CN117603385A - 一种绿色荧光微球的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种绿色荧光微球的制备方法及其应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)将苯乙烯和羧基功能单体进行乳液聚合反应，得到羧基聚苯乙烯微球的种子乳液；(2)制备硼二吡咯染料；(3)将硼二吡咯染料通过溶胀法包埋至羧基聚苯乙烯微球内部，得到所述绿色荧光微球。本发明制备方法操作简单，得到的绿色荧光微球尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强而且性能稳定。所述的绿色荧光微球偶联抗体后，具有快速、简便、检查结果直观、稳定性好、检测标本种类多等特点，可达到对待测物进行定量分析的目的。
Description
技术领域
本发明涉及荧光微球技术领域，尤其涉及一种绿色荧光微球的制备方法和应用。
背景技术
聚合物荧光微球结合了荧光物质的特异性、发光效率高、寿命长以及微球表面基团可调和、良好单分散性等特征，使其在荧光免疫层析技术中实现了通过荧光示踪对检测结果进行精准定量，从而获得可观的信噪比、灵敏度以及检测范围。
荧光免疫层析技术是以荧光类物质作为生物活性物质的标记物，基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，这种化学偶联的方式区别于胶体金的物理性吸附，大大提高了检测效果的灵敏度以及稳定性，得到了人们的广泛研究和运用。
其中，绿色荧光微球因其具有良好的热稳定性、良好的分散性、生物相容性、高荧光稳定性和表面改性能力，从而在生物医学、临床化学分析、免疫检测等高新技术领域获得很好的应用。
绿色荧光微球的应用体现在：1)绿色荧光微球可以用于细胞标记、生物分子标记及在活性条件下的示踪，也可固定蛋白质分子等，并跟踪其功能化过程；2)绿色荧光微球还可以用于检测方面，将表面带有能与被检测物结合的配体的荧光微球与标记的被检测物相混合，体系中能与微球结合的被检测物，免疫分析仪光源放射能激发荧光物质产生荧光，从而可以对被检测物进行检测。
制备绿色荧光微球目的在于，在免疫荧光定量检测平台，已覆盖POCT快检市场上并获得国家药监局认证的仪器设备大部分的光源最大发射波长是520nm，这也是绿色荧光微球的发射波长，且这款微球主要是被国外厂家垄断，因此国产替代降本也是至关重要。
因此，急需开发一种应用于侧向流免疫层析的绿色荧光微球。
发明内容
本发明的目的在于解决以上技术缺陷，提供一种绿色荧光微球及其制备方法和应用，所述的绿色荧光微球制备方法操作简单，得到的绿色荧光微球尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强而且性能稳定。所述的绿色荧光微球偶联抗体后，具有快速、简便、廉价、检查结果直观、稳定性好、检测标本种类多以及灵敏度低等特点，可达到对待测物进行定量分析的目的。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：一种绿色荧光微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)苯乙烯和羧基功能单体进行乳液聚合反应：将苯乙烯、羧基功能单体和水混合成为反应体系，再将引发剂加入反应体系中溶解，加热至反应温度，进行乳液聚合反应，得到羧基聚苯乙烯微球的种子乳液；
(2)制备硼二吡咯染料：将吡咯和吡咯醛溶解在有机相溶液中，加入三氯氧磷反应，再加入三氟化硼和有机碱继续反应，得到固体的硼二吡咯染料；
(3)溶胀包埋：将所述硼二吡咯染料溶解到溶胀剂中制成硼二吡咯染料溶液，再和所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液混合，避光条件下进行溶胀反应，将硼二吡咯染料包埋至羧基聚苯乙烯微球内部，得到所述绿色荧光微球。
优选的，步骤(1)所述乳液聚合反应的温度为60-80℃；反应的时间为4-24h。
优选的，步骤(1)中，以所述苯乙烯的总质量为100％计，所述引发剂的质量百分数为0.1％-0.5％。例如但不限于0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％。
优选的，步骤(1)中，所述苯乙烯和羧基功能单体的体积比为(0.1-0.4):1。包括但不限于为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4。
优选的，步骤(1)中，所述羧基功能单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯或丙烯酸二甲氨基丙酯中的任意一种或两种及以上的组合。其中典型但非限制性的组合包括：丙烯酸和甲基丙烯酸的组合，甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和甲基丙烯酸二乙氨基丙酯的组合，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯和丙烯酸二甲氨基丙酯的组合等。
优选的，步骤(1)中，所述引发剂为水相引发剂。更优选的，所述引发剂包括硫酸钾、过硫酸钾或硫代硫酸钠中的任意一种或两种及以上的组合，其中典型但非限制性的组合包括：硫酸钾和过硫酸钾的组合，过硫酸钾和硫代硫酸钠的组合，硫酸钾、过硫酸钾和硫代硫酸钠的组合。
优选的，步骤(1)的反应在保护性气氛下进行。例如可以是氮气气氛。
优选的，步骤(1)所述溶解的时间为30-60min。例如但不限于30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min。
优选的，步骤(1)所述乳液聚合反应的温度为60-80℃。例如但不限于60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃。
优选的，步骤(1)所述乳液聚合反应的时间为4-24h。例如但不限于4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h。
优选的，步骤(2)中，所述有机相溶液为二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃中的任意一种。
优选的，步骤(2)中所述有机碱为二乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的任意一种。
优选的，步骤(2)中所述吡咯和吡咯醛的摩尔比为1:(1-2)。
优选的，步骤(2)中，所述吡咯和吡咯醛体积之和与有机相溶液的体积比为1:(5-20)。
优选的，步骤(2)中，所述吡咯和三氯氧磷的摩尔比为1:(0.2-0.5)。
优选的，步骤(2)中所述吡咯、有机碱、三氟化硼的摩尔比为1:(10-20):(10-20)。
优选的，步骤(2)中所述吡咯和吡咯醛，也可以是2,4-二甲基吡咯、2,4-二甲基-3-乙基吡咯和3,5-二甲基-2-吡咯甲醛、3,5-二甲基-4-乙基-2-吡咯甲醛之间的任意组合。
优选的，步骤(2)中所述吡咯和吡咯醛，也可以替换为2,4-二甲基吡咯和3,5-二甲基-2-吡咯甲醛。
优选的，步骤(2)中所述吡咯和吡咯醛，也可以替换为2,4-二甲基-3-乙基吡咯和3,5-二甲基-4-乙基-2-吡咯甲醛。
优选的，步骤(2)中反应的搅拌速度为100-300rpm，例如但不限于100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm。
优选的，步骤(2)中所述反应的温度为25-35℃，例如但不限于25℃、30℃、35℃。
优选的，步骤(2)中所述反应的时间为2.5-5h，例如但不限于2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h。
优选的，步骤(2)中所述反应后还要进行后处理，包括除溶剂、萃取、旋蒸和柱层析提纯，然后得到固体硼二吡咯染料。
优选的，步骤(3)中所述所述硼二吡咯染料溶液包括硼二吡咯染料和溶胀剂；所述硼二吡咯染料溶液中，硼二吡咯染料和溶胀剂的质量比为(0.02-0.2)：10。
优选的，步骤(3)中所述含硼二吡咯染料溶液和溶胀剂的质量比为(0.02-0.2):10，可以但不限于为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2。
优选的，步骤(3)中所述硼二吡咯染料和羧基聚苯乙烯微球的质量比为(0.04-0.1)：20，可以但不限于为0.04、0.06、0.08、0.1：20。
优选的，步骤(3)中所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液和溶胀剂的质量比为(2-4):1，可以但不限于为2、3、4：1。
优选的，步骤(3)中所述溶胀剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、己烯丙酮、甲苯、己二酸二辛酯、正辛烷或正己烷中的任意一种或至少两种的组合。
优选的，步骤(3)所述溶胀反应的温度为25-35℃。
优选的，步骤(3)所述溶解在避光条件下进行。
优选的，步骤(3)所述溶胀反应在避光和搅拌条件下进行。
优选的，步骤(3)所述溶胀反应的搅拌速率为100-300rpm；
优选的，步骤(3)所述溶胀反应的搅拌时间为2.5-5h。
优选的，步骤(3)所述溶胀反应后还包括蒸发和清洗，然后得到所述绿色荧光微球。
本发明通过苯乙烯和羧基单体的乳液聚合反应制备羧基聚苯乙烯微球种子乳液，以溶胀法将硼二吡咯荧光染料包埋在聚合物纳米粒子中，得到具有核壳结构的聚苯乙烯荧光微球。
其中，乳液聚合可以制备出单分散的亚微米级聚苯乙烯微球。疏水性单体苯乙烯等进行聚合时，单体的引发速率快于聚合物链的增长速率，导致齐聚物自由基大量生成，该自由基不断增长，当其聚合度达到一定的临界浓度时，就会凝聚形成初级粒子，初级粒子不断吸收齐聚物和单体而逐渐形成聚苯乙烯乳胶微球种子乳液。
溶胀包埋法主要是基于硼二吡咯染料作为荧光染料与微球内部碳氧结构的疏水相互作用，将硼二吡咯荧光染料包埋到微球内部。当将微球从溶胀剂中移出后，微球体积迅速缩小，微球表面的空隙也会随之缩小，从而将硼二吡咯荧光染料禁锢在微球内部。利用溶胀包埋法制备出粒径更小的功能化纳米微球，其在生物体系的应用中表现出更高的反应灵活性和更快的反应动力学特征。
步骤(2)中采用吡咯和吡咯醛的组合来制备硼二吡咯荧光染料，除了这个组合之外，本发明也优选2，4-二甲基吡咯和3,5-二甲基-2-吡咯甲醛的组合、2,4-二甲基-3-乙基吡咯和3,5-二甲基-4-乙基-2-吡咯甲醛的组合，或者2,4-二甲基吡咯、2,4-二甲基-3-乙基吡咯和3,5-二甲基-2-吡咯甲醛、3,5-二甲基-4-乙基-2-吡咯甲醛之间的任意组合，制备一种具有荧光特性的硼二吡咯荧光染料。其中，硼二吡咯系列染料也称为BODIPY系列，是以硼二吡咯(boron-dipyrromethene)为荧光结构母核的染料。BODIPY系列染料的主要特点是结构非对称性，这种非对称的硼二吡咯结构可以让BODIPY衍生出多样的结构和广泛的光谱范围，使它成为最常见、最实用的硼二吡咯荧光染料。BODIPY染料具有荧光明亮、消光系数高、光稳定性好、托克斯位移(Stokes shift)小，光谱窄，染料间干扰小等特点，可覆盖所有的可见光光谱范围，与各种仪器的参数相匹配。另外BODIPY染料间干扰小，染料分子不带电荷呈中性，易透膜，特别适用于透膜性探针的染料分子。BODIPY染料的荧光在各种溶剂中表现一致，适用于追踪材料表面性质，观测材料的器形细节等。
作为本发明的技术方案，步骤(1)具体包括如下步骤：
在保护性气氛下，先将苯乙烯和羧基功能单体依次加入水中分散，混合均匀，再将引发剂加入反应体系中溶解30-60min，加热至60-80℃，进行4-24h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
步骤(2)中，所述硼二吡咯染料的制备方法具体包括如下步骤：
将吡咯、吡咯醛溶解在有机相溶液中，再加入三氯氧磷、三氟化硼和有机碱进行混合，加热至反应的温度25-35℃开始反应，反应结束后进行后处理。向有机层中加入二氯甲烷和去离子水萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥；减压除去溶剂，残留物通过柱层析提纯，得到绿色金属光泽固体的纯产物硼二吡咯荧光染料。
步骤(3)具体包括如下步骤：
将硼二吡咯染料与溶胀剂制成硼二吡咯染料溶液，和羧基聚苯乙烯微球的种子乳液混合，避光条件下，在搅拌速率为100-300rpm和温度为25-35℃下进行2.5-5h溶胀反应，再进行旋蒸和清洗，得到所述绿色荧光微球。
第二方面，本发明提供一种绿色荧光微球，所述绿色荧光微球由第一方面所述的制备方法得到。制备得到的绿色荧光微球具有核壳结构。该绿色荧光微球经独特的内部染色工艺制得，内部染色工艺可保证微球荧光稳定，可有效防止荧光猝灭，表面无染料泄露，降低生物学应用环境因素对于荧光强度的影响。另绿色荧光微球表面的羧基分布可提高微球表面的共价偶联效率及检测灵敏度。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的绿色荧光微球在生物检测中的应用。该绿色荧光微球偶联PCT抗体，可用于POCT快检。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述的制备方法操作简单，得到的绿色荧光微球尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强而且性能稳定。
(2)本发明所述的绿色荧光微球偶联抗体后，具有快速、简便、廉价、检查结果直观、稳定性好、检测标本种类多以及灵敏度低等特点，可达到对待测物进行定量分析的目的。
(3)本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，在0.25ng/mL下的T/C比值的平均值在0.0196–0.0372之间，10次测量结果的标准差SD在0.0011-0.0018之间，变异系数CV在5.8％以内；
本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，在0.5ng/mL下的T/C比值的平均值在0.0548–0.0737之间，SD在0.0041–0.0048之间，CV在8.6％以内；
本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，在1ng/mL下的T/C比值的平均值在0.1101–0.1497之间，SD在0.0074–0.0097之间，CV在8.8％以内；
本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，在5ng/mL下的T/C比值的平均值在0.7042–1.0416之间，SD在0.0598-0.0836之间，CV在9.9％以内。
本发明的绿色荧光微球的制备方法操作简单，得到的绿色荧光微球尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强而且性能稳定。所述的绿色荧光微球偶联抗体后，具有快速、简便、廉价、检查结果直观、稳定性好、检测标本种类多以及灵敏度低等特点，可达到对待测物进行定量分析的目的。
附图说明
图1是实施例1所述的绿色荧光微球的扫描电镜图；
图2是实施例2所述的绿色荧光微球的扫描电镜图；
图3是实施例3所述的绿色荧光微球的扫描电镜图；
图4是实施例1合成的硼二吡咯化合物的结构式与谱图对照。
图5是实施例2合成的硼二吡咯化合物的结构式与谱图对照。
图6是实施例3合成的硼二吡咯化合物的结构式与谱图对照
图7是实施例1-3制备的硼二吡咯染料在荧光光度计进行荧光强度测试的测试谱图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种绿色荧光微球，所述绿色荧光微球由如下方法制备得到：
(1)羧基聚苯乙烯微球的种子乳液的制备
取分散水系(水系分散液)于水浴槽中，在氮气气氛下，将体积比为0.3:0.5:0.5的苯乙烯和羧基功能单体丙烯酸和甲基丙烯酸依次加入水中分散，混合均匀，再将基于苯乙烯单体用量的0.3wt％的引发剂过硫酸钾加入反应体系中溶解60min，加热至60℃，进行4h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
(2)硼二吡咯染料的制备
取1mmol的吡咯和1mmol的吡咯醛溶解在10mL二氯甲烷溶液中，得到混合液；加入0.2mmol的三氯氧磷，在25℃下反应6h；然后再加入10mmol的三乙胺和10mmol的三氟化硼，在25℃下反应12h。
反应结束后，向反应瓶中加入10-20mL的去离子水，再用二氯甲烷和去离子水萃取，收集有机相；然后用无水硫酸钠进行干燥，旋蒸蒸发溶剂得到金属光泽的固体，最后用正己烷和二氯甲烷进行柱层析提纯，得到金属光泽的固体，即硼二吡咯染料。
(3)绿色荧光微球的制备
取0.04g硼二吡咯染料依次加入5g溶胀剂和5g无水乙醇，避光条件下超声溶解，将染料溶液转移到装有20g羧基聚苯乙烯微球种子乳液的三口烧瓶中。将三口烧瓶安装在水浴锅上，设置机械搅拌转速为150rpm，温度为35℃，反应1h后将水浴锅温度升至50℃继续反应2h。反应结束后，将混合溶液转移到透析袋中，用去离子水透析，换水透析10-20次后收料，得到所述绿色荧光微球。
实施例2
本实施例提供一种绿色荧光微球，所述绿色荧光微球由如下方法制备得到：
(1)羧基聚苯乙烯微球的种子乳液的制备
取分散水系于水浴槽中，在氮气气氛下，将体积比为0.3:0.5:0.5的苯乙烯和羧基功能单体丙烯酸和甲基丙烯酸依次加入水中分散，混合均匀，再将基于苯乙烯单体用量的0.3wt％的引发剂过硫酸钾加入反应体系中溶解60min，加热至60℃，进行4h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
(2)硼二吡咯染料的制备
取1mmol的2,4-二甲基吡咯和2mmol的3,5-二甲基-2-吡咯甲醛溶解在20mL二氯甲烷溶液中，得到混合液；加入0.4mmol的三氯氧磷，在25℃下反应6h；然后再加入20mmol的三乙胺和20mmol的三氟化硼，在25℃下反应12h。
反应结束后，向反应瓶中加入10-20mL的去离子水，再用二氯甲烷和去离子水萃取，收集有机相；然后用无水硫酸钠进行干燥，旋蒸蒸发溶剂得到金属光泽的固体，最后用正己烷和二氯甲烷进行柱层析提纯，得到金属光泽的固体硼二吡咯染料。
(3)绿色荧光微球的制备
取0.06g硼二吡咯染料依次加入5g溶胀剂和5g无水乙醇，避光条件下超声溶解，将染料溶液转移到装有20g羧基聚苯乙烯微球种子乳液的三口烧瓶中。将三口烧瓶安装在水浴锅上，设置机械搅拌转速为150rpm，温度为35℃，反应1h后将水浴锅温度升至50℃继续反应2h。反应结束后，将混合溶液转移到透析袋中，用去离子水透析，换水透析10-20次后收料，得到所述绿色荧光微球。
实施例3
本实施例提供一种绿色荧光微球，所述绿色荧光微球由如下方法制备得到：
(1)羧基聚苯乙烯微球的种子乳液的制备
取分散水系于水浴槽中，在氮气气氛下，将体积比为0.3:0.5:0.5的苯乙烯和羧基功能单体丙烯酸和甲基丙烯酸依次加入水中分散，混合均匀，再将基于苯乙烯单体用量的0.3wt％的引发剂过硫酸钾加入反应体系中溶解60min，加热至60℃，进行4h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
(2)硼二吡咯染料的制备
取1mmol的2,4-二甲基-3-乙基吡咯和2mmol的3,5-二甲基-4-乙基-2-吡咯甲醛溶解在20mL二氯甲烷溶液中，得到混合液；加入0.4mmol的三氯氧磷，在25℃下反应6h；然后再加入20mmol的三乙胺和20mmol的三氟化硼，在25℃下反应12h。
反应结束后，向反应瓶中加入10-20mL的去离子水，再用二氯甲烷和去离子水萃取，收集有机相；然后用无水硫酸钠进行干燥，旋蒸蒸发溶剂得到金属光泽的固体，最后用正己烷和二氯甲烷进行柱层析提纯，得到金属光泽的固体硼二吡咯染料。
(3)绿色荧光微球的制备
取0.1g硼二吡咯染料依次加入5g溶胀剂和5g无水乙醇，避光条件下超声溶解，将染料溶液转移到装有20g羧基聚苯乙烯微球种子乳液的三口烧瓶中。将三口烧瓶安装在水浴锅上，设置机械搅拌转速为150rpm，温度为35℃，反应1h后将水浴锅温度升至50℃继续反应2h。反应结束后，将混合溶液转移到透析袋中，用去离子水透析，换水透析10-20次后收料，得到所述绿色荧光微球。
实施例4性能测试
1、将实施例1-3制得的所述绿色荧光微球进行扫描电镜测试，观察表观形貌，测试结果分别见图1、图2和图3。
图1～图3显示，本发明所制备的绿色荧光微球的粒径均一表面规整，粒径范围为210～230nm。
2、将实施例1-3所述的硼二吡咯染料进行核磁共振测试。核磁共振(NMR)可以根据化学位移鉴定基团，由耦合分裂峰数、偶合常数确定基团联结关系，根据各H峰积分面积定出各基团质子比。
图4、图5、图6，是实施例1、2、3分别的合成化合物硼二吡咯的结构式与谱图对照，可知各实施例合成的硼二吡咯化合物和预定的结构一致。
实施例1所述硼二吡咯染料为化合物1，分子式C9H7N2BF2，分子量192.07，核磁结果见图4为1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.53(dd,J＝6.9,1.0Hz,1H),8.34(dd,J＝3.8,1.5Hz,1H),8.12(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),7.66(dd,J＝7.8,6.9Hz,1H),7.55(dd,J＝7.9,3.8Hz,1H),6.93(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),6.31(s,1H)。
实施例2所述硼二吡咯染料为化合物II，分子式C13H15BF2N2，分子量248.13，核磁结果见图5为1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.48(m,J＝1.2Hz,1H),7.01(s,1H),6.03(s,1H),2.62(d,J＝1.3Hz,3H),2.51(s,3H),2.30–2.19(m,6H)。
实施例3所述硼二吡咯染料为化合物III，分子式C17H23BF2N2，分子量304.19，核磁结果见图6为1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.10(s,1H),2.63(q,J＝7.9Hz,2H),2.52(q,J＝7.2Hz,2H),2.39(s,3H),2.36(s,3H),2.18(s,3H),2.12(s,3H),1.18(t,J＝7.9Hz,3H),1.11(t,J＝7.2Hz,3H)。
3、将实施例1-3所述的硼二吡咯染料在荧光光度计进行荧光强度的测试，测试谱图汇总于图7中。图7显示化合物I的最大发射波长在514nm，化合物II的最大发射波长在520nm，化合物III的最大发射波长是550nm。
4、将实施例1-3所述的绿色荧光微球在荧光光度计进行荧光强度的测试，测试结果汇总于表5中。
表5显示，本发明所述的硼二吡咯染料用超纯水稀释成0.02％浓度，仪器参数设置激发波长504nm，发射波长515nm下进行测试。实施例1-3的绿色荧光微球的荧光强度分别为2300、2500、2100，对比荧光强度实施例2所述的制备方法最佳。
5、将实施例1-3所述的绿色荧光微球偶联抗体后进行测试；
(1)绿色荧光微球偶联抗体的制备方法
(a)活化：将绿色荧光微球混匀后，取100μL 1％固含量的乳胶微球悬浮液到EP管中，向EP管内加入1mL EDC/Sulfo-NHS的Buffer溶液(浓度为200mM，Sulfo-NHS溶液的浓度为200mM，MES为活化缓冲液50mM，pH 5.5)，在30℃下振荡孵育30min，活化结束后在15000rpm条件下离心10min，移去上清液。
(b)偶联：向EP管内加入1mL硼酸盐缓冲液，旋涡重悬分散后加入PCT抗体(所述绿色荧光微球与抗体的质量比为1mg:0.1mg)，漩涡混合器充分混匀微球，在37℃下振荡偶联2h，完成标记。将上述EP管的微球悬浮液，4℃、15000rpm、离心10min，小心移去上清液。
(c)洗涤：向EP管内加入1mL洗涤液，超声分散混匀微球，其中，超声分散的功率为200W，超声总时间为1min(超5s停5s)，然后在4℃、15000rpm、离心10min，小心移去上清液。重复该步骤1次。
(d)封闭：向EP管内加入1mL封闭液(BSA和甘氨酸的HEPES缓冲液母液与偶联缓冲液体积比为1:9的混合溶液)，超声分散混匀微球，常温旋转封闭过夜，4℃、15000rpm、离心10min，小心移去上清液。
(e)保存：向EP管内加入250μL微球保存液(NaCl、BSA、Tween-20和海藻糖的磷酸盐缓冲液)，超声混匀微球，获得绿色荧光微球标记抗体的微球溶液。
(2)绿色荧光微球偶联PCT抗体后试纸条重复性试验
本发明中，试纸条是由四部分组成：样本垫、结合垫、NC膜以及吸水垫。将其按一定顺序以相互重叠的方式粘贴于PVC底板上，组装好后形成完整的试纸条体系。采用喷金划膜仪在NC膜上进行划线，包被有单克隆PCT抗体和羊抗鼠IgG抗体作为试纸条的检测线(T线)与质控线(C线)。
将制备的三种绿色荧光微球(实施例1-3制备微球标记为A、B、C)，偶联PCT抗体的微球溶液进行铺垫干燥后，与NC膜、吸水垫、玻璃纤维膜一起组装得到层析试纸条，在PCT抗原浓度为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL梯度参考品下进行精密度测试。
测试结果汇总于表1-4和图4中。
表1绿色荧光微球偶联后在0.25ng/mL下的T/C比值
表2绿色荧光微球偶联后在0.5ng/mL下的T/C比值
| 编号 | A | B | C |
| 1 | 0.0510 | 0.0776 | 0.0666 |
| 2 | 0.0511 | 0.0773 | 0.0665 |
| 3 | 0.0543 | 0.0717 | 0.0596 |
| 4 | 0.0540 | 0.0723 | 0.0596 |
| 5 | 0.0546 | 0.0791 | 0.0569 |
| 6 | 0.0519 | 0.0791 | 0.0566 |
| 7 | 0.0523 | 0.0705 | 0.0582 |
| 8 | 0.0522 | 0.0700 | 0.0580 |
| 9 | 0.0635 | 0.0696 | 0.0679 |
| 10 | 0.0635 | 0.0699 | 0.0681 |
| Mean | 0.0548 | 0.0737 | 0.0618 |
| SD | 0.0047 | 0.0041 | 0.0048 |
| CV | 8.6％ | 5.5％ | 7.8％ |
表3绿色荧光微球偶联后在1ng/mL下的T/C比值
| 编号 | A | B | C |
| 1 | 0.1013 | 0.1597 | 0.1172 |
| 2 | 0.1017 | 0.1597 | 0.1172 |
| 3 | 0.1033 | 0.1522 | 0.1209 |
| 4 | 0.1034 | 0.1525 | 0.1206 |
| 5 | 0.1194 | 0.1339 | 0.1032 |
| 6 | 0.1193 | 0.1335 | 0.1032 |
| 7 | 0.1097 | 0.1486 | 0.0960 |
| 8 | 0.1096 | 0.1488 | 0.0963 |
| 9 | 0.1167 | 0.1541 | 0.1144 |
| 10 | 0.1165 | 0.1544 | 0.1144 |
| Mean | 0.1101 | 0.1497 | 0.1103 |
| SD | 0.0074 | 0.0092 | 0.0097 |
| CV | 6.7％ | 6.2％ | 8.8％ |
表4绿色荧光微球偶联后在5ng/mL下的T/C比值
| 编号 | A | B | C |
| 1 | 0.7577 | 1.0399 | 0.6592 |
| 2 | 0.7579 | 1.0400 | 0.6594 |
| 3 | 0.7834 | 1.0780 | 0.6715 |
| 4 | 0.7862 | 1.0776 | 0.6737 |
| 5 | 0.9055 | 0.9310 | 0.6817 |
| 6 | 0.9050 | 0.9351 | 0.6810 |
| 7 | 0.7700 | 1.1456 | 0.8358 |
| 8 | 0.7770 | 1.1859 | 0.8344 |
| 9 | 0.7493 | 0.9908 | 0.6725 |
| 10 | 0.7518 | 0.9923 | 0.6727 |
| Mean | 0.7944 | 1.0416 | 0.7042 |
| SD | 0.0598 | 0.0836 | 0.0694 |
| CV | 7.5％ | 8.0％ | 9.9％ |
分析表1-表4可知，本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，微球溶液喷垫制作成试纸条，在0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL梯度参考品下做重复性试验，批内精密度均小于15％，所述绿色荧光微球偶联PCT抗体性能稳定。
具体地，分析表1数据可知，本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，在0.25ng/mL下的T/C比值的平均值在0.0196–0.0372之间，10次测量结果的标准差SD在0.0011-0.0018之间，变异系数CV在5.8％以内。本发明所述的实施案例2的绿色荧光微球信噪比(T/C)更高且CV更低，在一定程度表明试纸条的重复性和灵敏度更好。
分析表2数据可知，本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，在0.5ng/mL下的T/C比值的平均值在0.0548–0.0737之间，SD在0.0041–0.0048之间，CV在8.6％以内。本发明所述的实施案例2的绿色荧光微球信噪比(T/C)更高且CV更低，表明该微球使用性能更优。
分析表3数据可知，本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，在1ng/mL下的T/C比值的平均值在0.1101–0.1497之间，SD在0.0074–0.0097之间，CV在8.8％以内。本发明所述的实施案例2的绿色荧光微球信噪比(T/C)更高且CV更低，表明该微球使用性能更优。
分析表4数据可知，本发明所述的绿色荧光微球偶联PCT抗体后，在5ng/mL下的T/C比值的平均值在0.7042–1.0416之间，SD在0.0598-0.0836之间，CV在9.9％以内。本发明所述的实施案例2的绿色荧光微球信噪比(T/C)明显高于其它组，表明该微球使用性能明显更优。
5、将实施例1-3进行如下测试：
将上所述的绿色荧光微球分别用超纯水取样稀释成0.01％浓度的样品，在纳米粒度及Zeta电位分析仪上，进行粒径的测试。
将上所述的绿色荧光微球分别用超纯水取样稀释成0.02％浓度的样品，在荧光分光光度计上设置相对应的激发波长/发射波长(Ex/Em)，进行荧光强度的测试。
上所述的绿色荧光微球的荧光强度结果汇总于表5中。
表5绿色荧光微球的理化性能
| 编号 | 基础信息 | 粒径(nm) | 羧基量(μmol/g) | 荧光强度 |
| 1 | 实施例1 | 221 | 110 | 2300 |
| 2 | 实施例2 | 222 | 115 | 2500 |
| 3 | 实施例3 | 221 | 105 | 2100 |
结果表明：
实施例1-3的粒径和羧基量相当，说明羧基聚苯乙烯种子乳液包埋不同硼二吡咯染料后的微球，其平均粒径和表面基团含量基本不变。
实施例1、3荧光强度性能不如实施例2，说明2,4-二甲基吡咯和3,5-二甲基-2-吡咯甲醛组合制备的绿色荧光微球性能更佳。
本发明的绿色荧光微球制备方法操作简单，得到的绿色荧光微球尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强而且性能稳定。所述的绿色荧光微球偶联抗体后，具有快速、简便、廉价、检查结果直观、稳定性好、检测标本种类多以及灵敏度低等特点，可达到对待测物进行定量分析的目的。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (19)
1.一种绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)苯乙烯和羧基功能单体进行乳液聚合反应：将苯乙烯、羧基功能单体和水混合成为反应体系，再将引发剂加入所述反应体系中溶解，加热至反应温度，进行乳液聚合反应，得到羧基聚苯乙烯微球的种子乳液；
(2)制备硼二吡咯染料：将吡咯和吡咯醛溶解在有机相溶液中，加入三氯氧磷反应，再加入三氟化硼和有机碱继续反应，得到固体的硼二吡咯染料；
(3)溶胀包埋：将所述硼二吡咯染料溶解到溶胀剂中制成硼二吡咯染料溶液，再和所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液混合，避光条件下进行溶胀反应，将硼二吡咯染料包埋至羧基聚苯乙烯微球内部，得到所述绿色荧光微球。
2.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述乳液聚合反应的温度为60-80℃；反应的时间为4-24h。
3.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，以所述苯乙烯的总质量为100％计，所述引发剂的质量百分数为0.1％-0.5％。
4.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述苯乙烯和羧基功能单体的体积比为(0.1-0.4):1。
5.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述羧基功能单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯或丙烯酸二甲氨基丙酯中的任意一种或两种及以上的组合。
6.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引发剂为水相引发剂。
7.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述有机相溶液为二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述有机碱为二乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的任意一种。
9.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述吡咯和吡咯醛的摩尔比为1:(1-2)。
10.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述吡咯和吡咯醛体积之和与有机相溶液的体积比为1:(5-20)。
11.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述吡咯和三氯氧磷的摩尔比为1:(0.2-0.5)。
12.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述吡咯、有机碱、三氟化硼的摩尔比为1:(10-20):(10-20)。
13.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述吡咯和吡咯醛，也可以是2,4-二甲基吡咯、2,4-二甲基-3-乙基吡咯和3,5-二甲基-2-吡咯甲醛、3,5-二甲基-4-乙基-2-吡咯甲醛之间的任意组合。
14.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述硼二吡咯染料和羧基聚苯乙烯微球的质量比为(0.04-0.1)：20。
15.根据权利要求1所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述硼二吡咯染料溶液包括硼二吡咯染料和溶胀剂；所述硼二吡咯染料和溶胀剂的质量比为(0.02-0.2)：10。
16.根据权利要求15所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液和溶胀剂的质量比为(2-4):1。
17.根据权利要求15所述的绿色荧光微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述溶胀剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、己烯丙酮、甲苯、己二酸二辛酯、正辛烷或正己烷中的任意一种或至少两种的组合。
18.一种绿色荧光微球，其特征在于，所述绿色荧光微球由权利要求1-17任一项所述的制备方法得到。
19.一种权利要求18所述的绿色荧光微球在生物检测中的应用。
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