进而区分不同样本；

(6)利用测序技术获取分析物的信息以及对应分析物上D和E分子的信息，并还原出分析物的空间信息和丰度信息。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述核酸标签分子D有x种，x的数值与行数一致，每种D分子都有特定的核酸序列作为空间定位信息，同时每个D分子还含有PCR扩增序列以及与桥梁分子L3互补配对的核酸序列。

20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述核酸标签分子D带有的功能基团包括氨基、羧基、环氧基、巯基、醛基、生物素和/或丙烯酰胺。

21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述核酸标签分子E有y种，y的数值与列数一致，每种E分子都有特定的核酸序列作为空间定位信息，以及与桥梁分子L3互补配对的核酸序列,与特定核酸捕获序列优选为PolyT，唯一分子标识符(UMI)序列，以及特定的核酸序列作为空间定位信息。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述基片的材料包括二氧化硅、氧化铟锡、硅和聚甲基丙烯酸甲酯中的一种。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述基片表面的活性功能基团包括氨基、羧基、环氧基、巯基、醛基中的一种。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将一个组织切片贴于基片的蛇形盘管区域，或者将多个相同或不同组织类型的切片贴于同一基片蛇形盘管的不同位置。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述释放的分析物包括RNA分子、DNA分子、蛋白质和代谢物中的一种或多种。