CN117604076B - 空间组学芯片及其制备方法、样本中目标分子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种空间组学芯片及其制备方法、以及样本中目标分子的检测方法，所述空间组学芯片的制备方法包括以下步骤：构建2~4条种子探针，再合成种子探针文库；其中，每条种子探针包括依次连接的第一接头、接头测序引物、空间编码、空间编码测序引物和第二接头，每条所述种子探针的空间编码测序引物之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列；将种子探针文库进行混合，与固定于芯片基底的寡核苷酸进行杂交，再扩增形成包括不同空间编码测序引物的探针簇；根据种子探针的数量，进行相应次数的测序；在所述探针簇的末端生成mRNA捕获序列。本发明的空间组学芯片可以提高分辨率且保证测序质量。
Description
技术领域
本发明属于芯片技术领域，更具体地，本发明涉及一种空间组学芯片及其制备方法、以及利用该空间组学芯片对待测样本中目标分子进行检测的方法。
背景技术
近年来，随着生物技术的不断发展，空间生物学成为生命科学领域最受关注的前沿技术之一。空间转录组学被权威科学期刊Nature Methods评为2020年的年度技术，也是Nature杂志评选的2022年“最受关注的七大技术”之一。空间组学技术已经被用于胚胎发育、肿瘤医学、神经科学、器官图谱构建等多个生命科学领域当中，涌现了很多重要的科研成果和重大发现。现在的空间转录组学方法主要有原位成像法和基于“空间编码”定位的原位捕获法。
基于“空间编码”定位的原位捕获法，主要通过构造一张带有空间编码的DNA探针芯片，利用探针对目标分子进行捕获，利用空间编码对目标分子进行定位。现在该技术主要由美国10X genomics公司提供，但是10x genomics的Visium芯片，分辨率是100μm。由于单细胞直径通常为几μm到几十μm之间，因此，100 μm的分辨率无法满足单细胞级别的表征。
基于二代测序而构建的空间组学芯片相较于Visium，分辨率有了很大的提升，是目前唯一可以将分辨率提升至2μm以内，满足单细胞级别的表征的空间组学芯片。基于二代测序技术构建空间组学芯片，以完整的底层测序技术为基础，其是首先通过合成一个带有一段随机碱基序列(作为空间编码)的文库，利用二代测序的桥式扩增反应在表面成簇，构造空间组学芯片，再通过二代测序对芯片上空间编码的序列和坐标(位置信息)进行解析。分辨率由芯片表面的簇的距离(或密度)决定。目前的分辨率已经达到2μm以内，但如果要进一步增加分辨率，簇的密度太高，算法将无法有效地将每个簇的光学信号分开以识别正确的碱基序列，就会造成测序质量的下降，而测序质量低的话，空间编码错误率高，最终文库就无法依靠空间编码定位。
进一步提高空间组学芯片的分辨率，实现细胞器级别的定位，且同时能保证测序的质量有着十分重要的意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种空间组学芯片及其制备方法、以及对样本中目标分子进行检测的方法，通过该制备方法制备得到的空间组学芯片，在提高分辨率的同时，测序质量也不会下降。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了一种空间组学芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)、构建2~4条种子探针，再合成种子探针文库；其中，每条种子探针包括依次连接的第一接头、接头测序引物、空间编码、空间编码测序引物和第二接头；每条所述种子探针的第一接头、接头测序引物、空间编码和第二接头的序列均相同，且每条所述种子探针的空间编码测序引物之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列；
(2)、将步骤(1)中所述种子探针文库进行混合，与固定于芯片基底的寡核苷酸进行杂交，再扩增形成包括不同空间编码测序引物的探针簇；所述固定于芯片基底的寡核苷酸为所述种子探针的第一接头和第二接头的互补序列；
(3)、根据步骤(1)的种子探针的数量，对步骤(2)中所述探针簇的空间编码进行相应次数的测序；
(4)、在所述探针簇的末端生成mRNA捕获序列。
本发明的第二方面，提供了上述制备方法制备得到的空间组学芯片。
本发明的第三方面，提供了一种样本中目标分子的检测方法，使用上述空间组学芯片进行检测，包括以下步骤：使待测样本加入至所述空间组学芯片上，使所述空间组学芯片上所述探针簇的mRNA捕获序列与待测样本的目标分子特异性结合。
本发明具有以下有益效果：
在本发明中，通过首先合成2~4个空间编码测序引物序列之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列的种子探针文库，再混合种子探针文库，与芯片基底杂交、扩增得到探针簇后，依次进行2~4次测序，最后在探针簇末端生成mRNA捕获序列，从而使制备得到的空间组学芯片的探针簇的密度非常高，分辨率可以更高；且由于分别通过几条不同的空间编码测序引物来完成测序反应，空间组学芯片表面的光学信号被“稀释”了，因此算法能够精确地识别每个种子探针簇的空间编码序列，在相同的分辨率下，测序质量更高。
附图说明
图1为本发明实施例1中的两条种子探针的结构示意图，其中，a、第一接头；b、接头测序引物；c、空间编码；1、空间编码测序引物1；d、第二接头；2、空间编码测序引物2。
图2为本发明实施例1中种子探针文库杂交扩增后形成探针簇的示意图(A)、荧光信号表征的芯片表面探针簇分布图(B)、及两次测序后产生信号的示意图(C、D)。
图3为本发明实施例2中种子探针文库杂交扩增后，荧光信号表征的芯片表面探针簇分布图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
在现有的基于二代测序技术制备空间组学芯片的基础上，本发明提出了一种新的空间组学芯片的制备方法，其首先合成2~4条不同的种子探针，其中每条种子探针的空间编码测序引物之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列(种子探针的其他部分：第一接头、接头测序引物、空间编码和第二接头均采用现有常规方法设计)，再混合种子探针得到种子探针文库，并与芯片基底杂交、扩增得到探针簇后，依次进行2~4次测序，最后在探针簇末端生成mRNA捕获序列；本发明的空间组学芯片的制备方法中，由于扩增得到非常高密度的包含2~4个互不干扰(彼此之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列)的空间编码测序引物序列的种子探针簇，能够进一步提升分辨率；更为重要的是，空间组学芯片上的种子探针簇在非常高密度的情况下，分别通过几条不同的空间编码测序引物来完成测序反应，这样对每一次测序反应来说，空间组学芯片表面的光学信号被“稀释”了，因此算法能够精确地识别每个种子探针簇的空间编码序列，保证了测序质量。与现有的由仅包含1个空间编码测序引物序列的探针文库制备的空间组学芯片相比，本发明的方法制备的空间组学芯片在同等分辨率下，测序质量显著提升。
在本发明的其中一些实施例中，公开了一种空间组学芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)、构建2~4条不同的种子探针，再合成种子探针文库；其中，每条种子探针包括依次连接的第一接头、测序引物、空间编码、空间编码测序引物和第二接头，每条所述种子探针的第一接头、接头测序引物、空间编码和第二接头的序列均相同，且每条所述种子探针的空间编码测序引物之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列；所述第一接头和第二接头用于与芯片基底的杂交，所述测序引物用于最终文库的测序；
(2)、将步骤(1)中所述2~4个种子探针文库进行混合，与固定于芯片基底的寡核苷酸进行杂交，再扩增形成包括不同空间编码测序引物的探针簇；所述固定于芯片基底的寡核苷酸为所述种子探针的第一接头和第二接头的互补序列；
(3)、根据步骤(1)的种子探针的数量，对步骤(2)中所述探针簇的空间编码进行相应次数的测序；
(4)、在所述探针簇的末端生成mRNA捕获序列。
在其中一些实施例中，所述空间编码测序引物的长度为25~30个核苷酸。优选为26~28个核苷酸。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述种子探针为2~3条，优选为2条。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述种子探针文库中每条种子探针均为2~10pmol。
在其中一些实施例中，所述每条种子探针均为2~8 pmol。
在其中一些实施例中，所述每条种子探针均为5~8 pmol。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述mRNA捕获序列为poly T或靶向探针序列，用于后续对目标分子的捕获。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述mRNA捕获序列通过连接酶或聚合酶延伸的方法生成。
在其中一些实施例中，所述连接酶为T4连接酶。
在本发明的另一些实施例中，公开了上述制备方法制备得到的空间组学芯片。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种检测目标分子的方法，使用上述空间组学芯片进行检测，包括以下步骤：使待测样本加入至所述空间组学芯片上，使所述空间组学芯片上所述探针簇的mRNA捕获序列与待测样本的目标分子特异性结合。
为了方便探针簇的mRNA捕获序列对目标分子的捕获，通过透化的方法将待测样本中的目标分子释放。具体包括使待测样本加入至所述空间组学芯片上，透化待测样本，使探针簇的mRNA捕获序列能够捕获待测样本的目标分子，与之进行特异性结合。透化待测样本的方式可以是化学处理、热处理、超声处理、酶处理、低渗处理等方式，以此将目标分子从待测样本中释放。
在其中一些实施例中，所述方法还包括步骤：根据探针簇的空间编码对所述待测样本的目标分子进行定位。空间组学为了对待测样本进行原位表征，需要对待测的目标分子进行定位，确定其来源于样本中的哪一位置。因此，通过采用本发明的上述检测方法，在目标分子上添加能够标记位置来源的空间编码，从而实现定位功能。
在本发明中，待测样本例如可以是组织样品，如组织切片等样品，具体可以是来源于动物细胞或植物细胞所形成的组织样品，例如可以是来源于运动系统、神经系统、内分泌系统、循环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统等器官的组织样品。组织样品的组织可以是活体组织，也可以是经体外培养的活组织。可以理解的是，组织同样可以是由一种或多种组织或细胞形成的类器官的组织，例如是正常组织或肿瘤组织来源的类器官、诱导性多能干细胞来源的类器官等。同时，类器官的类型例如是眼类器官、脑类器官、心脏类器官、肺类器官、肝类器官、胰腺类器官、肾类器官、上皮类器官等其中至少一种。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1空间组学芯片的制备方法
本实施例的空间组学芯片，其是通过以下方法制备而得：
1、首先构建2条种子探针，再合成种子探针文库；
种子探针的结构示意图如图1。种子探针1包括依次连接的第一接头a、接头测序引物b、空间编码c、空间编码测序引物1和第二接头d；种子探针2包括依次连接的第一接头a、接头测序引物b、空间编码c、空间编码测序引物2和第二接头d；其中，空间编码测序引物1和空间编码测序引物2的序列不同，且两者之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列；种子探针1的具体序列如SEQ ID NO:1所示，种子探针2的具体序列如SEQID NO:2所示。
SEQ ID NO:1
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG
(第一接头a) (接头测序引物b)
ATCTNNNNN NNNNN NNNNN NNNNN CCCGTTCGCAACATGTCTGG
(空间编码c) (空间编码测序引物1)
CGTCATA GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT
(第二接头d)
SEQ ID NO:2
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG
(第一接头a) (接头测序引物b)
ATCTNNNNN NNNNN NNNNN NNNNN CATGACACGCTCGGCGCTCA
(空间编码c) (空间编码测序引物2)
ATTTCTG GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT
(第二接头d)
空间编码c为20个随机碱基序列，以此在芯片上可以形成420种空间编码进行位置区分。
2、在芯片基底上固定CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO:3)和AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO:4)，SEQ ID NO:3与第一接头a序列相同，SEQID NO:4与第二接头d序列反向互补。
3、将两个种子探针文库按1:1的摩尔比(均为2 pmol)进行混合，加至芯片基底上，种子探针与芯片基底表面的寡核苷酸进行杂交后，再进行桥式扩增，使芯片基底上长出一个个探针簇(图2中的A和B)，其中，探针簇有两种类型，两种类型的探针簇中空间编码测序引物不相同。
4、合成与空间编码测序引物1序列互补的引物，使之与空间编码测序引物1杂交，对空间编码c进行测序，并根据图像对每个空间编码进行空间定位，获得空间坐标，如图2中的C所示，仅包含空间编码测序引物1的探针簇有信号，而包含空间编码测序引物2的探针簇没有信号(图中，黑色表示有信号，灰色表示没有信号)，用变性试剂洗去空间编码测序引物1的测序链，用清洗试剂清洗；再合成与空间编码测序引物2序列互补的引物，使之与空间编码测序引物2杂交，对空间编码c进行测序，并根据图像对每个空间编码进行空间定位，获得空间坐标，如图2中的D所示，仅包含空间编码测序引物2的探针簇有信号，而包含空间编码测序引物1的探针簇没有信号(图中，黑色表示有信号，灰色表示没有信号)。
5、通过聚合酶延伸反应，在探针簇的末端生成mRNA捕获探针，用于后续对目标分子的捕获。
本实施例制备得到的芯片，其探针簇密度为0.51，芯片分辨率为1.40μm，计算测序的质量Q30值为88.2。
实施例2空间组学芯片的制备方法
本实施例的空间组学芯片的制备方法，除了步骤1中构建4条包括不同空间编码测序引物的种子探针(序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)，步骤4中依次进行4次测序外，其他步骤均与实施例1相同。
SEQ ID NO:5
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG
(第一接头a) (接头测序引物b)
ATCTNNNNN NNNNN NNNNN NNNNNCAGTCTCTACCGCACCGCTAG
(空间编码c) (空间编码测序引物3)
TATGTG GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT
(第二接头d)
SEQ ID NO:6
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG
(第一接头a) (接头测序引物b)
ATCTNNNNN NNNNN NNNNN NNNNNATCCGTCAACTTAGGTCAGCT
(空间编码c) (空间编码测序引物4)
GGCTCC GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT
(第二接头d)
本实施例制备得到的芯片的探针簇分布如图3所示。探针簇密度为1.05，芯片分辨率为0.98 μm，计算测序的质量Q30值为87.2。
对比例空间组学芯片的制备方法
本对比例的空间组学芯片的制备方法，除了步骤1中构建1条种子探针(SEQ IDNO:1)，步骤4中进行1次测序外，其他步骤均与实施例1相同。
本对比例制备得到的芯片，探针簇密度为0.55，芯片分辨率为1.35μm，计算测序的质量Q30值为82.8。
因此，在同等分辨率水平下，由仅包含1个空间编码测序引物序列的探针文库制备的空间组学芯片，相比由包含2~4个不同的空间编码测序引物序列的探针文库制备的空间组学芯片，测序的质量Q30明显要更低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种空间组学芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、构建2~4条不同的种子探针，再合成种子探针文库；其中，每条种子探针包括依次连接的第一接头、接头测序引物、空间编码、空间编码测序引物和第二接头；每条所述种子探针的第一接头、接头测序引物、空间编码和第二接头的序列均相同，且每条所述种子探针的空间编码测序引物之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列；
(2)、将步骤(1)中所述种子探针文库进行混合，与固定于芯片基底的寡核苷酸进行杂交，再扩增形成包括不同空间编码测序引物的探针簇；所述固定于芯片基底的寡核苷酸为所述种子探针的第一接头和第二接头的互补序列；
(3)、根据步骤(2)中不同空间编码测序引物，对步骤(2)中所述探针簇的空间编码进行测序，对所述空间编码进行空间定位，获得空间坐标；
(4)、在所述探针簇的末端生成mRNA捕获序列；所述mRNA捕获序列为poly T或靶向探针序列。
2.根据权利要求1所述的空间组学芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述种子探针为3~4条。
3.根据权利要求1所述的空间组学芯片的制备方法，其特征在于，所述空间编码测序引物的长度为25~30个核苷酸。
4.根据权利要求3所述的空间组学芯片的制备方法，其特征在于，所述空间编码测序引物的长度为26~28个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的空间组学芯片的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述种子探针文库中每条种子探针均为2~10 pmol。
6.根据权利要求1所述的空间组学芯片的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述mRNA捕获序列通过连接酶或聚合酶延伸的方法生成。
7.根据权利要求6所述的空间组学芯片的制备方法，其特征在于，所述连接酶为T4连接酶。
8.权利要求1~7任一项所述的制备方法制备得到的空间组学芯片。
9.一种样本中目标分子的检测方法，其特征在于，使用权利要求8所述的空间组学芯片进行检测，包括以下步骤：使待测样本加入至所述空间组学芯片上，使所述空间组学芯片上所述探针簇的mRNA捕获序列与待测样本的目标分子特异性结合。
10.根据权利要求9所述的样本中目标分子的检测方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：根据探针簇的空间编码对所述待测样本的目标分子进行定位。
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