CN117599205A - 一种级联增强辐射免疫调节剂的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及级联增强辐射免疫调节剂的制备方法及其应用，可有效解决肿瘤治疗的药物问题，其解决的技术方案是，具体包括如下步骤：1）制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白；2）制备纳米复合材料；3）制备膜融合脂质体；4）制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体；5）制备级联增强辐射免疫调节剂；本发明方法稳定可靠，所制得的RM‑HE@Hf具有良好的肿瘤靶向性和生物相容性等优点，可作为一种高效的X射线纳米处理器，克服放疗耐受，提高RT疗效，同时逆转肿瘤相关巨噬细胞胞葬作用介导的免疫沉默，有效的增强肿瘤放疗‑免疫治疗，是肿瘤放射治疗药物上的创新。

Description

一种级联增强辐射免疫调节剂的制备方法及其应用
一、技术领域
本发明涉及纳米医药技术领域，特别是一种级联增强辐射免疫调节剂的制备方法及其应用。
二、背景技术
众所周知，癌症是威胁人类生命健康的第二大病因。尽管近年来在抗肿瘤方面取得了重大进展，传统疗法(如手术、化疗)由于未能完全根除肿瘤导致肿瘤转移，肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因。放射治疗(RT)是临床上应用最广泛的实体瘤一线治疗手段，它应用高能X射线直接损伤DNA和电离水产生活性氧(ROS)诱导肿瘤细胞凋亡。研究表明，放疗可以通过激活cGAS-STING通路诱导先天性免疫，同时放疗诱导基因突变产生的新生抗原可以激活CD8+T细胞介导的适应性免疫，清除未照射的远端转移灶。然而，放疗的介导的远端肿瘤消退在临床中并不常见。
这主要是由于RT的治疗效果往往受到肿瘤固有生理障碍的限制，由于低Z原子吸收能量的能力较差(肿瘤软组织主要由低Z的有机物组成)，肿瘤往往对电离辐射表现出先天的抵抗力，导致放疗后肿瘤细胞凋亡率较低，肿瘤相关抗原释放量少，从而减弱了放疗诱导的免疫反应。而且，即使通过增强放疗疗效诱导肿瘤相关抗原释放量增多，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)介导的胞葬作用通过降解抗原进一步下调放疗诱导的免疫效应，导致免疫沉默。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞溶酶体中存在着高活性的半胱氨酸蛋白酶，升高的酶活性会降解溶酶体中经胞葬作用来源的肿瘤相关抗原，从而阻碍巨噬细胞对CD8+T细胞的抗原交叉呈递，并阻止CD8+T细胞的活化。因此，增强放疗疗效同时逆转肿瘤相关巨噬细胞胞葬作用介导的免疫沉默有利于增强放疗介导的免疫效应，有效治疗肿瘤转移。基于目前的现状，针对肿瘤治疗的药物载体设计与构建显示出至关重要的地位，基于此，如何利用凋亡细胞靶向巨噬细胞这一天然途径设计一种兼具肿瘤放疗增敏及重编程肿瘤相关巨噬细胞的级联型纳米药物是目前急需解决的技术问题。
三、发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种级联增强辐射免疫调节剂的制备方法及其应用，可有效解决肿瘤治疗的药物问题。
本发明解决的技术方案是，一种级联增强辐射免疫调节剂的制备方法，包括修饰肿瘤RGD靶向肽的膜融合脂质体和包覆于膜融合脂质体内的纳米复合材料；所述的纳米复合材料由负载E64的铁蛋白、放疗增敏剂Hf离子和单宁酸通过配位自组装形成；具体包括如下步骤：
1)制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白(HE)
分别将2-4mg铁蛋白(HFn)、0.5-1mg E64溶解在1-2mL去离子水中，超声下混合均匀，置于60℃恒温水浴，100-200rpm磁力搅拌下反应1-3h，反应结束后，500-2000rpm超滤离心5-15min去除游离的E64，用去离子水洗涤2次后收集超滤管中产物，40-60℃干燥10-16h，得到HE纳米粒；
2)制备纳米复合材料(HE@Hf)
将20-40mg的单宁酸(TA)溶解于1-2mL去离子水中；将3-9mg氯化铪(HfCl4)溶解于1-3mL去离子水中；将步骤1)中所得的1-2mg HE溶解于1-2mL去离子水中；将TA与HfCl4、HE超声混合2min后转移到50-100mL圆底烧瓶中，300-700rpm磁力搅拌下37℃水浴反应3-6h，反应完成后，8000-12000rpm离心5-10min收集产物，去离子水洗涤3次去除未反应的TA，得到由HE、放疗增敏剂Hf和单宁酸配位自组装形成的HE@Hf纳米粒；
3)制备膜融合脂质体(MFL)
分别称取质量比为7:6:3:4-9:7:5:5，2-二油基酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、鞘磷脂(SM)、胆固醇(CH)成膜材料于50mL茄型瓶中，加入甲醇和氯仿溶解，混合均匀使其充分溶解，当温度升至40℃时进行旋蒸，压力缓慢上调，避免压力过高产生气泡而影响成膜，当压强达到稳定时不再调节压强，待有机溶剂旋蒸完后，降低压强，停止旋蒸，取下茄型瓶，立即加入去离子水，在水浴锅中沿一个方向轻轻晃动茄型瓶，使膜水化下来并转移至离心管中，并依次在800nm、400nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压5-10次，得到膜融合脂质体；
4)制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体(RM)
将10-30mg DSPE-PEG2000-cRGD肽溶解于1-3mL N,N-二甲基甲酰胺中，取100-500μL溶解于步骤3)中得到的膜融合脂质体溶液中，混合均匀后，200-700rpm磁力搅拌下，4℃反应6-12h后收集产物，5000-12000rpm离心去除上清，得到RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体RM；
5)制备级联增强辐射免疫调节剂(RM-HE@Hf)
将步骤2)、步骤4)所得产物在去离子水中混合均匀，质量比为2：1-2：2，在200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压5-10次，得到级联增强辐射免疫调节剂(RM-HE@Hf)。
所述的步骤1)中HE纳米粒的粒径为10-15nm，步骤2)中HE@Hf纳米复合材料的粒径为50-100nm，步骤5)中级联增强辐射免疫调节剂RM-HE@Hf的粒径为100-200nm。
所述的级联增强辐射免疫调节剂在制备抗肿瘤药物注射剂中的应用。
所述的级联增强辐射免疫调节剂在肿瘤精准靶向治疗药物中的应用。
所述的级联增强辐射免疫调节剂在肿瘤放疗增敏药物中的应用。
所述的级联增强辐射免疫调节剂在提高肿瘤相关巨噬细胞抗原提呈能力中的应用。
所述的级联增强辐射免疫调节剂在增强肿瘤放疗-免疫治疗药物中的应用。
所述的级联增强辐射免疫调节剂在增敏临床PD-L1免疫检查点阻断治疗药物中的应用。
本发明方法稳定可靠，所制得的RM-HE@Hf具有良好的肿瘤靶向性和生物相容性等优点，可作为一种高效的X射线纳米处理器，克服放疗耐受，提高RT疗效，同时逆转肿瘤相关巨噬细胞胞葬作用介导的免疫沉默，有效的增强肿瘤放疗-免疫治疗，是肿瘤放射治疗药物上的创新。
四、附图说明
图1为本发明HFn、HE、HE@Hf、MFL、RM-HE@Hf的透射电子显微镜表征图。
图2为本发明HE、HE@Hf、MFL、RM-HE@Hf电位的测定图。
图3为本发明负载E64的铁蛋白(HE)体外释药曲线图。
图4为本发明GSH浓度依赖型的HE@Hf体外降解表征图。
图5为本发明膜融合脂质体性能图。
图6为本发明RM-HE@Hf的肿瘤细胞靶向能力图。
图7为本发明RM-HE@Hf的ROS生成能力图。
图8为本发明RM-HE@Hf对肿瘤相关巨噬细胞溶酶体半胱氨酸蛋白酶活性抑制效果图。
五、具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
1)制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白(HE)
分别将2mg铁蛋白(HFn)、0.5mg E64溶解在1mL去离子水中，超声下混合均匀，置于60℃恒温水浴，100rpm磁力搅拌下反应1h，反应结束后，2000rpm超滤离心15min去除游离的E64，用去离子水洗涤2次后收集超滤管中产物，40℃干燥16h，得到HE纳米粒；
2)制备纳米复合材料(HE@Hf)
将40mg的单宁酸(TA)溶解于1mL去离子水中；将9mg氯化铪(HfCl4)溶解于1mL去离子水中；将步骤1)中所得的1mg HE溶解于1mL去离子水中；将TA与HfCl4、HE超声混合2min后转移到50mL圆底烧瓶中，300rpm磁力搅拌下37℃水浴反应3h，反应完成后，8000rpm离心5min收集产物，去离子水洗涤3次去除未反应的TA，得到由HE、放疗增敏剂Hf和单宁酸配位自组装形成的HE@Hf纳米粒；
3)制备膜融合脂质体(MFL)
分别称取质量比为9：7：5：5的1，2-二油基酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、鞘磷脂(SM)、胆固醇(CH)成膜材料于50mL茄型瓶中，加入甲醇和氯仿溶解，混合均匀使其充分溶解，当温度升至40℃时进行旋蒸，压力缓慢上调，避免压力过高产生气泡而影响成膜，当压强达到稳定时不再调节压强，待有机溶剂旋蒸完后，降低压强，停止旋蒸，取下茄型瓶，立即加入去离子水，在水浴锅中沿一个方向轻轻晃动茄型瓶，使膜水化下来并转移至离心管中，并依次在800nm、400nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到膜融合脂质体MFL；
4)制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体(RM)
将10mg DSPE-PEG2000-cRGD肽溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，取100μL溶解于步骤3)中得到的膜融合脂质体溶液中，混合均匀后，200rpm磁力搅拌下，4℃反应6h后收集产物，5000rpm离心去除上清，得到RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体RM；
5)制备级联增强辐射免疫调节剂(RM-HE@Hf)
将步骤2)、步骤4)所得产物在去离子水中混合均匀，质量比为2：1在200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到RM-HE@Hf。
实施例2
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
1)制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白(HE)
分别将3mg铁蛋白(HFn)、1mg E64溶解在1mL去离子水中，超声下混合均匀，置于60℃恒温水浴，150rpm磁力搅拌下反应2h，反应结束后，3000rpm超滤离心15min去除游离的E64，用去离子水洗涤2次后收集超滤管中产物，50℃干燥10h，得到HE纳米粒；
2)制备纳米复合材料(HE@Hf)
将20mg的单宁酸(TA)溶解于1mL去离子水中；将6mg氯化铪(HfCl4)溶解于1mL去离子水中；将步骤1)中所得的2mg HE溶解于1mL去离子水中；将TA与HfCl4、HE超声混合2min后转移到50mL圆底烧瓶中，500rpm磁力搅拌下37℃水浴反应3h，反应完成后，8000rpm离心5min收集产物，去离子水洗涤3次去除未反应的TA，得到由HE、放疗增敏剂Hf和单宁酸配位自组装形成的HE@Hf纳米粒；
3)制备膜融合脂质体(MFL)
分别称取质量比为7：6：5：5的1，2-二油基酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、鞘磷脂(SM)、胆固醇(CH)成膜材料于50mL茄型瓶中，加入甲醇和氯仿溶解，混合均匀使其充分溶解，当温度升至40℃时进行旋蒸，压力缓慢上调，避免压力过高产生气泡而影响成膜，当压强达到稳定时不再调节压强，待有机溶剂旋蒸完后，降低压强，停止旋蒸，取下茄型瓶，立即加入去离子水，在水浴锅中沿一个方向轻轻晃动茄型瓶，使膜水化下来并转移至离心管中，并依次在800nm、400nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到膜融合脂质体MFL；
4)制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体(RM)
将20mg DSPE-PEG2000-cRGD肽溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，取100μL溶解于步骤3)中得到的膜融合脂质体溶液中，混合均匀后，500rpm磁力搅拌下，4℃反应8h后收集产物，8000rpm离心去除上清，得到RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体RM；
5)制备级联增强辐射免疫调节剂(RM-HE@Hf)
将步骤2)、步骤4)所得产物在去离子水中混合均匀，质量比为1：1在200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到RM-HE@Hf。
实施例3
本发明在具体实施中，包括以下步骤：
1)制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白(HE)
分别将2mg铁蛋白(HFn)、1mg E64溶解在1mL去离子水中，超声下混合均匀，置于60℃恒温水浴，250rpm磁力搅拌下反应2.5h，反应结束后，3000rpm超滤离心15min去除游离的E64，用去离子水洗涤2次后收集超滤管中产物，60℃干燥8h，得到HE纳米粒；
2)制备纳米复合材料(HE@Hf)
将20mg的单宁酸(TA)溶解于1mL去离子水中；将3mg氯化铪(HfCl4)溶解于1mL去离子水中；将步骤1)中所得的2mg HE溶解于1mL去离子水中；将TA与HfCl4、HE超声混合2min后转移到50mL圆底烧瓶中，700rpm磁力搅拌下37℃水浴反应6h，反应完成后，12000rpm离心5min收集产物，去离子水洗涤3次去除未反应的TA，得到由HE、放疗增敏剂Hf和单宁酸配位自组装形成的HE@Hf纳米粒；
3)制备膜融合脂质体(MFL)
分别称取质量比为7：6：3：4的1，2-二油基酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、鞘磷脂(SM)、胆固醇(CH)成膜材料于50mL茄型瓶中，加入甲醇和氯仿溶解，混合均匀使其充分溶解，当温度升至40℃时进行旋蒸，压力缓慢上调，避免压力过高产生气泡而影响成膜，当压强达到稳定时不再调节压强，待有机溶剂旋蒸完后，降低压强，停止旋蒸，取下茄型瓶，立即加入去离子水，在水浴锅中沿一个方向轻轻晃动茄型瓶，使膜水化下来并转移至离心管中，并依次在800nm、400nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到膜融合脂质体MFL；
4)制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体(RM)
将20mg DSPE-PEG2000-cRGD肽溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，取100μL溶解于步骤3)中得到的膜融合脂质体溶液中，混合均匀后，700rpm磁力搅拌下，4℃反应12h后收集产物，12000rpm离心去除上清，得到RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体RM；
5)制备级联增强辐射免疫调节剂(RM-HE@Hf)
将步骤2)、步骤4)所得产物在去离子水中混合均匀，质量比为1：1在200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到RM-HE@Hf。
本发明通过增强肿瘤免疫原性及提高肿瘤相关巨噬细胞(TAM)抗原呈递能力增强放射免疫治疗。高原子序数金属具有高辐射衰减系数，可以沉积高能X射线产生各种带电粒子，高效损伤DNA分子。选择高原子序数金属铪(Hf)作为放疗增敏剂，选择带有空腔结构的铁蛋白纳米笼作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的载体，和单宁酸(TA)混合后通过配位自组装构建了金属-蛋白质-多酚纳米复合材料，并进一步包被肿瘤靶向RGD肽修饰的膜融合脂质体，获得级联增强辐射免疫调节剂RM-HE@Hf。借助RGD肽的肿瘤靶向功能，RM-HE@Hf在肿瘤组织高效蓄积并利用膜融合途径进入肿瘤细胞胞质，肿瘤细胞内高水平的谷胱甘肽(GSH)通过与铁蛋白和多酚形成竞争性非共价相互作用触发纳米复合材料解离，释放出负载E64的铁蛋白和金属Hf离子。当给与辐照治疗后，Hf通过增强X射线能量沉积，诱导肿瘤细胞DNA损伤，高效杀伤肿瘤细胞。随后，凋亡的肿瘤细胞被肿瘤微环境中的大量TAM吞噬，在TAM的低pH溶酶体环境中，铁蛋白解聚，释放半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64，E64通过降低TAM溶酶体中半胱氨酸蛋白酶活性，促进巨噬细胞的抗原呈递能力，从而激活CD8+T细胞，实现免疫的有效激活。这种一体化的递药系统，通过增强肿瘤免疫原性和促进抗原提呈增强了放射免疫治疗，经反复多次实验，效果显著，以实施例3为例，有关试验资料如下：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
一、级联增强辐射免疫调节剂RM-HE@Hf的表征实验
1.HFn、HE、HE@Hf、MFL、RM-HE@Hf的透射电子显微镜表征：
将各制剂溶于去离子水中，分别配置成0.1mg/mL的溶液，取10μL滴加在碳支持膜上，等液体蒸发后，重复此操作2次，用透射电子显微镜观察形貌，结果如图1所示。其中A为铁蛋白(HFn)的透射电镜图(标尺＝50nm)，HFn为10nm左右的空腔结构；B为负载E64的铁蛋白透射电镜图(标尺＝50nm)，HE的平均尺寸在10nm左右；C为单宁酸、HE和Hf离子组成的纳米复合物(HE@Hf)的透射电镜图(标尺＝100nm)，HE@Hf的平均尺寸在60nm左右；D为膜融合脂质体(MFL)的透射电镜图(标尺＝100nm)，MFL的平均尺寸在200nm左右；E为RM-HE@Hf的透射电镜图(标尺＝100nm)，如TEM图像显示，纳米复合物表面成功包覆上膜融合脂质体，平均尺寸在200nm左右。
2.HE、HE@Hf、MFL、RM-HE@Hf电位的测定：
取适量HE、HE@Hf、MFL、RM-HE@Hf分散于超纯水中，利用激光纳米粒度分析仪测得电位结果如图2所示，当铁蛋白负载E64后，电位从-5mV改变至-25mV，发生明显改变，这表明HE的成功制备；在HE@Hf表面修饰膜融合脂质体后，电位从-25mV改变至-9mV，表明膜融合脂质体的成功包覆。
3.负载E64的铁蛋白(HE)体外释药检测：
将制备的HE分别溶解在pH＝7.4、pH＝6.5和pH＝5.5的PBS中，随后置于截留分子量为8000Da的透析袋中，并在10mL的PBS中透析。透析过程中，将其置于37℃恒温条件下搅拌，在一定的时间间隔后，从透析袋外的溶液中取出100μL等分试剂进行紫外检测，测定吸光度，计算释放药物的含量，得到药物的释放曲线，结果如图3所示。观察到在37℃恒温条件下，pH＝7.4的条件下，药物释放非常缓慢，药物释放量不足20％。然而在pH＝5.5条件下，药物的释放增加至70％左右，呈现出明显的pH依赖性释药。这些结果表明，HE可以响应酸性环境释放药物。
4.GSH浓度依赖型的HE@Hf体外降解表征：
将HE@Hf与不同浓度的GSH溶液(0mM、1mM、10mM)在37℃条件下充分反应24h，然后用移液枪将反应液滴加在碳支持膜上，待其干燥后采用TEM观察纳米粒的形貌变化情况，结果如图4所示，HE@Hf在10mMGSH作用下发生解离(标尺＝100nm)。
5.膜融合性能考察实验
膜融合脂质体(MFL)是以与细胞膜融合的形式将药物直接递送到细胞胞质中，因此，为了考察MFL与细胞膜融合的性能，本发明利用10μM绿色荧光染料DiO标记MFL，用5μM的红色细胞膜荧光染料DiI标记结直肠癌(CT26)细胞膜，用共聚焦荧光显微镜观察膜在2h内的融合过程。结果如图5所示，由此看出，MFL与肿瘤细胞膜具有较强的共定位，可以与肿瘤细胞膜融合。同时，考察不同时间点MFLs与CT26细胞膜的融合，由结果可以看出，MFL与CT26细胞共孵育15min内，MFL与细胞膜接触，在20min内发生融合，红色荧光与绿色荧光共定位，而且，随着时间的延长，橙色荧光强度增加，这表明MFL可以与细胞膜快速融合(标尺＝10μm)。
6.考察RM-HE@Hf的肿瘤细胞靶向能力实验：
将CT26细胞接种于六孔板中，过夜培养后分别加入FITC标记的修饰RGD靶向肽的RM-HE@Hf和FITC标记的未修饰RGD靶向肽的M-HE@Hf、FITC修饰的HE@Hf纳米复合物，并与细胞孵育4h，其中HE@Hf的浓度为30μg/mL。药物孵育结束后用PBS洗涤细胞3次，收集细胞后通过流式细胞仪分析细胞对不同制剂的摄取情况，结果如图6所示，修饰RGD靶向肽的RM-HE@Hf可以被肿瘤细胞高效摄取。
7.考察RM-HE@Hf的ROS生成能力实验：
将CT26细胞(2×105/孔)接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2的培养箱中过夜培养。用含药培养基分别与细胞共孵育8h后，弃去上清培养基，并用PBS缓冲液洗涤细胞2次，将6孔板置于X射线辐照仪下进行放疗(照射剂量为6Gy)，随后将细胞培养基更换成2％的FBS培养基，继续培养48h，然后加入DCFH-DA(0.01mM)(用不含酚红的无血清培养基配)避光孵育30min，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA，最后用共聚焦显微镜检测并记录结果。结果如图7所示，含有放疗增敏剂Hf的制剂处理组，其肿瘤胞内绿色荧光明显增强，表明RM-HE@Hf可通过Hf介导的放疗增敏有效增强辐射诱导的ROS生成水平。
8.考察RM-HE@Hf对肿瘤相关巨噬细胞溶酶体半胱氨酸蛋白酶水平的影响：
将CT26细胞(2×105/孔)接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2的培养箱中过夜培养。用含有E64的RM-HE@Hf和不含E64的RM-H@Hf分别与细胞共孵育8h后，弃去上清培养基，并用PBS缓冲液洗涤细胞2次，将6孔板置于X射线辐照仪下进行放疗(照射剂量为6Gy)，随后将细胞培养基更换成2％的FBS培养基，继续培养48h后收集上清和细胞，与提前极化好的M2-TAM共孵育4h后用ProSense680在终浓度为1μM的条件下，在37℃下孵育6h，PBS缓冲液洗涤细胞2次，收集细胞，流式分析结果，结果如图8所示。含有E64的制剂组诱导的凋亡肿瘤细胞可以有效降低巨噬细胞溶酶体中半胱氨酸蛋白酶的含量。
在对上述实施例3实验的同时，对其它实施例也做了同样的实验，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一列举。
从上述实验可以看出，本发明与现有技术相比具有以下的有益效果：
1)本发明提供的级联增强辐射免疫调节剂能够高效负载放疗增敏剂Hf，同时可以在肿瘤细胞内响应GSH降解，释放HE和Hf，实现肿瘤精准释放。
2)本发明提供的级联增强辐射免疫调节剂可以有效克服放疗抗性，增加胞内ROS产生，提高肿瘤细胞杀伤效率。
3)本发明提供的级联增强辐射免疫调节剂可以有效降低肿瘤相关巨噬细胞溶酶体中的半胱氨酸蛋白酶活性，促进巨噬细胞的抗原呈递，从而有效激活CD8+T细胞，逆转胞葬作用介导的免疫沉默，增强肿瘤放射免疫治疗。
二、结论
本发明产物稳定，方法稳定可靠，有效逆转放疗抗性，重编程肿瘤相关巨噬细胞，恢复其抗原呈递能力，有效激活CD8+T细胞，该级联增强辐射免疫调节剂通过其表面修饰的RGD靶向肽在肿瘤组织高效蓄积，并经膜融合途径进入肿瘤细胞胞质中，释放纳米复合材料。肿瘤细胞内高水平的谷胱甘肽(GSH)通过与铁蛋白和多酚形成竞争性非共价相互作用触发纳米复合材料解离，释放负载E64的铁蛋白和金属Hf离子，当给予辐照治疗后，Hf通过增强X射线能量沉积，诱导肿瘤细胞DNA损伤，产生大量新生抗原。随后，凋亡的肿瘤细胞被肿瘤微环境中的大量M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)吞噬，在M2-TAM的低pH溶酶体环境下，铁蛋白解聚，释放的E64通过降低TAM溶酶体中半胱氨酸蛋白酶活性恢复TAM的抗原呈递能力，从而增强CD8+T细胞依赖性抗肿瘤免疫，是肿瘤放射治疗药物上的创新，具有实际的临床意义和推广应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一种级联增强辐射免疫调节剂的制备方法，其特征在于，包括修饰肿瘤RGD靶向肽的膜融合脂质体和包覆于膜融合脂质体内的纳米复合材料；所述的纳米复合材料由负载E64的铁蛋白、放疗增敏剂Hf离子和单宁酸通过配位自组装形成；具体包括如下步骤：
1）制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白
分别将2-4mg HFn、0.5-1mg E64溶解在1-2mL去离子水中，超声下混合均匀，置于60℃恒温水浴，100-200rpm磁力搅拌下反应1-3h，反应结束后，500-2000rpm超滤离心5-15min去除游离的E64，用去离子水洗涤2次后收集超滤管中产物，40-60℃干燥10-16h，得到负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白；
2）制备纳米复合材料
将20-40mg的TA溶解于1-2mL去离子水中；将3-9mg HfCl4溶解于1-3mL去离子水中；将步骤1）中所得的1-2mg 负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白溶解于1-2mL去离子水中；将TA与HfCl4、负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白超声混合2min后转移到50-100mL圆底烧瓶中，300-700rpm磁力搅拌下37℃水浴反应3-6h，反应完成后，8000-12000rpm离心5-10min收集产物，去离子水洗涤3次去除未反应的TA，得到由负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白、放疗增敏剂Hf和单宁酸配位自组装形成的纳米复合材料；
3）制备膜融合脂质体
分别称取质量比为7:6:3:4-9:7:5:5，2-二油基酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胆固醇成膜材料于50mL茄型瓶中，加入甲醇和氯仿溶解，混合均匀使其充分溶解，当温度升至40℃时进行旋蒸，压力缓慢上调，避免压力过高产生气泡而影响成膜，当压强达到稳定时不再调节压强，待有机溶剂旋蒸完后，降低压强，停止旋蒸，取下茄型瓶，立即加入去离子水，在水浴锅中沿一个方向轻轻晃动茄型瓶，使膜水化下来并转移至离心管中，并依次在800nm、400nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压5-10次，得到膜融合脂质体；
4）制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体
将10-30mg DSPE-PEG2000-cRGD肽溶解于1-3mL N,N-二甲基甲酰胺中，取100-500μL溶解于步骤3）中得到的膜融合脂质体溶液中，混合均匀后，200-700rpm磁力搅拌下，4℃反应6-12h后收集产物，5000-12000rpm离心去除上清，得到RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体；
5）制备级联增强辐射免疫调节剂
将步骤2）、步骤4）所得产物在去离子水中混合均匀，质量比为2：1-2：2，在200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压5-10次，得到级联增强辐射免疫调节剂。
2. 根据权利要求1所述的级联增强辐射免疫调节剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白
分别将2mg HFn、0.5mg E64溶解在1mL去离子水中，超声下混合均匀，置于60℃恒温水浴，100rpm磁力搅拌下反应1h，反应结束后，2000rpm超滤离心15min去除游离的E64，用去离子水洗涤2次后收集超滤管中产物，40℃干燥16h，得到负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白；
2）制备纳米复合材料
将40mg的TA溶解于1mL去离子水中；将9mg HfCl4溶解于1mL去离子水中；将步骤1）中所得的1mg 负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白溶解于1mL去离子水中；将TA与HfCl4、负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白超声混合2min后转移到50mL圆底烧瓶中，300rpm磁力搅拌下37℃水浴反应3h，反应完成后，8000rpm离心5min收集产物，去离子水洗涤3次去除未反应的TA，得到由负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白、放疗增敏剂Hf和单宁酸配位自组装形成的纳米复合材料；
3）制备膜融合脂质体
分别称取质量比为9：7：5：5的1，2-二油基酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胆固醇成膜材料于50mL茄型瓶中，加入甲醇和氯仿溶解，混合均匀使其充分溶解，当温度升至40℃时进行旋蒸，压力缓慢上调，避免压力过高产生气泡而影响成膜，当压强达到稳定时不再调节压强，待有机溶剂旋蒸完后，降低压强，停止旋蒸，取下茄型瓶，立即加入去离子水，在水浴锅中沿一个方向轻轻晃动茄型瓶，使膜水化下来并转移至离心管中，并依次在800nm、400nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到膜融合脂质体；
4）制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体
将10mg DSPE-PEG2000-cRGD肽溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，取100μL溶解于步骤3）中得到的膜融合脂质体溶液中，混合均匀后，200rpm磁力搅拌下，4℃反应6h后收集产物，5000rpm离心去除上清，得到RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体；
5）制备级联增强辐射免疫调节剂
将步骤2）、步骤4）所得产物在去离子水中混合均匀，质量比为2：1在200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到级联增强辐射免疫调节剂。
3. 根据权利要求1所述的级联增强辐射免疫调节剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白
分别将3mg HFn、1mg E64溶解在1mL去离子水中，超声下混合均匀，置于60℃恒温水浴，150rpm磁力搅拌下反应2h，反应结束后，3000rpm超滤离心15min去除游离的E64，用去离子水洗涤2次后收集超滤管中产物，50℃干燥10h，得到负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白；
2）制备纳米复合材料
将20mg的TA溶解于1mL去离子水中；将6mg HfCl4溶解于1mL去离子水中；将步骤1）中所得的2mg 负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白溶解于1mL去离子水中；将TA与HfCl4、负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白超声混合2min后转移到50mL圆底烧瓶中，500rpm磁力搅拌下37℃水浴反应3h，反应完成后，8000rpm离心5min收集产物，去离子水洗涤3次去除未反应的TA，得到由负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白、放疗增敏剂Hf和单宁酸配位自组装形成的纳米复合材料；
3）制备膜融合脂质体
分别称取质量比为7：6：5：5的1，2-二油基酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胆固醇成膜材料于50mL茄型瓶中，加入甲醇和氯仿溶解，混合均匀使其充分溶解，当温度升至40℃时进行旋蒸，压力缓慢上调，避免压力过高产生气泡而影响成膜，当压强达到稳定时不再调节压强，待有机溶剂旋蒸完后，降低压强，停止旋蒸，取下茄型瓶，立即加入去离子水，在水浴锅中沿一个方向轻轻晃动茄型瓶，使膜水化下来并转移至离心管中，并依次在800nm、400nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到膜融合脂质体；
4）制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体
将20mg DSPE-PEG2000-cRGD肽溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，取100μL溶解于步骤3）中得到的膜融合脂质体溶液中，混合均匀后，500rpm磁力搅拌下，4℃反应8h后收集产物，8000rpm离心去除上清，得到RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体；
5）制备级联增强辐射免疫调节剂
将步骤2）、步骤4）所得产物在去离子水中混合均匀，质量比为1：1在200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到级联增强辐射免疫调节剂。
4. 根据权利要求1所述的级联增强辐射免疫调节剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白
分别将2mg HFn、1mg E64溶解在1mL去离子水中，超声下混合均匀，置于60℃恒温水浴，250rpm磁力搅拌下反应2.5h，反应结束后，3000rpm超滤离心15min去除游离的E64，用去离子水洗涤2次后收集超滤管中产物，60℃干燥8h，得到负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白；
2）制备纳米复合材料
将20mg的TA溶解于1mL去离子水中；将3mg HfCl4溶解于1mL去离子水中；将步骤1）中所得的2mg 负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白溶解于1mL去离子水中；将TA与HfCl4、负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白超声混合2min后转移到50mL圆底烧瓶中，700rpm磁力搅拌下37℃水浴反应6h，反应完成后，12000rpm离心5min收集产物，去离子水洗涤3次去除未反应的TA，得到由负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白、放疗增敏剂Hf和单宁酸配位自组装形成的纳米复合材料；
3）制备膜融合脂质体
分别称取质量比为7：6：3：4的1，2-二油基酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、胆固醇成膜材料于50mL茄型瓶中，加入甲醇和氯仿溶解，混合均匀使其充分溶解，当温度升至40℃时进行旋蒸，压力缓慢上调，避免压力过高产生气泡而影响成膜，当压强达到稳定时不再调节压强，待有机溶剂旋蒸完后，降低压强，停止旋蒸，取下茄型瓶，立即加入去离子水，在水浴锅中沿一个方向轻轻晃动茄型瓶，使膜水化下来并转移至离心管中，并依次在800nm、400nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到膜融合脂质体MFL；
4）制备RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体
将20mg DSPE-PEG2000-cRGD肽溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，取100μL溶解于步骤3）中得到的膜融合脂质体溶液中，混合均匀后，700rpm磁力搅拌下，4℃反应12h后收集产物，12000rpm离心去除上清，得到RGD靶向肽修饰的膜融合脂质体；
5）制备级联增强辐射免疫调节剂
将步骤2）、步骤4）所得产物在去离子水中混合均匀，质量比为1：1在200nm的聚碳酸酯多孔膜微型脂质体挤出器中挤压10次，得到级联增强辐射免疫调节剂。
5.根据权利要求1所述的级联增强辐射免疫调节剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中负载半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的铁蛋白粒径为10-15nm，步骤2）中纳米复合材料的粒径为50-100nm，步骤5）中级联增强辐射免疫调节剂的粒径为100-200nm。
6.权利要求1-5任一项所述的级联增强辐射免疫调节剂在制备抗肿瘤药物注射剂中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述的级联增强辐射免疫调节剂在肿瘤精准靶向治疗药物中的应用。
8.权利要求1-5任一项所述的级联增强辐射免疫调节剂在肿瘤放疗增敏药物中的应用。
9.权利要求1-5任一项所述的级联增强辐射免疫调节剂在增强肿瘤放疗-免疫治疗药物中的应用。
10.权利要求1-5任一项所述的级联增强辐射免疫调节剂在增敏临床PD-L1免疫检查点阻断治疗药物中的应用。
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