CN117598393A - 一种警犬专用复合微生态制剂及其在昆明犬幼犬养殖中的应用 - Google Patents
一种警犬专用复合微生态制剂及其在昆明犬幼犬养殖中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种警犬专用复合微生态制剂及其在昆明犬幼犬养殖中的应用，该复合微生态制剂包含罗伊氏乳杆菌MKLQ3807‑13和格氏乳杆菌MKCH1884‑43。复合微生态制剂在昆明犬幼犬养殖中的应用，通过复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮，发酵条件为复合菌接种量1.8×107CFU/g，复合菌接种比例1:1，单甘脂添加量200mg/kg，料液比1:1.2g/mL，发酵温度35℃，发酵时间36h。经饲喂试验证实，该发酵犬粮对昆明犬幼犬具有良好的促生长作用，并可明显提升幼犬警用性能，同时可显著降低腹泻率。本发明扩展了微生态制剂在昆明犬幼犬养殖中的应用，对昆明犬的繁育和驯化具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种警犬专用复合微生态制剂及其在昆明犬幼犬养殖中的应用，具体涉及罗伊氏乳杆菌MKLQ3807-13和格氏乳杆菌MKCH1884-43在昆明犬幼犬养殖中的应用。
背景技术
昆明犬在养殖过程中，幼犬因消化道发育不完善，尚未建立起成熟的肠道菌群，饲喂普通商品犬粮容易引发肠道炎症反应，导致腹泻率较高，进而影响生长发育。为控制昆明犬幼犬腹泻，目前仍多采用抗生素防治为主，且存在盲目用药和过量使用等现象，极易导致肠道菌群微生态失衡，增强肠道微生物耐药性，使一般药物无效。因此，在昆明犬幼犬养殖过程中，研发能够减少或替代抗生素使用、促进机体健康的产品，在昆明犬繁育和驯化中将具有广阔前景。
微生态制剂是指通过改善动物肠道菌群平衡、促进营养物质消化吸收、增强免疫功能，以提高动物健康水平的微生物制剂产品。与抗生素相比，微生态制剂具有安全、无毒、无残留、无耐药性以及环境友好等优点，是饲用抗生素最具潜力的替代品。菌种即益生菌的种类，是微生态制剂发挥功能的基础，也是产品安全的首要保证，世界各国对此都有明确规定和严格管理。目前应用于动物生产中的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌等菌种，其中乳酸菌是指一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的总称。乳酸菌作为益生菌的重要种类，已在世界范围内被公认为GRAS(Generally Recognized as Safe)等级微生物。乳酸菌发酵饲料不仅会产生大量有机酸、酶等代谢产物，还可降解饲料中的抗营养因子，改善饲料适口性，提高饲料中营养物质的消化利用，从而提升动物的生长性能。此外，有研究表明健康犬的十二指肠、回肠、结肠和直肠都有乳酸菌存在，且乳杆菌属丰度与昆明幼犬调引表现、物品注意力、持物衔取咬合、搜索能力等警用性能呈正相关。然而，应用微生态制剂发酵犬类饲料进行饲喂，进而影响犬类警用性能鲜有报道。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)属厚壁菌门、乳杆菌科、乳杆菌属，是一种天然定殖在哺乳动物肠道的益生菌，其在维持动物健康和免疫调节等方面有着重要意义。2001年我国卫生部批准罗伊氏乳杆菌为可用于保健食品的益生菌菌种，2014年国家卫生计生委同意罗伊氏乳杆菌(菌株号DSM17938)可用于婴幼儿食品。格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)亦属厚壁菌门、乳杆菌科、乳杆菌属，天然存在于动物胃肠道、阴道和母乳中。研究发现，格氏乳杆菌在厌氧和有氧环境下均能较好生长，且对消化液具有较强耐受性，在维持肠道菌群微生态平衡、抑制病原菌生长和调节机体免疫等方面发挥重要功效。2022年国家卫健委更新《可用于食品的菌种名单》，其中就包含格氏乳杆菌。目前，格乳杆菌已广泛应用于医药、食品和饲料工业。
综上所述，筛选能够耐受胃肠道环境，抗生素敏感且抑菌效果优良的罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌，将其混合制成复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮进行饲喂，对于提升昆明犬幼犬生长和警用性能，降低腹泻率，减少抗生素在幼犬养殖过程中的应用具有重要意义。
发明内容
针对昆明犬繁育和驯化的急迫需求，减少或替代抗生素在养殖过程中的使用，本发明提供了一种复合微生态制剂及其在昆明犬幼犬养殖中的应用。首先，所述复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮后，可显著提高饲粮中粗蛋白和粗脂肪含量，并可有效提升饲料适口性。其次经饲喂实验证实，该发酵犬粮对昆明犬幼犬具有良好的促生长作用，并可明显提升幼犬警用性能，同时可显著降低腹泻率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种警犬专用复合微生态制剂，主要由两种乳酸菌组成，其一为罗伊氏乳杆菌，该菌种于2023年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.28319，分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri；其二为格氏乳杆菌，该菌种于2023年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.28320，分类命名为格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri。
进一步，上述罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌的菌株均分离自公安部昆明警犬基地培育定型的昆明犬草黄品系1884犬的新鲜粪便。此两种乳酸菌使用MRS琼脂培养基培养后，菌落形态均呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑且隆起、不透明，均具有较强的消化液耐受性、良好的肠上皮细胞黏附性、较好的抑菌活性和抗生素敏感性。
上述的警犬专用复合微生态制剂在昆明犬幼犬养殖中的应用。
制备复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮，制备方法包含如下步骤：
(1)取罗伊氏乳杆菌MKLQ3807-13和格氏乳杆菌MKCH1884-43冻存菌液分别均以1％接种量接种至含0.1％抗坏血酸的MRS肉汤培养基中，37℃培养8h制备获得两种乳酸菌发酵种子液；
(2)将全价幼犬犬粮粉碎后，按料液比1:1.2g/mL添加水分，121℃灭菌20min后冷却至室温，得到灭菌全价幼犬粮料；将培养好的两种乳酸菌发酵种子液以复合菌接种量1.8×107CFU/g，复合菌接种比例1:1接入灭菌全价幼犬粮料，同时添加200mg/kg单甘酯搅拌均匀后，设置发酵温度35℃，发酵时间36h，封口发酵；其中，添加单甘酯的目的在于，其是一种重要的非离子型表面活性剂，可提高饲料中的油脂稳定性，防止贮藏过久出现油水分离现象。同时，其具有一定的抗菌功效，可防止饲料变质，延长饲料贮藏期。
进一步，发酵昆明犬幼犬全价犬粮以质量比60％添加至未发酵犬粮中饲喂幼犬，可显著提升幼犬生长和警用性能，并可明显降低幼犬腹泻率。
本发明的有益效果：本发明公开了一种警犬专用复合微生态制剂及其在昆明犬幼犬养殖中的应用，通过罗伊氏乳杆菌MKLQ3807-13和格氏乳杆菌MKCH1884-43组成的复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮并经饲喂试验证实，该发酵犬粮对昆明犬幼犬具有良好的促生长作用，并可明显提升幼犬警用性能，同时可显著降低腹泻率。本发明扩展了微生态制剂在昆明犬幼犬养殖中的应用，对昆明犬的繁育和驯化具有重要意义。
附图说明
图1是不同乳酸菌对肠道上皮细胞HT-29的黏附性。
图2是不同乳酸菌对TNF-α诱导肠上皮细胞IL-8基因表达量的影响。
注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1
乳酸菌的分离和鉴定
(一)乳酸菌的分离
(1)样品的采集
将公安部昆明警犬基地培育定型的昆明犬狼青品系3807犬、4704犬和草黄品系1884犬粪便样品用无菌工具装入含有30％无菌甘油的离心管中，甘油全部包裹后置于液氮中，-80℃保存备用。
(2)菌株的分离
在无菌条件下，将保存在30％无菌甘油中的粪便样品进行梯度稀释，按1％的比例添加到含有0.1％抗坏血酸的MRS肉汤培养基中，37℃培养箱中培养24h。将富集后的培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释接种于碳酸钙-MRS固体培养基，装入厌氧盒(放入三菱厌氧袋)中37℃培养箱中培养48h，挑取形态不同并有明显溶钙圈的单菌落，纯化3次后保存备用。
如表1所示，总计从昆明犬狼青品系3807犬、4704犬和草黄品系1884犬新鲜粪便样品中分离得到21株可在碳酸钙-MRS固体培养基上产生明显溶钙圈的菌株。该溶钙圈的产生是由于微生物产生的乳酸能够溶解菌落周围的碳酸钙从而形成透明圈，透明圈越大产酸能力越强，表明21株菌株具有较强的产酸能力。
表1昆明犬粪便分离出的菌株编号
(二)乳酸菌的鉴定
对从昆明犬新鲜粪便中分离得到的21株疑似乳酸菌菌株进行分子生物学鉴定，具体方法如下：
(1)提取乳酸菌疑似菌株的基因组DNA即PCR扩增模板，使用细菌16S rRNA通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)包括：上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，2×Taq buffer 25μL，ddH2O21μL；扩增程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。
(2)扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测后进行DNA测序。测序结果与NCBI数据库进行BLAST比对，对分离所得菌株进行鉴定。
如表2所示，MKLQ4704-30与罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的同源性为100.00％；MKCH1884-82和MKCH1884-30与罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的同源性均为99.86％；MKLQ3807-33与阴道黏液乳杆菌(Limosilactobacillus vaginalis)的同源性为100.00％；MKCH1884-43与格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)的同源性为99.93％；其余16株菌株与罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的同源性均为99.93％。
表2菌株16S rRNA序列同源性比对分析
实施例2
乳酸菌的益生特性
(一)乳酸菌的抗生素敏感性
乳酸菌对某些抗生素的耐药性，会随着乳酸菌进入机体将自身的耐药基因转移至宿主，进而影响机体健康，因此对所筛选的乳酸菌进行耐药性评估至关重要。采用滤纸片扩散法对21株乳酸菌进行抗生素敏感性试验。将乳酸菌菌液均匀涂布于MRS琼脂培养基中，待培养基冷却后，贴放标准药敏纸片，纸片间距不少于24mm，于厌氧盒(放入三菱厌氧袋)中37℃培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。抗生素的种类、药敏纸片含药量及抑菌圈直径判断标准见表3。
表3试验用抗生素的种类、药敏纸片药含量及抑菌圈直径判定标准
如表4所示，21株乳酸菌均对阿莫西林、头孢噻吩敏感，诺氟沙星、卡那霉素和万古霉素耐药；除MKLQ3807-13、MKLQ4704-19和MKCH1884-30对庆大霉素中度敏感，其余18株菌均对庆大霉素耐药；MKLQ3807-2、MKLQ3807-20、MKLQ3807-33、MKLQ4704-25、MKLQ4704-42、MKCH1884-21、MKCH1884-43、MKCH1884-50、MKCH1884-59、MKCH1884-65和MKCH1884-82对青霉素G中度敏感，其余10株菌对青霉素G敏感；MKLQ4704-42、MKCH1884-14、MKCH1884-40和MKCH1884-59对头孢噻肟中度敏感，其余17株菌对头孢噻肟敏感；除MKCH1884-11对氨苄西林中度敏感，其余20株菌均对氨苄西林敏感。
表4乳酸菌抗生素敏感试验结果
注：“S”表示敏感，“I”表示中度敏感，“R”表示耐药。
(二)乳酸菌对主要肠道致病菌的抑菌性能
将21株乳酸菌和参考菌株鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)接种于含有0.1％抗坏血酸的MRS肉汤培养基中，活化传代3次，菌液在4℃、5000rpm条件下离心10min，收集上清液，调节pH至6.2备用，吸取37℃过夜培养的大肠杆菌(Escherichiacoli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)培养液20μL与20mL温度为50℃的LB固体培养基剧烈混合后倾注倒入培养皿，用无菌牛津杯(内径为8mm)打孔，将LGG和分离菌株的上清液加入琼脂孔中(每孔100μL)，空白对照组为无菌的MRS肉汤培养基，37℃培养24h后，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，与参考菌株LGG进行比较。
由表5可知，21株乳酸菌均对大肠杆菌、福氏志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌具有抑制作用。21株乳酸菌对鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌的抑制作用与参考菌株LGG相近；MKCH1884-50和MKCH1884-65对大肠杆菌的抑制作用强于参考菌株LGG，其余19株乳酸菌对大肠杆菌的抑制作用与参考菌株LGG相近。
表5乳酸菌对3种肠道致病菌的抑菌试验结果
注：“-”表示无抑菌作用；“+”表示抑菌圈直径5-10mm；“++”表示抑菌圈直径11-17mm。
(三)乳酸菌耐受模拟胃液能力
菌株耐模拟胃液试验：分别将21株乳酸菌按1％的比例添加到含有0.1％抗坏血酸MRS肉汤培养基中，37℃培养箱中培养16h，4℃、5000rpm条件下离心10min收集菌体。用无菌0.9％NaCl溶液重悬清洗菌体，再次于4℃、5000rpm离心10min收集菌体，加入10mL无菌0.9％NaCl溶液重悬菌体，调节菌体数至1×108CFU/mL，吸取1mL于9mL的模拟胃液(pH 2.0)中混匀，置于37℃恒温箱中培养0h和3h，取1mL菌悬液逐级稀释，进行平板计数，计算0h和3h菌落数的Log10CFU值，比较0h和3h菌落数的Log10 CFU值的下降值。
由表6可知，模拟胃液中处理3h后，14株乳酸菌菌落数Log10 CFU的下降值为0.02至0.96，顺序依次为MKLQ4704-19、MKLQ3807-33、MKLQ4704-49、MKCH1884-11、MKCH1884-14、MKCH1884-40、MKCH1884-43、MKLQ4704-30、MKCH188421、MKLQ3807-13、MKLQ3807-35、MKLQ4704-25、MKCH1884-30、MKCH188459，其余7株乳酸菌菌落数Log10CFU值的下降值值大于1，其范围在1.13至1.99之间。在模拟人工胃液中处理0h与3h相比，菌落数Log10 CFU的下降值小于1，表示其对模拟胃液的耐受性较好，菌落数Log10 CFU的下降值大于1，表示其对模拟胃液的耐受性较差。选取乳酸菌Log10 CFU值下降值小于1的菌株进行下一步试验。
表6乳酸菌模拟胃液耐受试验结果
(四)乳酸菌耐受模拟肠液能力
菌株耐模拟肠液试验：选取对模拟胃液耐受较好的14株乳酸菌进行模拟肠液耐受试验，分别将14株乳酸菌按1％的比例添加到含有0.1％抗坏血酸MRS肉汤培养基中，37℃培养箱中培养16h、4℃，5000rpm条件下离心10min收集菌体，用无菌0.9％ NaCl溶液重悬清洗菌体，再次于4℃、5000rpm离心10min收集菌体，用10mL无菌0.9％NaCl溶液重悬菌体，调节菌体数至1×108CFU/mL，吸取1mL于9mL的模拟肠液中混匀，置于37℃恒温箱中培养0h和3h，取1mL菌悬液逐级稀释，进行平板计数，计算0h和3h后菌落数的Log10CFU值，比较0h和3h菌落数的Log10CFU下降值。
由表7可知，与0h相比，模拟肠液中处理3h后，12株乳酸菌菌落数Log10CFU的下降值由为0.04至0.88，顺序依次为MKLQ3807-33、MKLQ4704-30、MKCH1884-11、MKLQ3807-13、MKLQ4704-19、MKLQ3807-35、MKCH1884-30、MKCH1884-43、MKCH1884-40、MKCH1884-59、MKCH1884-14、MKLQ470449，而MKLQ4704-25和MKCH1884-21菌落数Log10CFU的下降值分别为3.66和4.13。在模拟人工肠液中处理0h与3h相比，菌落数Log10CFU的下降值小于1，表示其对模拟肠液的耐受性较好，菌落数Log10CFU的下降值大于1，表示其对模拟肠液的耐受性较差。选取乳酸菌Log10CFU下降值小于1的菌株进行下一步试验。
表7乳酸菌模拟肠液耐受试验结果
(五)乳酸菌对肠道上皮细胞的黏附性能
根据抗生素敏感试验、肠道主要致病菌抑制试验以及胃肠道耐受试验结果，筛选出MKLQ3807-13、MKLQ3807-35、MKLQ4704-19、MKLQ4704-30、MKLQ4704-49、MKCH1884-30和MKCH1884-43进行肠上皮细胞黏附试验。将上述7株乳酸菌和参考菌株鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)以100μL接种量接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养16h，4℃、5000rpm条件下离心10min，收集菌体。PBS溶液洗涤3次后，用RPMI-1640培养基重悬菌体，将菌悬液的A600调整至所需浓度(1×108CFU/mL)，以每孔2mL添加量将菌体-RPMI-1640培养基添加至长有单层HT-29细胞的6孔细胞培养板。在添加乳酸菌之前，用DPBS缓冲液洗涤6孔细胞培养板中单层HT-29细胞三次，后将6孔细胞培养板置于5％的CO2培养箱中37℃培养1h，用DPBS缓冲液洗涤三次，洗脱没有黏附的乳酸菌及其代谢物，然后加入1mL含0.1％ Triton X-100的PBS溶解细胞30min，细胞溶解后用无菌0.9％ NaCl溶液逐级稀释，进行平板计数，检测培养后的活菌数，计算公式如下：
黏附指数＝黏附的细菌数/细胞数
细胞计数：HT-29细胞用0.25％胰酶消化后，加入RPMI-1640进行稀释配置为细胞悬液，取200μL细胞悬液与200μL 4％台盼蓝混合均匀，取10μL于干净的血球细胞计数板上，从盖玻片下方一端注入，放置显微镜下观察并计数。计算公式如下：
细胞数/mL＝四大格细胞平均数×2×104
试验结果如图1所示：与参考菌株LGG相比，MKLQ3807-13和MKLQ3807-35对HT-29细胞的黏附指数显著增加(P<0.05)，MKLQ4704-19、MKLQ4704-30和MKCH1884-43对HT-29细胞的黏附指数无显著差异(P>0.05)，MKLQ4704-49和MKCH1884-30对HT-29细胞的黏附指数显著降低(P<0.05)。选取MKLQ3807-13、MKLQ3807-35、MKLQ4704-19、MKLQ4704-30和MKCH1884-43进行下一步试验。
(六)乳酸菌对TNF-α诱导HT-29细胞IL-8基因表达量的影响
将HT-29细胞按1.5×106个细胞/孔接种到6孔细胞培养板，待细胞汇合率达到80％，弃去原培养基，对照组(CON)加入2mL RPMI1640完全培养基继续培养19h；TNF-α组加入2mL RPMI1640完全培养基继续培养16h，添加TNF-α(终浓度为50ng/mL)诱导3h；乳酸菌处理组分别加入2mL含有108CFU/mL分离菌株MKLQ3807-13、MKLQ3807-35、MKLQ4704-19、MKLQ4704-30和MKCH1884-43的RPMI1640培养基共同孵育16h，添加TNF-α(终浓度为50ng/mL)诱导3h，采用Trizol法提取细胞总RNA，合成cDNA后以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测白细胞介素-8(IL-8)基因的mRNA相对表达量。qRT-PCR反应体系为20μL，包括10μL 2×SuperReal PreMix Plus，1.2μL 10μM引物，2.0μL cDNA，6.8μL RNase-Free ddH2O。反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃变性30s，循环40次。反应程序结束后采用2－ΔΔCt法进行相对定量分析。基因引物序列及片段大小如表8所示。
表8qRT-PCR引物序列
如图2所示，与对照组相比，TNF-α诱导组HT-29肠上皮细胞IL-8基因的mRNA表达水平显著增加(P＜0.05)；与TNF-α炎症模型相比，LGG、MKLQ3807-13、MKLQ3807-35和MKCH1884-43处理组HT-29肠上皮细胞IL-8基因的mRNA表达水平显著下降(P＜0.05)，MKLQ4704-19处理组IL-8基因的mRNA表达水平显著增加(P＜0.05)，MKLQ4704-30处理组IL-8基因的mRNA表达水平无显著差异(P＞0.05)；与LGG相比，虽然MKLQ3807-13、MKLQ3807-35和MKCH1884-43处理组HT-29肠上皮细胞IL-8基因的mRNA表达水平无显著变化。但是，MKLQ3807-13和MKCH1884-43相比LGG能够更好的抑制TNF-α诱导的HT-29肠上皮细胞IL-8基因的mRNA表达。因此，最终选择MKLQ3807-13和MKCH1884-43组合成复合微生态制剂进行昆明犬幼犬全价犬粮发酵试验。
实施例3
复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮
由于具有罗伊氏乳杆菌MKLQ3807-13和格氏乳杆菌MKCH1884-43均具有较好的益生特性。因此，本发明将其混合制成复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮。为了验证该应用价值，本发明提供一种复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮的制备方法，具体步骤如下：
(1)取罗伊氏乳杆菌MKLQ3807-13和格氏乳杆菌MKCH1884-43冻存菌液分别以1％接种量接种至含0.1％抗坏血酸的MRS肉汤培养基中，37℃培养8h制备获得发酵种子液。
(2)将全价幼犬粮料粉碎后，按料液比1:1.2g/mL添加水分，121℃灭菌20min后冷却至室温。将培养好的两种乳酸菌发酵种子液以复合菌接种量1.8×107CFU/g，复合菌接种比例1:1接入灭菌全价幼犬粮料，同时添加200mg/kg单甘酯搅拌均匀后，设置发酵温度35℃，发酵时间36h，封口发酵。
(一)复合微生态制剂发酵全价幼犬粮前后营养成分含量及pH值变化
参照《饲料中的水分测定》(GB/T 6435-2014)测定水分含量；参照《饲料中粗蛋白的测定-凯氏定氮法》(GB/T 6432-2018)测定粗蛋白含量；参照《饲料中粗脂肪的测定》(GB/T6433-2006)测定粗脂肪含量；参照《饲料中粗灰分的测定》(GB/T 6438-2007)测定粗灰分含量；参照《饲料中钙的测定》(GB/T 6436-2018)测定钙含量；参照《饲料中总磷的测定-分光光度法》(GB/T 64372018)测定磷含量；取10g发酵后的样品加入100mL无菌水中，搅拌30min后采用pH计直接测定。
发酵前后营养成分含量变化如表9所示：与发酵前相比，发酵后全价幼犬粮中粗蛋白和粗脂肪含量显著提高(P＜0.05)，其中粗蛋白含量提高了8.45％，粗脂肪含量提高了6.16％，粗灰分、钙和总磷无显著变化(P＞0.05)。pH由6.1下降到5.1。
表9发酵前后营养成分含量(绝干样)及pH变化
注：同列数据肩标不同小写字母，表示差异显著(P<0.05)；肩标无字母或相同字母，表示差异不显著(P>0.05)。
(二)复合微生态制剂发酵全价幼犬粮后微生物卫生指标和乳酸菌菌落数测定
对经过罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌发酵的犬粮进行微生物卫生指标检测，参照国标检测大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、霉菌和酵母菌的含量。取10g发酵样品，加入装有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中振荡混匀，取1mL该液体加入到9mL的无菌生理盐水中逐步进行10倍梯度稀释，取100μL稀释液加于大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、霉菌和酵母菌的选择性固体培养基中涂布均匀，培养48h，记录菌落数。
对经过罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌发酵的犬粮进行乳酸菌菌落数检测，称取10g发酵样品，加入装有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中振荡混匀，取1mL该液体加入到9mL的无菌生理盐水中逐步梯度稀释，取100μL稀释液加到MRS固体培养基中涂布均匀，37℃厌氧盒(放入三菱厌氧袋)中培养48h，记录菌落数。
经过罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌发酵全价幼犬粮后，饲料微生物卫生指标和乳酸菌菌落数检测结果如表10所示，全价幼犬粮发酵后乳酸菌总数达2.32×109CFU/g，未检测出大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和霉菌等致病菌，表明饲料未发生霉变或污染。
表10发酵饲料微生物卫生指标
注：“-”表示未检出。
(三)复合微生态制剂发酵全价幼犬粮后饲料感官评定
采用德国农业协会(Deutche Lan DwirtschaftsGeseutschaft,DLG)评分法对发酵饲料进行取样，观察和记录饲料经发酵后的颜色、气味、黏度的变化，评分标准参见表11。
表11发酵饲料感官评定标准表
经过罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌发酵全价幼犬粮后，饲料感官评定结果如表12所示。全价幼犬粮经过发酵后有明显的酸香味，无污染或腐烂，发酵后烘干颜色略有变化，未发酵的呈黄褐色，发酵后的呈褐色，从气味、质地和色泽进行综合评分，得分为16分，达到优良等级。
表12发酵饲料感官评定结果
实施例4
复合微生态制剂发酵犬粮对昆明犬幼犬生理性能的影响
制备获得复合微生态制剂发酵犬粮后，本发明将其应用于昆明犬幼犬养殖过程中，验证了其对幼犬生理性能的影响。试验在云南省动物营养与饲料重点实验室和公安部昆明警犬基地进行，采取单因素试验设计，选取10头62-64日龄健康昆明犬幼犬(6公4母)，根据体重、性别随机分到2组中，分别为基础日粮饲喂对照组(CG组)和60％发酵犬粮替代试验组(TG组)，每组3公2母，试验周期共4周。为保证犬舍干燥卫生，每组幼犬分配两个犬舍，两个犬舍交替使用。每个犬舍配有保温灯、塑料网格漏尿板，犬舍每天定时清理粪便。根据幼犬的采食和排便情况定时定量饲喂犬粮(干物质摄入量相同)，每日饲喂三次，上午8:00、下午15:00和晚上20:00。
(一)饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬生长性能的影响
试验初始及结束时称量每头幼犬的空腹体重，每日观察并记录每组幼犬的采食量，按以下公式计算每头幼犬的平均日采食量、平均日增重、料重比。
平均日采食量＝总采食量/(试验天数×幼犬头数)
平均日增重＝(终末体重-初始体重)/(试验天数×幼犬头数)
料重比＝采食量/增重
饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬生长性能的影响如表13所示。与CG组相比，TG组的平均日增重显著升高(P<0.05)，料重比显著降低(P<0.05)，其中日增重升高17.55％，料重比降低14.81％。
表13饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬生长性能的影响(干物质基础)
注：“*”表示两组间差异显著(P<0.05)。
(二)饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬腹泻率的影响
每日记录幼犬的腹泻情况，粪便呈稠状或水状、不成形、粪水分离时认为幼犬发生腹泻。
腹泻率(％)＝100×[幼犬腹泻头次总和/(幼犬头数×试验天数)]。
饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬腹泻率的影响如表14所示。与CG组相比，TG组四周内的腹泻率显著下降(P<0.05)。
表14饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬腹泻率的影响
注：“*”表示两组间差异显著(P<0.05)。
(三)饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬警用性能的影响
参考公安部昆明警犬基地拟定的警用性能评分标准，在饲喂三周后和四周后进行两次警用性能评分，评分标准见表15。
表15昆明犬幼犬警用性能评分标准
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饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬警用性能的影响如表16所示。在饲喂3周发酵犬粮后，与CG组相比较，TG组的兴奋性及注意力、衔取及占有欲、气味搜索及嗅觉、调引表现、抛物追逐占有欲、搜索欲望和搜索能力评分均显著升高(P<0.05)，胆量及敏感度、人群穿梭、环境适应、物品注意力和持物衔取咬合评分无显著变化(P>0.05)，但均有升高的趋势；饲喂4周发酵犬粮后，与CG组相比较，TG组的胆量及敏感度、气味搜索及嗅觉、人群穿梭和环境适应评分显著升高(P<0.05)，兴奋性及注意力、衔取及占有欲、调引表现、物品注意力、持物衔取咬合、抛物追逐占有欲、搜索欲望和搜索能力评分无显著变化(P>0.05)。值得注意的是，TG组的兴奋性及注意力、衔取及占有欲、环境适应、调引表现、物品注意力、持物衔取咬合和抛物追逐占有欲评分均已满分，而CG组并无满分项。综合分析表明，饲喂发酵犬粮能显著提高昆明犬幼犬的警用性能。
表16饲喂发酵犬粮对昆明犬幼犬警用性能的影响
注：“*”表示两组间差异显著(P<0.05)。
Claims (5)
1.一种警犬专用复合微生态制剂，其特征在于，该复合微生态制剂主要由两种乳酸菌组成，其一为罗伊氏乳杆菌，该菌种于2023年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28319，分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillusreuteri；其二为格氏乳杆菌，该菌种于2023年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28320，分类命名为格氏乳杆菌Lactobacillusgasseri。
2.根据权利要求1所述的警犬专用复合微生态制剂，其特征在于，罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌的菌株均分离自成年健康昆明犬新鲜粪便。
3.权利要求1或2所述的警犬专用复合微生态制剂在昆明犬幼犬养殖中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮，制备方法包含如下步骤：
(1)取罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri和格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri冻存菌液分别均以1％接种量接种至含0.1％抗坏血酸的MRS肉汤培养基中，37℃培养8h制备获得两种乳酸菌发酵种子液；
(2)将全价幼犬犬粮粉碎后，按料液比1:1.2g/mL添加水分，121℃灭菌20min后冷却至室温，得到灭菌全价幼犬粮料；将培养好的两种乳酸菌发酵种子液以复合菌接种量1.8×107CFU/g，复合菌接种比例1:1接入灭菌全价幼犬粮料，同时添加200mg/kg单甘酯搅拌均匀后，设置发酵温度35℃，发酵时间36h，封口发酵，得到复合微生态制剂发酵昆明犬幼犬全价犬粮。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵昆明犬幼犬全价犬粮以质量比60％添加至未发酵犬粮中饲喂幼犬。
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