CN117603383A - 一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用 - Google Patents
一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，所述空心高分子微球的制备方法具体包括以下步骤：将苯乙烯、功能单体、引发剂、活性成分和去离子水搅拌反应得到乳液；将所述乳液采用有机溶剂溶胀，离心后得到沉淀即为功能化的空心高分子微球。本发明提供的空心高分子微球的球形度良好、粒径均一、空心率高、表面性质可调控修饰，能够更好地分散在水相溶液中，提高试剂的稳定性，增强检测试剂的灵敏度和准确度，使其在成像与检测领域中具有重要的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及成像与检测技术领域，具体涉及一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用。
背景技术
高分子微球因其材料来源广泛、粒径大小均一可控、功能单体选择多样化、聚合工艺适于批量生产等独特优势，在众多领域得到广泛应用，尤其是面向人体的生命健康如体外诊断、细胞活体生物成像与检测、食品安全和环境监测等领域。
体外诊断是疾病诊断的主要途径，同时体外诊断试剂也被用于个人健康水平的检测及预警，体外诊断试剂的涉及范围极广，包括了肝肾功能、心梗检测和炎症诊断等一系列项目，体外诊断多使用血液、尿液、唾液等作为检测样本，以求达到快速、便捷、精准的诊断目的，在体外诊断领域，免疫检测技术是重要的组成部分，其利用抗原与抗体之间高特异性识别与结合反应实现生物分子的检测，其中，基于微球的免疫检测占据重要的地位。
细胞及活体层次的生物成像，因其实时、快速、可视化等优势，在病理病程研究、生理现象探索、早期诊断等方面发挥着重要作用，例如，发光微球作为探针材料，负载发光材料分散于水相环境，在生物成像领域具有广泛的应用。
食品及环境安全影响广泛，建立快速、高效的污染物检测方法在生命科学、环境科学、食品以及农业生产等方面都具有重要的意义。荧光探针在检测污染物时具有选择性好、灵敏度高、检测限低、快速可视化等优势，但由于有机发光探针通常水溶性差且在水中荧光量子效率低，所以高分子微球载体具有显著的实用价值。
但是以上应用研究，使用的高分子微球通常为实心高分子微球，由于其密度较大易发生沉降，同时在水相中的稳定性较差，因而在一定程度上其应用领域受到了限制或者应用效果并不理想。
因此，提供一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明目的在于提出一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，本发明提供的空心高分子微球的球形度良好、粒径均一、空心率高、表面性质可调控修饰，能够更好地分散在水相溶液中，提高试剂的稳定性，增强检测试剂的灵敏度和准确度，使其在成像与检测领域中具有重要的实际应用价值。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，所述空心高分子微球的制备方法具体包括以下步骤：
将苯乙烯、功能单体、引发剂、活性成分和去离子水搅拌反应得到乳液；
将所述乳液采用有机溶剂溶胀，离心后得到沉淀即为功能化的空心高分子微球。
优选地，所述活性成分和所述去离子水的质量比为0.003-0.3:100；
所述苯乙烯、所述功能单体和所述去离子水的体积比为3-10:1.2-6:100；
所述引发剂和所述去离子水的质量比为0.05-0.4:100；
所述反应的温度为65-80℃，时间为4-16h；
所述搅拌的转速为150-600rpm。
优选地，所述活性成分包括矿物质盐和/或生物大分子；
所述功能单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯；
所述引发剂为过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸铵中的任意一种。
优选地，所述矿物质盐包括钙盐、磷盐、镁盐、钾盐、钠盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、碘盐、硒盐和钼盐中的至少一种；
所述生物大分子包括氨基酸、核苷酸、多糖、维生素和蛋白质中的至少一种；
所述反应的温度为70℃。
优选地，所述乳液和所述有机溶剂的体积比大于1，溶胀时间大于1min；
所述有机溶剂为四氢呋喃、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、环己烷、甲苯、二甲苯和三甲苯中的至少一种。
优选地，制备得到的上述空心高分子微球，通过离心弃上清液，然后用水、乙醇或乙醇/水混合液交替洗涤离心即可。
优选地，反应在惰性气体氛围中进行，惰性气体优选包括氮气、氦气、氩气中的一种。
本发明使用的功能单体带有亲水性的环氧基官能团，在进行无皂乳液聚合的过程中，亲水性的官能团优先分布在微球的外侧，而疏水性的官能团较多的分布在微球的内部。其中，亲水性的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯在有机溶剂中基本不发生溶解，主要是由于在微球外侧甲基丙烯酸缩水甘油酯持续的反应中发生了交联，而分布在内部的聚苯乙烯极易溶解在有机溶剂中。
在通常的聚合反应中，两种单体倾向于无规共聚，导致微球在有机溶剂溶胀过程中有较多的表面被破坏，无法形成高质量的空心结构，然而，本发明在苯乙烯与甲基丙烯酸缩水甘油酯的反应液中加入活性成分，可改变单体之间的聚合倾向，即有更多的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯倾向于分布在微球外部、而更多的聚苯乙烯倾向于分布在微球内部，且在溶胀过程中微球的形貌基本不发生变化，进而通过反应条件的控制，可制得粒径均一且单分散的功能化中空高分子微球。
同时，不加入功能单体的微球，其聚合物链为线性结构，难以稳定存在于高浓度的有机溶剂中；而本发明通过添加了较高用量的功能单体，合成的高分子微球能够在高浓度的有机溶剂中长时间稳定存在，功能单体用量在合适的比例下能够使微球处于中空结构，增加功能单体用量会使得微球的中空度降低，功能单体用量大幅度降低，则会使得微球在有机溶剂中发生较大程度的破损或者溶解。
优选地，所述成像与检测领域包括制备生物成像剂、制备体外诊断剂、环境监测和食品安全检测。
优选地，所述功能化的方式包括以下几种：
所述空心高分子微球表面修饰环氧基、羧基、氨基、醛基和羟基中的至少一种；
或者所述空心高分子微球内部负载发光材料和/或磁性材料；
或者所述空心高分子微球与生物标志物特异性结合的对应物偶联；
或者所述空心高分子微球表面接枝荧光探针。
优选地，所述体外诊断剂应用于免疫检测，所述免疫检测包括免疫比浊检测、均相免疫发光检测、化学发光免疫检测、时间分辨免疫检测、免疫层析检测和酶联免疫检测等。
所述免疫比浊检测优选将抗体偶联至所述空心高分子微球上，在遇到对应抗原(半抗原)时，空心高分子微球上的抗体与抗原(半抗原)特异性结合，引起微球凝聚，从而引起溶液的浊度变化，通过测试溶液中透射或散射的吸光度变化，可确定样本中待测抗原(半抗原)的浓度。
优选地，所述均相免疫发光检测优选所述空心高分子微球作为表面包被敏化剂或发光剂的载体(分别为供体微球和受体微球)，再将对应抗体分别包被在上述供体微球或受体微球上，加入待测溶液，当遇到对应抗原时，供体微球和载体微球通过特异性反应结合在一起，供体微球在光激发下由光敏剂释放单线态氧，单线态氧在扩散至受体微球，刺激发光剂产生光信号，通过检测该光信号强度可以实现定性或定量检测。
优选地，所述化学发光免疫检测选用所述空心高分子微球作为固相载体，鲁米诺、吖啶酯或三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+作为发光物质。
优选地，所述酶联免疫检测优选所述空心高分子微球作为固相载体，偶联抗原或抗体，利用抗原-抗体特异性结合作用检测待测样品中的待测抗体或待测抗原，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶作为标记物。
优选地，所述免疫检测包括用于传染性疾病、内分泌疾病、呼吸道疾病、肾病、高血压、心血管疾病、炎症、肿瘤的标志物的检测。
所述常见心血管疾病包括心肌梗死、心肌缺血、心衰等疾病，其标志物包括心肌损伤标志物(肌钙蛋白Tn、肌红蛋白MYO、肌酸激酶同工酶CK-MB)、心脏型脂肪酸结合蛋白H-FABP、心脏功能(BNP、NT-proNBP)、血小板功能与凝血机制(D-二聚体)等。
所述传染性疾病主要包括性病(艾滋病、梅毒)、病毒性肝炎(甲肝HAV、乙肝HBV、丙肝HCV、戊肝HEV等)、疟疾、流感以及诊断细菌感染、脓毒症、病毒感染等疾病，其标志物主要为抗原表面蛋白或其他抗原，例如乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg、HIV重组抗原。
所述常见的内分泌疾病包括糖尿病、甲状腺疾病、肾上腺疾病、多囊卵巢综合症等，其标志物包括但不限于胰岛素INS、三/四碘甲状腺原氨酸T3/T4、促甲状腺激素TSH、甲状腺过氧化物酶TPO、Ⅰ型前胶原氨基端前肽PINP、黄体生成素LH、卵泡刺激素FSH、女性雌二醇E2、抗缪勒氏管激素AMH等。
所述高血压检测的标志物包括但不限于血浆肾素(Renin)、血浆血管紧张素(AII)、血浆醛固酮(ALD)、血浆皮质醇(Cortisol)、血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)。
所述呼吸道疾病检测的标志物包括C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、IL-6、红细胞沉降率(ESR)等。
所述肾病标志物包括DC3细胞高表达的基因TNF、IL1B、CCL17、CCL22、HLA、CD40、CD80、CD86中的至少一种，和/或DC3细胞成熟相关联的转录因子STAT4、RELB中的至少一种；和/或受损近端肾小管上皮细胞(iPT)高表达基因VCAM1、CCL2、CXCL12、CX3CL1中的至少一种。
所述炎症标志物包括降钙素原(PCT)、白细胞介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)、人血清淀粉样蛋白A(SAA1)、人胰蛋白酶原2(PRSS2)、脂多糖结合蛋白(LBP)、可溶性髓系细胞表达触发受体-1(sTREM-1)、可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(suPAR)、肾上腺髓质素前体(pro-ADM)，SCD14亚型(Presepsin)中的至少一种。
其他的标志物还包括血清淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、甲胎蛋白(AFP)、血清癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白CYFRA21-1、铁蛋白Fer、组织多肽抗原TPA、前列腺特异抗原PSA、人绒毛膜促性腺激素β-HCG、白细胞介素-6、肝素结合蛋白HBP、脂蛋白相关磷脂酶A2、β2-微球蛋白(BMG)、胱抑素C(CysC)、视黄醇结合蛋白(RBP)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、α1-微球蛋白(AMG)、尿微量白蛋白(MALB)。
优选地，所述免疫比浊为用于全血中的血清淀粉样蛋白A的检测。
优选地，所述均相免疫发光为用于全血中的C反应蛋白CRP的检测。
优选地，所述免疫层析为用于全血中的降钙素原PCT的检测。
优选地，所述时间分辨免疫检测为用于临床上POCT(point ofcare testing)的快速诊断，检测cTnI、H-FABP、CK-MB、MYO中的至少一种。
优选地，上述空心高分子微球功能化的方法为表面含有环氧基、羧基、氨基、醛基和羟基中的至少一种。
优选地，所述生物成像剂包括细胞成像剂、小动物活体成像剂、大动物活体成像剂、生物组织成像剂、血液成像剂和尿液成像剂中的任意一种。
优选地，上述用于生物成像剂的空心高分子微球内部负载有发光材料/磁性材料。
优选地，所述磁性材料包括纳米磁珠、铁基磁性纳米粒子、复合磁性纳米粒子、磁性量子点中的至少一种。
所述发光材料包括荧光染料、稀土掺杂上转换发光纳米粒子、稀土配合物、金属配合物、无机长余辉材料、有机长余辉材料和光化学长余辉材料中的至少一种。
优选地，所述环境监测包括对环境中的离子、pH、微生物、大分子、有机小分子、污染物等进行检测，具体包括但不限于水体离子检测、水体pH检测、水体微生物检测、水体大分子检测、水体有机小分子检测、水体污染物检测、大气污染物检测、土壤污染物检测、土壤离子检测、土壤pH检测、土壤微生物检测、土壤大分子检测和土壤有机小分子检测中。
优选地，上述空心高分子微球表面接枝荧光探针用于重金属离子的检测。
其中，所述重金属离子包括铜离子、锌离子、汞离子、银离子、铅离子、镉离子、砷离子、镁离子、锰离子和钴离子中的任意一种。
优选地，所述空心高分子微球表面接枝荧光探针用于汞离子的检测。
优选地，所述空心高分子微球氯化后，与不同的荧光分子探针修饰结合制备的固相荧光传感器用于检测用于重金属离子的检测。
所述食品安全检测包括但不限于食品营养成分检测、食品污染物检测和食品添加剂检测。
优选地，所述空心高分子微球表面修饰多聚谷氨酸形成的纳米螯合筛介导的低场核磁共振免疫传感器可用于食品污染物的检测。
优选地，所述食品污染物包括生物大分子、抗生素、农药残留物。
其中，所述农药残留物包括有机磷类、有机氯类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、苯氧乙酸类、有机锡类。
所述生物大分子包括降钙素原、沙门氏菌。
所述抗生素包括氯霉素、新霉素。
优选地，所述空心高分子微球由羧基和氨基修饰后可用于农药残留物的检测。
优选地，所述空心高分子微球内填充发光材料和磁性富集材料，可用于对食源性致病菌的检测。
优选地，所述空心高分子微球羧基化后可用于对三聚氰胺分子的检测。
优选地，所述空心高分子微球与抗体偶联，可用于对食品中的瘦肉精进行检测。
优选地，所述空心高分子微球表面羧基化后内部包埋油溶性CdSe/ZnS量子点用于真菌毒素的检测。
其中，所述真菌毒素包括环匹阿尼酸、黄曲霉毒素。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的功能化空心高分子微球表面具有较大的比表面积，表面含有大量的环氧基，亲水性较好，能够与生物分子进行偶联，且各种官能团和生物物种可以很容易地对微球的表面进行改性，每个微球上都能够被连接上大量的荧光分子，在体外诊断或生物成像领域，是非常好的荧光信号放大的载体。
(2)本发明提供的功能化空心高分子微球粒径均一、球形度良好、且表面无凹陷和破损、负载能力高，荧光微球在低浓度下具有较高的荧光信号值，在高浓度下或长时间放置过程中不易聚集，荧光微球非常稳定，受外界影响小，具有较好的荧光强度及光稳定性，增强免疫检测技术的灵敏度、稳定性和准确度，适用于医疗诊断、生物检测、环境检测和食品安全监测以及生物成像领域中；与传统的实心高分子微球相比，高分子空心微球具有密度低、比表面积大、负载能力强等特性，因而在生物、医学、药学、食品、化工等方面具有更广泛的应用前景，尤其是密度低、可功能化的空心高分子微球，将极大地改善上述应用的性能效果，具有显著性进步。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，本描述中的附图仅仅是本发明的实施例。
图1为传统的微球与本发明实施例中制备得到的实心高分子微球与空心高分子微球的电镜图；
图2为实施例1和实施例2制备得到的空心高分子微球的透射电镜图；
图3为对比例2制备得到的空心高分子微球的透射电镜图；
图4为实施例18高分子微球稳定性测试结果图；
图5为实施例19荧光微球的光稳定测试结果图；
图6为对比例3高分子微球偶联抗体的效果图；
图7为实施例25高分子微球精密度结果图；
图8为实施例26高分子微球的染料负载情况图；
图9为实施例26羧基化高分子微球的染料负载情况图。
具体实施方式
下面描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不理解为对本发明的限制。
实施例1
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、100mg氯化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应8h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合溶胀5min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，得到空心高分子微球。
电镜(TEM)测试：在日本Hitachi公司的HT7700透射电子显微镜上进行，将制备得到的高分子微球稀释1000倍后滴加至覆盖有碳膜的铜支撑网上，室温下自然晾干后再进行表征，工作电压为100kV，未溶胀处理前实心高分子微球直径在275nm左右，溶胀处理后得到了表面完整的中空高分子微球，形状依然是球形，表面不存在凹陷或者破损，说明高分子微球在四氢呋喃溶剂中基本不发生形貌的改变，测得其直径在270nm左右。
对比例1
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应8h后，反应溶液呈现乳白色，离心弃上层液体，洗涤得到形貌均一的实心聚苯乙烯微球，将上述实心微球采用实施例溶胀方法处理变成空心微球的过程中，存在一系列的问题，参见图1，其中，a为实心微球在溶胀的过程中一些发生溶解，一些在变成空心微球时形貌不规整甚至发生团聚，还有一些实心微球几乎无法溶胀的效果图，这限制了实心微球的应用，b为实施例1中合成的空心微球，可以看出得到的空心高分子微球形貌规则、空心化程度高、尺寸均一。
实施例2
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、30mg氯化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到73℃，反应10h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后用水离心洗涤，制得粒径为259nm的表面完整的中空高分子微球，空心高分子微球电镜图参见图2，由于聚合的温度升高，单体之间的聚合更倾向于无规共聚，当引发温度到达73℃时，制备的空心微球内部中空程度较低。
对比例2
将实施例1制备得到的实心高分子微球乳液与四氢呋喃按照体积比1:1、1:3、1:5、1:10混合溶胀5min、20min、12h以及24h，离心弃上层液体，在不进行离心的情况下进行透射电镜测试，结果见图3，由图可知，在较高含量四氢呋喃溶胀时(微球乳液与四氢呋喃体积比分别为1:5和1:10)，溶胀20min、12h、24h的微球形貌无明显区别，且均具有较高的单分散性。此外，在较低含量四氢呋喃溶胀时(微球乳液与四氢呋喃体积比分别为1:1和1:3)微球之间发生黏连，主要是由于低四氢呋喃含量时，不能有效溶解从微球内部溶胀出的聚苯乙烯，其粘附在微球表面，导致微球相互团聚。
实施例3
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、30mg溴化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后用水离心洗涤，制得粒径为253nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例4
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、30mg氯化钠、5mg核苷酸和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应4h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为264nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例5
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、3mg氯化钙和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为254nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例6
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、300mg氯化钾和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为333nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例7
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钠、100mg氯化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为265nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例8
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入400mg的过硫酸钾、50mg氯化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为285nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例9
将3mL的苯乙烯和1.2mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、10mg氯化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为244nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例10
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、30mg氯化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为200RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为215nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例11
将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、30mg氯化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为500RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为302nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例12
将10mL的苯乙烯和6mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入110mg的过硫酸钾、30mg氯化钠和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体15min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合10min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次，制得粒径为475nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例13
将5mL的苯乙烯和4mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入200mg的过硫酸钾、60mg氯化钠、20mg核苷酸和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体20min后，于室温下加热到65℃，反应16h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和四氢呋喃按照体积比1:2混合15min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤两次，制得粒径为388nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例14
将5mL的苯乙烯和4mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入200mg的过硫酸钾、60mg氯化钾、60mg牛血清白蛋白和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为200RPM，开启冷凝水，通入惰性气体20min后，于室温下加热到68℃，反应15h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和乙醚按照体积比1:4混合15min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤两次，制得粒径为397nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例15
将5mL的苯乙烯和4mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入200mg的过硫酸钾、60mg氯化钾、60mg淀粉和100mL去离子水，启动机械搅拌并设置转速为350RPM，开启冷凝水，通入惰性气体20min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和甲苯按照体积比1:4混合15min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤两次，制得粒径为317nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例16
将5mL的苯乙烯和4mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入200mg的过硫酸钾、60mg氯化钠、60mg维生素D和100mL去离子水，启动机械搅拌，通入惰性气体20min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和环己烷按照体积比1:5混合15min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤两次，制得粒径为336nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例17
将5mL的苯乙烯和4mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中，加入200mg的过硫酸钾、60mg氯化钠、60mg葡萄糖和100mL去离子水，启动机械搅拌，通入惰性气体20min后，于室温下加热到70℃，反应12h后，反应溶液呈现乳白色，将乳液和乙酸乙酯按照体积比1:5混合15min后，离心弃上层液体，随后分别用乙醇和水交替离心洗涤两次，制得粒径为289nm的表面完整的中空高分子微球。
实施例18
空心聚苯乙烯微球颗粒的稳定性
取1g实施例1的空心聚苯乙烯微球溶到50mL去离子水中，充分超声，形成聚苯乙烯球水溶液，利用动态光散射法记录空心聚苯乙烯微球颗粒在6个月内放置过程中的粒径变化，将对比例1中未溶胀处理前获得的实心聚苯乙烯微球，按照上述测试方法记录实心聚苯乙烯微球颗粒的稳定性，结果如图4所示，S1为对比例1微球，S2为实施例1微球，空心聚苯乙烯微球的粒径大小没有发生任何变化，且其单分散性保持不变，说明空心聚苯乙烯微球不易沉降，具有良好的分散稳定性，而实心聚苯乙烯水溶液放置3个月后，粒径急剧增大，颗粒之间发生团聚，说明实心聚苯乙烯颗粒的稳定性相对较差。
实施例19
荧光微球的光稳定性
荧光微球的制备：将敏化剂、发光剂和光化学缓存剂加入到5mL的苯甲醇-乙二醇-水(v:v:v,1:8:1)溶液中，敏化剂浓度为5μmol/L，光化学缓存剂浓度为3mmol/L，发光剂浓度为5mmol/L，各组分超声分散后，加入50mg聚苯乙烯微球，在110℃加热30min，然后，冷却至室温，使用乙醇和水离心清洗3次，最后将纳米粒子配制成1mg/mL浓度的水溶液，获得荧光微球。
由实施例1中的空心聚苯乙烯微球按照上述方法制备得到荧光微球A。
作为对比，对比例1中的实心聚苯乙烯微球，按照上述方法制备得到荧光微球B。
将两种微球置于透明玻璃瓶中，在相同测试条件下，使用爱丁堡FS-5仪器记录两种微球的60min的荧光衰减情况，结果如图5所示，荧光微球A经过60min照射后，荧光强度几乎未下降，经过30min的照射后荧光强度下降了2％，下降并不明显，而荧光微球B的荧光强度30min下降了接近50％，下降较为显著；由于空心聚苯乙烯微球的比重轻、比表面积大，颗粒间不易沉降，因此，荧光微球A具有稳定的高效发光，光稳定性的提升对于很多实际应用有重要的意义，例如可以增加免疫检测中的信号采集的稳定性，进而降低由信号采集导致的误差并提升检测的准确性。
实施例20
基于免疫比浊法检测全血中的血清淀粉样蛋白A(SAA)
胶乳试剂的制备：将实施例1制备得到的空心聚苯乙烯微球在MES(50mM，pH＝6.2)缓冲溶液中稀释至1％，室温下搅拌，加入200mg EDC，搅拌2h后10000RPM离心10min，胶乳用MES(50mM，pH＝6.2)缓冲溶液清洗两次后重悬，加入10mg SAA抗体，搅拌反应2h，然后10000RPM离心15min，去除上清液，胶乳在储存液(50mM PBS+0.5％BSA+0.1％ProClin300+0.5％Triton X-100+0.5％海藻糖，pH 7.0)重悬并超声分散，稀释至胶乳浓度为0.5％左右备用；
标准品的制备：将SAA抗原标准品用50mM PBS配制成一系列标准品，浓度分别为0mg/L、5mg/L、18mg/L、36mg/L、75mg/L、150mg/L、200mg/L、300mg/L；
建立SAA标准曲线：将8个SAA标准品，浓度从0到300mg/L，放于生化仪中样品盘内，分别与配制的SAA胶乳试剂反应，进行检测，记录吸光度，检测波长为546nm，采用两点终点法，反应时间60s，计算两点吸光度差值，根据浓度和吸光度差值建立标准曲线；
同法测定血清样本的吸光度差值，代入校准曲线计算样本SAA浓度，测试结果如表1所示。
表1检测血清样本中SAA的分析评价结果
选用零值标准品作为空白样本测试，按生化仪检测方法重复测试20次，根据建立的标准曲线计算20次测试结果的平均值，以空白均值加两倍标准差作为试剂的灵敏度(最低检测限)，结果显示本试剂的灵敏度为0.15mg/L，血清淀粉样蛋白A的检测临床参考值在10mg/L左右，SAA试剂的灵敏度一般不大于0.5mg/L，本试剂的灵敏度完全符合标准要求。
所以，由表中数据可知，本发明的空心聚苯乙烯微球粒径均一，具有较小的密度，将其应用于免疫比浊检测试剂中，可使微球能更好的分散在溶液中，提高试剂的稳定性，并可检测到低浓度范围内被检测物的浓度，增强检测试剂的灵敏度，并且本试剂具备良好的准确性，测得的变异系数在可接受的范围内。同时，参见图6b，本实施例中的空心高分子微球偶联后可以看到空心高分子微球偶联效果更加优异，由于空心高分子微球密度更低，因此在溶液中几乎无沉降。
对比例3
将聚苯乙烯实心微球用上述同样的方法偶联抗体，并且将聚苯乙烯实心微球及上述实施例20中的聚苯乙烯空心微球放置一天后观察，结果参见图6，图6中a是实心高分子微球偶联抗体的效果，b是空心高分子微球的偶联效果，可以明显看到空心高分子微球偶联抗体的效果比实心高分子微球显著，且实施例20空心聚苯乙烯微球和对比例3中聚苯乙烯实心微球放置一天后进行观察，可以看到实心高分子微球由于密度大沉降严重，而空心高分子微球几乎无沉降，这就为空心高分子微球在溶液中的应用提供了无限潜力。
实施例21
基于均相化学发光免疫检测全血中的C反应蛋白(CRP)
敏化剂：酞菁染料，激发波长730nm，结构式如下：
发光剂：铕配合物，发光波长615nm，结构式如下：
光化学缓存剂，结构式如下：
与生物标志物CRP特异性结合的对应物：CRP-Ab1单克隆抗体、CRP-Ab2单克隆抗体；
载体微球：实施例1制备得到的空心聚苯乙烯球；
检测系统：包括样品室、光源装置、采集装置、检测装置和处理装置，样品室被配置用于盛放待检测的均相免疫反应体系；光源装置被配置用于输出激发长余辉均相检测材料的激发光以照射样品室；采集装置被配置用于采集来自样品室的光；检测装置被配置用于接收从采集装置输出的光并基于所接收的光生成光谱或动力学曲线；处理装置被配置用于数据处理。
供体微球的制备及包被CRP-Ab1单克隆抗体
(1)供体微球的制备
将实施例1制备得到的0.1g空心聚苯乙烯球溶到100mL去离子水中，超声形成分散相；向该分散液中加入2wt％的十二烷基苯磺酸钠和1wt％乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚各1mL，搅拌，得到水相；
将敏化剂分散于10mL四氢呋喃溶液中，溶液配制完成后迅速加入上述水相中，然后逐渐升温到50℃，持续搅拌10h后离心，获得的空心聚苯乙烯球用去离子水和乙醇清洗两次，并保存于去离子水中，制成供体微球，并于避光放于常温下备用。
(2)偶联与生物标志物特异性结合的对应物
取上述制得的供体微球高速离心，用BBS缓冲液清洗3次，最终定容到0.5％的固含量，超声分散均匀，得到分散液；
将500μL上述分散液加入500μL MES和10mg EDC中，室温下反应2h，反应结束后，离心洗涤，分别将其复溶到500μL PBS缓冲液中，向其中分别加入0.05mg CRP-Ab1单克隆抗体，在室温下反应8h；反应结束后，以35000rpm搅拌混合物，离心洗涤，复溶到500μL PBS缓冲液中，向其中加入10mg BSA，室温下反应8h；反应结束后，离心洗涤，得到包被CRP-Ab1抗体的供体微球，将其复溶到1.0mL BBS缓冲液中，并于4℃保存备用。
受体微球的制备及包被CRP-Ab2单克隆抗体
(1)受体微球的制备：按照上述供体微球的制备方法制得受体微球，其中代替敏化剂和参比物质，而将发光剂和缓存剂分散于10mL的四氢呋喃溶液中；
(2)包被CRP-Ab2单克隆抗体：按照上述偶联方法在受体微球上偶联CRP-Ab2单克隆抗体，得到包被CRP-Ab2抗体的受体微球，将其复溶到1.0mL BBS缓冲液中，并于4℃保存备用。
试剂盒的制备
配制微球保护剂，其组成为：20μL 20％(w/v)葡萄糖，20μL10％(w/v)甘露醇，20μL0.5％(w/v)BSA和20μL 0.01(v/v)Proclin-30上述制备的包被CRP-Ab2抗体的受体微球稀释到微球固含量为0.01％，然后分别按1:1体积比与100mM BBS缓冲液(用纯化水配制，含有0.5％(w/v)PEG、0.1％(w/v)SDS、0.9％(w/v)NaCl、0.1％(w/v)KCl、0.5％(w/v)BSA，pH7.0-7.6)进行混合后分装入试剂瓶1作为试剂1、试剂瓶2作为试剂2，得到成品试剂盒，成品试剂盒放置于2-8℃避光保存。
检测方法
检测全血样本中的CRP
(1)建立长余辉光信号-待检测物浓度标准曲线
1)用稀释液(50mM PBS缓冲液，含有1％(w/v)BSA，250mM氯化钠，0.1％(w/v)防腐剂)将余辉生物标志物CRP抗原稀释为浓度依次递增的6份CRP抗原稀释液，浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L、320mg/L，使用稀释液作为0mg/mL；
2)将2μL上述CRP抗原稀释液之一、150μL试剂1、150μL试剂2依次加入同一反应杯中，搅拌均匀制备成免疫反应体系，孵育5min；
3)用730nm激发光照射，参比物质光信号值F1；在10ms后，收集长余辉光信号值F2，通过拟合得到，长余辉光信号-待检测物浓度标准曲线。
(2)检测待测样本(全血)中的生物标志物CRP
1)将2μL待测全血样本、稀释液、150μL试剂1和150μL试剂2依次加入同一反应杯中，搅拌均匀制备成免疫反应体系，孵育5min；
2)用730nm激发光照射反应杯，关闭激发光，在10ms后，收集长余辉信号值F22；
3)将F22长余辉光信号-待检测物浓度标准曲线，得出待测物浓度。
血清样本的测试结果如表2所示，从评价结果可以看出，本试剂盒具有良好的准确性，测得的变异系数在可接受的范围内。
表2检测血清样本中CRP的分析评价结果
以5％人血清白蛋白为空白样本，根据建立的标准曲线计算20次测试结果的平均值，以空白均值加两倍标准差作为试剂的灵敏度，结果显示本试剂盒的灵敏度为0.18mg/L，目前要求CRP试剂的灵敏度一般不大于0.5mg/L，由表中数据可知，本试剂的灵敏度符合标准要求，说明本发明的空心聚苯乙烯微球粒径均一，具有较小的密度，从而能够使微球更好地分散在溶液中，提高试剂的稳定性，增强检测试剂的灵敏度。
实施例22
本实施例同实施例21，所不同的是实施例21中是先制备空心聚苯乙烯微球，然后将实施例21中提及的染料包在空心的聚苯乙烯微球中，而本实施例中是将实施例1中的反应原料和实施例21中的染料、溶胀剂一起混合搅拌，洗涤纯化，发现同样能得到包覆有实施例21中染料的功能化后的空心聚苯乙烯微球。
实施例23
基于免疫层析检测全血中的降钙素原(PCT)
1、荧光微球的制备
(1)分别取30mg菁类荧光染料DiD分散于10mL四氢呋喃溶液中，形成有机相；
(2)取1g实施例1的空心聚苯乙烯微球复溶到50mL去离子水中，充分超声，形成空心聚苯乙烯球水溶液；
(3)向羧基聚苯乙烯球水溶液中加入20％的十二烷基苯磺酸钠和10％乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚各1mL，并放入2mL磁力搅拌子，搅拌得到溶液A；
(4)将有机相迅速加入溶液A中，然后逐渐升温到50℃，持续搅拌10h；
(5)步骤(4)反应完成得到荧光微球，离心除去多余的荧光染料，再分别用去离子水和乙醇清洗两次，并保存于去离子水中，避光放于常温下备用。
免疫层析试纸条检测全血中的降钙素原(PCT)
(1)荧光探针的制备
1)将上述方法制备的荧光微球离心，复溶到18mL pH 7.4的BBS缓冲液中，充分超声使其分散均匀，得到分散体系；
2)向分散体系中分别加入10mg EDC和5mg NHSS，室温下反应2h；
3)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL pH 7.4的BBS缓冲液中，向其中加入5mgPCT-Ab1型单克隆抗体(南京京达生物技术有限公司)，室温下反应4h；
4)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL pH 7.4的BBS缓冲液中，向其中加入100mgBSA，室温下反应2h；
5)反应结束后，离心洗涤，复溶到10mL pH 7.4的BBS缓冲液中，4℃保存备用；
免疫层析试纸条的制备
1)PCT免疫层析试纸条NC膜的制备：使用PBS缓冲液(添加有1％BSA，1％蔗糖，50mMNaCl和0.5％TWEEN 20)分别将PCT抗原的捕获抗体(PCT-Ab2，南京京达生物技术有限公司)和驴抗鼠IgG分别以1mg/mL和1mg/mL的浓度且以8mm的间隔，用划膜仪划于硝酸纤维素膜上，放于37℃过夜烘干；
2)PCT免疫层析试纸条样品垫的制备：取制备好的荧光探针，离心处理，用喷膜缓冲液(1％BSA，1％蔗糖)复溶为16.5mg/mL，通过喷膜仪将荧光探针以1.2μL/cm的速度喷于玻璃纤维上，并于37℃烘烤过夜；
3)PCT免疫层析试纸条的组装：在白色PVC底板上依次相互交错3mm地贴上步骤2)制备的样品垫(标记了PCT-Ab1型单克隆抗体的荧光微球的玻璃纤维)，步骤1)制备的NC膜(划有PCT-Ab2的T线和驴抗鼠IgG的C线)，最后贴上吸水纸，接着将组装好的层析板通过高速斩切机切割成3.8mm宽的试纸条，然后再用配套的上下两个塑料卡壳固定试纸条，即得到免疫层析试纸条。
全血样本中PCT标准曲线的建立
1)用全血将PCT抗原储备液稀释为不同浓度的全血PCT抗原溶液，浓度分别为0ng/mL、0.125ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和50ng/mL；
2)分别取20μL全血PCT抗原溶液加入到80μLPBS缓冲液中(含有1％BSA、0.1％SDS和0.1％Thesit)，并充分混合；
3)将混合均匀的100μL混合液加入到免疫层析试纸条加样孔(塑料卡壳上对应加样区的位置)处，液体会通过毛细作用依次通过样品区、检测区和吸水区。检测样本中含有目标分析物(抗原)时，抗原首先与样品区的荧光探针结合形成免疫复合物，然后随着液体泳动到T线与PCT-Ab2形成夹心免疫复合物，多余的荧光探针则泳动到C线与驴抗鼠二抗结合，而当检测样本中没有抗原时，则会带动免疫荧光探针直接泳动到C线与驴抗鼠二抗结合；
采用本发明实施例1的空心聚苯乙烯微球制备荧光微球，基于免疫层析检测全血中的降钙素原，本试剂的荧光免疫检测灵敏度为0.0708ng/mL，线性范围为0.0708～50ng/mL；
将对比例1中未溶胀处理前获得的实心聚苯乙烯微球，按照上述操作步骤建立基于免疫层析检测全血中的降钙素原，试剂的荧光免疫检测灵敏度为0.313ng/mL，线性范围为0.313～50ng/mL；
根据上述结果可知，由于空心聚苯乙烯微球的比表面较大，对发光剂的负载量大，在低浓度下也具有荧光信号值，因此，由空心聚苯乙烯微球建立的免疫检测试剂具有较高的灵敏度。
用0.6ng/mL和35ng/mL的降钙素原校准品作为样本，按照实施例1的空心聚苯乙烯微球和对比例1中的实心聚苯乙烯微球建立的检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，计算相对偏差进行准确度考察，计算变异系数进行重复性考察，结果如表3所示，由数据可知空心聚苯乙烯微球建立的免疫检测试剂具有较高的准确度和重复性。
表3免疫层析检测方法的准确度和重复性分析评价结果
按照同样的方法，重复实施例22的操作，获得基于免疫层析试纸条的抗原检测标准曲线，不同之处在于所检测的目标抗原分别更换为：SAA、CRP、AFP、CEA、PSA、TPA、Fer、HBsAg、β-HCG、HBP、ALB，可获得这些物质的浓度。
实施例24
水样中汞离子的检测
醛基化的罗丹明基荧光探针的合成
将罗丹明6G(1.916g，4mmol)溶于60mL无水乙醇中，室温下混合揽拌均匀，再缓慢滴加6mL(过量)85％的水合肼并快速揽拌，升温至80℃回流2h，期间深紫色消失，出现粉色沉淀，后经抽滤，乙醇/水(1:1)多次洗涤，减压真空干燥得到罗丹明6G酰腙RH6G-NH2。
将RH6G-NH2(0.9226g，2mmol)溶于40mL无水乙醇中，滴入过量30％的乙二醇(1.552g，8mmol)后于室温下混合揽拌4h，所得沉淀经过滤，乙醇/水(1:1)多次洗涤，减压真空干燥得到黄色固体RH6G-CHO；
微球表面接枝荧光探针
将实施1中制备得到的空心聚苯乙烯微球5mL，加水稀释至50mL后超声分散，加入三口瓶中缓慢搅拌，调节溶液pH值为7，升温至80℃；将溶于5mL DMF的RH6G-CHO(10mg,0.02mmol)缓慢滴加到三口瓶中，调节溶液pH值为8后，80℃下反应4h，用超纯水透析净化3天，得到微球表面接枝荧光探针的分散液；
实际样品检测
取5g微球表面接枝荧光探针的分散液，加乙腈和水(30:70,v/v)，稀释至50mL，pH调至7，金属阳离子配成0.02M的水溶液，依次取4mL稀释后的分散液于5mL离心管中，用微量注射器分别加入0～35μM不同浓度的Hg2+，测量各自荧光光谱，以浓度为横坐标，荧光响应强度为纵坐标，绘制标准工作曲线，结果表明，标准样品中Hg2+在不同浓度范围内线性关系良好，相关系数R2>0.98，可满足分析的需要，按照上述步骤建立的方法可应用于实际样品中Hg2+的检测。本发明的空心聚苯乙烯微球表面接枝荧光探针，进一步提高荧光分子探针的灵敏度，提高检测金属离子的可操作性和便利性，同时有助于金属离子检测常规化，达到现场检测，及时筛选等性能。
同理，按照上述的设计思路，可设计合成不同的荧光探针，检测食品、环境、生物等样品中的重金属离子的残留，比如铜、锌、银、铅、镉、砷等重金属离子。
实施例25
荧光微球活体成像
向健康4～5周龄雌性Balb/c裸鼠的右侧足垫注射0.02mL的荧光微球(实施例19中得到的荧光微球A和对比例2得到的荧光微球B)溶液，注射24h后对小鼠进行麻醉，在小动物活体成像系统中成像；实验结果发现，荧光微球A试剂在低浓度下可快速成像，检测信噪比达到100以上，而荧光微球B试剂在低浓度下荧光信号较弱，在高浓度下或长时间放置过程中发生聚集，稳定性变差，致使荧光变弱，荧光微球B试剂的检测信噪比在10～20之间，本发明的空心聚苯乙烯微球可在活体层次实现小鼠高信噪比的成像，且空心聚苯乙烯微球含有亲水性的环氧基团，易分散于水相中，并对于生物无毒性，可作为一个很好的载体应用于生物成像领域内。
实施例26
定量检测cTnI、H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂
将实施例1中的时间分辨荧光空心聚苯乙烯微球溶于100mM MES缓冲液(pH为6.0)中，加入活化剂(NHS,20mg/ml；EDC,20mg/ml)活化15min；洗涤、离心，将时间分辨荧光微球用60mM硼酸缓冲液(PH为8.5)复溶，随后加入肌钙蛋白I单克隆抗体2进行反应2h(空心聚苯乙烯微球与抗体的质量比在10mg:0.5mg)；反应完后加入封闭剂(BSA，100mg/ml)进行封闭2h；封闭过后，洗涤、离心，再次用60mM硼酸缓冲液(PH为8.5)及封闭剂(BSA，100mg/ml)复溶、超声，使微球均匀分散在缓冲液中，2-8℃避光保存。
H-FABP单克隆抗体2标记的荧光微球的制备、羊抗兔抗体标记的荧光微球的制备过程同cTnI制备微球的过程相同。
用pH为8.0、100mM的Tris缓冲液将步骤中的cTnI、H-FABP、羊抗兔包被的荧光空心聚苯乙烯微球进行稀释,其中，cTnI、H-FABP包被的荧光空心聚苯乙烯微球稀释300倍，羊抗兔包被的荧光空心聚苯乙烯微球稀释3000倍，混合后即为所需要的荧光混合液。用小牛血清稀释cTnI、H-FABP混合标准品，浓度分别为cTnI：0、0.1、0.5、1.0、5.0、25.0、50.0ng/ml；H-FABP：0、1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、120.0ng/ml，分别取10μl混合标准品与80μl荧光混合液混合，再取80μl混合液滴加在cTnI、H-FABP时间分辨荧光免疫层析试纸条上，反应15min后，通过与cTnI、H-FABP时间分辨荧光免疫层析试纸条配套的免疫层析读数仪，分别读取系统检测信号1、系统检测信号2，每个混合标准品的浓度检测三次；用上述方法分别测试cTnI、H-FABP的混合标准品(cTnI的浓度为1和25ng/ml、H-FABP的浓度为10和80ng/ml)，每个标准品重复检测十次，得到cTnI、H-FABP的精密度。本实施例中采用空心聚苯乙烯微球作为时间分辨荧光微球，结果参见图7，从图7中可以看出本实施例中的荧光微球在缓冲液中的分散性好，粒径均一。
实施例27
羧基化磁性空心聚苯乙烯荧光微球
多孔羧基化空心聚苯乙烯微球：将多孔羧基化空心聚苯乙烯微球分散于氯仿/异丙醇混合溶液中得到混合溶液A；多孔羧基化空心聚苯乙烯微球质量与氯仿/异丙醇混合溶液体积比为5mg/mL；
油酸修饰的磁性四氧化三铁的制备：将油酸修饰的磁性四氧化三铁分散于氯仿溶液得到混合溶液B；油酸修饰的磁性四氧化三铁质量与氯仿溶液体积比为25mg/mL。
将混合溶液A和混合溶液B混匀，进行溶胀吸附，后干燥、洗涤，得到羧基化磁性空心聚苯乙烯荧光微球；混合溶液A和混合溶液B按照5:995体积比混匀；
将羧基化磁性空心聚苯乙烯荧光微球分散在四氢呋喃水溶液中，四氢呋喃水溶液中四氢呋喃与水的质量比为1:7，后加入脂溶性荧光染料，进行溶胀吸附，干燥、洗涤，制得羧基化磁性空心聚苯乙烯荧光微球。
磁性空心聚苯乙烯荧光微球荧光负载的均一性好，溶胀进去的四氧化三铁不易泄露，磁性负载量高，相比于实心聚苯乙烯微球荧光强度更高相关结果见图8和9，参见图8，其中S3是对比例1中的实心聚苯乙烯微球的染料负载情况，S4是实施例1中的空心聚苯乙烯微球的染料负载情况，可以看出空心聚苯乙烯微球比实心聚苯乙烯的微球负载量高，继续参见图9，其中S5是实施例1中的空心聚苯乙烯微球的染料负载情况，S6是本实施例中的羧基化磁性空心聚苯乙烯微球的染料负载情况，可以看出羧基化后的染料负载效果比单纯的空心聚苯乙烯微球的负载量高。
实施例28
检测食源性致病菌
通过将掺杂Tm元素的上转换发光材料(UCNPsTm)与磁性富集材料(Mems)填充至实施例空心聚苯乙烯微球中，形成多特性粒子，并将食源性致病菌的特异性识别元件连接至多特性粒子表面，作为荧光捕捉探针；再将其特异性适配体(Apt)与掺杂Er元素的上转换发光材料(UCNPsEr)进行连接，形成UCNPsEr-Apt信号探针。当待测物不存在时，荧光捕捉探针与信号探针独立存在。当待测物存在时，由于适配体、抗体对待测物的特异性识别，形成信号探针-待测物-荧光捕捉探针复合物，经磁分离后，复合物在980nm近红外光激发下，产生荧光信号，因此，基于此原理建立了待测物浓度和荧光强度的关系曲线，实现食源性致病菌快速高灵敏检测的目的。
本实施例中，多特性粒子以空心聚苯乙烯微球为基底进行制备，空心聚苯乙烯微球是直径在纳米级的空心球形高分子复合材料，单分散性好，表面功能化后的空心聚苯乙烯微球具有良好的物理性能和化学性能。通过在空心聚苯乙烯微球内部填充上转换发光材料与磁性富集材料，同时具有信号响应及磁性捕捉性能，结合上转换发光材料的发光性能可调性质，通过获取的不同发光图像的合并，可实现食源性致病菌的快速判别，该判别方法相比于使用染料的判别方法，结果更可靠，准确；利用染料检测的判别方法会引起光漂白、光损伤和自荧光问题。且该方法具有显著的光稳定性，能长期监测上转换标记的食源性致病菌，信号强度损失率仅为0.5％，甚至可以视为没有显著信号强度的损失，而现有技术中检测食源性致病菌的信号强度损失率高达30％。
实施例29
检测瘦肉精
将实施例1空心聚苯乙烯荧光微球与瘦肉精抗体偶联，获得荧光微球标记的瘦肉精抗体；空心聚苯乙烯荧光微球标记的瘦肉精抗体处理标记物垫，瘦肉精抗原以及阳性对照抗体处理捕获膜；将处理好的标记物垫和捕获膜置于37℃恒温箱中干燥1-2h；捕获膜首先粘贴在支撑底板上，在靠T线一侧先后粘贴标记物垫以及样品垫；在靠C线一侧粘贴吸水垫，然后用切割机切割成4-5mm宽的试纸，于铝箔袋中封闭保存备用。
将含有不同浓密度的瘦肉精对照溶液分别滴加到检测试纸上反应后用荧光检测仪检测荧光信号；绘制标准曲线；将动物组织样品用0.5％-10％NaCl处理1min-20min，获得样品溶液；将获得的样品溶液用稀释液稀释2-10倍，取样滴加到检测试纸的样品垫上，反应后检测荧光信号；将荧光强度结合标准曲线计算瘦肉精含量浓度。
本实施例中使用空心聚苯乙烯荧光微球与瘦肉精抗体偶联，获得荧光微球标记的瘦肉精抗体，使得制备的试纸条在检测过程中具备更高的灵敏度，检测限低至0.5μg/L，同时荧光免疫层析定量检测瘦肉精成分的方法的可靠性也得到了保证。
实施例30
检测真菌毒素
同步检测环匹阿尼酸和黄曲霉毒素浓度混合污染量子点空心聚苯乙烯荧光微球层析试剂盒，包括层析试纸条、含有量子点空心聚苯乙烯荧光微球标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品、含有量子点空心聚苯乙烯荧光微球标记的黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，样品稀释液及样品稀释液吸管。层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为3mm，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线位于质控线下方，个数为2条，检测线上分别上包被环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物和黄曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物，为环匹阿尼酸检测线、和黄曲霉毒素检测线。
本实施例中的量子点空心聚苯乙烯荧光微球层析试剂盒对检测溶液中的环匹阿尼酸检测线、和黄曲霉毒素最低检测限更低，可以检测浓度在pg/μL级别，满足食品检测中的限量要求，同时，灵敏度高，各真菌毒素的检测之间无干扰，简单、快速。
综上所述，本发明的空心聚苯乙烯微球对低浓度范围内被检测物具有非常好的荧光检测信号，灵敏度较高，此外，空心聚苯乙烯微球粒径均一、球形度良好、比表面大、比重轻、负载能力高，可更好地分散在溶液中，提高试剂的稳定性，增强检测试剂的准确度，适用于医疗诊断、生物检测、环境检测和食品安全监测以及生物成像技术领域中。
实施例31
空心高分子微球的功能化制备方法
功能化是赋予微球应用功能的重要方式，通过功能化可以使微球具有发光、显色、电或磁等功能。与实心球的功能化相比，空心球的功能化可以采取不同的方法，以调节因微球密度、内部空间等差异所带来的影响。在本实施例中，主要展示空心微球面向免疫检测的功能化方法。本公开空心球的功能化可以使用传统的实心球功能化方法，只是效果未达到最优化，包括例如染料的负载量未达到最大化。但是，空心球功能化的改进方法，对于实心球的功能化是不适用的。在本实施例对传统的实心球采用溶胀法吸附染料功能化流程中，由于实心球的负载量有限，且密度较大在水中稳定性不足，若将染料与载体微球的投料比例设置得过高(质量比≥1:2)，会导致粒子沉淀，无法进行功能化。而对于空心球，在相同的染料与载体微球投料比时，可以稳定存在并进行功能化。
除此之外，本实施例测试了微球功能化过程中的其他实验条件影响，相比于传统的实心球功能化，本公开的空心球功能化可兼容更低的搅拌速度、更短的反应时间、更大的粒径、更高的负载量、更宽的酸碱与离子范围、更长的稳定存放周期，这些条件性质在微球功能化中是更优选的，展现了显著的优势与便捷性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，上述制备方式可以是分步制备也可以是一步法制备；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述空心高分子微球的制备方法具体包括以下步骤：
将苯乙烯、功能单体、引发剂、活性成分和去离子水搅拌反应得到乳液；
将所述乳液采用有机溶剂溶胀，离心后得到沉淀即为功能化的空心高分子微球。
2.根据权利要求1所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述活性成分和所述去离子水的质量比为0.003-0.3:100；
所述苯乙烯、所述功能单体和所述去离子水的体积比为3-10:1.2-6:100；
所述引发剂和所述去离子水的质量比为0.05-0.4:100；
所述反应的温度为65-80℃，时间为4-16h；
所述搅拌的转速为150-600rpm。
3.根据权利要求1所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述活性成分包括矿物质盐和/或生物大分子；
所述功能单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯；
所述引发剂为过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸铵中的任意一种。
4.根据权利要求3所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述矿物质盐包括钙盐、磷盐、镁盐、钾盐、钠盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、碘盐、硒盐和钼盐中的至少一种；
所述生物大分子包括氨基酸、核苷酸、多糖、维生素和蛋白质中的至少一种；
所述反应的温度为70℃。
5.根据权利要求1所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述乳液和所述有机溶剂的体积比大于1，溶胀时间大于1min；
所述有机溶剂为四氢呋喃、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、环己烷、甲苯、二甲苯和三甲苯中的至少一种。
6.根据权利要求1所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述成像与检测领域包括制备生物成像剂、制备体外诊断剂、环境监测和食品安全检测。
7.根据权利要求1所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述功能化的方式包括以下几种：
所述空心高分子微球表面修饰环氧基、羧基、氨基、醛基和羟基中的至少一种；
或者所述空心高分子微球内部负载发光材料和/或磁性材料；
或者所述空心高分子微球与生物标志物特异性结合的对应物偶联；
或者所述空心高分子微球表面接枝荧光探针。
8.根据权利要求7所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述磁性材料包括纳米磁珠、铁基磁性纳米粒子、复合磁性纳米粒子、磁性量子点中的至少一种；
所述发光材料包括荧光染料、稀土掺杂上转换发光纳米粒子、稀土配合物、金属配合物、无机长余辉材料、有机长余辉材料和光化学长余辉材料中的至少一种。
9.根据权利要求6所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用，其特征在于，所述生物成像剂包括细胞成像剂、小动物活体成像剂、大动物活体成像剂、生物组织成像剂、血液成像剂和尿液成像剂中的任意一种。
10.根据权利要求6所述一种功能化的空心高分子微球在成像与检测领域中的应用的制备方法，其特征在于，所述环境监测包括对环境中的离子、pH、微生物、大分子、有机小分子和污染物中的至少一种进行检测；
所述食品安全检测包括食品营养成分检测、食品污染物检测和食品添加剂检测中的任意一种。
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