CN117586909A - 一株戊糖片球菌lwq1及其应用 - Google Patents

一株戊糖片球菌lwq1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种戊糖片球菌LWQ1及其应用，属于微生物技术领域。戊糖片球菌LWQ1的保藏号为CCTCC NO:M 20231802。本发明提供了戊糖片球菌LWQ1或其发酵产物在制备细菌或真菌抑制剂中的应用，体外抑菌实验表明其具有广谱抑菌活性，对多种致病细菌和霉菌均表现出来较好的抑菌能力。戊糖片球菌LWQ1无溶血性，生物安全性高。本发明提供的戊糖片球菌LWQ1与酵母并不相互排斥，且对酵母生长没有影响，将之运用在酸面团中构建馒头原位防腐技术，能够有效的抑制馒头在常温存放中的霉菌萌发，并延长馒头的常温保质期。戊糖片球菌LWQ1具有降低胆固醇活性，可将其应用于相关药物或功能食品的开发。

Description

一株戊糖片球菌LWQ1及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株戊糖片球菌LWQ1及其应用。
背景技术
真菌是食品、农作物和牲畜饲料腐败的主要原因。真菌引起的食品腐败会造成巨大的经济损失，还会产生危害人体健康的毒素，这引起了人们对微生物安全性的关注。随着消费者对健康、天然食品的需求日益增加，开发优质、安全的生物防腐方法显得尤为重要。
馒头是以面粉和水为原料，酵母为主要发酵剂，揉成面团后经过发酵、定型、蒸煮而形成的一种食品。然而由于馒头营养丰富，水分含量高，在运输储存过程中容易受到细菌和真菌的侵染引起腐败变质。因此，通常采用低温冷冻方法进行馒头的运输储存，增加馒头流通和销售过程中的困难和成本，不利于馒头的工业化推广。目前，对馒头进行常温运输极受到季节的限制，春秋冬季气候凉爽干燥可推广；然而，夏季气候高温高湿易引起微生物生长繁殖，以馒头表面霉菌腐败表现为主。
导致馒头腐败变质主要原因有以下几方面：一、熟制过程不能彻底杀菌：蒸汽加热温度一般在100～108℃，面坯中心温度一般不超过100℃，各种菌类基本死亡，但真菌孢子和芽孢未能被彻底杀灭，甚至少数菌体仍有存活。二、食品生产运输过程中的微生物污染：在冷却和包装过程中，易受到空气中霉菌孢子的侵染；在运输储存过程中，孢子极易萌发腐败。因此，在馒头生产运输储存过程中，控制霉菌孢子的侵染和萌发，可实现馒头的常温运输，促进馒头的工业化进展。
近年来，利用有益微生物及其代谢产物进行生物防腐的方法越来越受到重视。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)通常被认为是安全(GRAS，Generally Recognized asSafe)的益生菌，研究表明，LAB对许多真菌属具有很强的抑菌活性，产生的各种生物活性代谢产物与其对真菌的抑制作用密切相关。
酸面团是以面粉和水为主要原料，通过天然发酵法培育出的面团，菌群以乳酸菌和酵母菌为主。研究表明，酸面团中的乳酸菌可以抑制微生物的生长，延长产品的保质期。因此，从酸面团中筛选可抑制真菌的乳酸菌，以其结合酵母菌作为发酵剂进行馒头的发酵和生产，并研究酸面团发酵机理，有望延长馒头的常温防腐时间，是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效抑制食源致病微生物增殖生长的益生菌，将其应用于开发相关药品或食品添加剂中。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明从传统发酵剂酸面团中分离筛选出一株新的乳酸菌菌株，通过形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性以及16S rRNA基因比对分析，鉴定该菌株为片球菌属(Pediococcus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，因此将其命名为戊糖片球菌LWQ1(Pediococcus pentosaceus LWQ1)。
戊糖片球菌LWQ1于2023年09月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:M 20231802。
体外抑菌活性实验显示，戊糖片球菌LWQ1对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌如大肠杆菌，真菌如黑曲霉、青霉均表现出有益的抑菌活性。
抑菌机理研究发现，戊糖片球菌LWQ1的代谢产物能够破坏霉菌细胞膜，导致霉菌细胞内容物质泄露，发挥杀菌作用。其抑菌效果由代谢产物中的有机酸作用产生。
本发明提供所述的戊糖片球菌LWQ1在制备细菌或真菌抑制剂中的应用。
所述戊糖片球菌LWQ1或其代谢产物或其灭活菌体用于制备抑制细菌或真菌的药物或食品添加剂。戊糖片球菌LWQ1代谢产物的抑菌活性不受温度影响。
本发明提供的戊糖片球菌LWQ1无溶血性，用于制备药物或食品添加剂时，具备生物安全性。
进一步的，所述细菌可以为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，具体的，所述细菌可以为但不限于金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。
进一步的，所述真菌可以为但不限于霉菌，具体的，所述真菌为黑曲霉或青霉。
进一步的，所述细菌或真菌抑制剂中含有戊糖片球菌LWQ1的发酵上清液或其灭活菌体。
进一步的，所述戊糖片球菌LWQ1的发酵产物的制备方法包括：将戊糖片球菌LWQ1接种于MRS固体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h后，按体积比2％的接种量接种到MRS肉汤中，37℃培养24h后取出，4℃、8000r/min离心5min，取上清液用0.22μm的滤膜过滤后得到无细胞发酵上清液，获得所述发酵上清液；
所述戊糖片球菌LWQ1灭活菌体的制备方法包括：将戊糖片球菌LWQ1接种于MRS固体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h后，按体积比2％的接种量接种到MRS肉汤中，37℃培养24h后取出，将其放于100℃水浴锅中20min后，4℃、8000r/min离心5min，弃上清液，获得灭活菌体。
制备细菌或真菌抑制剂时，除了上述戊糖片球菌LWQ1或其发酵产物或其灭活菌体作为活性成分，再添加有助于活性成分稳定、促进机体吸收的载体。具体的，当真菌抑制剂作为药物时，还包括药学上可接受的载体；当真菌抑制剂作为食品添加剂时，还包括食品学上可接受的载体。
进一步的，所述细菌或真菌抑制剂作为发酵食品添加剂。所述戊糖片球菌LWQ1或其发酵产物或其灭活菌体添加到发酵食品中用于抑菌防腐。所述发酵食品是指制作过程中采用酵母发酵形成的食品。所述发酵食品可以为但不限于馒头、面包。
进一步的，在发酵食品制作过程中添加戊糖片球菌LWQ1或其发酵上清液或其灭活菌体以及酵母。本发明提供的戊糖片球菌LWQ1与酵母并不相互排斥，且对酵母生长没有影响，因此，戊糖片球菌LWQ1或其发酵上清液或其灭活菌体可以在食品制作过程中与酵母一起使用。
本发明还提供了一种延长馒头常温保质期的方法，包括以下步骤：
(1)将所述的戊糖片球菌LWQ1与面粉、水混合，在25～35℃条件下发酵10～15h，得到酸面团；
(2)将酸面团、面粉、酵母和水混合揉成面团，室温下放置4～6h后分切整型，置于发酵条件下发酵；然后蒸制形成馒头。
步骤(1)中，戊糖片球菌LWQ1菌悬液与面粉、水的配比为1mL：45～55g：45～55g。
进一步的，制作酸面团时添加碳源，所述碳源为蔗糖或葡萄糖。添加碳源可以增加戊糖片球菌LWQ1在酸面团发酵时的生物量，增加抑菌活性物质，可显著延缓馒头中霉菌萌发时间。
步骤(2)中，酸面团、面粉、酵母和水的配比为90～110g：140～160g：1g：45～55g。将原料混合揉成面团，进行醒发后分切整型。醒发条件为25-30℃，4～6h。醒发好面团分割成多个面坯质量为45-55g/个，二次醒发条件25-30℃，30-40min，并将醒发后的面坯蒸熟，得到所述馒头。
进一步的，蒸制形成的馒头冷却后进行真空包装或者在包装中添加脱氧剂。本发明研究表明，利用脱氧包装可显著延缓馒头中霉菌萌发时间。具体的，往食品包装中添加商业脱氧剂或进行真空包装。
本发明还提供了所述的戊糖片球菌LWQ1在制备降低胆固醇的药物中的应用，所述胆固醇包括低密度脂蛋白胆固醇。本发明研究表明，将戊糖片球菌LWQ1活菌应用于高脂膳食动物模型，可以显著降低低密度脂蛋白胆固醇的含量，可减缓心血管疾病发生的风险。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供了一株新的戊糖片球菌LWQ1，体外抑菌实验表明其具有广谱抑菌活性，对多种致病细菌和真菌均表现出来较好的抑菌能力。
(2)本发明提供的戊糖片球菌LWQ1对酵母生长没有影响，将之运用在酸面团中构建馒头原位防腐技术，能够有效的抑制馒头在常温存放中的真菌污染，并延长馒头的货架期。
(3)本发明提供的戊糖片球菌LWQ1无溶血性，生物安全性高。
(4)本发明提供的戊糖片球菌LWQ1具有降低胆固醇活性，可将其应用于相关药物或功能食品的开发。
附图说明
图1为戊糖片球菌LWQ1生长曲线。
图2为戊糖片球菌LWQ1生长平板(A)与革兰氏染色显微镜图(B)。
图3为戊糖片球菌LWQ1的同源性分析。
图4为戊糖片球菌LWQ1对金黄色葡萄球菌抑菌圈。
图5为戊糖片球菌LWQ1对大肠杆菌抑菌圈。
图6为戊糖片球菌LWQ1对黑曲霉和青霉生长的影响。
图7为戊糖片球菌LWQ1溶血活性测定，其中(A)为戊糖片球菌LWQ1，(B)为金黄色葡萄球菌。
图8为戊糖片球菌LWQ1对酵母菌的影响。
图9为戊糖片球菌LWQ1对黑曲霉径向生长的影响。
图10为不同温度处理戊糖片球菌LWQ1发酵上清液后对霉菌抑菌活性的影响。
图11为不同蛋白酶处理戊糖片球菌LWQ1发酵上清液后对霉菌抑菌活性的影响。
图12为不同pH条件处理戊糖片球菌LWQ1发酵上清液后对霉菌抑菌活性的影响。
图13为戊糖片球菌LWQ1发酵上清液处理对霉菌OD260nm的影响
图14为戊糖片球菌LWQ1对霉菌细胞膜完整性的影响。
图15为戊糖片球菌LWQ1馒头在冬季常温放置2个月馒头图，其中(A)为LWQ1处理馒头，(B)为对照组馒头。
图16为戊糖片球菌LWQ1馒头与对照组馒头包装与馒头切面图。
图17为戊糖片球菌LWQ1对小鼠血清脂质参数影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
下述实施例中，MRS肉汤、马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基、PDA固体培养基、LB肉汤、血平皿、琼脂粉、均为本领域常规培养基/液。
下述实施例中，面粉是五得利的产品，货号为Q/WDL 0016S；干酵母是安琪酵母股份有限公司的产品，货号为GB/T 20886.1。食品用脱氧剂是上海枫未实业有限公司的产品，货号为SB/T 10514。
下述实施例中的黑曲霉Aspergillus niger和青霉Penicillium sp由自制馒头样品中分离得到。具体分离方法如下：将发霉馒头放置在超净工作台中，用无菌手术刀取出馒头腐败部位至PDA平板上，置于28℃培养箱培养2-4d。根据霉菌菌落形态及颜色对其进行分类，并对不同霉菌进行ITS测序鉴定。切取不同种类的霉菌孢子置于PDA平板上，28℃培养至孢子形成，再次扩大培养，备用。
实施例1：戊糖片球菌LWQ1的筛选与鉴定
1、实验材料
从来自山东的酸面团样品(北方做馒头用的传统发酵剂)中分离筛选乳酸菌。
2、实验方法与结论
2.1菌株的分离
从采样中称取10g放置在均质袋中并加入95mL已灭菌生理盐水均质混匀，随后制备10倍梯度递增系列稀释样品匀液，稀释选择10-5、10-6、10-7三个梯度，每个梯度涂布于MRS固体培养基上三个平行，放入厌氧培养箱中37℃培养24-48h。待长出单菌落后挑选差异明显的菌落在MRS固体培养基上划线分离，放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。重复划线3-5次后，挑取单菌落接入滴于载玻片上的过氧化氢液(5％)并混匀，观察产生气泡的为阳性，未产生气泡的为阴性，其过氧化氢酶试验结果为阴性菌株。将其中一株疑似乳酸菌株命名LWQ1，进行后续性能检测。
2.2生长曲线的绘制
实验方法：将2.1中分离得到的菌株LWQ1接种至MRS肉汤中，37℃培养24h，用接种环挑取菌液至MRS固体培养基划线培养，37℃厌氧培养48h，挑取单菌落接入MRS肉汤中，37℃恒温培养24h。将培养好的菌液用新MRS肉汤调整600nm处吸光度为0.1。从中取1mL菌液放置微生物生长分析中测定其生长曲线，做3组平行。
实验结果：如图1所示，菌株在测定时间内吸光度先迅速增加后趋于平稳。在2.5h左右，菌体进入对数生长期，开始大量繁殖，同时600nm处吸光度增加，在12h左右进入稳定期，并且在12～48h期间吸光度均保持稳定。
2.3菌株鉴定
2.3.1形态学鉴定
实验方法：将所选乳酸菌划线培养，挑取单菌落至MRS肉汤37℃培养24h。进行平板形态观察与革兰氏染色。
实验结果：如图2所示，菌株LWQ1在MRS培养皿上的菌落形态呈圆形，凸起，微白色。革兰氏染色后呈现蓝紫色，球形且形态均一，判定为革兰氏阳性菌。
2.3.2 16S rRNA基因序列分析
实验方法：从LWQ1平板中挑取单菌落接入MRS肉汤，37℃厌氧培养24h，用接种环挑取菌液至MRS固体培养基划线培养，37℃厌氧培养48h。菌落划线纯化2次后，挑单菌落至MRS肉汤中37℃厌氧培养24h，使用提取DNA试剂盒提取菌液DNA，测定其DNA浓度后进行扩增。
反应体系：超纯水7.0μL、DNA模板1.0μL，2X M5 Hiper plus Taq HiFi PCR mix10.0μL，上游引物和下游引物各1μL。
表1.16S rRNA引物
反应程序：于95℃预变性2min，95℃30s，56℃30s，72℃1min，36个循环；最后在72℃保温10min。
将符合条件的PCR扩增产物送往生工公司进行测序，以获得菌株LWQ1的扩增基因序列。在NCBI数据库中对处理好的基因序列进行BLAST同源性对比分析，分析可得与数据库中同源性最高的已知菌株。如图3所示，与已知菌株Pediococcus pentosaceus的同源性达到99％以上。
结合上述分析，鉴定LWQ1为片球菌属(Pediococcus)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。因此，将其命名为戊糖片球菌LWQ1(Pediococcus pentosaceus LWQ1)。
将戊糖片球菌LWQ1于2023年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:M 20231802，并于2023年10月04日检测完毕，鉴定为存活。
实施例2：戊糖片球菌LWQ1的抑菌活性检测
1、实验菌株
实施例1分离鉴定的戊糖片球菌LWQ1。
2、实验方法与结论
2.1菌株的抑菌谱
2.1.1LWQ1菌液的制备
实验方法：将戊糖片球菌LWQ1接种于MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，按2％(v/v)的接种量接种到MRS肉汤中，37℃厌氧培养24h，得到菌原液放置于4℃冰箱备用。
取菌原液4℃、8000r/min离心5min，取上清液用0.22μm的滤膜过滤后得到菌发酵上清液(上清液)，放置于4℃冰箱备用。
取上清液用1mol/L NaOH进行调节，将上清液调节至pH＝7(中性上清液)后放置于4℃冰箱备用。
2.1.2金黄色葡萄球菌抑菌性测定
实验方法：挑取金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CGMCC 1.8721单菌落接种于LB肉汤中，振荡培养至菌液在600nm处的吸光度为1。菌液按体积比0.3％接种量接入灭菌冷却至45℃的LB固体培养基中混匀，倒入培养皿待凝固后打孔，孔径为6mm。
将已制备好的原液、上清液、中性上清液各200μL分别加入孔中，以等体积已灭菌的蒸馏水为对照，放入37℃静置培养24h后，拍照记录并测量其抑菌圈直径。
实验结果：如图4所示，LWQ1原液和上清液均有抑菌效果，上清液pH值调节至中性后，无抑菌圈。结果表明，LWQ1中的有机酸是抑制金黄色葡萄球菌的主要成分。
2.1.3大肠杆菌抑菌性测定
实验方法：挑取大肠杆菌(Escherichia coli)CICC10004单菌落接种于LB肉汤中，振荡培养至菌液在600nm处的吸光度为1。菌液按体积比0.3％接种量接入灭菌冷却至45℃的LB固体培养基中混匀，倒入培养皿待凝固后打孔，孔径为6mm。
将已制备好的原液、上清液、中性上清液200μL分别加入孔中，以等体积已灭菌的蒸馏水为对照，放入37℃静置培养24h后，拍照记录并测量其抑菌圈直径。
实验结果：如图5所示，原液和上清液均有明显的抑菌圈的形成，但将上清液pH值调至7后，无抑菌圈。结果表明，LWQ1原液和上清液对大肠杆菌有抑制作用。
2.1.4霉菌抑菌性测定
实验方法：将上述从发霉馒头中分离得到的霉菌接种在PDA平板上，28℃培养3～4d直至孢子形成，用无菌生理水刮取培养基表面孢子，通过4层无菌纱布过滤，除去菌丝体即为孢子悬液。采用血球计数测定孢子数，用无菌生理盐水调整孢子浓度为106个/mL备用。
将MRS固体培养基作为下层培养基，将菌原液点样10μL在平板中央，37℃厌氧培养48h。将霉菌(黑曲霉、青霉)孢子浓度调整到106个/mL再与融化的PDA培养基充分混合，倾注在MRS固体培养基上，28℃培养3d之后观察。
实验结果：如图6所示，在菌株点样周围有明显抑菌圈的形成。黑曲霉开始为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。随着时间的延长对照组平板长满黑曲霉，LWQ1组点样周围形成明显抑菌圈。
对于青霉的生长，开始为白色，后逐渐变为绿色，随着培养时间的延长，对照组平板长满青霉，LWQ1组点样周围有明显抑菌圈的形成。
上述结果表明，LWQ1对黑曲霉和青霉生长有明显抑制效果。
2.2溶血活性测定
溶血是菌株中自带的溶血毒素分泌而导致细胞破裂溶解的现象，形成的溶血圈分为草绿色的潜在性致病菌溶血圈(α型溶血)、无色透明的强致病菌溶血圈(β型溶血)和无溶血现象。
实验方法：将菌株LWQ1划线至血平皿，37℃培养48h，观察菌落周围是否有溶血圈形成，以金黄色葡萄球菌作为阳性对照。
实验结果：如图7所示，金黄色葡萄球菌划线周围形成了透明的溶血圈，LWQ1菌落周围没有出现溶血圈，结果表明其无溶血性。
2.3与酵母相互作用测定
实验方法：将菌株LWQ1菌液在MRS固体培养皿上画两条2.5mm的线条，37℃厌氧培养48h。将含有酵母的PDA培养基倾倒在上层，待其凝固，28℃培养48h，观察结果。
实验结果：如图8所示，菌株划线周围没有抑菌圈的形成，结果表明，LWQ1与酵母并不相互排斥，即对酵母的生长没有影响。
实施例3：戊糖片球菌LWQ1抑菌机理分析
1、实验菌株
实施例1分离鉴定的戊糖片球菌LWQ1。
2、实验方法与结论
2.1发酵上清液和浓缩液的制备
实验方法：LWQ1发酵上清液制备同实例2的2.1.1。
取500mL LWQ1发酵上清液冷冻干燥后，用50mL无菌水溶解得到10倍浓缩的LWQ1浓缩液；将500mL MRS肉汤冷冻干燥后，用50mL无菌水溶解得到10倍浓缩的MRS浓缩液。
2.2指示菌孢子悬液的制备
实验方法：将霉菌接种在PDA培养基上，28℃培养3～4天直至孢子形成，用无菌生理水刮取培养基表面孢子，通过4层无菌纱布过滤，除去菌丝体即为孢子悬液。采用梯度稀释法测定孢子数，用无菌生理盐水将孢子浓度调整为106个/mL备用。
2.3LWQ1菌液对黑曲霉菌径向生长的影响
实验方法：分别将LWQ1原液(LWQ1发酵上清液)、LWQ1浓缩液、对照原液(MRS肉汤)和对照浓缩液(MRS浓缩液)按体积比10％加入PDA培养基中，混匀后倒入培养皿，待培养基冷凝后，在平板中心位置点接5μL黑曲霉孢子悬浮液，28℃培养观察黑曲霉菌落直径，验证抑菌活性。
实验结果：如图9所示，随着时间的增加，LWQ1原液组黑曲霉的径向生长较对照原液组缓慢。在浓缩组中，对照组浓缩后反而加速了黑曲霉的径向生长进程，LWQ1浓缩后显著延缓黑曲霉的径向生长。结果表明，LWQ1发酵上清液能够抑制黑曲霉径向生长速度。
2.4不同温度对发酵上清液抑制霉菌活性的影响
实验方法：将发酵上清液在-20℃、4℃、60℃、80℃、100℃和121℃中处理20min，等温度降至室温后备用。
在96孔板中分别加入100μL含霉菌孢子悬浮液(10 6个/mL)及100μL不同温度处理后的发酵上清液或MRS肉汤，以未处理发酵上清为对照组，28℃培养48h，酶标仪在600nm处测定其吸光值，按下列公式计算不同温度处理后的发酵上清液的抑菌率。
抑菌率(％)＝[(OD1-OD2)/OD2]×100％ (1)
式中：OD1表示霉菌孢子在乳酸菌发酵上清液中培养48h的OD600nm；OD2表示霉菌孢子在MRS肉汤中培养48h的OD600nm。
实验结果：如图10所示，发酵上清液经过不同温度处理之后，对黑曲霉与青霉的抑菌率与未处理发酵上清相比没有显著差异，结果表明，LWQ1发酵上清中的抑菌物质在-20-121℃范围内具有稳定性。
2.5不同酶对发酵上清液抑制霉菌活性的影响
实验方法：将LWQ1发酵上清液用1mol/L NaOH和1mol/L乳酸分别调节至胃蛋白酶的最适pH2，胰蛋白酶的最适pH7，蛋白酶K的最适pH7，过氧化氢酶的最适pH7，然后分别添加该酶使最终浓度为1mg/mL。将其放于37℃水浴锅中反应2h后，放于100℃的水浴锅中反应5min使酶失活，等温度降至室温后将pH调至起始的pH。
在96孔板中分别加入100μL含霉菌孢子悬浮液(106个/mL)及100μL不同酶处理后的发酵上清液或MRS肉汤，以未处理发酵上清为对照组，28℃培养48h，酶标仪在600nm处测定其吸光值，按公式(1)计算不同酶处理后发酵上清液的抑菌率。
实验结果：如图11所示，LWQ1发酵上清液经过胃蛋白酶、胰蛋白酶过氧化氢酶处理后对黑曲霉的抑菌率显著下降。与未处理组发酵上清相比，胃蛋白酶处理后青霉抑菌率显著下降。结果表明，发酵上清液中可能存在过氧化氢和蛋白类抑菌物质共同作用。
2.6不同pH对发酵上清液抑制霉菌活性的影响
实验方法：用1mol/L NaOH和1mol/L乳酸调节发酵上清液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在96孔板中分别加入100μL含霉菌孢子悬浮液(106个/mL)及100μL调节pH后的发酵上清液或MRS肉汤，以未处理发酵上清为对照组，28℃培养48h，酶标仪在600nm处测定其吸光值，按公式(1)计算不同酶处理后发酵上清液的抑菌率。
实验结果：如图12所示，pH处理对LWQ1发酵上清液的抑菌率影响较大，当pH为3和4时，发酵上清液对黑曲霉和青霉的抑菌率与对照相比无显著差异，当pH≥5时发酵上清液对黑曲霉和青霉的抑菌率均显著降低。pH为5时对黑曲霉的抑制作用最低，pH为6时对青霉的抑制作用最低。结果表明，LWQ1发酵上清液中的有机酸为主要抑菌物质。
2.7发酵上清液对霉菌核酸泄露的影响
实验方法：将浓度为106个/mL霉菌孢子悬浮液接种于PDB培养基中，180r/min、28℃下摇床培养48h后，8000r/min离心5min，弃上清液，用无菌生理盐水多次清洗得到菌丝球。称取菌丝球0.5g至10mL离心管中，向其中加入5mL发酵上清液，以等体积无菌生理盐水为对照组。180r/min、28℃下摇床培养，在0、2、4、6h时分别吸取溶液于4℃、8000r/min离心5min，至超微量分光光度计测定260nm处吸光度。每组3个平行。
实验结果：如图13所示，随着时间的增加，LWQ1组在260nm处的吸光度差值显著高于对照组，且持续增加。结果表明，黑曲霉与青霉在处理后细胞膜受到破坏，导致细胞内核酸渗漏，核酸透过细胞膜渗透到培养液中致使溶液中核酸含量迅速增加。
2.8发酵上清液对菌丝细胞膜的影响
实验方法：同实例3的2.7培养成菌丝球清洗后，取菌丝球至10mL离心管中，用发酵上清液重悬使最终霉菌(黑曲霉和青霉)浓度为106个/mL，以未添加发酵上清液为对照组，180r/min、28℃下摇床培养48h。收集菌丝，用蒸馏水冲洗两次，然后4000r/min离心5min，弃掉上清液，在其中加入1mL 10μg/mL的PI染色液，混匀后室温避光染色30min，用PBS洗涤多余的染料后重悬于PBS缓冲液中，置于激光共聚焦显微镜下观察，并拍照记录。
实验结果：PI染色液可以穿过受损的细胞膜并与DNA特异结合，发出红色荧光，而它不能透过完整细胞膜。如图14所示，经过LWQ1发酵上清液培养的黑曲霉与青霉很容易被PI染色，与对照相比，LWQ1组更多的菌丝被染色并发出红色荧光。表明LWQ1处理后导致黑曲霉与青霉丧失了细胞活力，并有相当比例的细胞膜失去完整性。结果表明，LWQ1具有破坏真菌细胞膜结构并改变其通透性的能力。
实施例4：戊糖片球菌LWQ1在馒头常温防腐中的应用
1、实验材料
实验菌株为实施例1分离鉴定的戊糖片球菌LWQ1。面粉为五得利八星面粉。
2、实验方法与结论
2.1馒头冬季常温防腐实验
实验方法：LWQ1菌株在MRS肉汤中培养24h后，离心(3000/min，15min)收集菌体，并用无菌生理盐水清洗两次后，重悬于生理盐水中。以同体积无菌水为对照组。将面粉、菌悬液和无菌蒸馏水加入到和面机中，面团得率((面粉质量+水质量)×100/面粉质量)为150。和面机和面20min后，于恒温恒湿(30℃，80％RH)条件下发酵8h。制作馒头的面团用和面机和面之后，再手工和面5-10min，使面团表面光滑，馒头成型，置于相同条件下发酵2h。将蒸锅加热煮沸后，放入馒头汽蒸20min。蒸好馒头放凉，放入密封袋中密封保存。
将馒头密封保存2个月后分别观察馒头表面、硬皮下和内芯的发霉情况。
保存条件：保存时间为冬季12月份-次年2月份，平均温度为0-2℃、湿度为60-65％RH。
实验结果：如图15和表2所示，保存2个月后LWQ1组的3个馒头均无霉菌生长。对照组馒头发霉严重，其中一个腐败严重至馒头内芯。结果表明，在冬季低温的情况下，LWQ1馒头在常温中可保存2个月不发霉。
表2.馒头在冬季常温保存情况
2.2馒头不同温度和湿度常温防腐实验
实验方法：LWQ1菌株在MRS肉汤中培养24h，然后用离心法收集。倒出上清液后，清洗菌体并重新悬浮在无菌生理盐水中。将4mL细胞悬液与200g面粉和200mL水混合，在30℃下发酵12h制备酸面团，以同体积无菌水为对照。发酵完成后再从中取出300g酸面团，与450g面粉、3g酵母和150mL水混合揉成面团，将面团在室温下发酵5h。面团与少量面粉打滑，切割成50g的面坯整型后，在发酵箱中27-30℃发酵30-40min。将蒸锅加热煮沸后，放入面坯汽蒸40min。将蒸好的馒头放至冷却架中冷却放凉，放入食品塑封袋中热封，于室温下保存。观察LWQ1组与对照组的变化，记录一个月内馒头霉菌萌发时间。
保存条件：时间为2月-3月时，平均温度为2-7℃、湿度为54-62％RH；时间为5月-6月时，平均温度为19-24℃、湿度为57-67％RH。
实验结果：如表3所示，当保存时间为2月-3月时，对照组3个馒头在第5d观察到霉菌萌发，LWQ1组在第20d观察到有1个馒头有霉菌萌发；当保存时间为5月-6月时，对照组3个馒头在第3d观察到霉菌萌发，LWQ1组在第8d观察到有1个馒头有霉菌萌发。
结果表明，在环境温度和湿度较高的情况下LWQ1组可以在一定程度上延长馒头常温保质期。
表3.春季馒头常温放置霉菌萌发情况
注：-表示1个月观察期间馒头外表皮未有霉菌萌发情况发现。
2.3馒头脱氧包装常温防腐实验
霉菌的生长环境达到一定的温度和湿度，霉菌的生长速度较快。由2.2部分可知，随着气温的升高，菌株LWQ1在馒头上抑制真菌作用受到影响，因此，尝试进行脱氧包装(脱氧剂)保存。
实验方法：实验方法同实例4的2.2，在馒头冷却包装时加入脱氧剂一起密封。观察LWQ1组与对照组馒头的变化，记录一个月内馒头霉菌萌发时间。
保存条件：时间为6月份-7月份，平均温度为23-30℃、湿度为71-80％RH。
实验结果：如表4所示，采用食品塑封袋(普通包装)进行保存时，对照组在第2d、LWQ1组在第5d观察到霉菌萌发；而采用脱氧包装(添加脱氧剂)时，对照组在第15d、LWQ1组在第20d观察到霉菌萌发，剩余3个可保存1个月。结果表明，在高温高湿天气时LWQ1组结合脱氧剂能显著延长馒头常温保质期。
表4.馒头活性包装常温放置霉菌萌发情况
注：-表示1个月观察期间馒头外表皮未有霉菌萌发情况发现。
2.4馒头真空包装常温防腐实验
实验方法：实验方法同实例4的2.1，在馒头冷却后用真空包装袋包装，并对其进行抽真空处理。观察LWQ1组与对照组馒头的变化，记录一个月内霉菌萌发时间。
保存条件为：同实例4的2.3。
实验结果：如表5所示，对照组馒头在4d内先后观察到霉菌萌发，LWQ1组馒头在第16d观察到一个馒头霉菌萌发，剩余4个馒头可保存1个月。结果表明，在高温高湿天气时对LWQ1馒头进行抽真空处理后，可以在一定程度上延长馒头常温保质期。
表5.馒头真空包装常温放置霉菌萌发情况
注：-表示1个月观察期间馒头外表皮未有霉菌萌发情况发现。
2.5馒头补充碳源常温防腐实验
为在酸面团发酵时获得大量的戊糖片球菌LWQ1菌体，在制作酸面团时补充一定量的碳源(糖)，以促进戊糖片球菌LWQ1在发酵过程中的生物量。
实验方法：实验方法同实例4的2.2，按酸面团总体积(400g)添加质量比1.8％的绵白糖进行酸面团制作。每天观察每个馒头的发霉情况，观察LWQ1组与对照组之间的差距，记录一个月内馒头霉菌萌发时间。
保存条件：在夏季高温高湿条件下制作馒头，7月份-8月份，平均温度为26-33℃，湿度为80-86％RH。
实验结果：如表6所示，未加糖LWQ1组在第3d、未加糖对照组在第2d观察到霉菌萌发，两者之间相差1d；加糖LWQ1组在第8d、加糖对照组在第2d观察到霉菌萌发情况，两者之间相差6d。结果表明，在制作酸面团时补充碳源后能够显著延长馒头在高温高湿季节的保存期。
表6.馒头常温放置霉菌萌发情况
注：-表示1个月观察期间馒头外表皮未有霉菌萌发情况发现。
实施例5：戊糖片球菌降低高脂膳食小鼠低密度脂蛋白胆固醇能力
实验方法：选取5周龄、体重相近的健康雄性C57BL/6小鼠(SPF)为实验对象，预饲喂1周后，随机分为3个实验组，每组3笼，每笼5只，进行15周饲喂试验。
对照组(NCD)：饲喂普通饲料，每天灌胃200μL生理盐水。
高脂组(HFD)：饲喂高脂饲料(前9周45％+后6周60％)，每天灌胃200μL生理盐水。
LWQ1组：饲喂高脂饲料(前9周45％+后6周60％)，每天灌胃200μL的LWQ1(含有2×108cfu活菌)。
饲喂结束后眼眶取血，使用南京建成试剂盒测定血清中总甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)。
实验结果：如图17所示，LWQ1的摄入，显著降低低密度脂蛋白胆固醇的含量，可减缓心血管疾病发生的风险。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株戊糖片球菌LWQ1，其特征在于，该戊糖片球菌的保藏号为CCTCC NO:M20231802。
2.如权利要求1所述的戊糖片球菌LWQ1在制备细菌或真菌抑制剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌；所述真菌为黑曲霉或青霉。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌或真菌抑制剂中含有戊糖片球菌LWQ1的发酵上清液或其灭活菌体。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌或真菌抑制剂作为发酵食品添加剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵食品在制作过程中添加戊糖片球菌LWQ1或其发酵上清液或其灭活菌体以及酵母。
7.如权利要求1所述的戊糖片球菌LWQ1在制备降低胆固醇的药物中的应用，其特征在于，所述胆固醇包括低密度脂蛋白胆固醇。
8.一种延长馒头常温保质期的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将如权利要求1所述的戊糖片球菌LWQ1与面粉、水混合，在25～35℃条件下发酵10～15h，得到酸面团；
(2)将酸面团、面粉、酵母和水混合揉成面团，室温下放置4～6h后分切整型，置于发酵条件下发酵；然后蒸制形成馒头。
9.如权利要求8所述的延长馒头常温保质期的方法，其特征在于，步骤(1)中，制作酸面团时添加碳源，所述碳源为蔗糖或葡萄糖。
10.如权利要求8所述的延长馒头常温保质期的方法，其特征在于，步骤(2)中，蒸制形成的馒头冷却后进行真空包装或者在包装中添加脱氧剂。
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