CN117586461A - 一种聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶 - Google Patents

一种聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种聚2‑甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶，属于医用抗菌涂层领域。将PMETAC与GelMA通过光引发交联，获得了常温下快速固化的抗菌水凝胶，固化时间缩短至1min，固化效率高。本发明利用该水凝胶，在透明矫治装置表面构建了表面抗菌涂层。经验证，该涂层厚度均匀，表面超亲水，摩擦系数低，溶胀率低，与基材粘接牢固，机械稳定性好，降解率低，能保持一定的化学稳定性；具有良好的体外和体内生物相容性，通过抑制细菌的初期粘附和杀菌作用抑制生物膜的形成，在不干扰口腔微生态多样性的同时能够降低口内致龋菌属的丰度，抑制菌斑的形成，具有长期抗菌效果，防止牙釉质的脱矿。

Description

一种聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化 明胶水凝胶
技术领域
本发明属于医用抗菌涂层领域，具体涉及一种聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
细菌在口腔中广泛定植，比如牙齿表面、颊腭黏膜、牙龈沟等，以及口腔治疗中应用的透明矫治器或活动矫治器、义齿等材料表面。这些口腔医疗装置在长期佩戴过程中会一定程度上阻碍舌体和唾液的清洁作用，从而加重菌斑堆积，引起龋病、黏膜炎和牙周炎等疾病。无托槽透明矫治器/保持器，主要是由热塑性高分子膜片制成，因其具备美观、便捷和舒适等优点而被广泛应用于正畸临床中，患者每日佩戴时间超过22h，长期佩戴极易造成材料表面大量的菌斑堆积，增加患者罹患龋病的风险。因此，需采用有效的措施来预防因佩戴透明矫治装置而引起的菌斑积聚甚至牙齿脱矿、龋病等。
目前，临床上采用多种抗菌策略预防牙面脱矿和龋病，包括使用抗菌漱口水、牙膏和牙面涂氟等。然而，这些常规干预措施在很大程度上取决于患者的依从性，其预防效果具有很大的不确定性。因此增加矫治器本身的抗菌能力具有重要的临床意义。提高材料的抗菌性可以通过在制造热压膜片(Heat compressive film，HCF)的过程中加入抗菌剂进行材料改性或者于HCF表面制作抗菌涂层。进行了材料改性的HCF其力学性能可能会降低，难以满足正畸临床应用的需求；而抗菌涂层则可以在保留HCF原有力学性能的同时增加抗菌功能，因而具有良好的临床应用潜能。因此，研发一种方便应用、无色透明并可稳固结合于透明矫治器基材HCF上的抗菌涂层，以增强材料表面的抗菌能力，有望减少菌斑生物膜的积聚生长，从而达到预防牙面脱矿及龋病发生的目的，具有重要的临床意义。
阳离子聚合物是一种具有固有抗菌效果的聚合物。阳离子聚合物的抗菌机理是依靠聚合物表面的阳离子与细菌膜表面的阴离子相结合，造成细菌膜破裂，从而杀灭细菌。专利CN113616851A公开了一种壳聚糖/聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵基水凝胶，该水凝胶以阳离子聚合物聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(poly[2-(methacryloyloxy)ethyl]trimethyl ammonium chloride，PMETAC)作为支架材料，支架材料上负载壳聚糖(阳离子聚合物)，该水凝胶具有良好的抗菌性能，但是该PMETAC基水凝胶所用的固化时间长，需要4～7h，固化效率低；同时，该水凝胶用作伤口敷料，而非涂层，且前期材料需要乏氧环境，不利于临床制作涂层。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶，本发明提供的水凝胶可用作正畸透明矫治装置的表面抗菌涂层，具有快速固化、结合牢固、耐受机械磨损、生物降解和抗菌等优势。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供一种聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
将甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacrylate，GelMA)和光引发剂溶于水中，得到GelMA水凝胶前体溶液；向GelMA水凝胶前体溶液中加入2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵([2-(methacryloyloxy)ethyl]trimethyl ammonium chloride，METAC)，搅拌均匀得PMETAC/GelMA水凝胶前体溶液，通过光照引发交联获得所述PMETAC/GelMA水凝胶。
在本发明的一些实施例中，所述GelMA可为市售产品，也可以自制，以节约资金。
在本发明的一些实施例中，自制GelMA的制备方法可为：向明胶溶液中逐滴滴加甲基丙烯酸，并调节pH至7.0～7.5；搅拌反应，反应完毕后得GelMA溶液；GelMA溶液经透析、离心、浓缩、干燥处理后得到GelMA干粉。
其中，所述明胶溶液中溶剂可选为PBS缓冲液；所述明胶溶液中明胶的浓度可选为0.1～0.3g/mL，具体可选为0.1g/mL、0.125g/mL、0.13g/mL、0.25g/mL、0.275g/mL、0.3g/mL等。
其中，所述明胶与甲基丙烯酸的用量比为：35～40g：20～25mL，具体可选为35g：20mL、37.5g：21.74mL、38g：22.5mL、39.2g：24.3mL、40g：25mL等。
其中，采用酸或碱调节pH，优选采用碱溶液调节pH。所述碱溶液可选为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液等。所述碱溶液的浓度优选为1mol/L。进一步优选的，所述碱溶液为1mol/L的氢氧化钠溶液。
其中，所述透析为将冷却至室温的GelMA溶液装入分子量为10000～15000的透析袋中透析3～4天，优选采用分子量为12000的透析袋。
其中，所述浓缩可选为利用旋转蒸发器对GelMA溶液进行浓缩处理。
其中，所述干燥为冷冻干燥，具体的，所述冷冻干燥的步骤为：将浓缩液-80℃快速降温结冰后，转移至冷冻干燥机中-50℃处理48h，得到GelMA干粉。
在本发明的一些实施例中，GelMA与METAC的质量比为1：1～3，优选为1：1。
在本发明的一些实施例中，所述光引发剂为包括但不限于LAP或光引发剂2959中的一种或几种，优选为LAP。所述GelMA与光引发剂的质量比为35～45：1，优选为40：1。
在本发明的一些实施例中，所述光照为紫外光辐照，所述光照波长为350～370nm，辐照时间为1～2min。
本发明的第二个方面，提供一种PMETAC/GelMA水凝胶，所述PMETAC/GelMA水凝胶采用上述制备方法制得。
本发明的PMETAC/GelMA水凝胶具有优异的抗菌性能，因而本发明的第三个方面，提供上述PMETAC/GelMA水凝胶在正畸透明矫治装置的表面抗菌涂层中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述应用为：将正畸透明矫治装置表面经等离子处理和二苯甲酮处理后，再在其表面涂刷PMETAC/GelMA水凝胶的前体溶液，光照引发交联，在正畸透明矫治装置的表面制得表面抗菌涂层。
本发明的第四个方面，提供一种正畸透明矫治装置的表面抗菌涂层，所述表面抗菌涂层的制备方法包括如下步骤：
清洗正畸透明矫治装置，干燥后对其进行等离子体处理，在正畸透明矫治装置表面接枝羟基；
将经过等离子体处理的正畸透明矫治装置浸泡在二苯甲酮溶液中，干燥；
最后将上述的PMETAC/GelMA水凝胶的前体溶液涂覆在浸泡过二苯甲酮的正畸透明矫治装置，光照引发交联，在正畸透明矫治装置的表面制得表面抗菌涂层；
所述正畸透明矫治装置的材质为HCF材料。
本发明提供的正畸透明矫治装置的表面抗菌涂层，该涂层厚度均匀，表面超亲水，摩擦系数低，溶胀率低，与正畸透明矫治装置的基材(HCF材料)粘接牢固，机械稳定性好，降解率低，能保持一定的化学稳定性。同时，该表面抗菌涂层具有良好的体外和体内生物相容性，通过抑制细菌的初期粘附和杀菌作用抑制生物膜的形成，在不干扰口腔微生态多样性的同时能够降低大鼠口内致龋菌属的丰度，抑制菌斑的形成，并具有较好的长期抗菌效果，进而防止牙釉质的脱矿。
本发明的第五个方面，提供一种正畸透明矫治装置，所述正畸透明矫正装置的表面涂覆上所述的表面抗菌涂层。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种PMETAC/GelMA水凝胶的制备方法，包括如下步骤：将GelMA和光引发剂溶于水中，得到GelMA水凝胶前体溶液；向GelMA水凝胶前体溶液中加入METAC，搅拌均匀得PMETAC/GelMA水凝胶前体溶液，通过光照引发交联获得所述PMETAC/GelMA水凝胶。专利CN113616851A公开的水凝胶的固化时间非常长，不适用做正畸透明矫治装置的表面抗菌涂层。为缩短PMETAC基水凝胶的固化时间、方便后期临床转化，本发明调整了PMETAC基水凝胶的交联体系。GelMA是由甲基丙烯酸酯改性的明胶，在光引发剂和紫外线的作用下可快速交联形成水凝胶，并且GelMA水凝胶具有低成本、易于生产和生物相容性好等特点。本发明创造性地将PMETAC与GelMA通过光引发交联，获得了常温下快速固化、方便应用的抗菌水凝胶涂层。该PMETAC/GelMA水凝胶的固化时间缩短至1min之内，固化效率高。
本发明利用PMETAC/GelMA水凝胶，在透明矫治装置表面构建了一种能够快速固化、结合牢固、耐受机械磨损和生物降解、抗菌的PMETAC/GelMA水凝胶涂层，预防因佩戴透明矫治装置而引起的菌斑积聚甚至牙齿脱矿、龋病等。经试体外评估其理化结构、凝胶化时间、亲疏水性、摩擦系数、溶胀率、与基材之间的粘接强度、机械稳定性和降解性能，以及水凝胶涂层的细胞相容性、抗S.mutans初期粘附作用、对游离S.mutans的抗菌作用和对S.mutans生物膜形成的抑制作用，还建立大鼠口内S.mutans菌斑模型，对PMETAC/GelMA水凝胶涂层的体内生物相容性、对口腔微生态的影响和体内对S.mutans的抗菌作用进行评估；建立人离体牙S.mutans菌斑模型，评估PMETAC/GelMA水凝胶涂层的长期抗菌作用和预防牙釉质脱矿的效果。经验证，本发明在透明矫治器表面成功制备能快速光固化的PMETAC/GelMA水凝胶透明涂层。该涂层厚度均匀，表面超亲水，摩擦系数低，溶胀率低，与基材粘接牢固，机械稳定性好，降解率低，能保持一定的化学稳定性。PMETAC/GelMA水凝胶涂层具有良好的体外和体内生物相容性，通过抑制细菌的初期粘附和杀菌作用抑制生物膜的形成，在不干扰口腔微生态多样性的同时能够降低大鼠口内致龋菌属的丰度，抑制菌斑的形成，并具有较好的长期抗菌效果，进而防止牙釉质的脱矿。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为涂层粘接强度测试的制样示意图；
图2为大鼠口内S.mutans菌斑模型，其中A为大鼠体内实验流程示意图；B为大鼠牙列模型和透明矫治器，从左至右依次为大鼠上颌牙的硅橡胶印模、石膏模型和透明矫治器；C为透明矫治器固定于大鼠口内，上颌前牙和左后牙作为粘接部位，上颌右后牙作为实验部位；
图3为人离体牙S.mutans菌斑模型及离体抗菌实验流程示意图；
图4为水凝胶涂层的表面形貌表征，其中A为原始HCF、透明保持器和覆有PMETAC/GelMA水凝胶涂层的HCF、透明保持器的宏观图片，B为原始HCF和水凝胶涂层的表面化学成分的XPS分析，C为流变学分析水凝胶的凝胶化时间，D为原始HCF和水凝胶涂层表面形貌的SEM图像，E为原始HCF和覆有水凝胶涂层的HCF横截面的SEM图像；红色箭头之间为涂层；
图5为水凝胶涂层的表面性能表征，A、B分别为原始HCF和PMETAC/GelMA水凝胶涂层表面的粗糙度Ra及其统计分析，C为HCF和PMETAC/GelMA水凝胶涂层表面的接触角分析，D、E分别为PMETAC/GelMA水凝胶涂层表面的典型摩擦系数曲线和平均摩擦系数；右下角为B、C、E图的图例；*P＜0.05，**P＜0.01，***P<0.001；
图6为水凝胶涂层的溶胀率，A为各水凝胶涂层的溶胀率，B为PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层溶胀后的横截面的SEM图像；红色箭头指向涂层；
图7为水凝胶涂层的粘接强度，A为搭接剪切粘附实验和水凝胶涂层粘接机理示意图；B、C分别为有无二苯甲酮处理的HCF(均经过等离子体处理)与PMETAC/GelMA水凝胶涂层之间粘接强度曲线和最大粘接强度；D、E分别为溶胀24h后，有无二苯甲酮处理的HCF(均经过等离子体处理)与涂层之间粘接强度曲线和最大粘接强度；
图8为水凝胶涂层的机械稳定性测试，A为未经过测试的PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂层的表面SEM图像和EDS图像，B为反复摘戴10次后的PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂层的表面SEM图像和EDS图像，C为流水冲洗1min后的PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂层的表面SEM图像和EDS图像；
图9为水凝胶涂层的化学稳定性测试，A-E分别为水凝胶涂层样本在5种人工唾液中浸泡7天后的降解率，图E右侧为图A-E的图例；F为PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂层在5种人工唾液中浸泡7天后表面存留情况的SEM-EDS图；*P＜0.05，**P＜0.01，***P<0.001；
图10为水凝胶涂层的细胞相容性评估，A为有/无涂层的样本处理1、4、7天后的HGF的活/死细胞染色；活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色；B为CCK-8法检测有/无涂层的样本处理1、4、7天后的HGF细胞的OD450 nm值；*P＜0.05，***P＜0.001；
图11为水凝胶涂层的初期抗S.mutans粘附作用，有/无涂层的样本与S.mutans共同孵育2h和5h后，其表面粘附细菌的活/死细菌染色图像(A)和SEM图像(B)；C为活/死细菌染色图像中，各组表面的活菌的覆盖率；**P＜0.01，***P＜0.001；
图12为水凝胶涂层对游离态S.mutans的抗菌作用，A为水凝胶涂层接触S.mutans24 h后的活菌的菌落图像，B为水凝胶涂层接触S.mutans 24h后的活菌落数的统计分析，C为水凝胶涂层接触S.mutans 24h后的活/死细菌染色图像，D为水凝胶涂层接触S.mutans 24h后的SEM图；**P＜0.01，***P＜0.001；
图13为水凝胶涂层对S.mutans生物膜形成的抑制作用和部分降解后的涂层的抗菌作用；将水凝胶涂层放入S.mutans菌液内24h后，通过激光共聚焦显微镜(A)和SEM(B)检测涂层对S.mutans生物膜形成的抑制作用；C为在含α-唾液淀粉酶的中性人工唾液中浸泡7天后的水凝胶涂层，与S.mutans接触24h后的活/死细菌染色图像；
图14为水凝胶涂层的体内生物相容性，A为透明矫治器覆盖的右上后牙列颊侧的牙龈(左图深蓝色虚线框内视野在右图中被局部放大)和(B)心、肝、脾、肺、肾等重要脏器的H&E染色；
图15为水凝胶涂层体内的抗菌作用，A为透明矫治器右后牙区内侧面的SEM图，B为透明矫治器覆盖的右后牙列的菌斑染色图像，从左至右分别为牙列的腭面和颊面，C为Shannon指数，D为Chao指数，E为PCA分析，F为链球菌属和其他龋病相关菌属(乳杆菌属和放线菌属)的差异性分析；*P＜0.05；
图16为水凝胶涂层的长期抗菌作用和预防牙釉质脱矿的作用，A为实验示意图，B、C分别为有/无涂层的矫治器覆盖人离体牙1天和7天后的牙齿表面菌落计数及PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的杀菌率，D、E分别为有/无涂层的矫治器覆盖人离体牙1天和7天后的磨牙颊侧釉质表面的SEM图和采用EDS检测的Ca/P比的统计分析；*P＜0.05。
具体实施方式
HCF是临床上用的一类热压膜片的总称，是一个临床上应用的商业化产品，可在Erkodent公司、Scheu公司等进行购买得到。以下实施例中采用的HCF材料购自Erkodent公司，其由对苯二甲酸乙二醇酯、乙二醇、醋酸乙烯和乙烯聚合而成。
实施例
实验材料和方法：
1.PMETAC/GelMA水凝胶涂层的制备和表征
1.1PMETAC/GelMA水凝胶前体溶液的制备
称取37.5g明胶加入300mL PBS，搅拌溶解。然后将21.74mL的甲基丙烯酸缓慢逐滴滴加到前述溶液中，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4左右。待完全溶解后，继续反应3h。在反应过程中不断搅拌，并保持溶液pH值为7.4。反应完全后，得到GelMA溶液。随后将冷却至室温的GelMA溶液装入分子量为12000的透析袋中透析3～4天。透析结束后，3500g离心3min，小心吸取上清液至烧杯中。利用旋转蒸发器对GelMA溶液进行浓缩处理，然后将浓缩液放入-80℃冰箱中快速降温结冰后，转移至冷冻干燥机中-50℃处理48h，得到GelMA干粉。将1g GelMA、0.025g LAP加入9mL去离子水中，搅拌均匀后得到GelMA水凝胶前体溶液。在GelMA水凝胶前体溶液中，分别加入1g、2g、3g METAC，搅拌均匀，得到PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)水凝胶前体溶液。
1.2水凝胶涂层的构建
首先分别将厚度为1mm的HCF剪裁成合适大小的样本或者在牙列模型上采用热塑成型制作为透明保持器，以便用于后续实验。随后，用无水乙醇和去离子水分别超声清洗HCF 5min，以去除HCF表面的有机物、油污等。将HCF干燥后，用等离子体进行初步处理3min，使HCF表面接枝羟基。随后将经过初步处理的HCF进一步浸泡在含10％二苯甲酮的异丙醇溶液中5min，再用异丙醇润洗HCF，以去除未与HCF结合的二苯甲酮，之后干燥HCF使其表面的异丙醇挥发。最后将PMETAC/GelMA水凝胶前体溶液涂覆在HCF上，在365nm紫外光灯(6W)下照射2min固化，分别形成GelMA涂层和PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)涂层。
1.3材料表征
1.3.1涂层大体形貌的观察
将HCF裁剪成直径2cm的圆形，将PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂覆在材料表面形成涂层，观察涂层的性状及透明程度，用数码相机拍摄原始HCF和覆有涂层的HCF的照片；将HCF通过热塑成形制备成透明保持器形状，将PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂覆在材料表面形成涂层，观察涂层的性状及透明程度，用数码相机拍摄无涂层和有涂层的保持器的照片。
1.3.2涂层表面的化学元素分析
为了验证涂层是否成功在HCF表面形成，选取PMETAC/GelMA(1/1，质量比)代表PMETAC/GelMA涂层，对原始HCF和GelMA涂层、PMETAC/GelMA涂层的表面进行XPS分析。将原始HCF和覆有水凝胶涂层的HCF，在真空干燥箱中彻底干燥后，利用XPS分析测定无涂层和有涂层HCF表面的元素组成。所有测试结果用C1s(284.8eV)校准，采用CasaXPS软件对测试结果进行分峰拟合分析。
1.3.3涂层的凝胶化时间分析
采用流变仪对在1Hz频率和1％应变下GelMA和PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)水凝胶样本的储能模量(G’)和损耗模量(G”)随时间变化的规律进行分析，以便对水凝胶的凝胶化时间进行量化。
1.3.4涂层的表面形貌和横断面观察
将制备好的原始HCF和4种水凝胶涂层样本(GelMA和PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)水凝胶样本)在-80℃中冷冻过夜，之后在-50℃中冷冻干燥，然后将冻干的HCF和水凝胶涂层样本固定在导电胶上并喷金，采用SEM对样本的表面形貌进行观察。选取PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层，采用SEM对其和原始HCF的横断面形貌进行观察。
1.3.5涂层表面粗糙度观察
准备直径2cm的圆形HCF样本和4种水凝胶涂层样本(GelMA和PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)水凝胶样本)，采用激光扫描显微镜观察其表面粗糙度Ra。每组选取3个样本，每个样本测量表面的平均粗糙度，进行统计分析。
1.3.6涂层的润湿性检测
采用接触角测试仪在室温25℃下测试原始HCF和4种水凝胶涂层样本(2cm×2cm)(GelMA和PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)水凝胶样本)的表面润湿性，测试中的单次去离子水液滴体积为2μL，待液滴在试样表面停止扩散，测量其接触角。每组测量五个样本，每个样本随机选取五个不同位置测试。
1.3.7涂层的摩擦系数评价
使用流变仪测试HCF和4种水凝胶涂层样品(GelMA和PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)水凝胶样本)的摩擦系数。将待测样品安置在流变仪支架上，在0.5N的法向力W下，流变仪驱动半径为R的底板沿一个方向旋转，并记录扭矩T。根据以下公式计算摩擦系数μ：
1.3.8涂层的溶胀性能检测
将预先称重的覆有水凝胶涂层的HCF样本浸入37℃的PBS中，24h后取出样品，并用滤纸吸干多余水分后称重，使用以下公式计算水凝胶涂层的溶胀率：
其中WH是HCF基材的重量，WO是涂层样本浸泡前的总重量，WS是涂层样本浸泡24h后的总重量。
选取浸泡24h后的PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层，对其冷冻干燥、喷金后，采用SEM观察其横断面形貌，以明确涂层是否在溶胀后发生脱落。
1.3.9涂层的稳定性测试
1.3.9.1粘接强度测试
采用搭接剪切粘附实验测试涂层与HCF之间的粘接强度。将HCF制成2cm×4cm的长条状，并将其分成对照组(Plasma)和实验组(Benzophenone)，其中Plasma组仅进行等离子体处理，Benzophenone组进行等离子体和二苯甲酮处理。如图1所示，将两条经过相同处理的HCF重叠放置，使重叠面积为2cm×2cm。选取PMETAC/GelMA(1/1，质量比)进行本测试，在上下两条HCF的重叠区之间滴加20μL该水凝胶的前体溶液，使其均匀铺开在重叠区，经紫外光照射2min后固化，作为一个试样。将试样的上下两端夹持固定在万能力学测试机上，按照5mm/min的速度进行搭接剪切粘附实验，评估水凝胶涂层与基材间的粘接强度。每组测试3个试样。按照前述方法准备同样的试样，将试样在37℃、PBS中溶胀24h后，对样本进行搭接剪切粘附实验，比较Plasma组和Benzophenone组的水凝胶涂层溶胀后与基材间的粘接强度。
1.3.9.2机械稳定性测试
选取PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层进行机械稳定性测试。将涂覆有涂层的样本在牙列模型上反复摘戴10次或用流水冲洗涂层样本1min，以观察涂层是否剥脱。将未进行机械稳定性测试的涂层样本作为对照。之后将涂层样本冷冻干燥、喷金后进行SEM-EDS分析，以评估涂层的机械稳定性。
1.3.9.3化学稳定性测试
将水凝胶涂层样本浸泡在人工唾液中7天以评估其化学稳定性和降解性能。首先向pH 7.0的无菌人工唾液中分别添加适量乙酸、1mol/L的氢氧化钠、溶菌酶和α-唾液淀粉酶，制备无菌pH 4.7和pH 8.7的人工唾液、含700U/mL溶菌酶的中性人工唾液和含有0.29μg/mLα-唾液淀粉酶的中性人工唾液。随后准备直径2cm的GelMA、PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)水凝胶涂层样本，称量其基材HCF的重量WH和制成涂层样本后的初始重量WO，紫外光照射1.5h后，将其分别浸泡在无菌的pH 4.7、pH 7.0、pH 8.7的人工唾液、含溶菌酶的中性人工唾液和含α-唾液淀粉酶的中性人工唾液中，37℃孵育7天后，取出材料，用吸水纸拭干其表面水分后称量其重量WS，按照以下公式计算降解率：
选取在5种人工唾液中浸泡7天后的PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层样本进行冷冻干燥、喷金，然后再进行SEM-EDS分析，观察其表面涂层是否脱落。
2.体外实验检测PMETAC/GelMA水凝胶涂层的细胞生物相容性及抗菌性能
2.1涂层的体外细胞相容性检测
2.1.1细胞分离和培养
实验方案经山东大学口腔医学院医学伦理委员会批准(方案编号：GR20201108)。根据赫尔辛基宣言(第17版)签署书面知情同意书，用于在拔除阻生牙后获取健康牙龈组织。获得患者知情同意后，从三名全身健康患者中采集健康牙龈组织用于人牙龈成纤维细胞的分离。
在运送到实验室之前，将获取的牙龈组织储存在含有5％双抗的DMEM培养基中。简而言之，按照本课题组之前的实验方法，获得了牙龈成纤维细胞的原代单细胞。原代成纤维细胞在含有20％FBS和1％双抗的DMEM中，于37℃恒温培养箱(5％ CO2)中培养，每3天更换一次培养基。细胞生长至80％～90％时，用0.25％胰酶消化传代，将传代的成纤维细胞在含有10％ FBS和1％双抗的DMEM中培养。第4～6代的细胞用于接下来的实验。
2.1.2浸提液的制备
按照ISO 10993-5:2009的标准，将GelMA和PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)水凝胶涂层涂覆的HCF和原始HCF放在紫外光下照射1.5h，以完全培养基(含10％ FBS的DMEM)为浸提介质，按照试样表面积与浸提液体积比为70mm2/mL浸提1、4、7天。在后续实验使用之前用0.22μm的滤器滤菌。
2.1.3活/死细胞染色和CCK-8实验
采用活/死细胞染色和CCK-8法评价涂层的细胞毒性。以每孔1.5×104个细胞的密度或每孔2×103个细胞的密度将HGF接种到24孔板或96孔板上，前者用于活/死细胞染色，后者用于CCK-8检测。之后在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h。随后，用500μL(用于24孔板)或100μL(用于96孔板)浸提液替换掉旧培养基，其中原始HCF的浸提液处理的细胞作为对照组(HCF)。在37℃、5％CO2的培养箱中孵育1、4、7天后，弃掉浸提液。对于24孔板内孵育的细胞按照活/死细胞染色试剂盒的说明进行染色，用荧光显微镜观察细胞并拍照；对于96孔板内孵育的细胞，用100μL含有10％ CCK-8溶液的DMEM培养基于37℃孵育2.5h后，用酶标仪测量450nm处的OD值。
2.2水凝胶涂层的初期抗细菌粘附作用
采用活/死细菌染色和SEM观察评估水凝胶涂层在S.mutans定植初期的抗细菌粘附的作用。将直径为2cm的无涂层和涂有GelMA、PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂层的HCF样本用紫外光照射1.5h，然后将材料取出，放进12孔板中，每孔加入1mL 107CFU/mL的S.mutans菌液，无涂层的HCF处理的细菌作为对照组(HCF)，厌氧条件下37℃培养2h和5h。随后，将材料取出，用无菌生理盐水轻柔冲洗3次，去除未粘附的细菌。按照活/死细菌染色试剂盒的说明，用200μL染料(N01 1:500、PI 1:2000)对材料避光染色15min，然后再用无菌生理盐水洗涤去染料，随后在荧光显微镜下观察拍照，用Image J测量活菌所覆盖的面积并进行统计分析。
按照上述方法，将经过2h和5h孵育的材料取出，用PBS轻柔冲洗材料3次，去除未粘附的细菌，用电镜固定液固定过夜。随后，弃掉电镜固定液，分别用30％、50％、70％、80％、100％的乙醇浸泡10min脱水，然后放进冷冻干燥机中-50℃冻干，喷金后在SEM下观察。
2.3水凝胶涂层对游离S.mutans的抗菌作用
根据日本JIS Z 2801:2000标准，采用薄膜密着法评价水凝胶涂层对游离S.mutans的抗菌作用。在此选择实验室常见的封口膜作为薄膜。将直径为2cm的无涂层的HCF样本和涂有GelMA、PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂层的HCF样本以及相同大小的薄膜用紫外光照射1.5h，然后将各种HCF样本放进12孔板中，其中涂层组样本的涂层面朝上放置。在各样本的上表面滴加20μL 107CFU/mL的S.mutans菌液，再在其上覆盖一片与HCF相同大小的薄膜，以使菌液均匀铺开并防止菌液蒸发而影响细菌活性，无涂层的HCF处理的细菌作为对照组(HCF)，37℃、90％湿度条件下厌氧培养24h。随后将材料取出，用1mL无菌生理盐水将样本和薄膜上的细菌重悬。使用10倍梯度稀释法逐级稀释细菌悬液至10-7倍，然后用排枪吸取5μL原浓度和各稀释倍数(10-1～10-7)对应的菌液，在BHI营养琼脂板上平行滴加两列。将琼脂板在37℃厌氧条件下孵育24h后，拍摄菌落并计数菌落数。
将按照上述方法进行孵育24h的材料取出，用1mL无菌生理盐水将材料和薄膜上的细菌重悬，重悬液转移至1.5mL EP管中，按照活/死细菌染色试剂盒的说明进行染色，并在荧光显微镜下观察拍照。
按照上述方法，将孵育24h的HCF样本取出，用电镜固定液固定、梯度脱水、冻干并喷金后在SEM下观察细菌形态。
2.4水凝胶涂层对S.mutans生物膜形成的抑制作用
采用活/死细菌染色和SEM评估涂层对S.mutans生物膜形成的抑制作用。将直径为2cm、经过紫外线照射1.5h处理的原始HCF和涂有GelMA、PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶涂层的HCF放在12孔板中，涂层组的涂层向上放置。每孔加入1mL 107CFU/mL的S.mutans菌液，无涂层的HCF处理的细菌作为对照组(HCF)。厌氧条件下37℃培养24h。随后将样本取出，用生理盐水轻柔的冲洗其表面3次以去除未粘附的细菌，按照活/死细菌染色试剂盒的说明，用200μL染料(N01 1:500、PI 1:2000)对材料避光染色15min，然后再用无菌生理盐水洗涤去染料，之后在激光共聚焦显微镜下拍照观察生物膜的形成情况。
按照上述步骤，将材料与细菌共同培养24h。之后将材料取出，电镜固定液固定过夜、梯度脱水、冷冻干燥后在SEM下观察生物膜的形成情况。
另外，在“1.3.9.3化学稳定性测试”中检测了涂层在不同条件下孵育7天后的降解情况。为查看部分降解后的涂层是否保持抗菌特性，采用活/死细菌染色方法评估部分降解后的涂层对S.mutans的抗菌作用。选取含有α-唾液淀粉酶的中性人工唾液，测试GelMA和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层在其中降解后的抗菌能力。将在含有α-唾液淀粉酶的无菌中性人工唾液中浸泡7天后的水凝胶涂层样本(直径2cm)取出，紫外线照射1.5h后，将其放进12孔板中，涂层向上放置。每孔加入1mL 107CFU/mL的S.mutans菌液。GelMA涂层样本处理的细菌作为对照组。厌氧条件下37℃培养24h。之后将材料取出，用无菌生理盐水轻柔冲洗3次以去除未粘附的细菌，按照活/死细菌染色试剂盒的说明，用200μL染料(N01 1:500、PI1:2000)对材料避光染色15min，然后再用无菌生理盐水洗涤去染料，之后在荧光显微镜下拍照观察。
3.水凝胶涂层对大鼠口内S.mutans菌斑初期抑制作用、对口腔微生态作用及生物相容性的评估
3.1大鼠口内S.mutans菌斑模型的建立
在体内建立大鼠口内S.mutans菌斑模型，对PMETAC/GelMA水凝胶涂层的体内生物相容性、对口腔微生态的影响和体内对S.mutans的抗菌作用进行评估。在本实施例中，所涉及大鼠的实验均符合国家研究委员会的实验动物护理和使用指南，并经山东大学口腔医院医学伦理委员会批准(No.GD20220341)。本实施例所用大鼠口内S.mutans菌斑模型是结合大鼠正畸牙移动模型和龋病模型模拟正畸的临床实际应用改良而来。将12只7周龄的雄性Wistar大鼠(300～350g)编号并随机分为2组，每组6只，分别为HCF组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层组，其中HCF组作为对照组，每只大鼠的上颌右侧后牙作为待测牙列，上颌其余牙齿用于粘接固位以固定透明矫治器。
3.1.1术前准备
(1)术前准备好术中所需的物品，包括异氟烷、手术器械盒、75％酒精棉球、光固化灯、流体树脂、酸蚀剂和粘接剂等。
(2)在术前4天对大鼠上颌牙列取模制作透明矫治器(图2A、B)。通过吸入氧气和异氟烷的混合物麻醉大鼠并维持麻醉状态(氧流量0.5～0.7L/min，异氟烷浓度为1.5％～2％)，将大鼠固定在手术台上，处于仰卧位，头部朝向手术者。使用自制软毛刷清洁大鼠的上颌牙列后，将硅橡胶注射到大鼠上颌，以制取上颌牙的印模。待硅橡胶凝固后，小心将其取出，流水清洁，然后用超硬石膏灌制模型。待模型干燥变硬后，取出修整外形，采用牙科压膜机对1mm厚度的HCF进行热塑成型，制成牙列的透明矫治器。在PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的透明矫治器右侧后牙面制作水凝胶涂层，HCF组的透明矫治器右侧后牙面无涂层。将两组的透明矫治器进行紫外线照射1.5h备用。
(3)从术前4天开始，每日给大鼠的无菌饮用水中添加1％复方磺胺甲恶唑，以去除口内的内源性链球菌。手术当日准备好所需107CFU/mL S.mutans菌液，并对手术室进行30min紫外线照射消毒。
3.1.2模型建立
(1)通过吸入氧气和异氟烷的混合物麻醉大鼠并维持麻醉状态(氧流量0.5～0.7L/min，异氟烷浓度为1.5％～2％)，将大鼠固定在手术台上，处于仰卧位，头部朝向手术者。
(2)大鼠上颌前牙和左侧后牙用于粘接矫治器进行固位，上颌右侧后牙用作测试牙列，具体粘接方式如图2C所示。在透明矫治器表面制备的涂层干燥后，涂层透明无色且无水光感，肉眼无法区分涂层组和HCF组。根据大鼠的编号，选择其编号对应的矫治器进行粘接。术者首先用自制软毛刷清洁大鼠的上颌牙列，再用酒精棉球清理，然后用干棉球擦干牙列，随后在待粘接的上颌前牙和左侧后牙上涂适量的35％磷酸酸蚀剂，10s后擦除酸蚀剂，再用水冲洗净后，干棉球擦干并在牙面上均匀涂擦粘接剂，紫外光灯照射20s后，在矫治器的前牙和左后牙面处放置流体树脂并将矫治器戴到大鼠口腔中，紫外光灯照射20s固化。
(3)将107CFU/mL S.mutans菌液混合均匀后，吸取20μL注射到每只大鼠的上颌右后牙面与矫治器中间的缝隙里。随后将大鼠放入笼中等待苏醒。
3.1.3术后护理
术后密切关注大鼠的状态，给予大鼠5％的无菌蔗糖水作为营养支持。
3.2样本收集与处理
为避免食物残渣阻塞在牙面和透明矫治器之间影响结果的评估，对佩戴上颌矫治器的大鼠不进行固体饲料的喂养。因此，从动物伦理学角度出发，将该动物实验周期设为24h，且24h已足够形成菌斑生物膜，因此该动物实验主要用于评价涂层的短期抗菌作用。
术后1天将大鼠安乐死，用无菌拭子在每只大鼠右上后牙列的磨牙牙合面均匀涂擦3s以获取牙菌斑，随后将拭子放入无菌EP管中于-80℃保存，用于16s核糖体DNA(ribosomal DNA，rDNA)测序分析；切取大鼠上颌右后牙列颊侧的牙龈和心、肝、脾、肺、肾脏等重要器官，放在4％多聚甲醛中固定保存，用于后续的组织学染色；切取大鼠上颌右后牙列放在4％多聚甲醛中固定保存，该牙列的颊腭面用于牙面菌斑染色；将上颌右后牙面对应的矫治器剪下放置在电镜固定液中保存，用于矫治器表面菌斑的SEM观察。
4.水凝胶涂层在离体牙菌斑模型中的长期抗菌作用和预防釉质脱矿作用的评估
为观察水凝胶涂层的长期抗菌及预防牙釉质脱矿的作用，进一步建立人离体牙S.mutans菌斑模型(图3)，并模拟日常使用情景，检测矫治器在反复摘戴和清洁后其涂层的抗菌效果。具体步骤为：
(1)选取无牙体缺损、表面釉质光滑、矿化良好的磨牙一颗和前磨牙两颗为一组，将其“一”字排开固定在硅橡胶中作为一个样本(图3)，然后对其取模、灌注模型，用1mm厚的HCF在模型上热压成形以制成透明矫治器。
(2)将12个样本分为两组，分别为HCF组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组。HCF组的矫治器不做任何处理，设为对照组；PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组在矫治器内表面涂覆PMETAC/GelMA(1/1，质量比)水凝胶制成涂层。
(3)在离体牙样本高温高压蒸汽灭菌后，将经过紫外线照射1.5h的两种透明矫治器分别戴到对应的离体牙样本上，浸泡在提前准备好的107CFU/mL的S.mutans菌液中，厌氧条件下37℃培养1天和7天。
(4)在培养期间，每天更换一次107CFU/mL的新鲜菌液，并模仿实际戴用情况，将矫治器取下，用5mL无菌生理盐水冲洗一次矫治器和离体牙，再将矫治器戴好放入菌液中。
(5)在1天和7天后，用无菌棉棒在离体牙牙冠表面均匀涂擦1min以提取牙齿表面的细菌，并按照2.3中的方法对细菌进行重悬、梯度稀释和菌落计数，按以下公式计算杀菌率(％)：
其中NH是HCF组的活菌菌落数，NC是涂层组的活菌菌落数。
在1天和7天后，将离体牙样本取出，用切磨机切下样本中磨牙颊面的釉质块，大小为3×3×2mm3，清洗干燥喷金后进行釉质表面的SEM观察，以及EDS元素分析釉质表面的钙/磷比值并进行统计分析。
实验结果：
1.涂层的理化性质
1.1涂层的宏观形貌
如图4A所示，在原始的HCF和已经热塑成形的HCF上均能形成涂层，涂层肉眼观为均匀的无色透明状，不影响HCF的透明美观性。
1.2涂层的表面化学成分分析
通过XPS分析(图4B)，在HCF、GelMA和PMETAC/GelMA中可检测到C、O和N元素，但仅在PMETAC/GelMA中观察到Cl元素的特征峰，分别位于198.7eV(Cl 2p 1/2)和197.1eV(Cl2p 3/2)，表明在HCF表面成功形成了PMETAC/GelMA涂层。
1.3涂层的凝胶化时间分析
采用流变仪对水凝胶的凝胶化时间进行量化(图4C)，在储能模量(G’)超过损耗模量(G”)时，溶液变为凝胶，结果显示GelMA和PMETAC/GelMA水凝胶均能在紫外光照射下1min内G’超过G”，随后进入平台期，表明涂层能够在1min内快速固化，并在凝胶态保持稳定。添加METAC并不影响GelMA水凝胶的凝胶化时间，而且不同比例的PMETAC/GelMA水凝胶之间的凝胶化时间无明显差异。
1.4涂层的表面形貌和横断面形貌
通过SEM观察水凝胶涂层的表面形貌(图4D)，可见HCF表面平整，制备上涂层后，表面光滑平整，未有明显改变。
然后，进一步通过SEM对涂层的横截面进行观察(图4E)。结果显示，HCF表面的涂层连续且厚度均匀，厚度约为40～50μm，与基材之间结合紧密，涂层与基材界面处无孔洞和脱离现象。
1.5涂层的表面粗糙度
利用激光扫描显微镜观察水凝胶涂层的粗糙度(图5A、图5B)，结果显示HCF表面粗糙度约为1.3μm，当在其表面制备GelMA涂层和不同比例的PMETAC/GelMA涂层后，表面粗糙度增加到2.9～3.1μm，各涂层组之间粗糙度没有显著差异。
1.6涂层的润湿性能
通过接触角分析涂层的润湿性(图5C)，结果显示HCF和GelMA涂层的接触角分别为80°和78°，具有亲水性；而PMETAC/GelMA(1/1、2/1、3/1，质量比)涂层的接触角均在10°以下，表面呈超亲水性。
1.7涂层的摩擦性能
采用流变仪对水凝胶涂层的摩擦系数进行评估，结果如图5D、图5E所示，HCF和GelMA的摩擦系数分别约为0.05和0.03；而PMETAC/GelMA的三种水凝胶涂层的摩擦系数显著降低，均小于0.01，其中PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层的摩擦系数最低，约为0.004。
1.8涂层的溶胀性能
进一步对水凝胶涂层的溶胀率进行了评估(图6A)，结果显示GelMA组的溶胀率约为115％；添加METAC后，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的溶胀率最低，约为55％。随后通过SEM对溶胀后PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层的横截面进行观察(图6B)，发现涂层与基材之间结合紧密，其界面处无孔洞和脱离现象。因此，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的溶胀率较低，溶胀后涂层无剥脱，较适用于制备涂层。
1.9涂层的稳定性
1.9.1涂层与基材间的粘接强度
为从微观角度验证水凝胶涂层的稳定性，进行了搭接剪切粘附实验以评价水凝胶涂层与HCF之间的粘接强度。等离子体处理是基材表面处理常用的初步处理方式，因此本实施例仅对比了等离子处理及等离子体+二苯甲酮处理的粘接强度。等离子体处理后涂层与基材之间仅为物理作用，而二苯甲酮则会在涂层基材间形成化学键，理论上其粘接强度更高，而且本实施例也证明了这一点。图7A为搭接剪切粘附实验和水凝胶涂层与HCF之间的粘接原理示意图。HCF表面经疏水性光引发剂二苯甲酮处理后，二苯甲酮可渗透进入HCF表层，作为接枝剂使水凝胶内的聚合物链与HCF基材表层的聚合物链交联在一起，在HCF外表面形成水凝胶-基材聚合物互穿层，从而将水凝胶涂层固定在基材上。仅等离子处理的HCF表面作为对照组(Plasma组)。测试数据(图7B、C)显示在水凝胶涂层溶胀前，Plasma组基材与涂层间的粘接力为195kPa，经等离子体+二苯甲酮处理的HCF表面(Benzophenone组)与涂层间的粘接力显著增强，约为502kPa。当水凝胶涂层溶胀后(图7D、E)，两组基材与涂层间的结合力较溶胀前均有所降低，Benzophenone组表面粘接力约为217kPa，而Plasma组表面粘接力约为104kPa。但无论溶胀前后，Benzophenone组均比Plasma组的粘接强度高出一倍左右。因此，采用二苯甲酮处理材料表面可使涂层与基材间具有更高的粘接强度，涂层具有更好的稳定性。
1.9.2机械稳定性
选取PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层进行机械稳定性测试。如图8A所示，未经过任何测试的PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层表面完好无损；该涂层的化学组成元素C、O、N、Cl均匀分布在表面。将覆有涂层的透明保持器在牙列模型上反复摘戴10次后(图8B)，肉眼未见涂层出现剥脱现象，从SEM图像中亦可见涂层均质完整，无明显脱落；EDS光谱进一步显示4种元素均匀分布在其表面。在用流水冲洗1min后(图8C)，SEM图像显示涂层完整，无明显剥脱；EDS光谱显示C、O、N和Cl等元素均匀分布在基材表面。以上结果证明PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层具有较好的机械稳定性。
1.9.3化学稳定性
为了探究水凝胶涂层的化学稳定性，将水凝胶涂层浸泡在各种人工唾液条件下7天以评估其降解率。如图9A-E所示，在5种人工唾液中浸泡7天后，GelMA涂层降解严重，降解率分别为64％、83％、93％、96％和91％。然而，PMETAC的添加显著降低了涂层的降解率，使PMETAC/GelMA涂层在各种唾液条件下的降解率降至甚至低于50％。此外，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层的SEM图像(图9F)显示，涂层表面仍然相对完整，但个别涂层存在皱褶，可能因涂层部分降解后，冷冻干燥处理导致涂层不均匀皱缩有关。EDS显示PMETAC特征性元素Cl元素依然在基材表面均匀分布，可进一步证实涂层的存在。上述结果表明PMETAC/GelMA涂层在人工唾液中具有相对较低的降解率，可在一周内保持一定的化学稳定性。
2.水凝胶涂层的细胞相容性
采用活/死细胞染色和CCK-8法评估水凝胶涂层的体外细胞相容性。无涂层的HCF处理的细胞作为对照组(HCF)。活/死细胞染色结果(图10A)显示，从第1天到第7天，HCF组、GelMA组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的细胞增殖明显，细胞形态正常，且各组间的细胞密度相似；而PMETAC/GelMA(2/1、3/1，质量比)组的活细胞数量则明显减少，并且在三个时间点均少于HCF组、GelMA组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组。CCK-8结果(图10B)显示，随着时间延长，HCF组、GelMA组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的细胞活力逐渐增加，在第7天时，各组间细胞活力无差异。与这三组相比，PMETAC/GelMA(2/1、3/1，质量比)组的细胞活力显著降低。因此，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组细胞相容性较好。
结合前期理化表征结果，鉴于PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组具有最低的溶胀率、较好的耐降解性以及具有良好的细胞相容性，因此选取PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组进行后续实验。
3.水凝胶涂层的初期抗细菌粘附作用
利用活/死细菌染色和SEM对水凝胶涂层的初期抗S.mutans粘附作用进行评估(图11)。无涂层的HCF处理的细菌设为对照组(HCF)。从图11A看出，在2h和5h，在HCF组和GelMA涂层表面均有较多的活细菌粘附，死细菌较少，而在PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组表面可见活菌数量明显减少，死菌较多。从2h到5h，HCF和GelMA组活细菌大量增殖，而PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的活细菌增殖较少。在图11B中，SEM结果与活/死细菌染色结果相一致，HCF和GelMA表面可见类圆形的簇集的细菌；在PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层表面见少数散在的细菌，其细菌胞膜发生破坏。从图11C的表面活菌覆盖率可以看出，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的活菌覆盖率显著小于其他两组。这表明PMETAC/GelMA(1/1)能够抑制细菌的早期粘附。
4.水凝胶涂层对游离态S.mutans的抗菌作用
通过菌落计数、活/死细菌染色和SEM评估水凝胶涂层对游离态S.mutans的抗菌作用。无涂层的HCF处理的S.mutans作为对照组(HCF)。如图12A、B所示，与HCF组相比，GelMA组表面细菌菌落显著增加，无抗菌作用；而与这两组相比，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组能够显著抑制S.mutans，杀菌率达99.8％。活/死细菌染色结果、SEM结果与菌落计数结果类似。如图12C所示，HCF组和GelMA组的活细菌明显多于PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组；与之相反，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的死细菌数量则明显多于HCF组和GelMA组。从图12D看出，HCF组和GelMA组的细菌形态完整，呈类圆形；PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的细菌形态出现明显变形、胀大。以上结果表明PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组具有良好的杀菌作用。
5.水凝胶涂层对S.mutans生物膜形成的抑制作用
首先，通过激光共聚焦显微镜评估水凝胶涂层对S.mutans生物膜形成的抑制作用。无涂层的HCF处理的生物膜设为对照组(HCF)。在培养24h后，HCF组和GelMA组表面形成了较厚的S.mutans生物膜；而PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组表面的生物膜厚度较前两组薄，且由大量死细菌组成(图13A)。此外，利用SEM进一步评估抗菌涂层对生物膜形成的抑制作用(图13B)。HCF组和GelMA组表面可见大量成团聚集的细菌，胞膜完整，呈类圆形；PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组表面的细菌数量明显减少。上述结果表明PMETAC/GelMA(1/1，质量比)能够抑制S.mutans菌斑生物膜的形成。
将发生部分降解的水凝胶涂层接触细菌24h后，其活/死细菌染色图像结果表明(图13C)，与对照组(GelMA组)相比，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)涂层表面绿色的活菌数量明显减少，主要被大量红色的死菌覆盖，表明部分降解后剩余的PMETAC/GelMA涂层仍然具有抗菌能力。
6.水凝胶涂层的体内生物相容性和预防菌斑形成的作用
建立大鼠口内S.mutans菌斑模型，以评估PMETAC/GelMA水凝胶涂层的体内生物相容性、对口腔微生态的影响和体内对S.mutans的抗菌作用。戴用无涂层矫治器的大鼠设为对照组(HCF)。首先对大鼠牙龈和心、肝、脾、肺、肾脏等重要脏器进行H&E染色，评估水凝胶涂层的体内生物相容性。牙龈组织的H&E染色(图14A)结果显示，HCF组上皮层完整，为复层鳞状上皮，表面角化，上皮钉突较多，伸入固有层中，无炎症或坏死，为正常牙龈上皮表现。PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组上皮的组织学表现与HCF组相类似，无炎症或坏死。重要脏器的H&E染色(图14B)结果显示，与HCF组相比，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的心、肝、脾、肺、肾脏的组织学无明显异常表现。以上结果初步表明，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)具有良好的体内生物相容性。
其次，采用SEM、菌斑染色和16s rDNA分析评估水凝胶涂层对大鼠牙面的抑菌能力和对口腔微生态的影响。SEM(图15A)结果显示在HCF组的表面有大量细菌成簇分布，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组表面细菌数量明显变少。菌斑染色(图15B)结果显示，HCF组牙齿表面菌斑被染成粉红色，在颊腭侧均可见大量菌斑；而在PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组牙齿表面粉色菌斑分布明显少于HCF组。16s rDNA分析主要被用来分析菌斑中的物种多样性以及物种组成。Shannon指数和Chao指数(图15C、D)结果显示，HCF组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组之间并没有显著性差异，表明水凝胶涂层没有影响微生物的菌群多样性和丰富性。PCA分析(图15E)结果显示HCF组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的组内样本差异小，组间差异大，说明数据有效，可以进行后续的分析。从图15F看出，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组链球菌属细菌数量显著少于HCF组；对于口内其他致龋菌属(乳杆菌属和放线菌属)的丰度，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组显著少于HCF组，表明PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组对致龋菌属细菌的早期抑制作用明显。以上结果表明，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)能够抑制大鼠牙面的菌斑形成的同时维持微生态的多样性。需要说明的是，为避免食物残渣阻塞在牙面和透明矫治器之间影响结果的评估，我们对佩戴上颌矫治器的大鼠不进行固体饲料的喂养。因此从动物伦理学角度出发，我们将动物实验周期设为24h，且24h已足够形成菌斑生物膜，因此该动物实验主要用于评价涂层的短期抗菌作用，涂层的长期抗菌作用需要进一步的研究。
7.水凝胶涂层的长期抗菌作用和预防釉质脱矿作用
为评估水凝胶涂层对S.mutans的长期抗菌作用和抑制釉质脱矿的作用，建立人离体牙S.mutans菌斑模型(图16A)，通过菌落计数、SEM和EDS分析反映其预防以S.mutans为主的致龋菌所致龋病的能力。无涂层矫治器处理的离体牙和细菌设为对照组(HCF)。菌落计数(图16B、C)结果显示，与对照组(HCF)相比，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组第1天和第7天的S.mutans菌落数显著减少，杀菌率分别达到93％和83％，表明该涂层能够维持至少7天的抗菌作用。从SEM图(图16D)中看出，第1天HCF组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的釉质表面较光滑，凹坑较少；第7天时，与PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组相比，HCF组釉质表面明显变粗糙，表明HCF组发生了脱矿。采用EDS分析有/无涂层的透明矫治器处理后的牙釉质的钙/磷(Ca/P)比(图16E)，结果显示，第1天时，HCF组和PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的Ca/P比均正常，为1.67；到第7天时，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组的Ca/P比基本不变；而HCF组Ca/P比下降，显著低于PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组。以上结果表明，PMETAC/GelMA(1/1，质量比)组能够发挥长期抗菌作用，并能够抑制牙釉质脱矿。值得注意的是，在实验过程中，为模拟日常戴用情景，对矫治器进行每日摘戴和清洁，因此该结果也证明了涂层能够在经受机械磨损后依然能够发挥抗菌作用。
结论：
本发明在透明矫治器表面成功制备能快速光固化的PMETAC/GelMA水凝胶透明涂层。该涂层厚度均匀，表面超亲水，摩擦系数低，溶胀率低，与基材粘接牢固，机械稳定性好，降解率低，能保持一定的化学稳定性。PMETAC/GelMA水凝胶涂层具有良好的体外和体内生物相容性，通过抑制细菌的初期粘附和杀菌作用抑制生物膜的形成，在不干扰口腔微生态多样性的同时能够降低大鼠口内致龋菌属的丰度，抑制菌斑的形成，并具有较好的长期抗菌效果，可防止牙釉质的脱矿。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂溶于水中，得到甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶前体溶液；向甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶前体溶液中加入2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，搅拌均匀得聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶前体溶液，通过光照引发交联获得所述聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酐化明胶的制备方法为：向明胶溶液中逐滴滴加甲基丙烯酸，并调节pH至7.0～7.5；搅拌反应，反应完毕后得甲基丙烯酸酐化明胶溶液；甲基丙烯酸酐化明胶溶液经透析、离心、浓缩、干燥处理后得到甲基丙烯酸酐化明胶干粉。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述干燥为冷冻干燥；
所述明胶与甲基丙烯酸的用量比为：35～40g：20～25mL。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述光照为紫外光辐照，所述光照波长为350～370nm，辐照时间为1～2min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，甲基丙烯酸酐化明胶与2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的质量比为1：1～3，优选为1：1。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为包括LAP和光引发剂2959中的一种或几种。
7.一种聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶，其特征在于，所述水凝胶采用权利要求1-6任一所述制备方法制得。
8.一种权利要求7所述的聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶在正畸透明矫治装置的表面抗菌涂层中的应用；
优选的，所述应用为：将正畸透明矫治装置表面经等离子处理和二苯甲酮处理后，再在其表面涂刷聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶的前体溶液，光照引发交联，在正畸透明矫治装置的表面制得表面抗菌涂层。
9.一种正畸透明矫治装置的表面抗菌涂层，其特征在于，所述表面抗菌涂层的制备方法包括如下步骤：
清洗正畸透明矫治装置，干燥后对其进行等离子体处理，在正畸透明矫治装置表面接枝羟基；
将经过等离子体处理的正畸透明矫治装置浸泡在二苯甲酮溶液中，干燥；
最后将权利要求7所述的聚2-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵/甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶的前体溶液涂覆在浸泡过二苯甲酮的正畸透明矫治装置，光照引发交联，在正畸透明矫治装置的表面制得表面抗菌涂层；
所述正畸透明矫治装置的材质为HCF材料。
10.一种正畸透明矫治装置，其特征在于，所述正畸透明矫正装置的表面涂覆权利要求9所述的表面抗菌涂层。
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