CN117587027A - 编码抗vegf的抗体或抗原结合片段的多核苷酸表达盒及质粒 - Google Patents
编码抗vegf的抗体或抗原结合片段的多核苷酸表达盒及质粒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及编码抗VEGF的抗体或抗原结合片段的多核苷酸表达盒、含有该多核苷酸表达盒的质粒、宿主细胞、重组病毒及其组合物和用途。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域/生物医药领域，具体而言，本发明涉及编码抗VEGF的抗体或抗原结合片段的多核苷酸表达盒，含有该多核苷酸表达盒的质粒、宿主细胞、重组病毒及其组合物、用途和治疗方法。
背景技术
新生血管的形成是许多疾病发展和扩散的关键所在。眼部的许多疾病都涉及血管发生，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞(RVO)、糖尿病视网膜病变(DR)和病理性近视等。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。VEGF与3种酪氨酸激酶受体即血管内皮生长因子受体(VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)结合后发挥其生物学作用。VEGFR的膜外部分大约有750个氨基酸残基，由7个与免疫球蛋白结构相似的Ig结构域组成。当受体被VEGF激活后，细胞内的酪氨酸激酶基团发生磷酸化，并导致一系列的信号传递，最终引发血管新生。有研究表明VEGFR-1膜外区的晶体结构显示第二个Ig结构域是与配体结合的区域。VEGFR-2的第三个Ig结构域对于配体结合的专一性起作用。
VEGF广泛分布于人和动物体内多处组织中，正常眼视网膜色素上皮细胞、血管内皮细胞和周细胞均可产生较低水平的VEGF。许多研究已证实如果VEGF表达过量就可以诱发病理性新生血管性眼病。由于VEGF信号传递对血管新生的重要性，阻断VEGF或VEGF受体从而达到抑制血管新生，对包括癌症、视网膜血管病变等与血管新生相关的疾病有着重要的治疗作用。在过去的十多年，诞生了一些用于治疗眼部新生血管性眼病的抗VEGF药物，如哌加他尼(Macugen)、贝伐珠单抗(Avastin)、雷珠单抗(Lucentis)、阿柏西普(Eylea)等。虽然这些药物在临床上都能够发挥确切疗效，但是由于半衰期较短，目前的抗VEGF抗体或抗原结合片段药物都需要反复的玻璃体内给药，这对于医生和患者来说都增加了负担，因此基因治疗成为了一种期望的治疗方案。
基因治疗通过将外源性的抗VEGF基因通过合适的载体(如腺病毒)导入靶细胞，通过有效的表达相应的药物从而达到治疗作用。其旨在通过药物的持续表达从而实现长时间的药效维持，以显著改善病人的生理和心理负担。然而，基因治疗的一个重大挑战在于如何使外源性的基因在靶细胞中充分地高表达功能性的蛋白或抗体，成为了基因治疗成功与否的关键。
发明内容
基于上述目的，本发明一方面在于提供一种多核苷酸表达盒，所述多核苷酸表达盒包括：1)表达调控元件；
2)编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列。
在一些实施例中，本发明所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段重链可变区包含SEQID NO：1所述的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段重链包含SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列。
本发明包括编码上述抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列，所述编码序列其可操作性地连接于表达调控元件。在一些实施例中，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列。在编码表达的抗VEGF抗体或其抗原结合片段中，重链和轻链中间以F2A肽连接。
在另一些实施例中，本发明所述的抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列经过密码子优化，例如所述编码序列在不改变编码产物氨基酸序列基础上，采用本领域所公知的方法对密码子进行修饰，例如使用在靶细胞中高频表达的密码子替代低频表达的密码子，使得本发明的编码序列在靶细胞内相对于原始密码子具有增加的表达量，可以提高编码产物在靶细胞中的表达水平。
本发明所述的多核苷酸表达盒还包括表达调控元件，例如，表达调控元件为启动子，所述启动子可操作性地连接于编码序列。启动子包括启动子序列或其功能性片段。所述启动子对真核细胞或哺乳动物细胞具有特异性。所述启动子选自下组的启动子：β-肌动蛋白启动子(CBA)、巨细胞病毒启动子(CMV)、延伸因子1α启动子(EF1α)、MNT启动子、UB6启动子、CAG启动子、RPE65启动子、视蛋白启动子、人工拼接启动子(CASS)、pMNTC启动子。优选的，所述启动子包括CBA启动子、CMV启动子、CAG启动子或EF1α启动子。在某些实施例中。
本发明的表达调控元件还可以包括多腺苷酸化信号(polyA)。多腺苷酸化信号保护mRNA，免受核酸外切酶攻击，并且对转录终结、将mRNA从细胞核输出及进行翻译都十分重要。多腺苷酸化信号包含多个连续的腺苷一磷酸，通常含有AAUAAA重复序列。本发明所述多腺苷酸化信号位于编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列的下游。在一些实施例中，多腺苷酸化信号包括猴空泡病毒40(SV40)、人生长激素(HGH)、牛生长激素(BGH)或β-珠蛋白。
本发明的表达调控元件还可以包括内含子，所述内含子位于启动子之后。在一些情况下，内含子可指可被转录但不被翻译的任何序列。在一些情况下，内含子可以指被转录并从细胞中的成熟RNA转录物中去除的任何序列。所述内含子选自PI内含子、VH4内含子、SV40内含子、Chi内含子、U12内含子、RHD内含子等。
本发明的表达调控元件还进一步包括位于所述编码序列上游和所述启动子下游的5”非转译区(5”UTR)。在一些实施例中，所述5”UTR序列与所述启动子序列是异源的。在一些这种实施例中，所述5”UTR包括选自由以下组成的组的序列：UTR1、UTR2、来自腺病毒主要晚期启动子(eMLP)的增强子元素以及来自腺病毒的三联前导序列(TPL序列)。在一些实施例中，所述5”UTR包括UTR1序列。在一个实施例中，所述5”UTR包括UTR2序列。在优选实施例中，所述5”UTR按5”到3”顺序包括TPL序列和eMLP序列。
在一些实施例中，本发明的表达调控元件还进一步包括处于编码序列下游的增强子。所述增强子区包含干扰素的支架附着区(SAR)。在本公开的一些优选的实施方案中，所述支架附着区序列(SAR)为人β-干扰素的人支架附着区(IFNB SAR)。有研究发现在外源基因的表达框中增加人干扰素基因的SAR区域序列，有利于防止外源基因的甲基化沉默，维持外源基因的长期稳定表达。
在某些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒在5’和3’末端侧接有功能性的腺病毒反向末端重复序列(ITR)。功能性的腺病毒反向末端重复序列(ITR)是指如用于整合、复制和包装AAV病毒粒子的ITR序列。所述反向末端重复序列是血清型的腺相关病毒ITR，选自AAV1 ITR，AAV2 ITR，AAV3 ITR，AAV4 ITR，AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9ITR、AAV10 ITR、AAV11 ITR和AAV12 ITR。
在一些实施例中，所述多核苷酸表达盒包括位于编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列下游和所述多腺苷酸化区上游的RNA输出信号。所述RNA输出信号示例性地选自人乙型肝炎病毒转录后元件(HPRE)序列和土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)序列。优选的，所述RNA输出信号选自土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)启动子区，所述启动子区包含CMV启动子序列；
3)内含子区，所述内含子区包含PI内含子序列；
4)5’UTR区，所述5’UTR区包含三联前导序列(TPL)和主要晚期启动子的增强子元件(eMLP)区；
5)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列区；
6)增强子区，所述增强子区包含人支架附着区序列区(SAR)；
7)BGH多腺苷酸化信号序列；
8)AAV 3'ITR。
在一些优选的实施例中，本发明的多核苷酸表达盒包括SEQ ID NO：6所述的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CBA启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)兔β珠蛋白多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些优选的实施例中，本发明的多核苷酸表达盒包括SEQ ID NO：7所述的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CBA启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)BGH多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些优选的实施例中，本发明的多核苷酸表达盒包括SEQ ID NO：8所述的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CMV启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)hGH多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些优选的实施例中，本发明的多核苷酸表达盒包括SEQ ID NO：9所述的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)EF1α启动子序列；
2)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
3)SV40多腺苷酸化信号序列；
4)AAV 3'ITR。
在一些优选的实施例中，本发明的多核苷酸表达盒包括SEQ ID NO：10所述的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)UBC启动子序列；
3)UBC内含子序列；
4)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
5)HGH多腺苷酸化信号序列；
6)AAV 3'ITR。
在一些优选的实施例中，本发明的多核苷酸表达盒包括SEQ ID NO：11所述的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CMV启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)BGH多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CMV启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)SV40多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CMV启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)兔β珠蛋白多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)MNTC启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)SV40多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)MNTC启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)BGH多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)MNTC启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)HGH多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)MNTC启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)兔β珠蛋白多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸表达盒还可以包括Kozak序列。所述Kozak序列位于启动子和抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列之间。
在一些实施例中，本发明所述的多核苷酸表达盒包括位于编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列下游和所述多腺苷酸化区上游的RNA输出信号。所述RNA输出信号示例性地选自人乙型肝炎病毒转录后元件(HPRE)序列和土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)序列。
本发明的另一个目的在于提供一种包含本发明的多核苷酸表达盒的质粒。
本发明的另一个目的在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞转染本发明的多核苷酸表达盒或质粒。在一些实施例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。
本发明的另一方面，提供了基因递送的载体，所述基因递送载体包括本发明的所核苷酸盒。在一些实施例中，所述的基因递送载体为重组病毒，所述重组病毒包括：衣壳蛋白和本发明所述的多核苷酸表达盒。在一些实施例中，重组病毒为重组腺相关病毒(rAAV)，其中所述重组腺相关病毒包括AAV衣壳蛋白和本发明所述的多核苷酸盒。在一些实施例中，所述衣壳蛋白为野生型AAV衣壳蛋白，示例性地，所述AAV血清型衣壳蛋白选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12。在其他实施例中，所述AAV衣壳蛋白为变体AAV衣壳蛋白。在一个实施例中，所述AAV衣壳变体为AAV2的变体。
本发明的另一个方面，在于提供一种药物组合物。所述药物组合物包括本发明的多核苷酸表达盒、质粒或重组病毒，和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，所述药物组合物包括本发明所述的重组病毒和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物被制备为玻璃体内注射、视网膜下注射、脉络膜上腔注射、静脉注射、肿瘤内注射或肌肉注射的制剂。
本发明的另一个方面在于提供本发明所述的多核苷酸表达盒、质粒或重组病毒在制备用于治疗与VEGF有关的疾病的药物中的用途。在某些实施例中，所述与VEGF有关的疾病为眼部新生血管疾病。在某些实施例中，所述眼部新生血管疾病选自年龄相关性黄斑变性，糖尿病视网膜病变，糖尿病性黄斑水肿，视网膜中央静脉阻塞，视网膜分支静脉阻塞所致黄斑水肿，继发于视网膜静脉阻塞的黄斑水肿，息肉状脉络膜血管病变，极低视力的湿性年龄相关性黄斑变性，继发于病理性近视的脉络膜新生血管。
本发明的另一方面在于提供一种治疗哺乳动物受试者中与VEGF有关的疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的包含本发明所述的多核苷酸表达盒的重组病毒或药物组合物递送至眼睛。在某些实施例中，所述与VEGF有关的疾病为眼部新生血管疾病。在某些实施例中，所述眼部新生血管疾病选自年龄相关性黄斑变性，糖尿病视网膜病变，糖尿病性黄斑水肿，视网膜中央静脉阻塞，视网膜分支静脉阻塞所致黄斑水肿，继发于视网膜静脉阻塞的黄斑水肿，息肉状脉络膜血管病变，极低视力的湿性年龄相关性黄斑变性，继发于病理性近视的脉络膜新生血管。在一些实施例中，通过玻璃体内注射、视网膜下注射、脉络膜上腔注射、静脉注射、肿瘤内注射或肌肉注射本发明所述的重组病毒或药物组合物。在一些实施例中，所述治疗方法包括将106到1016vg，优选108到1013vg，更优选109到1012vg所述的重组病毒递送至所述眼睛。
说明书附图
图1提供了重组质粒的示意图，其中示例性的，多核苷酸表达盒定位在腺相关病毒血清型2(AAV2)的反向末端重复序列(ITR)之间
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。并且以下实施例也不代表以下实验为本发明所有的实验或仅有的实验。
实施例1：质粒的构建
使用标准的重组DNA克隆技术或者通用的分子生物学技术构建产生了一系列含有调控元件和编码序列的各种组合的多核苷酸表达盒(表1)。然后使用常规的DNA重组技术和克隆技术在大肠杆菌中构建和克隆包含本表1中所述的多核苷酸表达盒的重组质粒，用于后续制备重组AAV病毒。图1给出了本发明的重组质粒表达框架盒的一个示意图，其中示例性的，多核苷酸表达盒定位在腺相关病毒血清型2(AAV2)的反向末端重复序列(ITR)之间。
如图1的重组质粒示意图所表示，每个盒定位在腺相关病毒血清型2(AAV2)的反向末端重复序列(ITR)之间，盒1-6从5'到3'顺序包含5'ITR、启动子、内含子(或无)、5’UTR(或无)、编码抗VEGF抗体(重链可变区包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列)的编码序列、增强子(或无)和3'ITR。各多核苷酸表达盒主要组成如表1中所示。
表1多核苷酸表达盒
然后分别构建基于上述多核苷酸表达盒1-6的质粒，分别命名为No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6，多核苷酸表达盒从5’到3’端分别包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所述的核苷酸序列。
实施例2：质粒瞬时转染293细胞的蛋白表达
为了对每个多核苷酸表达盒或质粒的表达特性进行体外评估，使用转染试剂将每个重组构建体转染到悬浮的HEK293F细胞中进行转染。具体方法为：选择合适的细胞代数(不超过P15代)，在转染质粒前2h,在不干扰细胞单层的情况下，小心加入10ml DMEM(含10％FBS)培养基；然后通过LipofectamineTM 2000的方法进行单质粒转染，具体包括：加入含2μg目的基因的质粒(需除去内毒素)于1mL无血清培养基中，另加入5μL LiP2000于1mL无血清培养基中；各自静置5min；然后轻轻混匀，静置15min；将上步所得混合液加入细胞培养皿内，加入时将混合液均匀分布在各个位置，完毕后轻轻混匀整个培养液，于37℃，5％CO2培养；转染6h后，小心吸除培养基，并更换为新鲜培养基(10％FBS，1％P/S)，继续培养48～72h后，收集细胞及细胞上清液；通过反复冻融3次，制备含表达蛋白的细胞裂解液，通过ELISA测定蛋白含量，结果如表2。
表2
Claims (10)
1.一种多核苷酸表达盒，其特征在于，所述多核苷酸表达盒包括：
1)表达调控元件；
2)编码抗VEGF的抗体或其抗原结合片段的编码序列；所述抗VEGF的抗体或其抗原结合片段重链可变区包括SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，轻链可变区包括SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列；优选地，所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段重链包含SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列，轻链包含SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸表达盒，其特征在于，所述抗VEGF的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸表达盒，其特征在于，所述多核苷酸表达盒包括位于侧翼的反向末端重复序列(ITR)；优选地，所述ITR是血清型的腺相关病毒ITR，选自AAV1ITR，AAV2 ITR，AAV3 ITR，AAV4 ITR，AAV5 ITR，AAV6 ITR，AAV7 ITR，AAV8 ITR，AAV9ITR，AAV10 ITR，AAV11 ITR和AAV12 ITR。
4.根据权利要求1所述的多核苷酸表达盒，其特征在于，所述多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)启动子区，所述启动子区包含CMV启动子序列；
3)内含子区，所述内含子区包含PI内含子序列；
4)5’UTR区，所述5’UTR区包含三联前导序列(TPL)和主要晚期启动子的增强子元件(eMLP)区；
5)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列区；
6)增强子区，所述增强子区包含人支架附着区序列区(SAR)；
7)BGH多腺苷酸化信号序列；
8)AAV 3'ITR；或者
所述多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CBA启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)兔β珠蛋白多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR；或者
所述多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CBA启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)BGH多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR；或者
所述多核苷酸表达盒从5’到3’端顺序包括：
1)AAV 5'ITR；
2)CMV启动子序列；
3)可操作性地连接于启动子序列的编码抗VEGF抗体或抗原结合片段的编码序列；
4)hGH多腺苷酸化信号序列；
5)AAV 3'ITR。
5.根据权利要求1所述的多核苷酸表达盒，其特征在于，所述多核苷酸表达盒包括SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所述的核苷酸序列。
6.一种质粒，包括权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸表达盒。
7.一种宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞包含权利要求1-5任一项所述的多核苷酸表达盒或权利要求6中所述的质粒；优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。
8.一种重组病毒，其包括衣壳蛋白和根据前述权利要求1-5任一项所述的多核苷酸表达盒；优选地，所述重组病毒为重组腺相关病毒；优选地，所述衣壳蛋白为血清型衣壳蛋白，选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，AAV12或前述任一项衣壳蛋白的变体。
9.一种药物组合物，其特征在于包括根据权利要求1-5任一项所述的多核苷酸表达盒，或者权利要求6所述的质粒，或者权利要求8所述的重组病毒和药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物为玻璃体内注射剂、视网膜下注射制剂、脉络膜内注射制剂、静脉注射制剂、肿瘤内注射制剂或肌肉注射制剂。
10.权利要求1-5任一项所述的多核苷酸表达盒，或者权利要求6所述的质粒，或者权利要求8所述的重组病毒在制备用于治疗与VEGF有关的疾病的药物中的用途；优选地，所述与VEGF有关的疾病为眼部新生血管疾病；更优选地，所述眼部新生血管疾病选自年龄相关性黄斑变性，糖尿病视网膜病变，糖尿病性黄斑水肿，视网膜中央静脉阻塞，视网膜分支静脉阻塞所致黄斑水肿，继发于视网膜静脉阻塞的黄斑水肿，息肉状脉络膜血管病变，极低视力的湿性年龄相关性黄斑变性，继发于病理性近视的脉络膜新生血管。
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