CN117586235A - 增强线粒体自噬的嵌合分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增强线粒体自噬的嵌合分子，在低浓度下能够有效地增强线粒体自噬，修复线粒体损伤从而增强线粒体功能，并在多种细胞中以及动物体内进行了验证，本发明的嵌合分子在预防或治疗线粒体功能障碍的疾病中具有广泛的应用价值。

Description

增强线粒体自噬的嵌合分子及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别是涉及一种增强线粒体自噬的嵌合分子及其应用。

背景技术

线粒体是细胞中最重要的细胞器之一，通过氧化磷酸化为细胞提供能量分子(ATP)，并在细胞代谢、生长、凋亡等多个细胞生物学过程中起关键作用。

线粒体在行使功能过程中会不断产生自由基，形成对线粒体的损伤，而衰老、应激等因素则加剧线粒体损伤，导致线粒体功能障碍。

线粒体功能障碍促进多种人类重大疾病的发生发展，如老年痴呆、帕金森、渐冻症、心血管疾病、肥胖、糖尿病、肝肾肺等组织纤维化、痛风、癌症等。

线粒体自噬是细胞中正常存在的清除损伤线粒体的机制，在这个过程中损伤线粒体被选择性地包裹进入自噬体，之后与溶酶体融合后通过水解酶的作用降解。线粒体自噬是一种细胞保护机制，可清除多余或功能失调的线粒体，维持健康线粒体数量以平衡细胞内稳态。越来越多的证据表明，线粒体自噬在维持线粒体网络的健康中起着重要作用，线粒体自噬异常及不足与线粒体功能障碍密切相关，增强细胞的线粒体自噬水平可望为这些疾病的治疗提供新方法新策略。

目前已报道数个天然产物分子及合成小分子，如Urolithin-A，UMI-77，Kaempferol以及Rhapontigenin等，均能诱导线粒体自噬，增强细胞清除损伤线粒体的能力并在老年痴呆等动物疾病模型中起到一定疗效，但这些分子调控线粒体自噬的特异性不高，它们在影响线粒体自噬的同时很可能还会影响其它信号通路或生物学过程，另外它们诱导线粒体自噬所需的浓度均在微摩尔水平或更高，作为新药开发的前景有限。能在低浓度特异性增强细胞线粒体自噬水平的小分子是目前急需但尚未满足的市场需求。

蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis targeting chimeras，PROTAC)是一种新型靶向蛋白降解技术。传统的PROTAC分子通过蛋白酶体途径起作用，由于蛋白酶体的孔径有限，只能降解较小尺度的靶标如蛋白质分子，但无法降解包括线粒体在内的细胞器，因此传统的PROTAC分子无法实现增强线粒体自噬水平的目的。

目前亦报道了数种在PROTAC基础上发展的利用自噬途径而非蛋白酶体途径降解靶蛋白的嵌合型小分子，如ATTEC、AUTAC、AUTOTAC等。ATTEC和AUTOTAC能降解靶蛋白及脂滴(Lipid Droplet)，但尚未有降解受损线粒体的报道。

2019年发表在Molecular Cell杂志上的一篇论文(Takahashi，D.；Moriyama，J.；Nakamura，T.；Miki，E.；Takahashi，E.；Sato，A.；Akaike，T.；Itto-Nakama，K.；Arimoto，H.AUTACs：Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy.Mol.Cell 2019，76(5)，797，DOI：10.1016/j.molcel.2019.09.009)中，日本科学家设计合成了AUTAC4嵌合型小分子，可以降解损伤线粒体。AUTAC4导致线粒体产生K63泛素化，但机制不明，是否通过招募某个E3连接酶发挥作用不详，此外AUTAC4在细胞中降解受损线粒体需要10微摩尔浓度，动物体内是否有效尚未测试，临床应用前景存疑。

细胞中目前已知的线粒体自噬有泛素化依赖和泛素化不依赖两种模式，其中Pink1/Parkin介导的泛素化依赖型线粒体自噬研究的最为透彻。在无线粒体损伤的健康细胞中，起“哨兵”作用的Pink1来到线粒体外膜后会迅速进入线粒体并被降解，无法在线粒体外膜停留。而当线粒体发生损伤时其膜电势丧失，此时Pink1滞留在线粒体外膜，磷酸化靠近线粒体外膜预先存在的泛素分子(Ub)，然后结合Parkin并导致Parkin被磷酸化。磷酸化和活化的Parkin使线粒体外膜上的许多蛋白发生K63泛素化，通过选择性自噬受体蛋白(目前已知的有p62、NBR1、OPTN、NDP52以及TAX1BP1等)同时结合泛素和LC3蛋白的作用招募自噬体到损伤线粒体，驱动线粒体自噬的下游过程。

除了Pink1/Parkin，也有其它E3连接酶介导的线粒体外膜蛋白泛素化驱动线粒体自噬的报道，比如线粒体E3连接酶MARCH5直接与FUNDC1相互作用，介导其在赖氨酸119位点的泛素化，随后降解FUNDC1从而调节缺氧诱导的线粒体自噬。

因此，一种显而易见的设想是设计一个一端结合某个线粒体外膜蛋白的PROTAC分子，它的另一端招募某个特定E3连接酶到线粒体外膜靶蛋白后模拟激活后Parkin的作用，强制性地导致线粒体外膜蛋白的泛素化，增强线粒体自噬。然而，到目前为止，尚未有能有效降解损伤线粒体的PROTAC分子问世。事实上，日本科学家在2019年发表的《MolecularCell》论文中尝试了这个设想，合成了一端结合CRBN(一种PROTAC分子最常采用的E3连接酶之一)另一端结合外源表达的线粒体外膜蛋白mito-EGFP-HT的嵌合型分子。该分子成功地将CRBN带到线粒体外膜并引发mito-EGFP-HT的K48泛素化，但无法降解受损线粒体。

有望增强线粒体自噬嵌合型小分子的技术瓶颈在于E3连接酶，找到能有效模拟激活之后的Parkin的E3连接酶是关键。人体中有近600个E3连接酶，提供了巨大可能性。

综上所述，基于PROTAC设计，通过招募特定E3连接酶到线粒体，驱动线粒体外膜蛋白泛素化(特别是K63泛素化)进而增强线粒体自噬的嵌合型小分子，理论上可行但尚未有成功案例。

发明内容

为了克服现有技术存在的问题，经研究，本发明提供如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种增强线粒体自噬的嵌合分子，所述嵌合分子的结构如式1所示：

M-L-O

式1

其中，M表示MAP3K1的配体，L表示连接链，O表示线粒体外膜蛋白的配体；

M的结构式包括：

L为烷氧基类链，包括：-(CH₂CH₂O)_a-、-(CH₂CH₂CH₂O)_b-，其中a、b分别为大于等于1的自然数。

优选地，所述线粒体外膜蛋白包括TSPO、VDAC。

优选地，所述O的结构式包括：

其中，X为卤素。

优选地，所述X选自氟、氯、溴、碘中的至少一种。

优选地，所述嵌合分子的结构式如式2或式3所示：

其中，n为1-10的自然数；X¹为卤素；

其中，m为1-10的自然数；X²、X³、X⁴均为卤素。

更优选地，n为1-5的自然数。

更优选地，m为1-5的自然数。

优选地，所述嵌合分子选自：

本发明的第二方面提供了一种药物组合物，包括以上所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，以及任选的药用辅料。

本发明的第三方面提供了以上所述的增强线粒体自噬的嵌合分子、药物组合物在制备预防或治疗线粒体功能障碍的疾病的药物中的应用。

优选地，所述线粒体功能障碍的疾病包括老年痴呆、帕金森、渐冻症、心血管疾病、肥胖、糖尿病、癌症、肝肾肺等组织纤维化、痛风、自身免疫性或炎症性疾病、病毒性感染。

本发明的有益效果至少包括：

本发明首次披露了一种基于PROTAC设计的能有效增强线粒体自噬的嵌合分子(Mitophagy-Enhancing Chimera，简称MEC)，在低浓度(10至100纳摩尔浓度)下能够有效地增强线粒体自噬，修复线粒体损伤从而增强线粒体功能，并在多种细胞中以及动物体内进行了验证，从而填补了该领域的一大空白。本发明的嵌合分子在预防或治疗线粒体功能障碍的疾病中具有广泛的应用价值。

本发明的特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1显示本发明的MEC嵌合分子的结构示意图。

图2显示本发明的MEC嵌合分子的作用机制示意图。

图3显示本发明MAP3K1(人类)的基本结构图。

图4显示在CCCP损伤的HeLa细胞中不同MEC小分子对线粒体膜电势的恢复作用。

图5显示在Aβ损伤的SN4741细胞中MEC1和MEC7嵌合分子对线粒体膜电势的恢复作用。

图6显示采用TMRE的方法检测CCCP损伤的SH-SY5Y细胞中几种MEC小分子对线粒体膜电势的恢复作用。

图7显示采用JC-1检测CCCP损伤的SH-SY5Y细胞中MEC1和MEC7对线粒体膜电势的恢复功能。

图8显示血管紧张素II损伤的血管平滑肌细胞中不同MEC小分子以及AUTAC4对线粒体膜电势的恢复作用。

图9显示在未损伤的Hela细胞中MEC1小分子不影响线粒体膜电势。

图10显示在未损伤的SH-SY5Y细胞中MEC1小分子不影响线粒体膜电势。

图11显示在未损伤的Hela细胞中MEC1小分子不影响线粒体ROS。

图12显示在未损伤的Hela细胞中MEC1小分子不影响ATP产生能力。

图13显示在未损伤的Hela细胞中MEC1小分子不影响细胞活力。

图14显示在CCCP损伤的HeLa细胞中MEC1小分子恢复线粒体膜电势的剂量依赖性以及“Hook”效应。

图15显示在CCCP或者OA损伤的SN4741细胞中MEC1小分子以剂量依赖方式恢复线粒体膜电势。

图16显示在CCCP损伤的SH-SY5Y细胞中MEC1小分子以剂量依赖方式恢复线粒体膜电势。

图17显示在未损伤以及CCCP损伤的AML-12细胞中MEC1对线粒体膜电势的不同影响。

图18显示在CCCP损伤的HEK293T细胞中MEC1小分子恢复线粒体膜电势的剂量依赖性以及“Hook”效应。

图19显示在CCCP损伤的Hela细胞中MEC1小分子以剂量依赖方式降低整体ROS和线粒体ROS水平。

图20显示在CCCP损伤的SH-SY5Y细胞中MEC1小分子以剂量依赖方式降低整体ROS水平。

图21显示在Aβ损伤的SN4741细胞中MEC1小分子降低线粒体ROS水平的作用。

图22显示在CCCP损伤的Hela细胞中MEC1小分子以剂量依赖方式恢复细胞产生ATP的能力。

图23显示在CCCP损伤的Hela细胞中MEC1小分子以剂量依赖方式提高细胞活力的作用以及“Hook”效应。

图24显示在无损伤Hela细胞中MEC1小分子不降解线粒体内膜和外膜蛋白也不改变自噬水平。

图25显示在CCCP损伤的Hela细胞中MEC1小分子通过自噬而非蛋白酶体途径降解线粒体内膜和外膜蛋白。

图26显示MEC1在未损伤的SH-SY5Y细胞中不影响线粒体蛋白水平，但在CCCP损伤的细胞中以浓度依赖方式降解线粒体内膜和外膜蛋白。

图27显示MEC1在HeLa细胞中进一步增强CCCP诱导的细胞自噬。

图28显示在CCCP损伤的Hela细胞中MEC1小分子修复线粒体膜电势以及降低线粒体ROS水平的作用能够被自噬抑制剂阻断。

图29显示在ATG5敲除的Hela细胞中MEC1丧失修复损伤线粒体的作用，包括对线粒体膜电势、整体ROS、线粒体ROS以及ATP产生能力的作用均丧失。

图30通过线粒体和自噬体荧光共定位显示MEC1在未损伤的Hela细胞中不诱导线粒体自噬，但在CCCP损伤的Hela细胞中增强线粒体自噬水平。

图31通过MitoKeima荧光变化显示在CCCP损伤的Hela细胞中以剂量依赖方式增强线粒体自噬水平。

图32采用Mtphagy Dye的方法显示MEC1在未损伤的Hela细胞中不诱导线粒体自噬，但在CCCP损伤的Hela细胞中以剂量依赖方式增强线粒体自噬水平且表现出“Hook”效应。

图33通过Thermal ShiftAssay显示MEC1与细胞中的TSPO蛋白具有相互作用能力。

图34通过Thermal Shift Assay显示MEC1与细胞中表达的Flag-MAP3K1以及外源表达纯化的His-MAP3K1-CTD蛋白具有相互作用能力。

图35显示MEC1能同时和表达纯化的GST-TSPO以及His-MAP3K1-CTD相互作用并形成三联体。

图36采用PLA方法显示HeLa细胞中MEC1招募MAP3K1到TSPO的时间效应。

图37通过提取线粒体的方法显示HeLa细胞中MEC1增强线粒体的K63泛素化。

图38通过外转带HA标签的泛素和免疫共沉淀(co-IP)的方法显示MEC1增强TSPO和VDAC的K63泛素化。

图39显示在MAP3K1敲除的Hela细胞中MAP3K1蛋白不表达。

图40显示在MAP3K1敲除的Hela细胞中MEC1丧失修复损伤线粒体的作用，包括对线粒体膜电势、整体ROS、线粒体ROS以及细胞活力的作用均丧失。

图41显示在MAP3K1敲除的Hela细胞中外转表达带Flag标签的MAP3K1蛋白后MEC1修复损伤线粒体的作用恢复。

图42显示在MAP3K1敲除的Hela细胞中MEC1增强线粒体K63泛素化的作用丧失。

图43显示在MAP3K1敲除的Hela细胞中MEC1在CCCP损伤情况下降解TSPO和TIM23的作用丧失。

图44显示TSPO敲除的Hela细胞中无TSPO蛋白表达。

图45显示在TSPO敲除的Hela细胞中MEC1恢复损伤线粒体膜电势的作用丧失，但MEC7的作用不受影响。

图46显示在TSPO敲除的Hela细胞中MEC1恢复损伤线粒体ATP产生能力以及降低整体ROS水平的作用丧失。

图47显示在TSPO敲除的Hela细胞中外转表达带Myc标签的TSPO蛋白。

图48显示在TSPO敲除的Hela细胞中外转表达带Myc标签的TSPO蛋白后MEC1修复损伤线粒体的作用得到恢复。

图49显示在HeLa细胞中敲低NBR1导致MEC1修复损伤线粒体的作用丧失，证明NBR1是MEC1增强线粒体自噬的关键选择性自噬受体蛋白。

图50显示Nur77只有在线粒体损伤情形下被MEC1高效招募到线粒体外膜，且Nur77敲低导致MEC1修复损伤线粒体的功能丧失，证明Nur77是决定MEC1选择性降解损伤线粒体但不降解正常线粒体的关键因素。

图51显示MEC1小分子本身不影响巨噬细胞的细胞活力。

图52通过检测LDH释放显示MEC1小分子本身不诱发巨噬细胞死亡。

图53显示MEC1小分子本身对巨噬细胞基础自噬水平无影响。

图54显示MEC1在NLRP3炎症小体活化的巨噬细胞中提高线粒体自噬水平。

图55显示MEC1在野生型巨噬细胞中以浓度依赖方式抑制NLRP3炎症小体活化引发的IL-1β释放，但不影响与NLRP3炎症小体活化无关的TNF-α释放。

图56显示MEC1在野生型巨噬细胞中以浓度依赖方式抑制NLRP3炎症小体活化引发的LDH释放和Gasdermin D剪切。

图57显示MEC1在CAPS突变的巨噬细胞中以浓度依赖方式抑制NLRP3炎症小体活化引发的IL-1β释放、线粒体ROS产生以及Gasdermin D剪切。

图58显示尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体活化导致巨噬细胞线粒体膜电势丧失，而MEC1恢复线粒体膜电位。

图59显示尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体活化导致巨噬细胞中ROS以及线粒体ROS水平大大增加，而MEC1浓度依赖地降低细胞的整体ROS以及线粒体ROS水平。

图60显示MEC1浓度依赖地修复NLRP3炎症小体活化导致的溶酶体损伤。

图61显示MEC1在NLRP3炎症小体活化的巨噬细胞中抑制IL-1β释放以及降解线粒体内外膜蛋白的作用能被自噬抑制剂阻断。

图62显示MEC1在NLRP3炎症小体活化的巨噬细胞中抑制IL-1β释放以及降解线粒体内外膜蛋白的作用不能被蛋白酶体抑制剂阻断。

图63显示MEC1对于NLRP3炎症小体活化导致的线粒体ROS水平和整体ROS水平升高的抑制作用能够被自噬抑制剂阻断。

图64显示MEC1在MSU和Alum小鼠模型中显著抑制NLRP3炎症小体活化。

图65显示MEC1在LPS+D-Gal小鼠模型中显著抑制NLRP3炎症小体活化引发的急性肝损伤。

图66显示在高脂喂养的肥胖模型中MEC1显著减缓小鼠的体重增加。

图67显示高脂喂养导致小鼠的氧气消耗和二氧化碳产生能力大幅度下降，而MEC1给药在相当程度上恢复高脂喂养小鼠的氧气消耗和二氧化碳产生能力。

图68显示高脂喂养小鼠的葡萄糖耐受下降，而MEC1给药显著提升高脂喂养小鼠的葡萄糖耐受能力。

图69显示MEC1给药显著减少高脂喂养小鼠的腹部白色脂肪、附睾白色脂肪以及棕色脂肪的重量。

图70显示高脂喂养导致小鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆固醇、甘油三酯以及LDL-C水平升高，而MEC1给药显著降低这些指标。

图71显示高脂喂养小鼠的肝脏组织细胞中有空泡以及脂肪组织中脂滴增大，而MEC1给药后肝脏细胞中的空泡减少，脂肪组织中脂滴变小。

图72显示高脂喂养小鼠的肝脏细胞和脂肪细胞中线粒体形态异常，而MEC1治疗后线粒体形态有所恢复。

图73通过RNA测序和基因集的富集评分分析显示高脂喂养小鼠中脂质合成相关基因的表达水平显著增高，而MEC1给药后这些基因的表达下调。

图74显示转录组测序结果中线粒体自噬相关基因的表达情况，相当一部分线粒体自噬相关基因在MEC1给药后表达水平上调。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。在本申请的描述中，除非另有说明，“多个/多种”等类似用词的含义是两个/种以上。

【术语说明】

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本领域普通技术人员通常理解的含义。

如本文所用，在提到具体的数值时，意指该数值可以在不多于5％的范围内变动。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。

在本发明中，小分子是指分子量在2000以下的分子。

本发明的第一方面提供了一种增强线粒体自噬的嵌合分子。

本发明所披露的MEC(Mitophagy-Enhancing Chimera)嵌合分子，也可称为MEC小分子，由三部分组成，分别是结合E3连接酶MAP3K1的小分子(MAP3K1 ligand)，结合一种线粒体外膜蛋白的小分子(OMM ligand)，以及中间的连接分子(Linker)，图形示意如图1，应注意的是，图1中的图形只是为了区分，并不能限定各部分的分子结构。

本发明的嵌合分子的结构式如式1所示：

M-L-O

式1

其中，M表示MAP3K1的配体，L表示连接链，O表示线粒体外膜蛋白的配体。

MEC的作用模式如图2所示，借助于该嵌合分子同时结合MAP3K1和线粒体外膜蛋白的能力，MEC招募MAP3K1到线粒体外膜，通过MAP3K1的E3连接酶活性导致线粒体外膜蛋白(包括TSPO、VDAC或其它线粒体外膜蛋白)发生K63泛素化。如果线粒体没有损伤，膜电势正常，Nut77(一种主要定位在细胞核中的孤儿受体蛋白)滞留在细胞核中无法到达线粒体，此时线粒体外膜蛋白的K63泛素化不引发后续的线粒体自噬过程。然而，线粒体损伤会诱导Nut77出核，在MEC1引发的线粒体外膜蛋白K63泛素化前提下被大量招募到受损的线粒体外膜，之后与选择性自噬受体蛋白NBR1联合作用招募自噬体，逐渐延伸的自噬体将损伤线粒体包裹，与溶酶体融合后通过溶酶体内水解酶的作用完成对受损线粒体的降解。外膜蛋白泛素化的过程完成后，MEC分子(或者是MEC分子与MAP3K1的结合体)可以从TSPO靶蛋白上解离，结合到下一个线粒体的TSPO分子上重复起作用，循环降解更多损伤线粒体，从而产生PROTAC标志式的“催化”模式效应。

本发明披露的MEC分子有两大特点至关重要。首先，尽管MEC通过MAP3K1的作用在损伤和非损伤线粒体外膜上均产生K63泛素化，但只有损伤线粒体会招募自噬体并导致降解，而非损伤线粒体不会招募自噬体，也不会被降解。此外，与上面结果相吻合，MEC仅在线粒体有损伤的细胞中提高线粒体自噬水平，清除受损线粒体，从而修复线粒体功能，但在线粒体无损伤的细胞中不改变线粒体自噬水平，对正常线粒体无降解作用。人体细胞在受到线粒体损伤时会启动天然存在的线粒体自噬过程(如广为研究的Pink1/Parkin介导的线粒体自噬)，MEC通过在损伤线粒体的外膜增加K63泛素化的方式增强这个过程。众所周知，自噬(包括线粒体自噬)是一把双刃剑，在疾病的预防或治疗中可能产生有益的生物学效应同时也可能带来生物安全性隐患。仅在线粒体有损伤的细胞中提高线粒体自噬水平以及选择性清除受损线粒体这两点赋予了MEC分子高度的生物安全性，大大有助于MEC分子的临床应用。

MEC分子的设计中另外两点考虑也很关键。一方面，所选定的E3连接酶在被招募到线粒体外膜上的靶蛋白后必须要能快速高效地导致靶蛋白本身或者与其相邻的其它线粒体外膜蛋白的泛素化，且最好是K63泛素化，从而驱动后续由选择性自噬受体蛋白介导的线粒体自噬。另一方面，本发明的目的是降解线粒体而不是靶蛋白，E3连接酶在被MEC分子招募到线粒体外膜上的靶蛋白后最好不会导致靶蛋白快速通过蛋白酶体降解，从而有足够时间催化包括靶蛋白在内的线粒体外膜蛋白的泛素化。也就是说，本发明理想的MEC分子应具备优秀的PROTAC分子必须具备的高效结合靶蛋白和E3连接酶形成三联体的能力以及所招募的E3连接酶必须处在活化状态从而具备催化临近蛋白泛素化的能力，但在驱动蛋白酶体介导的靶蛋白降解上有缺陷(因而是不典型的PROTAC分子)。

MEC技术的关键，亦是其瓶颈，是找到合适的能有效驱动线粒体自噬的E3连接酶。目前尚无有效的预测工具或方法，只能通过实验验证。在人类细胞中含有的600种E3连接酶中，相当一大部分目前尚无合适的能用于构建MEC的结合小分子，使得实验测试困难重重。

本发明的主要突破是创造性地发现了适合的E3连接酶，即MAP3K1，在被招募到线粒体外膜后能导致线粒体外膜蛋白的K63泛素化并驱动泛素化依赖的线粒体自噬，从而降解损伤线粒体。在本发明实施例中测试的三种E3连接酶(CRBN，APC^CDC20以及MAP3K1)中，仅MAP3K1具备增强线粒体自噬的效果，其它两种E3连接酶无效。

E3连接酶MAP3K1的基本结构如图3所示，MAP3K1不仅具有泛素连接酶结构域(433-492)，同时还具有蛋白激酶结构域(1243-1508)，这是其与众多其它E3连接酶相比最大的不同点。

本发明实施的一个关键点是采用合适的结合MAP3K1的小分子(对应结构式中的M，也就是MAP3K1的配体)。理想的小分子具有高度的特异性(仅结合MAP3K1而不结合细胞中其它蛋白)，具备尽量高的结合常数(与MAP3K1结合后不容易解离)，且不会抑制MAP3K1的E3连接酶活性。

能够结合MAP3K1的小分子包括IKAM-1、SM1-71等，其中优选IKAM-1(1-(3-bromo-4-fluorophenyl)-3-(3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)quinoxalin-6-yl)urea))：

IKAM-1是MAP3K1激酶功能的抑制剂，它通过与MAP3K1蛋白C端的蛋白激酶结构域直接相互作用，从而将MAP3K1招募到线粒体外膜上发挥其E3连接酶活性。然而，结合MAP3K1激酶结构域或者抑制MAP3K1激酶活性的能力并非本发明实施的必要条件，也就是说并不能作为本发明的限制。能够结合其它MAP3K1部位的小分子，只要不抑制MAP3K1的E3连接酶活性，均可以用于本发明的实施。

相应地，M的结构式包括：

在一些优选的实施方案中，所述X选自氟、氯、溴、碘中的至少一种。

连接分子(Linker)对MEC的作用至关重要，PROTAC技术常规采用的优化方法及策略均可用于MEC的连接分子的优化。

本发明中采用烷烯基醇类作为连接分子。优选地，以Ethylene Glycol(EG)作为连接分子，包括EG2、EG4等，优选EG4。

相应地，在嵌合分子中的L为烷氧基类基团，包括：-(CH₂CH₂O)_a-、-(CH₂CH₂CH₂O)_b-，其中a、b分别为大于等于1的自然数。在一些优选的实施方案中，a为1-10的自然数。在一些优选的实施方案中，b为1-10的自然数。在一些更优选的实施方案中，所述a为1-5的自然数。在一些更优选的实施方案中，b为1-5的自然数。

本发明的线粒体外膜蛋白可以在宽的范围内选择，满足下列两个条件的线粒体外膜蛋白均可以成为本发明实施的靶蛋白：特异性表达在线粒体外膜(细胞中其它部位不表达)以及在线粒体外膜上的丰度较高。本发明优选的线粒体外膜蛋白包括TSPO和VDAC，其它线粒体外膜蛋白诸如TOM20、Miro1，MFN 1/2，Fis1等均能满足本发明的要求。

在一些优选的实施方案中，所述线粒体外膜蛋白包括TSPO、VDAC。

相应在嵌合分子中，O的结构可以在宽的范围内选择，只要具备结合线粒体外膜蛋白(包括TSPO、VDAC)的能力均可用于本发明的实施。

在一些优选的实施方案中，理想的结合TSPO或VDAC的小分子具备高度的特异性(仅结合TSPO或VDAC而不结合细胞中其它蛋白)，具备中到高的结合常数，但并非结合能力越高越好。事实上，在保证小分子结合TSPO或VDAC之后能高效产生MAP3K1介导的TSPO或VDAC(以及其它相邻的线粒体外膜蛋白)K63泛素化这个前提上，相对较低的结合能力或许具有优势，更容易让携载了MAP3K1的MEC小分子在完成对线粒体外膜蛋白的泛素化作用之后从靶蛋白上脱落，进而结合新一个TSPO或VDAC分子驱动下一轮泛素化，实现PROTAC分子特征性的“催化”功能。此外，理想的MEC小分子在增强线粒体自噬的有效浓度下最好不影响TSPO或VDAC正常的生物学功能。

多种能结合TSPO的小分子已被报道，包括天然TSPO配体如胆固醇和卟啉类化合物，各种合成分子诸如2-苯基吲哚-3-乙醛酰胺(2-phenylindole-3-glyoxyamides)、PK-11195、苯二氮类化合物(比如Ro5-4864和AHN-086)，咪唑并吡啶类化合物(比如alpidem)、吲哚衍生物、(比如FGiN-1-27和SSr180575)、pyrrolobenzoxazepines、phenoxyphenylacetamide衍生物(比如DAA1106和Pbr28)，Isoquinoline carboxamide和Quinoline carboxamide等，均可用于本发明的实施，其中优选2-苯基吲哚-3-乙醛酰胺：

与TSPO的情况类似，多种小分子可用于结合VDAC，包括VBIT-4、VBIT-12、NSC15364、4,4′-diisothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonate(DIDS)等，其中优选VBIT-4：

优选地，所述O的结构式包括：

/>

其中，X为卤素。

在一些优选的实施方案中，所述X选自氟、氯、溴、碘中的至少一种。

在一些优选的实施方案中，本发明的嵌合分子的结构式如式2或式3所示：

其中，n为1-10的自然数；X¹为卤素；

在一些更优选的实施方案中，X¹选自氟、氯、溴、碘中的至少一种。X¹最优选为溴。

其中，m为1-10的自然数；X²、X³、X⁴均为卤素。

在一些更优选的实施方案中，X²、X³、X⁴分别选自氟、氯、溴、碘中的至少一种。

在一些进一步优选的实施方案中，X²为溴，X³为氯，X⁴为氟。

在一些更优选的实施方案中，n为1-5的自然数。

在一些更优选的实施方案中，m为1-5的自然数。

在一些优选的实施方案中，所述嵌合分子选自：

需要注意的是，下面制备方法中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，均可通过市售获得。

本发明的第二方面提供了一种药物组合物，包括以上所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，以及任选的药用辅料。

在本发明中，“药用辅料”包括但不限于任何被相关的政府管理部门许可为可接受供人类或家畜等动物使用的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、增甜剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、矫味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

本发明所述的MEC分子或药物组合物在各种各样的人类和动物细胞中均能通过驱动线粒体自噬而清除损伤线粒体进而修复线粒体功能，有望用于多种与线粒体自噬功能障碍相关的重大疾病的预防和治疗，包括老年痴呆、帕金森、渐冻症、心血管疾病、肥胖、糖尿病、癌症、肝肾肺等组织纤维化、痛风、自身免疫性或炎症性疾病、病毒性感染等。

在本发明中，“药物组合物”是指本发明化合物与本领域通常接受的用于将生物活性化合物输送至动物(包括人类和家畜等)的介质的制剂。该介质包括药学上可接受的载体。药物组合物的目的是促进生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本文所用术语“药用”是指不影响本发明化合物的生物活性或性质的物质(如载体或稀释剂)，并且相对无毒，即该物质可施用于个体而不造成不良的生物反应或以不良方式与组合物中包含的任意组分相互作用。

本发明的MEC分子可制备成各种药物剂型，通过口服、注射、透皮、吸入、粘膜等各种方式给药。

本文所使用术语“有效量”、“治疗有效量”或“有效给药量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种药剂或化合物的量。其结果可以为迹象、症状或病因的消减和/或缓解，或生物系统的任何其它所需变化。例如，用于治疗的“有效量”是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本文公开化合物的组合物的量。可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量。

本发明的MEC分子以浓度依赖的方式修复损伤线粒体，细胞实验的有效作用浓度范围为100皮摩尔到10微摩尔，优选浓度范围为1纳摩尔到1微摩尔，最优选范围为10到200纳摩尔。动物实验中有效给药剂量范围为0.2微克/千克(动物体重)到20毫克/千克，优选浓度范围为2微克/千克到5毫克/千克，最优选范围为20微克/千克到2毫克/千克。

和许多用于降解靶蛋白的PROTAC相似，MEC分子修复损伤线粒体的作用呈现“Hook”效应，即在低浓度区间修复损伤线粒体的作用随着MEC分子浓度的增加而增强，但在达到一定浓度值(细胞实验中对于MEC1分子来说这个值是1微摩尔)之后修复损伤线粒体的作用反而随着MEC分子浓度的增加而减弱。一种合理的解释是MEC分子需要同时结合MAP3K1和TSPO形成三联体才能起到驱动线粒体自噬的作用，细胞中的MAP3K1和TSPO蛋白分子数量均有限，在MEC分子为低浓度时MAP3K1和TSPO分子数目过量，绝大部分MEC分子均能同时结合MAP3K1和TSPO，这时MEC分子浓度的增加会导致驱动线粒体自噬的作用呈线性增加。但当MEC浓度达到一定值时，MEC分子数目过量，导致仅结合了MAP3K1或仅结合了TSPO的无法驱动线粒体自噬的二联体形成并降低三联体形成的可能性。过量的MEC分子越多，形成有效三联体的可能性越低。这个结果提示MEC分子的使用剂量将是实际应用中一个重要问题，必须确保MEC分子的使用剂量处在产生“Hook”效应所需的浓度之下。

本发明的第三方面提供了以上所述的增强线粒体自噬的嵌合分子、药物组合物在制备预防或治疗线粒体自噬功能障碍的疾病的药物中的应用。

在一些优选的实施方案中，所述线粒体自噬功能障碍的疾病包括老年痴呆、帕金森、渐冻症、心血管疾病、肥胖、糖尿病、癌症、肝肾肺等组织纤维化、痛风、自身免疫性或炎症性疾病、病毒性感染。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，注意是对本发明的解释而不是限定。

实施例1 MEC分子的制备

(1)中间体JQ1-PEG4-MKK的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

步骤1：在0℃下，向2-溴-4-硝基苯酚1(2.0g，9.2mmol，1.0eq.)的THF(20mL)溶液中分若干份加入NaH(60％在油中)(0.74g，18.4mmol，2.0eq.)。将混合物搅拌1小时，然后加入MOMBr(1.72g，13.8mmol，1.5eq.)，并将混合物再搅拌1小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，用H₂O(20mL)骤冷并用EtOAc(3×20mL)萃取，将合并的有机层用无水Na₂SO₄干燥并在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，PE∶EtOAc＝19∶1)纯化，得到白色固体2-溴-1-(甲氧基甲氧基)-4-硝基苯2(2.1g，产率87％)。M/z：[M+H]⁺＝261.97。

/>

步骤2：将2-溴-1-(甲氧基甲氧基-4-硝基苯2(1.0g，3.81mmol，1.0eq.)在EtOH(10mL)中的悬浮液用雷尼镍(23mg，0.38mmol，0.1eq.)在25℃、H₂气氛下处理30分钟。采用LCMS监测反应。反应完成后，将其过滤并在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，CH₂Cl₂∶CH₃OH＝49∶1)纯化，得到白色固体3-溴-4-(甲氧基甲氧基)苯胺3(400mg，产率45％)。[M+H]⁺＝232.1。

步骤3：将装有7-硝基-1H-喹喔啉-2-酮4(1.0g，5.2mmol，1.0eq.)和POCl₃(5mL)混合物的圆底烧瓶置于油浴中，加热至120℃并回流3小时。采用TLC监测反应。反应完成后，用冰水(20mL)骤冷，并用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的有机层用无水Na₂SO₄干燥并浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，仅DCM)纯化，得到白色固体2-氯-7-硝基喹喔啉5(1.0g，产率92％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ9.22(s，1H)，8.88(d，J＝5.2Hz，1H)，8.59(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H)，8.40(d，J＝9.2Hz，1H)。

步骤4：将2-氯-7-硝基喹喔啉5(1.0g，4.8mmol，1.0eq.)和1-甲基-4-(4，4,4,5-四甲基1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)吡唑6(1.1g，5.2mmol，1.1eq.)在1,4-二噁烷(24mL)和H₂O(8mL)中的悬浮液用四(三苯基膦)钯(280mg，0.2mmol，0.05eq.)和碳酸钾(1.33g，9.6mmol，2.0eq.)在120℃下处理2小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，用H₂O(20mL)稀释并用EtOAc(3×20mL)萃取。用无水Na₂SO₄干燥合并的有机层，并在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，PE∶EtOAc＝4∶1)纯化，得到黄色固体2-(1-甲基吡唑-4-基)-7-硝基喹喔啉7(1.2g，产率98％)。[M+H]⁺＝256.0。

步骤5：将2-(1-甲基吡唑-4-基)-7-硝基喹喔啉7(1.2g，4.7mmol，1.0eq.)在CH₃OH(30mL)和THF(5mL)中的悬浮液用雷尼镍(30mg，0.4mmol，0.1eq.)在25℃，H₂气氛下处理4小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，将其过滤并在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，PE∶EtOAc＝2∶8)纯化，得到黄绿色固体3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-胺8(0.95g，产率89％)。[M+H]⁺＝226.1。

步骤6：将3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-胺8(440mg，1.95mmol，1.0eq.)在EtOAc∶THF∶H2O(5+5+5mL)中的悬浮液用Na₂CO₃(103mg，0.97mmol，0.5eq.)在0℃处理5分钟，然后逐滴加入氯甲酸苯酯9(337mg，2.15mmol，1.1eq.)。将混合物在0℃下再搅拌1小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，用H₂O(10mL)稀释，并用EA(20mL×3)萃取，用Na₂SO₄干燥，在减压下蒸发。残留物通过快速色谱(硅胶，PE∶EtOAc＝1∶1)纯化，得到浅黄色固体苯基(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)氨基甲酸酯10(420mg，68％)。[M+H]⁺＝346.1。

步骤7：将苯基(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)氨基甲酸酯10(265mg，0.77mmol，1.0eq.)在THF(6mL)中的悬浮液用Et3N(116mg，1.15mmol，1.5eq.)在25℃下处理5分钟，然后加入3-溴-4-(甲氧基甲氧基)苯胺3(196mg，0.85mmol，1.1eq.)。将混合物加热至70℃保持4小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩，残留物在CH₂Cl₂(5mL)中重结晶，得到黄色固体3-(3-溴-4-羟基苯基)-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲11(300mg，产率81％)。[M+H]⁺＝483.1。

步骤8：将3-[3-溴-4-(甲氧基甲氧基)苯基]-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲11(400mg，0.83mmol，1.0eq.)在THF(6mL)和CH₃OH(6mL)中的悬浮液用浓盐酸在25℃下处理24小时。反应完成后，在减压下浓缩，得到黄色固体3-(3-溴-4-羟基苯基)-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲12(350mg，产率96％)。[M+H]⁺＝439.2。

步骤9：将3-(3-溴-4-羟基苯基)-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲12(240mg，0.54mmol，1.0eq.)和12-溴-4,7,10-三氧杂-1-氮杂十二烷-1-基甲酸叔丁酯13(214mg，0.60mmol，1.1eq.)在DMF(4mL)中的溶液用碳酸钾(113mg，0.82mmol，1.5eq.)在80℃下处理6小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，用EtOAc(20mL)稀释，并用盐水(20ml)洗涤。用无水Na₂SO₄干燥有机层，并在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，CH₂Cl₂∶CH₃OH＝19∶1)纯化，得到棕色油状的{1-[2-溴-4-({[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]氨基甲酰基}氨基)苯基]-1，4，7，10-四氧杂-13-氮杂十三烷-13-基}甲酸叔丁酯14(230mg，产率59％)。[M+H]⁺＝714.3。

步骤10：将{1-[2-溴-4-({[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]氨基甲酰基}氨基)苯基]-1，4，7，10-四氧杂-13-氮杂十三烷-13-基}甲酸叔丁酯14(230mg，0.32mmol，1.0eq.)在CH₂C1₂(3mL)中的溶液用TFA(0.5mL)在25℃下处理1小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，用EtOAc(10mL)稀释并用饱和NaHCO₃(10mL)洗涤。用无水Na₂SO₄上干燥有机层，并在减压下浓缩，得到棕色油状的3-[4-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)-3-溴苯基]-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲15(190mg，96％收率)。[M+H]+＝614.2。

步骤11：将3-[4-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)-3-溴苯基]-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲15(90mg，0.15mmol，1.0eq.)和氧代(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸16(59mg，0.15mmol，1.0eq.)在CH₂Cl₂(2mL)中的溶液用HATU(84mg，0.22mmol，1.5eq.)和DIEA(57mg，0.44mmol，3.0eq.)在25℃下处理2小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩混合物，残留物通过快速色谱(硅胶，CH₂Cl₂∶CH₃OH＝19∶1)和制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.05％NH₃)纯化，得到淡黄色固体(R)-N-(2-(2-(2-(2-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺JQ1-PEG4-MKK(25.2mg，产率17％)。[M+H]⁺＝996.2。HPLC：t_R3.327min，100％purity.¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 9.22(s，1H)，9.11(s，1H)，8.85(s，1H)，8.61(s，1H)，8.29(t，J＝5.2Hz，1H)，8.26(s，1H)，8.23(d，J＝2.0Hz，1H)，7.92(d，J＝9.2Hz，1H)，7.85(d，J＝2.4Hz，1H)，7.67(dd，J＝9.2，2.0Hz，1H)，7.48(d，J＝8.8Hz，2H)，7.42(d，J＝8.4Hz，2H)，7.34(dd，J＝9.2，2.0Hz，1H)，7.10(d，J＝8.8Hz，1H)，4.54-4.47(m，1H)，4.17-4.10(m，2H)，3.95(s，3H)，3.81-3.74(m，2H)，3.69-3.61(m，2H)，3.59-3.52(m，6H)，3.46(t，J＝5.6Hz，2H)，3.31-3.19(m，4H)，2.59(s，3H)，2.40(s，3H)，1.61(s，3H)。

(2)中间体AP-PEG-JQ1的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

步骤1：向(9H-芴-9-基)甲基(3-羟丙基)氨基甲酸酯1(4.5g，15.1mmol，1.0eq.)在CH₂Cl₂(50mL)中的混合物中加入TEA(4.6g，45.3mmol，3.0eq.)和4-硝基氯甲酸苄酯2(3.6g，18.1mmol，1.2eq.)。反应混合物在25℃下搅拌2.5小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，将反应混合物加入水(50mL)中，并用CH₂Cl₂(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE∶EtOAc＝3∶1)纯化，得到白色固体(9H-芴-9-基)甲基(3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙基)氨基甲酸酯3(3.6g，产率51％)。M/z：[M+Na]⁺＝485.1。

步骤2：向(9H-芴-9-基)甲基(3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙基)氨基甲酸酯3(3.6g，7.8mmol，1.0eq.)在CH₃CN(15mL)中的混合物中加入NH₃·H₂O(3.5mL)。反应混合物在25℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，将反应混合物加入水(30mL)中，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝5∶1)纯化，得到白色固体(9H-芴-9-基)甲基(3-(氨基甲酰氧基)丙基)氨基甲酸酯4(2.0g，产率76％)。M/z：[M+H]⁺＝341.1。

步骤3：向(9H-芴-9-基)甲基(3-(氨基甲酰氧基)丙基)氨基甲酸酯4(2.0g，5.9mmol，1.0eq.)在DMA(5mL)中的混合物中加入2,2,2-三氯乙烷-1，1-二醇5(9.8g，59.0mmol，10.0eq.)。将反应混合物在120℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE∶EtOAc＝1∶1)纯化，得到黄色油状的(9H-芴-9-基)甲基(3-(((2，2,2-三氯-1-羟乙基)氨基甲酰基)氧基)丙基)氨基甲酸酯6(3.4g，产率93％)。M/z：[M+Na]⁺＝509.0。

步骤4：向(9H-芴-9-基)甲基(3-(((2，2,2-三氯-1-羟乙基)氨基甲酰基)氧基)丙基)氨基甲酸酯6(3.4g，6.9mmol，1.0eq.)在CH₂Cl₂(25mL)中的混合物中加入2滴吡啶和氯化亚砜(4.7g，40.0mmol，5.8eq.)。将反应混合物在25℃下搅拌2.5小时。通过TLC监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到黄色油状的(9H-芴-9-基)甲基(3-(((1，2,2,2-四氯乙基)氨基甲酰基)氧基)丙基)氨基甲酸酯7(3.4g，产率97％)。

步骤5：向(9H-芴-9-基)甲基(3-(((1，2,2,2-四氯乙基)氨基甲酰基)氧基)丙基)氨基甲酸酯7(3.4g，6.7mmol，1.0eq.)在CH₂Cl₂(30mL)中的混合物中加入2-氨基嘧啶8(6.0g，63.6mmol，9.5eq.)，在0℃于氮气下搅拌该混合物。将反应混合物在25℃下搅拌3小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE∶EtOAc＝1∶1)纯化，得到黄色油状的(9H-芴-9-基)甲基(3-(((2，2,2-三氯-1-(嘧啶-2-基氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)丙基)氨基甲酸酯9(2.8g，产率74％)。M/z：[M+H]⁺＝564.1。

步骤6：向(9H-芴-9-基)甲基(3-(((2，2,2-三氯-1-(嘧啶-2-基氨基)乙基)氨基甲酰基)氧基)丙基)氨基甲酸酯9(2.8g，5.0mmol，1.0eq.)在DMF(6mL)中的混合物中加入吗啉(2mL)。将反应混合物在25℃下搅拌1小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，过滤反应混合物。滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过HPLC(0.1％FA)纯化，得到黄色固体3-氨基丙基(2，2,2-三氯-1-(嘧啶-2-基氨基)乙基)氨基甲酸酯10(2.1g，94％产率)。M/z：[M+H]⁺＝342.0。

步骤7：将(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-A][1，4]二氮杂-6-基)乙酸12(300mg，0.75mmol，1.0eq.)、DIPEA(193mg，1.50mmol，2.0eq.)和HATU(341mg，0.90mmol，1.2eq.)在CH₂Cl₂(5mL)中的混合物在25℃下搅拌10分钟。将2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇11(167mg，1.12mmol，1.5eq.)加入该混合物中。得到的溶液在25℃下搅拌50分钟。通过LCMS监测反应。反应完成后，将反应混合物在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过FFC(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1)纯化得到黄色油状的(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-N-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺13(360mg，产率90％)。M/z：[M+H]⁺＝532.2。

步骤8：向(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-N-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺13(360mg，0.68mmol，1.0eq.)、TEA(205mg，2.03mmol，3.0eq.)和DMAP(16.5mg，0.14mmol，0.2eq.)在CH₂Cl₂(5mL)中的溶液中加入4-甲基苯磺酰氯(258mg，1.35mmol，2.0eq.)。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过FFC(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1)纯化，得到白色固体(S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2,4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂/>-6-基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基-4-甲基苯磺酸酯14(360mg，产率77％)。M/z：[M+H]⁺＝686.3。

/>

步骤9：将(S)-2-(2-(2-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2,4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基-4-甲基苯磺酸酯14(120mg，0.17mmol，1.0eq.)、3-氨基丙基N-[2，2,2-三氯-1-(嘧啶-2-基氨基)乙基]氨基甲酸酯10(150mg，0.35mmol，2.0eq.)和K₂CO₃(72.5mg，0.52mmol，3.0eq.)在ACN(5mL)中的混合物在65℃下搅拌24小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过FFC(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1)纯化，得到粗产物。粗产物通过制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.1％FA)纯化，得到白色固体1-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3，2,4]三唑[4，3-a][1，4]二氮杂/>-6-基)-2-氧代-6,9-二氧杂-3，12-二氮杂十五烷-15-基(2，2,2-三氯-1-(嘧啶-2-基氨基)乙基)氨基甲酸酯AP-PEG-JQ1(26.5mg，产率18％)。M/z：[M+H]⁺＝855.1。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 8.42(d，J＝4.8Hz，2H)，8.27(t，J＝5.6Hz，1H)，7.86(d，J＝8.8Hz，1H)，7.49(d，J＝8.8Hz，2H)，7.42(d，J＝8.4Hz，2H)，7.21(d，J＝9.6Hz，1H)，6.83(t，J＝4.8Hz，1H)，6.69(t，J＝9.2Hz，1H)，4.51(t，J＝7.2Hz，1H)，4.06(s，2H)，3.57-3.52(m，6H)，3.46(t，J＝6.0Hz，2H)，3.27-3.20(m，5H)，2.83(t，J＝4.8Hz，2H)，2.73(t，J＝7.2Hz，2H)，2.59(s，3H)，2.41(s，3H)，1.82-1.73(m，2H)，1.62(s，3H)。

(3)中间体VDAC结合分子的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

步骤1：向1-溴-4-(三氟甲氧基)苯1(1.2g，5mmol，1.0eq.)在甲苯(20mL)中的溶液中加入甲酸哌嗪-1-基叔丁酯2(1.87g，10mmol，2.0eq.)、Xantphos(0.58g，1mol，0.2eq.)、Cs₂CO₃(3.26g，10mmol，2.0eq.)和Pd(OAc)₂(0.11g，0.5mmol，0.1eq.)。将反应混合物在110℃下在N₂气氛下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE/EtOAc＝10/1)纯化，得到黄色固体4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯3(1.4g，产率80％)。M/z：[M+H-56]⁺＝291.1。

步骤2：将{4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯3(1.4g，4.01mol，1.0eq.)于HCl的二噁烷(20mL)中的溶液中在25℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。将残留物溶解在NH₃的MeOH(50mL)溶液中。将混合物在25℃下搅拌1小时。将混合物在减压下浓缩，得到黄色固体4-(哌嗪-1-基)苯基二氟甲基次氟酸酯4(1.0g，产率100％)。M/z：[M+H]⁺＝247.3。

步骤3：在0℃下，向5H-呋喃-2-酮5(0.67g，8mmol，1.0eq.)在DCM(10mL)中的溶液中加入4-(哌嗪-1-基)苯基二氟甲基次氟酸酯4(1.0g，4.0mmol，0.5eq.)的DCM(2mL)溶液。将混合物在25℃下搅拌16小时。LCMS显示反应良好。将混合物浓缩并通过硅胶柱(PE∶EA＝1∶1)纯化，得到黄色固体4-{4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌嗪-1-基}氧杂环戊烷-2-酮6(0.8g，产率60％)。M/z：[M+H]⁺＝331.1。

步骤4：向4-{4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌嗪-1-基}氧杂环戊烷-2-酮6(0.8g，2.4mmol，1.0eq.)在甲苯(30mL)中的溶液中加入AlMe₃(4.8mL，2M，4.0eq.)，将混合物在25℃下搅拌10分钟。向溶液中加入4-氯苯胺7(0.61g，4.8mmol，2.0eq.)。将混合物在80℃下搅拌16小时。LCMS显示反应良好。将混合物浓缩并通过硅胶柱(EA)纯化，得到白色固体N-(4-氯苯基)-4-羟基-3-{4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌嗪-1-基}丁酰胺Vdac(0.64g，产率60％)。M/z：[M+H]⁺＝458.1。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 10.17(s，1H)，7.61(d，J＝8.8Hz，2H)，7.36-7.30(m，2H)，7.16(d，J＝8.8Hz，2H)，6.97(d，J＝9.2Hz，2H)，4.54(t，J＝5.2Hz，1H)，3.60-3.54(m，1H)，3.48-3.42(m，1H)，3.15-3.09(m，5H)，2.85-2.77(m，2H)，2.75-2.68(m，2H)，2.58-2.53(m，1H)，2.40-2.34(m，1H)。

(4)MEC 1(TSPO-PEG4-MKK)的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

步骤1：在0℃下，向2-苯基-1H-吲哚1(1g，5.2mmol，1.0eq.)的THF(20mL)溶液中加入草酰氯(2.31g，18.2mol，3.5eq.)。将混合物在25℃、N₂下搅拌16小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，在0℃下将CH₃OH(1mL)滴入混合物中。然后在减压下浓缩混合物。残留物通过快速色谱(硅胶，PE∶EtOAc＝3∶1)纯化，得到棕色固体2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸甲酯2(1.2g，产率83％)。[M+H]⁺＝280.0

步骤2：向2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸甲酯2(500mg，1.79mmol，1.0eq.)在CH₃OH(30mL)和H₂O(6mL)中的溶液中加入LiOH·H₂O(300mg，7.16mmol，4.0eq.)。将混合物在25℃下搅拌16小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，将反应混合物加入1N HCl(20mL)中，并用EtOAc(30mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。在减压下浓缩滤液，得到黄色固体2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸3(470mg，产率99％)。M/z：[M+H]+＝266.0。

化合物4：参见JQ1-PEG4-MKK的合成。

步骤3：将3-[4-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)-3-溴苯基]-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲4(100mg，O.16mmol，1.0eq.)和2-氧代(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸3(47mg，0.18mmol，1.1eq.)在CH₂Cl₂(2mL)中的溶液用HATU(93mg，0.24mmol，1.5eq.)和DIEA(63mg，0.49mmol，3.0eq.)在25℃下处理1小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩混合物，残留物通过快速色谱(硅胶，CH₂Cl₂∶CH₃OH＝19∶1)和制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.05％NH₃)纯化，得到浅黄色固体N-{1-[2-溴-4-({[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]氨基甲酰基}氨基)苯基]-1，4，7，10-四氧杂十二烷-12-基}-2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺(25.4mg，产率18％)。[M+H]⁺＝861.1。HPLC：t_R 1.014min，97.66％purity.¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 12.37(s，1H)，9.71(s，1H)，9.34(s，1H)，9.10(s，1H)，8.60(s，1H)，8.47(s，1H)，8.29-8.18(m，2H)，8.07(d，J＝7.2Hz，1H)，7.91(d，J＝9.2Hz，1H)，7.86(d，J＝2.4Hz，1H)，7.71(d，J＝8.4Hz，1H)，7.60-7.53(m，2H)，7.50-7.41(m，4H)，7.38(d，J＝8.4Hz，1H)，7.29-7.15(m，2H)，7.08(d，J＝8.8Hz，1H)，4.15-4.09(m，2H)，3.95(s，3H)，3.79-3.72(m，2H)，3.66-3.60(m，2H)，3.57-3.50(m，4H)，3.49-3.44(m，2H)，3.23(t，J＝6.4Hz，2H)，2.92(dd，J＝10.4，5.2Hz，2H)。

(5)MEC 2(MKK-EG2-TSPO)的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

化合物1：参见JQ1-PEG4-MKK的合成。

步骤1：将3-(3-溴-4-羟基苯基)-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲1(320mg，0.72mmol，1.0eq.)和(2-(2-溴乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯2(215mg，0.79mmol，1.1eq.)在DMF(6mL)中的溶液用碳酸钾(302mg，2.16mmol，3eq.)在70℃下处理6小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，用EA(20mL)稀释，并用盐水(20m1)洗涤，有机层用无水Na₂SO₄干燥并在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1)纯化，得到黄色固体(2-(2-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯3(290mg，产率63％)。[M+H]⁺＝627.2。

步骤2：将2-(2-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯3(290mg，0.46mmol，1.0eq.)在CH₂Cl₂(10mL)中的溶液用HCl/乙醚(3mL)在25℃下处理10小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩，得到砖红色固体1-(4-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-3-溴苯基)-3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲4(230mg，产率94％)。[M+H]⁺＝527.2。

化合物5：参见MEC 1的合成。

步骤3：将1-(4-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-3-溴苯基)-3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲4(230mg，0.44mmol，1.0eq.)和2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸5(127mg，0.48mmol，1.1eq.)在DMF(6mL)中的溶液用HATU(249mg，0.66mmol，1.5eq.)和DIEA(338mg，2.62mmol，6.0eq.)在25℃下处理8小时。采用LCMS监控反应。反应完成后，在减压下浓缩混合物，残留物通过快速色谱(硅胶，CH₂Cl₂∶CH₃OH＝19∶1)和制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.05％NH₃)纯化，得到黄色固体N-(2-(2-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)乙氧基)乙基)-2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺MKK-EG2-TSPO(28mg，产率8.3％)。[M+H]⁺＝773.2。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ 12.36(s，1H)，9.21(s，1H)，9.11(s，1H)，8.85(s，1H)，8.61(s，1H)，8.54(t，J＝5.6Hz，1H)，8.26(s，1H)，8.23(d，J＝2.2Hz，1H)，8.10(d，J＝7.2Hz，1H)，7.93(d，J＝8.8Hz，1H)，7.85(d，J＝2.4Hz，1H)，7.67(dd，J＝9.2，2.2Hz，1H)，7.57(d，J＝2.8Hz，2H)，7.51-7.46(m，4H)，7.36(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H)，7.30-7.20(m，2H)，7.11(d，J＝8.8Hz，1H)，4.13(d，J＝4.8Hz，2H)，3.95(s，3H)，3.76-3.69(m，2H)，3.35(s，2H)，2.96(q，J＝5.8Hz，2H)。

(6)MEC 3(sMKK-TSPO)的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

化合物1：参见MEC1的合成。

化合物2：参见JQ1-PEG4-MKK的合成。

将3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-胺2(100mg，0.44mmol，1.0eq.)和氧代(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸1(128mg，0.48mmol，1.1eq.)在CH₂Cl₂(3mL)中的溶液中用HATU(250mg，0.66mmol，1.5eq.)和DIPEA(171mg，1.32mmol，3.0eq.)在25℃下处理1小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩混合物，通过快速色谱(硅胶，CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1)和制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.05％NH₃)纯化残留物，得到黄色固体N-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)-2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺(28.2mg，产率14％)。[M+H]⁺＝473.1。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 12.56(s，1H)，11.06(s，1H)，9.17(s，1H)，8.63(s，1H)，8.28(s，1H)，8.21(dd，J＝6.4，2.4Hz，1H)，8.10(d，J＝2.2Hz，1H)，7.91(d，J＝9.0Hz，1H)，7.67-7.59(m，3H)，7.53(d，J＝6.8Hz，1H)，7.34-7.18(m，5H)，3.94(s，3H)。

(7)MEC 5(AP-EG4-TSPO)的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

化合物1-3：参见MEC1的合成。

步骤1：将氧代(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸3(1.3g，4.9mmol，1.0eq.)在CH₂Cl₂(10mL)中的混合物加入DIEA(1.27g，9.8mmol，2eq.)、HATU(2.24g，5.8mmol，1.2eq.)，在室温下搅拌10分钟。然后加入2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇4(1.1g，7.3mmol，1.5eq.)。将混合物在25℃下搅拌1小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩混合物，残留物通过快速色谱硅胶(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝20∶1)纯化，得到黄色固体N-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺5(840mg，产率43％)。[M+H]⁺＝397.1。

步骤2：向N-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺5(840mg，2.1mmol，1.0eq.)、TEA(1.1g，10.5mmol，5.0eq.)和DMAP(129.4mg，1.1mmol，0.5eq.)在CH₂Cl₂(5mL)中的溶液中加入TsCl(1.6g，8.4mmol，4eq.)。将混合物在25℃下搅拌3小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过FFC(PE∶EA＝1∶1)纯化，得到白色固体N-{2-[2-(2-{[(4-甲基苯)磺酰基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}-2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺6(700mg，产率60％)。M/z：[M+H]⁺＝551.2。

化合物7：参见AP-PEG-JQ1的合成。

步骤3：将N-{2-[2-(2-{[(4-甲基苯)磺酰基]氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}-2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺6(200mg，0.36mmol，1.0eq.)、3-氨基丙基N-[2，2,2-三氯-1-(嘧啶-2-基氨基)乙基]氨基甲酸酯7(373.31mg，1.1mmol，3.0eq.)和K₂CO₃(150.59mg，1.1mol，3.0eq.)在ACN(5mL)中的混合物在70℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过FFC(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1)纯化，得到粗产物。粗产物通过制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.1％NH₃)纯化，得到白色固体3-{[2-(2-{2-[2-氧代-2-(2-苯基-IH-吲哚-3-基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]氨基}丙基N-[2，2,2-三氯-1-(嘧啶-2-基氨基)乙基)氨基甲酸酯(30.19mg，产率11％)。M/z：[M+H]⁺＝720.2。HPLC：t_R 1.71min，98.45％purity.¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 12.37(s，1H)，8.49(s，1H)，8.43(d，J＝4.8Hz，2H)，8.07(d，J＝7.4Hz，1H)，7.82(d，J＝8.2Hz，1H)，7.59-7.54(m，2H)，7.50-7.45(m，4H)，7.27-7.19(m，2H)，7.15(d，J＝9.2Hz，1H)，6.83(m，1H)，6.68(m，1H)，4.04(s，2H)，3.46(s，4H)，3.41(m，2H)，3.23(m，2H)，2.91(m，2H)，2.59(m，2H)，2.54(s，2H)，1.66(s，2H)。

(8)MEC 7(MKK-EG4-VDAC)的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

步骤1：向1-溴-4-(三氟甲氧基)苯12(12.0g，0.05mol，1.0eq.)的甲苯(200mL)溶液中加入哌嗪-1-基甲酸叔丁酯13(28.0g，0.15mol，3.0eq.)、Xantphos(8.6g，0.015mol，0.3eq.)、Cs₂CO₃(64.9g，0.19mol，3.8eq.)和Pd(OAc)₂(1.2g，，0.74mol，14.8eq.)。将反应混合物在N2气氛下在110℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE/EtOAc＝10/1)纯化，得到黄色固体{4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌嗪-1-基}甲酸叔丁酯14(14.0g，产率81％)。M/z：[M+H-56]⁺＝291.1。

步骤2：将{4-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌嗪-1-基}甲酸叔丁酯14(14.0g，0.04mol，1.0eq.)在HCl中的二噁烷(80mL)溶液在25℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。将残留物溶解在MeOH(50mL)中的NH₃中。将混合物在25℃下搅拌1小时。将混合物在减压下浓缩，得到黄色固体1-[4-(三氟甲氧基)苯基]哌嗪4(10.0g，产率95％)。M/z：[M+H]⁺＝247.3。

步骤3：将(2E)-4-溴丁-2-烯酸乙酯1(600mg，3.10mmol，1.0eq.)、1-(1-甲基苯基)-1，4，7，10-四氧杂十二烷-12-醇2(1774mg，6.20mmol，2.0eq.)和Ag₂O(1080mg，4.66mmol，1.5eq.)在25℃黑暗中搅拌48小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，用EtOAc(20mL)稀释反应混合物并过滤。滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE/EtOAc＝2/1)纯化，得到无色油状的(E)-1-苯基-2,5,8,11，14-五氧杂十八碳-16-烯-18-酸乙酯3(600mg，产率48％)。M/z：[M+H]⁺＝397.2。

步骤4：将(E)-1-苯基-2,5,8,11，14-五氧杂十八碳-16-烯-18-酸乙酯3(600mg，1.50mmol，1.0eq.)、4-(哌嗪-1-基)苯基二氟甲基次氟酸酯4(561mg，2.25mmol，1.5eq.)和TEA(306mg，3.00mmol，2.0eq.)在EtOH(0.4mL)中的溶液在90℃下搅拌24小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE/EtOAc＝1/1)纯化，得到黄色油状的1-苯基-16-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-2，5，8，11，14-五氧杂十八烷-18-酸乙酯5(760mg，产率74％)。M/z：[M+H]⁺＝643.3。

步骤5：向1-苯基-16-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-2，5，8，11，14-五氧杂十八烷-18-酸乙酯5(600mg，0.93mmol，1.0eq.)在EtOH(10mL)中的溶液中加入Pd/C(99mg，0.93mmol，1.0eq.)。将反应混合物在H₂(15psi)下在25℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，过滤反应混合物。在减压下浓缩滤液，得到橙色油状的1-羟基-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酸乙酯6(494mg，产率91％)。M/z：[M+H]⁺＝553.2。

步骤6：向1-羟基-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酸乙酯6(494mg，0.89mmol，1.0eq.)在DCM(10mL)的溶液中加入TEA(271mg，2.67mmol，3.0eq.)和TsCl(255mg，1.34mmol，1.5eq.)。将反应混合物在25℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(10mL)，并用DCM(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE∶EtOAc＝1∶1)纯化，得到黄色油状的1-(甲苯磺酰氧基)-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酸乙酯7(279mg，产率42％)。M/z：[M+H]⁺＝707.2。

化合物8：参见JQ1-PEG4-MKK的合成

步骤7：向1-(甲苯磺酰氧基)-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酸乙酯7(279mg，0.39mmol，0.1eq.)在DMF(5mL)中的溶液中加入碳酸钾(136mg，0.98mmol，2.5eq.)和1-(3-溴-4-羟基苯基)-3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲8(347mg，0.79mmol，2.0eq.)。将反应混合物在70℃下搅拌5小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，将反应混合物加入到水(10mL)中并过滤。滤饼在减压下浓缩，得到黄色油状的1-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16酸乙酯9(381mg，产率49％)。M/z：[M+H]⁺＝973.2。

步骤8：向1-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酸乙酯9(381mg，0.39mmol，1.0eq.)在EtOH∶H₂O＝4∶1(5mL)中的溶液中加入LiOH(37mg，1.56mmol，4.0eq.)。将反应混合物在25℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(5mL)，并用EtOAc(5mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过制备型TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1)纯化，得到黄色固体1-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酸10(96mg，产率24％)。M/z：[M+H]⁺＝945.1。

步骤9：向1-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)-14-(4-(4-(三氟甲基氧)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16酸10(96mg，0.10mmol，1.0eq.)在DMF(3mL)中的溶液中加入HATU(46mg，0.12mmol，1.2eq.)、DIEA(19mg，19mg、DIEA(19mg，0.15mmol，1.5eq.)和4-氯苯胺11(15mg，0.12mmol，1.2eq.)。将反应混合物在25℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(10mL)，并用EtOAc(5mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(15mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过制备型TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1)和制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.1％FA)纯化，得到浅黄色固体1-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)-N-(4-氯苯基)-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酰胺MKK-EG4-VDAC(25mg，产率23％)。M/z：[M+H]⁺＝1054.1。¹H NMR(400MHz，CH₃OD)δ 9.00(s，1H)，8.43(s，1H)，8.27-8.24(m，2H)，7.91(d，J＝9.2Hz，1H)，7.78(d，J＝2.8Hz，1H)，7.72(dd，J＝9.2，2.4Hz，1H)，7.54-7.51(m，2H)，7.36(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，7.27-7.23(m，2H)，7.07-7.01(m，3H)，6.94-6.90(m，2H)，4.16-4.13(m，2H)，4.00(s，3H)，3.86-3.83(m，2H)，3.74-3.71(m，2H)，3.65-3.56(m，14H)，3.15-3.13(m，3H)，2.97-2.91(m，2H)，2.86-2.80(m，2H)，2.65(dd，J＝14.8，7.2Hz，1H)，2.55(dd，J＝15.2，6.8Hz，1H)。

(9)MEC13(Tha-EG4-TSPO)的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

步骤1：向在氮气下搅拌的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1，3-二酮1(200mg，0.73mmol，1.0eq.)在DMF(5mL)中的混合物中加入碳酸钾(252mg，1.82mmol，2.5eq.)和(2-(2-(-2-(2-(溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯2(287mg，0.80mmol，1.1eq.)。将反应混合物在60℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(10mL)，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE∶EtOAc＝0∶1)纯化，得到黄色固体(2-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯3(108mg，产率27％)。M/z：[M+Na]⁺＝572.2。

步骤2：向在氮气下搅拌的(2-(2-(2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯3(108mg，0.19mmol，1.0eq.)在CH₂Cl₂(2mL)中的混合物中加入HCl/二噁烷(5mL)。将反应混合物在25℃下搅拌3小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到白色固体4-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮4(95mg，产率95％)。M/z：[M+H]⁺＝450.2。

/>

步骤3：向2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酸5(45mg，0.17mmol，1.0eq.)在CH₂Cl₂(5mL)中的混合物中加入HATU(77mg，0.20mmol，1.2eq.)、DIEA(33mg，0.25mmol，1.5eq.)和4-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮4(90mg，0.18mmol、1.1eq.)。将反应混合物在25℃下搅拌1小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(5mL)，并用CH₂Cl₂(5mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水Na2SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.1％FA)纯化，得到黄色固体N-(2-(2-(-2-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-氧代-2-(2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙酰胺Tha-EG4-TSPO(28.96mg，产率31％)。M/z：[M+H]⁺＝697.2。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 12.45(s，1H)，11.11(s，1H)，8.53-8.49(m，1H)，8.09-8.05(m，1H)，7.82-7.77(m，1H)，7.59-7.54(m，2H)，7.53-7.44(m，6H)，7.29-7.20(m，2H)，5.12-5.04(m，1H)，4.35-4.31(m，2H)，3.81-3.77(m，2H)，3.66-3.62(m，2H)，3.54-3.49(m，4H)，3.47-3.43(m，2H)，3.22(t，J＝6.4Hz，2H)，2.93-2.83(m，3H)，2.62-2.52(m，2H)，2.06-1.98(m，1H)。

(10)MEC18(MKK-EG2-VDAC)的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

步骤1：向(2E)-4-溴丁-2-烯酸乙酯1(1.0g，5.2mmol，1.0eq.)在2-[2-(苄氧基)乙氧基]乙醇2(2.0g，10.4mmol，2.0eq.)中的溶液中加入Ag₂O(1.81g，7.8mmol，1.5eq.)。将混合物于黑暗中在25℃下搅拌48小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，用EtOAc(20m1)稀释反应混合物并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE/EtOAc＝2/1)纯化，得到无色油状的(2E)-4-{2-[2-(苄氧基)乙氧基]乙氧基}丁-2-烯酸乙酯(1.2g，产率75％)。M/z：[M+H]⁺＝309.2。

化合物4：参见Vdac结合分子的合成

步骤2：(2E)-4-{2-[2-(苄氧基)乙氧基]乙氧基}丁-2-烯酸乙酯(500mg，1.62mmol，1.0eq.)3和TEA(328mg，3.24mmol，2.0eq.)在EtOH(1mL)中的溶液中加入4-(哌嗪-1-基)苯基二氟甲基次氟酸酯4(481mg，1.94mmol、1.2eq.)。将混合物在90℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，在减压下浓缩反应混合物，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE/EtOAc＝1/1)纯化，得到黄色油状的4-(2-(2-(苄氧基)乙氧基)乙氧基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸乙酯5(600mg，产率67％)。M/z：[M+H]⁺＝555.3。

步骤3：向4-(2-(2-(苄氧基)乙氧基)乙氧基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸乙酯5(600mg，1.08mmol，1.0eq.)在MeOH(10mL)中的溶液中加入Pd/C(95mg，1.08mmol，1.0eq.)。将反应混合物于H2(15psi)下在25℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，过滤反应混合物。在减压下浓缩滤液，得到黄色油状的4-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸乙酯6(500mg，产率99％)。M/z：[M+H]⁺＝465.2。

步骤4：向4-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸乙酯6(500mg，1.07mmol，1.0eq.)在DCM(10mL)中的溶液中加入TEA(326mg，3.22mmol，3.0eq.)和TsCl(307mg，1.61mmol，1.5eq.)。将反应混合物在25℃下搅拌16小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(10ml)，并用DCM(10ml×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过硅胶柱色谱(PE∶EtOAc＝1∶1)纯化，得到无色油状的4-(2-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙氧基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸乙酯7(450mg，产率67％)。M/z：[M+H]⁺＝619.2。

化合物8：参见JQ1-PEG4-MKK的合成

步骤5：向4-(2-(2-(甲苯磺基氧基)乙氧基)乙氧基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸乙酯(140mg，0.23mmol，1eq.)在DMF(5mL)中的溶液中加入碳酸钾(125mg，0.90mmol，4eq.)和3-(3-溴-4-羟基苯基)-1-[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]脲(100mg，0.23mmol，1.0eq.)。将反应混合物在70℃下搅拌5小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(10m1)并过滤。滤饼在减压下浓缩，得到黄色油状的1-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酸乙酯9(180mg，产率90％)。M/z：[M+H]⁺＝885.2。

步骤6：向1-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)-14-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-3，6，9，12-四氧杂十六烷-16-酸乙酯9(150mg，0.17mmol，1.0eq.)在THF∶H₂O＝4∶1(5mL)中的溶液中加入LiOH·H₂O(28mg，0.67mmol，4.0eq.)。将反应混合物在25℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(5mL)，并用EtOAc(5mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。在减压下浓缩滤液，得到黄色固体4-(2-(2-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸10(130mg，产率89％)。M/z：[M+H]⁺＝857.2。

步骤7：向4-(2-(2-(2-溴-4-(3-(3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹喔啉-6-基)脲基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酸10(100mg，0.11mmol，1.0eq.)在DMF(3mL)中的溶液中加入HATU(53mg，0.14mmol，1.2eq.)、DIEA(30mg，0.23mmol，2eq.)和4-氯苯胺11(14mg，0.11mmol，1eq.)。将反应混合物在25℃下搅拌2小时。通过LCMS监测反应。反应完成后，向反应混合物中加入水(10ml)，并用EtOAc(5ml×3)萃取。将合并的有机层用盐水(15m1)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，得到残留物。残留物通过制备型TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝10∶1)和制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.1％NH₃·H₂O)纯化，得到4-{4-[1-(2-[2-[2-溴-4-({[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]氨基甲酰基}氨基)苯氧基]乙氧基)乙氧基)-3-[(4-氯苯基)氨基甲酰基]丙-2-基]哌嗪-1-基}苯基二氟甲基次氟酸酯MKK-EG2-VDAC(40mg，35％产率)，为白色固体。M/z：[M+H]+966.2。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 10.13(s，1H)，9.21(s，1H)，9.11(s，1H)，8.85(s，1H)，8.60(s，1H)，8.27-8.20(m，2H)，7.93(d，J＝9.0Hz，1H)，7.85(d，J＝2.8Hz，1H)，7.69-7.31(m，1H)，7.60(d，J＝8.8Hz，2H)，7.38-7.29(m，3H)，7.13(d，J＝8.8Hz，2H)，7.07(d，J＝9.2Hz，1H)，6.92(d，J＝9.2Hz，2H)，4.17-4.07(m，2H)，3.95(s，3H)，3.79-3.74(m，2H)，3.67-3.51(m，4H)，3.29(s，2H)，3.05(s，4H)，2.80(s，2H)，2.67(d，J＝2.0Hz，2H)，2.54(s，2H)，2.44-2.31(m，1H)。

(11)MEC19(MKK-Vdac)的合成

反应流程

具体包括以下步骤：

步骤1：向2-溴-4-硝基苯酚1(2.0g，9.2mmol，1.0eq.)和(2E)-4-溴丁-2-烯酸乙酯2(3.55g，18.4mmol，2.0eq.)在ACN(30mL)中的溶液中加入K₂CO₃(3.81g，27.6mmol，3.0eq.)，并将混合物在25℃下搅拌16小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，过滤并在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，PE：EtOAc＝4：1)纯化，得到白色固体(2E)-4-(2-溴-4-硝基苯氧基)丁-2-烯酸乙酯3(2.45g，产率80％)。M/z：[M+H]⁺＝330.0。

步骤2：向(2E)-4-(2-溴-4-硝基苯氧基)丁-2-烯酸乙酯3(2.35g，7.1mmol，1.0eq.)和4-(哌嗪-1-基)苯基二氟甲基次氟酸酯4(2.22g，7.8mmol，1.1eq.)在DMF(4mL)中的悬浮液中加入Et₃N(3.59g，35.5mmol，5.0eq.)，并将混合物在90℃下搅拌24小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，用EA(50mL)稀释，并依次用H₂O(100mL)和盐水(100ml)洗涤，然后将有机层用无水Na2SO₄干燥，并在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，PE∶EtOAc＝4∶1)纯化，得到4-(2-溴-4-硝基苯氧基)-3-[4-(4-{[(二氟甲基)-次氟基]氧基}苯基)哌嗪-1-基]丁酸乙酯5(1.0g、产率24％)。[M+H]⁺＝576.1。

步骤3：向4-(2-溴-4-硝基苯氧基)-3-[4-(4-{[(二氟甲基)-次氟基]氧基}苯基)哌嗪-1-基]丁酸乙酯5(1.0g，1.7mmol，1.0eq.)在EtOH(5mL)和H₂O(1mL)中的溶液中加入LiOH·H₂O(0.36g，8.5mmol，5.0eq.)，并将混合物在25℃下搅拌3小时。采用TLC监测反应。反应完成后，用冰水(30mL)稀释，将pH调节至5，用EtOAc(320mL)萃取。将合并的有机层用无水Na₂SO₄干燥并浓缩，得到淡黄色固体4-(2-溴-4-硝基苯氧基)-3-[4-(4-{[(二氟甲基)次]氧基}苯基)哌嗪-1-基]丁酸6(0.96g、产率100％)。[M+H]⁺＝548.0。

步骤4：在25℃下，向4-(2-溴-4-硝基苯氧基)-3-[4-(4-{[(二氟甲基)-次氟基]氧基}苯基)哌嗪-1-基]丁酸6(0.96g，1.7mmol，1.0eq.)和4-氯苯胺7(0.24g，1.8mmol，1.1eq.)在DCM(10mL)中的溶液中加入HATU(0.71g，1.8mmol，1.1eq.)和DIEA(0.66g，5.0mmol，3.0eq.)，并将所需溶液搅拌1小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，将其在减压下浓缩。残留物通过快速色谱(硅胶，仅DCM)纯化，得到黄色固体4-{4-[1-(2-溴-4-硝基苯氧基)-3-[(4-氯苯基)氨基甲酰基]丙-2-基]哌嗪-1-基}苯基二氟甲基次氟酸酯8(0.79g，71％产率)。[M+H]⁺＝657.0。

步骤5：将4-{4-[1-(2-溴-4-硝基苯氧基)-3-[(4-氯苯基)氨基甲酰基]丙-2-基]哌嗪-1-基}苯基二氟甲基次氟酸酯8(200mg，0.30mmol，1.0eq.)在EtOH(2mL)中的溶液用雷尼镍在25℃、H₂气氛下处理2小时。采用LCMS监测反应。反应完成后，过滤并在减压下浓缩，得到黄色油状的4-{4-[1-(4-氨基-2-溴苯氧基)-3-[(4-氯苯基)氨基甲酰基]丙-2-基]哌嗪-1-基}苯基二氟甲基次氟酸酯9(180mg，产率75％)。[M+H]⁺＝627.1。

化合物10：参见JQ1-PEG4-MKK的合成

步骤6：将4-{4-[1-(4-氨基-2-溴苯氧基)-3-[(4-氯苯基)氨基甲酰基]丙-2-基]哌嗪-1-基}苯基二氟甲基次氟酸酯9(123mg，0.36mmol，1.5eq.)在THF(2mL)中的溶液用Et₃N(72mg，0.72mmol，3.0eq.)在25℃下处理5分钟，然后加入4-{4-[1-(4-氨基-2-溴苯氧基)-3-[(4-氯苯基)氨基甲酰基]丙-2-基]哌嗪-1-基}苯基二氟甲基次氟酸酯10(150mg，0.24mmol，1.0eq.)，将混合物加热至70℃持续16小时。用LCMS监测反应。反应完成后，将其在减压下蒸发。残留物通过制备型高效液相色谱prep-HPLC(0.05％NH₃)纯化，得到白色固体4-(4-{1-[2-溴-4-({[3-(1-甲基吡唑-4-基)喹喔啉-6-基]氨基甲酰基}氨基)苯氧基]-3-[(4-氯苯基)氨基甲酰基]丙-2-基}哌嗪-1-基)苯基二氟甲基次氟酸酯MKK-Vdac(38.7mg，产率18％)。[M+H]⁺＝878.1。HPLC：t_R 2.149min，98.14％purity.¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ 10.22(s，1H)，9.22(s，1H)，9.11(s，1H)，8.85(s，1H)，8.61(s，1H)，8.26(s，1H)，8.22(d，J＝2.0Hz，1H)，7.93(d，J＝8.8Hz，1H)，7.83(d，J＝2.4Hz，1H)，7.67(dd，J＝9.2，2.4Hz，1H)，7.63(d，J＝9.2Hz，2H)，7.39-7.32(m，3H)，7.16(d，J＝6.8Hz，3H)，6.99(d，J＝9.2Hz，2H)，4.26-4.12(m，2H)，3.95(s，3H)，3.62-3.52(m，1H)，3.14-3.06(m，4H)，3.01-2.91(m，2H)，2.81-2.70(m，3H)，2.60(dd，J＝14.8，6.0Hz，1H).¹⁹F NMR(400MHz，DMSO)δ-57.21。

实施例2不同MEC分子在HeLa细胞中修复线粒体损伤(恢复线粒体膜电势)的能力比较

在本实施例中，本发明合成的MEC分子以及它们在100纳摩尔浓度时在HeLa细胞中修复CCCP导致的线粒体损伤(恢复线粒体膜电势)的能力打分见表1。其中，+++，强；++，中；+，弱；-，无。

具体包括以下步骤：采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)的方法检测线粒体膜电位。将Hela细胞(宫颈癌细胞系)以每孔5万的密度分到24孔板中，不同的MEC及AUTAC4在与羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)20微摩尔共处理3小时后，根据JC-1试剂盒的说明书进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后利用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析。

表1 MEC分子的线粒体损伤修复能力

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由表1可知，以MAP3K1作为靶向的E3连接酶以及EG作为连接分子时，连接分子的长度显著影响MEC分子对损伤线粒体的修复作用，EG4效果最佳，EG2为次，而在没有连接分子时MEC分子基本上不具备修复损伤线粒体的作用。线粒体外膜蛋白的选择并不重要，无论是TSPO或者VDAC均能充分支持MEC分子修复损伤线粒体的作用。另一方面，E3连接酶的选择至关紧要，以CRBN或APC^CDC20作为E3连接酶设计的MEC分子(MEC13和MEC5)均无修复损伤线粒体的功能。与文献报道相吻合，AUTAC 4在10微摩尔时具备修复损伤线粒体的能力，但在100纳摩尔浓度下完全没有活性。

实施例3不同MEC分子在多种细胞中恢复损伤线粒体膜电势的作用比较

线粒体膜电势变化是区分健康和损伤线粒体的金标准。

(1)Hela细胞

采用JC-1和TMRE两种方法评估了HeLa细胞中CCCP造成线粒体损伤后不同MEC小分子对线粒体膜电势的恢复作用，如图4所示。

具体包括以下步骤：参考实施例2的方法进行JC-1探针的染色。四甲基罗丹明乙酯(TMRE)染料是一种膜渗透性的阳离子荧光探针，可对线粒体膜电位进行特异性识别，从而附着在线粒体中，并产生明亮荧光，在一定浓度下，罗丹明类染料对细胞具有低毒性，因此普遍用于检测动物细胞、植物细胞以及微生物中的线粒体。细胞处理与JC-1染色方法中描述一致，根据试剂商的说明将TMRE配制成5毫摩尔的储备液，在避光条件下与细胞共孵育20分钟，PBS洗涤一次，最后利用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄不同孔之间的荧光变化，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析。

结果显示，在100纳摩尔时，MEC1和MEC7对损伤线粒体膜电势的修复作用最强，MEC2和MEC18居中，MEC3和MEC19弱，MEC5和MEC13基本上无活性。单独的MEC1两端分子混合(NC，包括IKAM-1和2-苯基吲哚-3-乙醛酰胺各100纳摩尔)没有活性，与预期相符，验证了MEC需要以嵌合型分子形式才能起作用。AUTAC4在10微摩尔时具备修复线粒体损伤作用，但在100纳摩尔时无效，与文献报道吻合。

(2)SN4741神经细胞

采用JC-1检测线粒体膜电势，评估MEC1和MEC7小分子在SN4741细胞中对β-淀粉样肽1-42(Aβ_1-42)诱导的线粒体损伤的修复作用，如图5所示。

具体包括以下步骤：采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)的检测方法检测线粒体膜电位。将SN4741细胞(小鼠多巴胺能神经细胞)以每孔3万的密度分到24孔板中，加入Aβ_1-42(10μM)和不同的MEC(100nM)共处理72小时后，根据JC-1试剂盒的说明书进行染色30分钟后用PBS洗涤，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析。

结果显示，Aβ_1-42能明显损伤SN4741细胞，减低线粒体膜电位，MEC1和MEC7在100纳摩尔时均能有效恢复线粒体膜电势，证明这两种MEC分子对β-淀粉样肽1-42导致的线粒体损伤具有修复作用。

(3)SH-SY5Y神经细胞

(3-1)采用TMRE探针评估了人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中经CCCP(20微摩尔)与不同MEC小分子(100纳摩尔)共处理6小时后线粒体膜电势的变化。

具体包括以下步骤：将SH-SY5Y细胞以每孔10万的密度接种在24孔板中，过夜培养后，将不同MEC分子与CCCP共孵育6小时后，根据实施例2中Hela细胞的操作方法进行TMRE的染色。

如图6所示，结果显示MEC1具有明显的恢复CCCP损伤的线粒体膜电势的作用，MEC2和MEC3次之，而MEC5基本无修复作用。

(3-2)采用JC-1方法评估MEC1和MEC7小分子对CCCP诱导的SH-SY5Y细胞中线粒体损伤的修复功能。

具体包括以下步骤：将SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)细胞以每孔10万的密度接种在24孔板中，过夜培养后，将MEC1分子与CCCP共孵育6小时后，根据实施例2中Hela细胞的操作方法进行JC-1的染色。

结果如图7所示，在100纳摩尔时，MEC1和MEC7小分子均能恢复线粒体膜电势。

(4)血管平滑肌细胞

采用JC-1染色的方法在血管平滑肌细胞中评估了由血管紧张素II造成线粒体损伤后不同MEC小分子对线粒体膜电势的恢复作用。

具体包括以下步骤：将MOVAS细胞(小鼠主动脉血管平滑肌细胞)以每孔10万的密度接种在24孔板中，用1微摩尔的血管紧张素II刺激24小时后，分别加入100纳摩尔的MEC7、MEC13、MECl8、MECl9、AUTAC4、MEC7-Cont(IKAM-1和Vdac结合分子的简单混合)共处理6小时后，参照实施例2中的JC-1染色方案，评估不同分子处理后细胞线粒体膜电位的变化情况。

如图8所示，在100纳摩尔的MEC分子处理后，MEC1和MEC7对细胞线粒体膜电位的恢复效应最强，MEC18居中，MEC19较弱，MEC13和AUTAC4基本上无恢复效果。单独的MEC7两端分子叠加(MEC7cont)无恢复线粒体膜电势的能力，与预期相符。

以上数据充分说明在合成的MEC分子中MEC1和MEC7修复线粒体损伤的作用最强，后面的实施例将以MEC1为主开展。

实施例4MEC1在多种细胞中修复损伤线粒体作用

1)MEC1本身不引发线粒体损伤，无细胞毒性

·线粒体膜电势

A.Hela细胞

采用JC-1染色的方法评估在未损伤的Hela细胞中，MEC1处理后对线粒体膜电势的影响，具体包括以下步骤：将Hela细胞以每孔5万的密度接种在24孔板中，不同浓度的MEC1与细胞共孵育3小时，按照实施例2的Hela细胞的染色方法对细胞进行染色及分析。

如图9所示，结果显示，在未损伤的Hela细胞中，MEC1(1，10，100纳摩尔)分子处理3小时后对线粒体膜电势无显著影响。

B.SH-SY5Y神经细胞

采用TMRE探针评估在SH-SY5Y细胞中MEC1小分子处理后对线粒体膜电势的影响，具体包括以下步骤：参照实施例3中Hela细胞的处理方法对SH-SY5Y细胞进行TMRE的染色。

如图10所示，结果显示，在未损伤的SH-SY5Y细胞中，MEC1分子在1-100nM的浓度范围内处理6h不影响线粒体的膜电势。

·MitoSox

MitoSOX Red超氧化物指示剂是一种新型荧光染料，专门靶向活细胞中的线粒体。线粒体超氧化物氧化MitoSOX试剂后产生明亮的红色荧光。利用Mitosox探针评估了在未损伤的Hela细胞中MEC1小分子孵育后对线粒体ROS的影响，具体包括以下步骤：将Hela细胞以每孔5万的密度接种在24孔板上，过夜培养后，给予不同浓度的MEC1分子处理3小时，按照MitoSOX Red(超氧化物指示剂)的说明书进行避光染色20分钟，PBS洗涤一次，利用荧光显微镜进行拍摄。

如图11所示，结果显示，在未损伤的Hela细胞中给予1nM到10μM的MEC1小分子孵育3h后对线粒体ROS基本上无影响。

·ATP产生能力

萤火虫萤光素酶催化萤光素产生萤光时需要ATP提供能量，当萤火虫萤光素酶和萤光素都过量时，在一定的浓度范围内萤光的产生和ATP的浓度成正比。利用该原理评估在未损伤的Hela细胞中不同浓度的MEC1小分子处理24h对线粒体ATP产生能力的影响，具体包括以下步骤：将Hela细胞以每孔5万的密度接种在24孔板上，过夜培养后用不同浓度的MEC1或AUTAC4与细胞共孵育24小时，弃培养基上清后每孔加入500ul ATP检测裂解液，按照ATP检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司S0026)的方法用多功能酶标仪(BioTekSynergy H1)进行蛋白定量和发光检测。根据检测结果进行ATP定量。

如图12所示，结果显示，MEC1小分子在1nM到1μM(有效修复损伤线粒体的浓度区间)对线粒体产生ATP的功能无影响，但是在10μM的时候对线粒体产生ATP的功能具有一定的抑制作用。MEC1的两端分子A(IKAM-1)和T(2-苯基吲哚-3-乙醛酰胺)的简单混合对线粒体产生ATP的能力无影响，对照分子AUTAC4在100nM与10μM对线粒体产生ATP的能力无影响。

·细胞增殖

采用CCK8的方法检测1nM到10μM的浓度区间MEC1小分子在无损伤的Hela细胞中孵育24h后的细胞活力，具体包括以下步骤：将Hela细胞以每孔1万的密度接种在96孔板上，过夜培养后用不同浓度的MEC1与细胞共孵育24小时，随后每孔加入10ul CCK8试剂，在37℃、5％CO2、90％湿度条件下培养2小时后用多功能酶标仪(BioTek Synergy H1)在450nm波长处测量吸光度。

如图13所示，结果显示，MEC1在1nM到1μM的浓度区间不影响细胞活力，只有在10μM的时候MEC1具有一定(约20％)的细胞毒性作用。

2)MEC1在多种损伤细胞中修复线粒体损伤，增进线粒体功能，抑制细胞死亡

·线粒体膜电势

A.Hela细胞

采用TMRE探针对线粒体膜电势进行染色的方法评估了HeLa细胞中不同浓度MEC小分子对CCCP(20μM)处理3h造成的线粒体损伤的修复作用，具体包括以下步骤：根据实施例3中Hela细胞的TMRE染色方法进行染色及拍摄。

如图14所示，结果显示，MEC1小分子在1-100nM以浓度依赖方式修复CCCP造成的线粒体膜电势丧失，100纳摩尔时效果最佳，而在1μM和10μM时这种恢复作用反而随着MEC1浓度增加而减少，提示我们设计的MEC小分子与传统的protac小分子一样具有“Hook”效应。

B.SN4741神经细胞

在SN4741(小鼠多巴胺能神经细胞)细胞中采用TMRE探针对线粒体膜电势进行染色的方法，以CCCP(20μM)或者寡霉素(Oligomycin)+抗霉素(Antimycin)各10微摩尔处理6h造成线粒体损伤，评估了不同浓度的MEC1小分子共处理对线粒体膜电势的恢复作用，具体包括以下步骤：将SN4741细胞以每孔10万的密度接种在24孔板中，将MEC1分子与CCCP或者Oligomycin+Antimycin共孵育6小时后，根据实施例3中Hela细胞的TMRE染色方法进行染色及拍摄。

如图15所示，结果显示，MEC1小分子在1-100nM对CCCP或者Oligomycin+Antimycin引发的线粒体损伤均有浓度依赖的修复线粒体膜电势的作用，100纳摩尔时效果最佳。

C.SH-SY5Y细胞

采用TMRE探针及JC-1探针对线粒体膜电势进行染色的方法评估了SH-SY5Y细胞中MEC1小分子共处理对CCCP(20μM)处理6h造成的线粒体损伤的修复作用，具体包括以下步骤：根据实施例4中SH-SY5Y细胞的处理，进行染色及拍摄。

如图16所示，两种探针检测的结果均显示，MEC1恢复线粒体膜电势的作用具有浓度依赖效应，100纳摩尔时效果最好。

D.AML-12肝细胞

采用JC-1对线粒体膜电位进行检测，评估MEC1在CCCP处理及不处理的AML-12细胞中对线粒体膜电势的影响，具体包括以下步骤：用添加了15％的胎牛血清和1％的胰岛素的DMDM-F12培养AML-12细胞，待细胞在大皿中贴壁后将其消化后按照每孔10万细胞分到24孔板中，过夜后将细胞分为4组处理组，每组分别为未处理的对照组(Cont)，单独用100纳摩尔MEC1小分子处理6小时组(MEC1)，单独用20微摩尔CCCP处理6小时组(CCCP)和先用CCCP处理6小时后再用100纳摩尔MEC1处理4小时的联合组(CCCP+MEC1)，按照上述方法处理细胞后用JC-1试剂盒按照说明书对细胞进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后利用荧光显微镜拍摄每组细胞线粒体膜电位。

如图17所示，结果显示，MEC1小分子在肝细胞中能恢复CCCP损伤后的线粒体膜电势，但在无损伤细胞中不影响线粒体膜电势。

E.HEK293T细胞

采用JC-1探针对线粒体膜电势进行染色的方法评估了HEK293T细胞中经CCCP(20μM)处理6h造成线粒体损情况下给予不同浓度MEC1小分子共处理对线粒体膜电势的恢复作用，具体包括以下步骤：根据实施例4中SH-SY5Y细胞的处理，进行染色及拍摄。

如图18所示，结果显示，MEC1在10nM到100nM具有明显恢复线粒体膜电势的作用，而在1μM效果反而下降，提示MEC1小分子在HEK293T细胞中具有“Hook”效应。

·细胞内整体ROS及线粒体ROS(MitoSox)

A.Hela细胞

采用DCFH-DA和Mitosox两种探针分别对细胞内整体ROS和线粒体ROS进行染色，在20μM的CCCP及共孵育1nM、10nM和100nM的MEC1小分子3h后，评估ROS水平，具体包括以下步骤：根据实施例2中Hela细胞的处理进行细胞的接种及小分子的处理，然后根据DCFH-DA和MitoSOX的说明书进行染色，在避光的条件下探针与细胞孵育20分钟，PBS洗涤一次，在荧光显微镜下拍摄。

如图19所示，结果显示，HeLa细胞中MEC1小分子以浓度依赖性方式抑制整体ROS和线粒体ROS的产生，在100纳摩尔时效果最佳。

B.SH-SY5Y细胞

采用DCFH-DA探针对SH-SY5Y细胞内整体ROS进行染色，在20μM的CCCP处理并共孵育10nM、50nM和100nM的MEC1小分子6h后，评估ROS水平，具体包括以下步骤：将培养好的SH-SY5Y按照实施例3中SH-SY5Y的方法进行小分子的处理后，根据图19所描述的方法进行DCFH-DA的染色及拍摄。

如图20所示，结果显示，MEC1小分子具有浓度依赖性抑制整体ROS的能力，100纳摩尔时效果最佳。

C.SN4741细胞

采用Mitosox对SN4741细胞内线粒体活性氧进行检测，具体包括以下步骤：将培养好的SN4741细胞按照实施例3中SN-4741细胞的方法进行细胞处理后，根据图19所描述的方法进行MitoSox的染色及拍摄。

如图21所示，结果显示，100nM的MEC1和MEC7小分子均能有效抑制Aβ诱导的SN4741线粒体活性氧的升高。

·ATP产生能力

a.评估在CCCP损伤的Hela细胞中不同浓度的MEC1、MEC1两端小分子或AUTAC4对线粒体ATP产生能力的影响，具体包括以下步骤：将Hela细胞以每孔5万的密度接种在24孔板上，过夜培养后用50微摩尔CCCP和不同浓度的MEC1、MEC1两端小分子或AUTAC4与细胞共孵育24小时，弃培养基上清后每孔加入500微升ATP检测裂解液，按照ATP检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司S0026)的方法用多功能酶标仪(BioTek Synergy H1)进行蛋白定量和发光检测。根据检测结果进行ATP定量。

如图22所示，CCCP能显著降低ATP的产生，MEC1小分子在10和100nM显著恢复ATP产生能力，而在1nM无明显作用。阳性对照分子AUTAC4与文献报道一致，在10μM具有一定的恢复ATP产生能力的作用但在100nM时无效。与预期相符，MEC1的两端分子A(IKAM-1)和T(2-苯基吲哚-3-乙醛酰胺)的简单混合不具备恢复ATP产生的功能。

b.评估不同浓度的MEC1小分子在CCCP(50μM)处理24h的条件下，对SH-SY5Y细胞ATP产生能力的修复作用，具体包括以下步骤：将SH-SY5Y细胞以每孔5万的密度接种在24孔板上，过夜培养后用50微摩尔CCCP和不同浓度的MEC1与细胞共孵育24小时，弃培养基上清后每孔加入500微升ATP检测裂解液，按照ATP检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司S0026)的方法用多功能酶标仪(BioTek Synergy H1)进行蛋白定量和发光检测。

·细胞增殖

采用CCK8的方法检测1nM到10μM的浓度区间的MEC1小分子在CCCP诱导损伤的Hela细胞中孵育24h后的细胞活力，具体包括以下步骤：将Hela细胞以每孔1万的密度接种在96孔板上，过夜培养后用50微摩尔CCCP与不同浓度的MEC1共孵育24小时，随后每孔加入10ulCCK8试剂，在37℃、5％CO₂、90％湿度条件下培养2小时后用多功能酶标仪(BioTek SynergyH1)在450nm波长处测量吸光度。

如图23所示，结果显示，CCCP能显著诱导细胞死亡，MEC1小分子在1-100nM的浓度区间里梯度性地抑制CCCP诱导的细胞死亡，而在1μM和10μM效果不佳，10μM时反而促进细胞死亡，体现MEC1的“Hook”效应以及高浓度下可能的毒性效应。MEC1的两端分子A(IKAM-1)和T(2-苯基吲哚-3-乙醛酰胺)的简单混合不具备抑制细胞死亡的功能。

实施例5 MEC1小分子在HeLa细胞中通过增强线粒体自噬作用修复线粒体损伤

1)MEC1在无线粒体损伤HeLa细胞中不降解TSPO，也不诱导自噬

采用Western Blot的方法，评估MEC1小分子在无损伤Hela细胞中处理6h后，线粒体内膜和外膜蛋白及自噬水平的变化，具体包括以下步骤：将Hela细胞按照每孔5万分到24孔板中，待过夜贴壁后，将细胞按照以下方法处理，分别为未处理的对照组，单独用20微摩尔CCCP处理30分钟洗去换成新鲜培养基和先用CCCP处理30分钟后再用不同浓度梯度(1、5、10、50、100纳摩尔)MEC1处理细胞6小时，除去细胞上清后每孔加入80μL Sample Buffer后收集细胞裂解液，100℃煮样后用WB检测相关蛋白的表达情况。

如图24所示，结果显示，不同浓度的MEC1小分子在无线粒体损伤的细胞中既不降解线粒体膜蛋白(内幕蛋白TIM23和外膜蛋白TSPO)，也不增强自噬水平(LC3-II水平)。

2)MEC1在线粒体损伤细胞中以自噬依赖但非蛋白酶体依赖方式降解线粒体外膜蛋白TSPO及内膜蛋白TIM23

A.Hela细胞

首先，采用Western Blot及免疫荧光的方法，评估了经20μM的CCCP预处理30min并洗去，再加入MEC1小分子处理6h的Hela细胞中线粒体膜蛋白的变化，具体包括以下步骤：将Hela细胞按照每孔5万分到24孔板中，待过夜贴壁后，将细胞按照以下方法处理，分别为未处理的对照组，单独用20微摩尔CCCP处理30分钟洗去换成新鲜培养基和先用CCCP处理30分钟后再用不同浓度梯度(1、5、10、50、100纳摩尔)MEC1处理细胞6小时，对于western blot，除去细胞上清后每孔加入80μLSample Buffer后收集细胞裂解液，100℃煮样后用WB检测线粒体内膜外膜表达情况；对于免疫荧光，将MEC1小分子处理过的Hela细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗净，再用0.2％透膜剂透膜10分钟，PBS洗净，用5％BSA封闭后，与TSPO抗体过夜四度孵育，PBS洗涤三遍，再孵育荧光二抗，最后与核燃料DAPI孵育30分钟，最后采用荧光显微镜拍摄图片。

如图26所示，结果显示，MEC1小分子呈浓度依赖的方式降解线粒体内膜蛋白TIM23及外膜蛋白TSPO(图25a)。且免疫荧光结果显示MEC1小分子在CCCP诱导损伤后导致TSPO水平下降，提示降解(图25b)。为了进一步探索MEC1降解线粒体膜蛋白的分子途径，我们采用自噬抑制剂CQ和渥曼青霉素(wortmannin)以及蛋白酶体抑制剂MG132联合MEC1处理CCCP预处理过的Hela细胞。如图25c和25d所示，Western Blot结果显示MEC1降解线粒体膜蛋白的效应被CQ和渥曼青霉素阻断但不被MG132阻断，证明MEC1的作用依赖于自噬途径而非蛋白酶体途径。

B.SH-SY5Y细胞

根据图25中描述的方法，评估SH-SY5Y细胞经CCCP(20μM)预处理30分钟后，加入不同浓度的MEC1处理不同的时间对TIM23及TSPO的降解作用。

如图26所示，结果显示，MEC1小分子以浓度(图26a-b)和时间依赖的方式降解TIM23及TSPO。单独的MEC1小分子在不同浓度处理12h后无明显降解TSPO或TIM23的作用(图26c)。

3)MEC1进一步增强CCCP诱导的细胞自噬

根据图26中描述的方法处理Hela细胞，区别在于孵育不同的抗体，在此图中4℃过夜孵育LC3抗体。

如图27所示，western blot检测结果显示，100nM MEC1在HeLa细胞中进一步增强CCCP处理30分钟导致的LC3I型向II型的转换，说明MEC1进一步增强CCCP诱导的细胞自噬。

4)MEC1恢复CCCP损伤线粒体膜电势的作用不依赖于蛋白酶体但依赖于自噬

4-1)采用JC-1和Mitosox探针分别对线粒体膜电位和线粒体ROS进行染色，评估MEC1恢复CCCP损伤线粒体膜电势的作用，具体包括以下步骤：Hela细胞按实施例2中描述的方法进行处理，MEC1，CCCP及自噬抑制剂BafA1或蛋白酶体抑制剂MG132共孵育3小时后，按照JC-1及Mitosox说明书的方法进行染色。

如图28所示，结果显示，自噬抑制剂BafA1显著抑制MEC1小分子在CCCP损伤的Hela细胞中修复线粒体膜电势(图28a)及降低线粒体ROS(图28b)生成的作用，而蛋白酶体抑制剂MG132不能，证明MEC1小分子恢复线粒体膜电势和降低线粒体ROS产生的作用依赖于自噬而非蛋白酶体通路。

4-2)为了进一步评估MEC1修复损伤线粒体的作用依赖于自噬，我们构建了ATG5(一种自噬过程中必需的基因)敲除的Hela细胞,Western Blot验证了ATG5基因的完全敲除导致无ATG5蛋白产生(图29a)

(1)评估在ATG5敲除的Hela细胞中不同浓度的MEC1对CCCP损伤后线粒体ATP产生能力的影响，具体包括以下步骤：将ATG5敲除的Hela细胞以每孔5万的密度接种在24孔板上，过夜培养后用50微摩尔CCCP和不同浓度的MEC1与细胞共孵育24小时，弃培养基上清后每孔加入500微升ATP检测裂解液，按照ATP检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司S0026)的方法用多功能酶标仪(BioTek Synergy H1)进行蛋白定量和发光检测。根据检测结果进行ATP定量。

如图29(b)所示，在ATG5敲除的Hela细胞中CCCP显著降低ATP水平，而MEC1小分子在1-100nM均不能恢复ATP产生的能力，进一步证明MEC1小分子恢复ATP产生能力的作用依赖于自噬。

(2)采用JC-1、Mitosox探针分别对线粒体膜电位、线粒体ROS进行染色，评估ATG5敲除后MEC1修复CCCP损伤线粒体的作用，具体包括以下步骤：Hela细胞按实施例2中描述的方法进行处理，MEC1和CCCP共孵育3小时后，按照JC-1、Mitosox说明书的方法进行染色。

如图29(c)和(d)所示，在ATG5敲除细胞中CCCP显著损伤线粒体，导致线粒体膜电势降低和线粒体活性氧水平升高，而MEC1无恢复作用，证明MEC1小分子修复线粒体损伤的作用依赖于自噬。

5)MEC1增强损伤细胞中的线粒体自噬

5-1)在过表达GFP-LC3的Hela细胞中，用Mitotracker探针定位线粒体，评估MEC1小分子联合以及不联合CCCP处理对线粒体自噬的影响，具体包括以下步骤：将过表达GFP-LC3的Hela细胞按照每孔5万分到24孔板中，待过夜贴壁后，将细胞按照以下方法处理，每组分别为未处理的对照组(Cont)，单独用100纳摩尔MEC1小分子处理6小时组(MEC1)，单独用20微摩尔CCCP处理3小时组(CCCP)和用CCCP和100纳摩尔MEC1处理3小时的联合组(CCCP+MEC1)，按照上述方法处理细胞后用线粒体染色试剂盒按照说明书对细胞线粒体进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后利用荧光显微镜拍摄每组细胞的绿色荧光自噬体GFP和红色荧光的线粒体。

如图30所示，单独的MEC1处理后，Mitotracker与GFP-LC3无共定位，表明MEC1小分子本身不诱导线粒体自噬。CCCP处理能够在一定程度上导致Mitotracker与GFP-LC3共定位，而MEC1联合CCCP处理，进一步增强这种共定位，表明MEC1增强损伤Hela细胞中的线粒体自噬水平。

5-2)Keima蛋白具有在酸性和中性pH中荧光信号不同的特性，因此定位于线粒体的Keima(也可表示为mitoKeima)可显示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体，直观反映线粒体自噬的程度。在过表达parkin的Hela细胞中稳定表达mitoKeima，以CCCP处理诱导线粒体自噬，观察440nm通道(中性PH)和586nm通道(酸性PH)激发荧光信号的变化，具体包括以下步骤：将过表达Parkin蛋白和mitoKeima蛋白的Hela细胞以每孔5万的密度接种在24孔板中，CCCP处理3小时或不处理的情况下加入不同浓度的MEC1处理6小时，无须染色，直接在荧光显微镜下观察440nm和586nm通道下荧光的变化，并采用软件进行统一分析。

如图31所示，结果显示，在CCCP处理后再加入MEC1，则呈浓度依赖的586nm通道红色荧光增强，表明MEC1提高CCCP诱导的线粒体自噬。

5-3)此外，Mtphagy Dye通过化学结合，固定在细胞内的线粒体上，会发出较弱的荧光。当线粒体发生自噬，损伤的线粒体会与溶酶体融合，pH会下降，变成酸性，此时Mtphagy Dye会产生较强的荧光。在过表达GFP-parkin的Hela细胞中，使用Mtphagy Dye探针孵育1h后，洗去，再加入CCCP预处理30min，最后加入不同浓度的MEC1小分子。具体包括以下步骤：将过表达GFP-parkin蛋白的Hela细胞以每孔5万的密度接种在24孔板中，过夜培养后，先将Mtphagy Dye探针加载到细胞中孵育1小时，洗去，再给予不同浓度的MEC1分子处理6小时，无须再染色，在荧光显微镜中观察红色荧光的变化，并采用软件进行统一分析。

如图32所示，结果显示，CCCP预处理30分钟可诱导一定程度的线粒体自噬，而加入MEC1分子后，线粒体自噬明显增强，且随着MEC1浓度增加而增强。然而增强作用在MEC1浓度达到10μM时反而减弱，再次体现“Hook”效应。

实施例6MEC1小分子通过增强线粒体自噬修复损伤线粒体的机制验证

1)MEC1结合TSPO

CETSA(Cellular Thermal Shift Assay，细胞热转移实验)是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是靶蛋白与药物分子结合时往往具有保护作用。即随着温度的升高，蛋白会发生变性聚集，可以通过离心去除，而当蛋白结合药物后，相同温度下，变性蛋白的量会降低。

具体包括以下步骤：根据这个原理，按照图19描述的方法处理Hela细胞。对Hela细胞的抽提液均等分为5份，不同浓度的MEC1小分子与细胞抽提液冰上孵育1h，之后在55℃孵育5min，随后20000g离心30min，吸取上清进行免疫印迹的检测。

如图33所示，结果显示，MEC1在体外具有浓度依赖的保护TSPO蛋白的作用，而对UQURC1无作用，证明MEC1能结合TSPO。

2)MEC1结合MAP3K1的能力

采用CETSA技术，在MAP3K1-/-HELA细胞中过表达Flag-MAP3K1的细胞的抽提液中加入His-MAP3K1-CTD的纯化蛋白。将混合物均等分为5份，与不同浓度的MEC1分子共孵育，55℃变性5min，随后离心，制样，具体包括以下步骤：根据这个原理，按照图19描述的方法处理Hela细胞。对Hela细胞的抽提液均等分为5份，不同浓度的MEC1小分子与细胞抽提液冰上孵育1h，之后在55℃孵育5min，随后20000g离心30min，吸取上清进行免疫印迹的检测。

如图34所示，western blot结果显示MEC 1对Flag-MAP3K1及His-MAP3K1-CTD蛋白具有浓度依赖的结合作用。

3)MEC1与MAP3K1以及TSPO形成Ternary Complex

采用GST pull-down实验技术，在给予和不给予MEC1的条件下，检测GST-TSPO与His-MAP3K1-CTD的相互作用，具体包括以下步骤：在100微升的IP缓冲液中分别加入GST-TSPO蛋白(1微克)、GST-TSPO蛋白(1微克)+His-MAP3K1-CTD蛋白(1微克)、GST-TSPO蛋白(1微克)+MEC1((20纳摩尔/升)或GST-TSPO蛋白(1微克)+His-MAP3K1-CTD蛋白(1微克)+MEC1((20纳摩尔/升)室温孵育半小时后，加入10微升GST糖珠4℃孵育6小时后，300g离心5分钟后收集上清制样，沉淀加入IP缓冲液离心清洗3次后制样，利用免疫印迹的方法分别检测上清和沉淀中的His-MAP3K1-CTD蛋白，以沉淀中的GST-TSPO蛋白信号为对照。

如图35所示，western blot结果显示，仅在MEC1存在的情况下，GST-TSPO与His-MAP3K1-CTD存在明显的相互作用，证明MEC 1,MAP3K1及TSPO形成了Ternary complex。

4)MEC1招募MAP3K1到TSPO的时间效应

在10uM CCCP处理30min诱导线粒体损伤的Hela细胞中，分别用100nM MEC1小分子处理10min，30min和60min，如图36所示，邻位连接技术(PLA)显示，MEC1处理细胞10min后即存在MAP3K1与TSPO的相互作用，30min及60min后该相互作用进一步增强。

5)MEC1增强线粒体的K63泛素化

通过提取线粒体的方法，在Hela细胞中分别单独用100nM的MEC1小分子处理3h，10uM CCCP处理30min，或者10uM CCCP处理30min洗掉后用100nM的MEC1小分子处理3h后收集细胞沉淀提取细胞线粒体。

如图37所示，结果显示，MEC1单独处理或CCCP单独处理后线粒体K63泛素化显著增强，而MEC1和CCCP联合处理后线粒体K63泛素化进一步增强。另一方面，K48泛素化无明显变化。

6)MEC1增强TSPO和VDAC的K63泛素化

通过免疫共沉淀(co-IP)的方法，在293T细胞中分别外转空载质粒，带HA标签的泛素化质粒，带HA标签的K63泛素化质粒(所表达的带标签的泛素分子仅在K63位点可以发生泛素化，其它位点的K均已突变)和带HA标签的K48泛素化质粒(所表达的带标签的泛素分子仅在K48位点可以发生泛素化，其它位点的K均已突变)，转染24小时后用10uM CCCP处理30min，洗掉后用100nM的MEC1小分子在处理3h，HA标签抗体免疫沉淀后对TSPO和VDAC1进行检测。

如图38所示，结果显示CCCP和MEC1均导致TSPO以及VDAC的K63泛素化增加，两者联合处理则产生进一步增强的TSPO以及VDAC K63泛素化。

7)MEC1修复CCCP损伤线粒体的作用依赖于MAP3K1

构建了MAP3K1敲除的Hela细胞，通过WB(免疫印迹)验证MAP3K1蛋白在MAP3K1敲除的Hela细胞中不表达，如图39所示。

在WT HeLa，MAP3K1-/-Hela和MAP3K1-/-Hela外转带Flag标签MAP3K1的细胞中分别用20uM CCCP处理3h诱导线粒体损伤和用20uM CCCP与100nM的MEC1小分子共同处理细胞3h，具体包括以下步骤：将WT Hela和MAP3K1-/-Hela按照每孔5万细胞分到24孔板中，用lipo3000将带有Flag标签的MAP3K1外转到MAP3K1-/-Hela中，48小时后，对每种细胞系按照上述方法进行加药处理，处理完毕后利用JC-1对细胞线粒体膜电位进行染色并用荧光显微镜拍摄。

如图40所示，结果显示MEC1在MAP3K1-/-Hela中不能恢复CCCP损伤的线粒体膜电位，而在MAP3K1-/-Hela细胞中MEC1不能修复CCCP损伤导致的线粒体膜电位的丧失。对细胞总体ROS、线粒体ROS以及细胞增殖能力的评估得到同样结论，即在MAP3K1-/-Hela细胞中MEC1小分子修复线粒体损伤的作用丧失。

如图41所示，结果显示MEC1在在外转表达了带Flag标签MAP3K1的MAP3K1-/-Hela细胞中MEC1修复CCCP损伤线粒体膜电位的作用完全恢复。

在MAP3K1-/-Hela的细胞中分别用10nM CCCP处理30min和10uM CCCP处理30min后洗掉再用100nM的MEC1小分子处理细胞3h，采用提取线粒体的方法，具体包括以下步骤：将WT Hela和MAP3K1-/-Hela培养在大皿中，待细胞贴壁后对每种细胞系按照上述方法进行加药处理，处理完毕收集细胞沉淀，分离细胞线粒体后用WB对细胞泛素化和线粒体内膜和外膜进行检测。

如图42所示，结果显示，MEC1在MAP3K1-/-Hela中对线粒体K63和K48的泛素化均无影响。

和上面同样处理，收集细胞裂解液，WB检测，结果如图43显示MEC1在MAP3K1-/-Hela细胞中对线粒体外膜蛋白TSPO和内膜蛋白TIM23无降解作用。

8)MEC1修复CCCP损伤线粒体的作用依赖于TSPO

构建了TSPO敲除的Hela细胞，通过WB显示TSPO蛋白在TSPO敲除的Hela细胞中不表达，如图44所示。

在WT HeLa和TSPO-/-Hela细胞中分别用20uM CCCP处理3h诱导细胞线粒体损伤和用20uM CCCP与100nM的MEC1小分子共同处理细胞3h，采用JC-I和TMRE两种检测线粒体膜电位的方法，具体包括以下步骤：将WT Hela和TSPO-/-Hela每孔5万分在24孔板中，待细胞贴壁后对每种细胞系按照上述方法进行加药处理，处理完毕用JC-1和TMRE对细胞线粒体膜电位进行染色后用荧光显微镜拍摄。

如图45所示，结果显示，MEC1在WT HeLa中能有效恢复CCCP损伤的线粒体膜电势但在TSPO-/-Hela中不能，证明MEC1修复损伤线粒体的作用依赖于TSPO。和预期吻合，MEC7的作用不依赖于TSPO。

在WT HeLa和TSPO-/-Hela细胞中分别用20uM CCCP处理3h诱导细胞线粒体损伤和用20uM CCCP与100nM的MEC1小分子共同处理细胞3h，采用DCFH-DA检测细胞内ROS，具体包括以下步骤：具体实施步骤如上述图29相应的内容。

如图46所示，结果显示，MEC1在WT HeLa中能有效抑制CCCP处理产生的ROS但在TSPO-/-Hela中不能。MEC1在CCCP损伤的TSPO-/-Hela细胞中也不能恢复ATP产生能力。这些结果充分证明TSPO对MEC1修复损伤线粒体的作用是必须的。

构建带myc标签的全长的TSPO的质粒，外转到TSPO-/-Hela的细胞中，通过WB显示在TSPO-/-Hela的细胞中TSPO能够成功表达，如图47所示。

在WT HeLa,TSPO-/-Hela和TSPO-/-Hela外转带myc标签TSPO的细胞中分别用20uMCCCP处理3h诱导细胞线粒体损伤和用20uM CCCP与100nM的MEC1小分子共同处理细胞3h，具体包括以下步骤：

将WT Hela和TSPO Hela按照每孔5万细胞分到24孔板中，用lipo3000将带有Myc标签的TSPO外转到TSPO-/-Hela中，48小时后，对每种细胞系按照上述方法进行加药处理，处理完毕后利用JC-1和线粒体活性氧对细胞进行染色并用荧光显微镜拍摄。

如图48所示，结果显示MEC1在TSPO-/-Hela中不能恢复CCCP损伤的线粒体膜电位，也不能减少CCCP处理产生的线粒体ROS，而在WT HeLa以及外转表达了TSPO蛋白的TSPO-/-Hela中可以。进一步验证了TSPO在MEC1修复损伤线粒体过程中的关键作用。

9)MEC1修复CCCP损伤线粒体的作用依赖于NBR1

具体包括以下步骤：将WT Hela按照每孔5万细胞分到24孔板中，用lipo3000将NBR1敲低的siRNA外转到WT Hela中，48小时后将每孔细胞按照以下方式处理，分别为无处理的对照组(Cont)、20微摩CCCP处理细胞3小时和20微摩CCCP与100纳摩MEC1同时处理3小时后收集细胞沉淀进行WB和进行线粒体膜电位染色。

如图49所示的三张图分别显示NBR1特异性siRNA在HeLa细胞中有效敲低NBR1的表达，导致MEC1抑制CCCP产生线粒体ROS以及修复CCCP损伤线粒体膜电势的作用丧失。证明MEC1的作用需要选择性自噬受体蛋自NBR1。

10)MEC1修复CCCP损伤线粒体的作用依赖于Nur77

如图50所示，在WT HeLa细胞中分别用单独的100nM的MEC1小分子，20uM CCCP处理3h诱导细胞线粒体损伤和用20uM CCCP与100nM的MEC1小分子共同处理细胞3h，采用免疫荧光检测Nur77蛋白的方法，具体包括以下步骤：将WT Hela每孔5万分在24孔板中，待细胞贴壁后对每种细胞系按照上述方法进行加药处理，处理完毕用Nur77抗体和DAPI对细胞中Nur77和细胞核进行染色后用荧光显微镜拍摄。将WT Hela每孔1万分在96孔板中，待细胞贴壁后对每种细胞系按照上述方法进行加药处理，处理完毕后用邻位连接技术对细胞进行染色后荧光显微镜拍摄。将WT Hela每孔5万分在24孔板中，用lipo3000将Nur77敲低的siRNA外转到WT Hela中待细胞贴壁后对每种细胞系按照上述方法进行加药处理，处理完毕后后收集细胞沉淀进行WB和进行线粒体活性氧染色。

如图50所示的三张图分别显示了在HeLa细胞中CCCP处理导致Nur77出核，MEC1在CCCP导致线粒体损伤情况下大量招募Nur77到线粒体外膜，Nur77被敲低后导致MEC1修复损伤线粒体的作用消失。

实施例7MEC1小分子在巨噬细胞(BMDM)中通过增强线粒体自噬抑制NLRP3炎症小体

1)MEC1在巨噬细胞中不影响细胞增殖，也不诱发细胞死亡

采用CCK-8细胞增殖检测实验，评估MEC1在脂多糖LPS处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中的细胞增殖情况，如图51所示。

具体包括以下步骤：用含10％胎牛血清FBS和20纳克每毫升的巨噬细胞集落刺激因子M-CSF的DMEM培养基培养分化骨髓细胞，7天后贴壁的即为BMDM细胞。按照每孔6万细胞分至96孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再加入1纳摩尔MEC1处理24小时的联合组(LPS+1nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入10纳摩尔MEC1处理24小时的联合组(LPS+10nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入100纳摩尔MEC1处理24小时的联合组(LPS+100nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入1微摩尔MEC1处理24小时的联合组(LPS+1uMMEC1)，每组三个复孔。随后每孔加入10微升CCK-8检测试剂，避光处理2小时，最后使用BioTek Synergy H1酶标仪在450纳米处测定吸光度。

结果显示，MEC1小分子不影响巨噬细胞的增殖。

采用乳酸脱氢酶LDH细胞毒性检测实验，评估MEC1在脂多糖LPS处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中的细胞毒性，如图52所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔10万细胞分至96孔中并按如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用10微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理1小时组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时再加入10纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+10nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入50纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+50nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入100纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+100nM MEC1)，每组三个复孔。随后按照乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒说明书处理细胞，最后使用BioTek Synergy H1酶标仪在490纳米处测定吸光度。

结果显示，经LPS预处理后，Nigericin诱导BMDM细胞死亡，而MEC1不会诱发巨噬细胞死亡。

2)MEC1不影响巨噬细胞的基础自噬水平

采用蛋白免疫印迹Westem Blot实验，评估MEC1在LPS处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中的自噬情况，如图53所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：未经处理的细胞组(Cont)，单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再加入10纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+10nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入50纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+50nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入100纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+100nM MEC1)。随后收取细胞裂解液，利用Western Blot方法检测细胞中LC3I和LC3II的含量。

结果显示，MEC1处理后没有影响LC3I型和II型的转换，说明MEC1不影响BMDM的基础自噬水平。

3)MEC1在巨噬细胞中提高NLRP3炎症小体活化所引发的线粒体自噬水平

采用线粒体自噬染料Mtphagy Dye染色实验，评估MEC1在脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中的线粒体自噬情况，如图54所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后参考实施例5-3的染色方法进行细胞染色，随后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用5微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理3小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1)，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析，荧光图比例尺为20微米。

结果显示，LPS+Nig通过活化NLRP3炎症小体引发线粒体损伤，而MEC 1能够显著增强LPS+Nig线粒体损伤后的Mtphagy Dye红色荧光，说明MEC1能够提高NLRP3炎症小体活化所引发的线粒体自噬水平。

4)MEC1抑制LPS+Nig导致的NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡(野生型BMDM)

采用酶联免疫吸附ELISA实验，评估MEC1在脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中IL-1β和TNF-α的释放，如图55所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用5微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入1纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+1nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入10纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+10nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入50纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+50nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+100nM MEC1)。随后收取细胞培养上清，按照鼠IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒说明书检测上清中IL-1β和TNF-α的含量，最后使用BioTek Synergy H1酶标仪在450纳米处测定吸光度，利用Elisa Calc软件进行数据分析。

结果显示，MEC1能够浓度依赖地抑制NLRP3依赖的炎性因子IL-1β的释放，但不影响NLRP3非依赖的炎性因子TNF-α的释放，说明MEC1能够抑制LPS+Nig导致的NLRP3炎症小体活化。

采用乳酸脱氢酶LDH细胞毒性检测实验，评估MEC1在脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中的细胞焦亡情况，如图56(a)所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔200微升10万细胞分至96孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：未经处理的细胞组(Cont)，最大酶活性组(Max)，单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用10微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理1小时组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入10纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入10微摩尔Nigericin处理1小时组(LPS+Nig+10nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入50纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入10微摩尔Nigericin处理1小时组(LPS+Nig+50nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入10微摩尔Nigericin处理1小时组(LPS+Nig+100nM MEC1)，每组三个复孔。随后按照乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒说明书处理细胞，最后使用BioTek Synergy H1酶标仪在490纳米处测定吸光度。

结果显示，LPS+Nig诱导细胞焦亡释放LDH，而MEC1浓度依赖地抑制LDH的释放，说明MEC1抑制LPS+Nig所导致的细胞焦亡。

采用蛋白免疫印迹Western Blot实验，评估MEC1在脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中的细胞焦亡情况，如图56(b)所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用5微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入10纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+10nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入50纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+50nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+100nM MEC1)。随后收取细胞裂解液，利用Western Blot方法检测细胞中Gasdermin D的含量。

结果显示，LPS+Nig诱导了Gasdermin D剪切介导的BMDM细胞焦亡，而100纳摩尔的MEC1抑制了Gasdermin D的剪切，说明MEC1抑制LPS+Nig所导致的细胞焦亡。

5)MEC1抑制LPS导致的CAPS NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡(CAPS突变BMDM)

CAPS是NLRP3突变引起的自身炎症性疾病，有CAPS突变的NLRP3炎症小体仅需要LPS一个信号就能激活。

采用酶联免疫吸附ELISA实验，评估MEC1在LPS处理和不处理的CAPS小鼠骨髓来源巨噬细胞CAPS BMDM中IL-1β的释放情况，如图57(a)所示。

具体包括以下步骤：用含10％胎牛血清FBS和20纳克每毫升的巨噬细胞集落刺激因子M-CSF的DMEM培养基培养分化骨髓细胞，7天后贴壁的即为CAPS BMDM细胞。按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：未经处理的细胞组(Cont)，单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(LPS)，先用LPS处理3小时再加入10纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+10nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入50纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+50nM MEC1)，先用LPS处理3小时再加入100纳摩尔MEC1处理6小时的联合组(LPS+100nM MEC1)。随后收取细胞培养上清，按照鼠IL-1β的ELISA试剂盒说明书检测上清中IL-1β的含量，最后使用BioTek Synergy H1酶标仪在450纳米处测定吸光度，利用Elisa Calc软件进行数据分析。

结果显示，MEC1在CAPS BMDM中能够浓度依赖地抑制LPS诱导的IL-1β的释放，说明MEC1能够抑制NLRP3炎症小体活化。

采用Mitosox对线粒体超氧化物进行检测，评估MEC 1在LPS处理和不处理的CAPS小鼠骨髓来源巨噬细胞CAPS BMDM中线粒体ROS的水平，如图57(b)所示。

细胞处理方式同上，随后按照Mitosox试剂盒说明书对细胞进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析，荧光图的比例尺为20微米。

结果显示，LPS处理CAPS BMDM后红色荧光增强，而MEC1浓度依赖地减弱了红色荧光，说明MEC1能够浓度依赖地降低线粒体ROS的水平。

采用蛋白免疫印迹Westem Blot实验，评估MEC1在脂多糖LPS处理和不处理的CAPS小鼠骨髓来源巨噬细胞CAPS BMDM中的细胞焦亡情况，如图57(c)所示。

细胞处理方式同上，随后收取细胞裂解液，利用Western Blot方法检测细胞中Gasdermin D的含量。

结果显示，LPS诱导了Gasdermin D剪切介导的CAPS BMDM细胞焦亡，而MEC1浓度依赖地抑制了Gasdermin D的剪切，说明MEC1抑制LPS诱导的细胞焦亡。

6)MEC1在巨噬细胞中减弱NLRP3炎症小体活化引发的线粒体损伤

采用JC-1对线粒体膜电位进行检测，评估MEC1评估MEC1在脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中对线粒体膜电势的影响，如图58所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用5微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理3小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1)，随后按照JC-1试剂盒说明书对细胞进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析，荧光图的比例尺为20微米。

结果显示，LPS+Nig处理导致红色荧光减弱，绿色荧光增强，显示线粒体膜电位丧失，而100纳摩尔的MEC1增强LPS+Nig处理后的红色荧光，同时减弱绿色荧光，说明MEC1能够恢复线粒体膜电位。

采用活性氧ROS检测实验，评估MEC1评估MEC1在脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中对整体ROS的影响，如图59(a)所示。

细胞处理方式同上，随后按照ROS试剂盒说明书对细胞进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析，荧光图的比例尺为20微米。

结果显示，LPS+Nig处理导致绿色荧光增强，细胞ROS水平升高，而100纳摩尔的MEC1有效降低绿色荧光，说明MEC1抑制整体ROS水平。

采用Mitosox对线粒体超氧化物进行检测，评估MEC1在脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM细胞中线粒体ROS的水平，如图59(b)所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用5微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入10纳摩尔MEC1处理3小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+10nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入50纳摩尔MEC1处理3小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+50nM MEC1)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理3小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+100nM MEC1)，随后按照Mitosox试剂盒说明书对细胞进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析，荧光图的比例尺为20微米。

结果显示，LPS+Nig处理导致红色荧光增强，线粒体ROS水平升高，而MEC1能够浓度依赖地降低红色荧光，说明MEC1抑制线粒体ROS水平。

采用Lysotracker对溶酶体进行检测，评估MEC1在脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中对溶酶体的影响，如图60所示。

细胞处理方式同上，随后按照Lysotracker试剂盒说明书对细胞进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析，荧光图的比例尺为20微米。

结果显示，LPS+Nig处理导致绿色荧光减弱，溶酶体损伤，而MEC1能够浓度依赖地增强绿色荧光，说明MEC1能够修复溶酶体损伤。

7)BMDM中MEC1修复损伤线粒体的效应依赖于自噬

采用酶联免疫吸附ELISA实验，评估自噬抑制剂巴菲霉素Bafilomycin A1对LPS+Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中MEC1修复损伤线粒体的作用，如图61(a)所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用5微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1和100纳摩尔Bafilomycin A1联合处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1+BafA1)，随后收取细胞培养上清，按照鼠IL-1β的ELISA试剂盒说明书检测上清中IL-1β的含量，最后使用BioTek Synergy H1酶标仪在450纳米处测定吸光度，利用Elisa Calc软件进行数据分析。

结果显示，MEC1抑制IL-1β的释放，而自噬抑制剂BafA1阻断了MEC1对IL-1β的抑制效应，说明MEC1修复损伤线粒体作用依赖于自噬途径。

采用蛋白免疫印迹Western Blot实验，评估自噬抑制剂巴菲霉素BafilomycinA1对LPS+Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中MEC1修复损伤线粒体的作用，如图61(b)所示。

细胞处理方式同上，收取细胞裂解液，进行TSPO和TIM23的Western Blot检测。

结果显示，MEC1能够导致TSPO和TIM23降解，而自噬抑制剂BafA1阻断了MEC1降解TSPO和TIM23的效应，说明MEC1修复损伤线粒体的作用依赖于自噬途径。

采用酶联免疫吸附ELISA实验，评估蛋白酶体抑制剂MG132对LPS+Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中MEC1修复损伤线粒体的作用，如图62(a)所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用5微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1和20微摩尔MG132联合处理6小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1+MG132)，随后收取细胞培养上清，按照鼠IL-1β的ELISA试剂盒说明书检测上清中IL-1β的含量，最后使用BioTekSynergy H1酶标仪在450纳米处测定吸光度，利用Elisa Calc软件进行数据分析。

结果显示，MEC1能够抑制IL-1β的释放，蛋白酶体抑制剂MG132不能阻断MEC1对IL-1β的抑制效应，说明MEC1修复损伤线粒体作用不依赖于蛋白酶体途径。

采用蛋白免疫印迹Western Blot实验，评估蛋白酶体抑制剂MG132对LPS+Nigericin联合处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中MEC1修复损伤线粒体的作用，如图62(b)所示。

细胞处理方式同上，收取细胞裂解液，进行TSPO和TIM23的Western Blot检测。

结果显示，MEC1能够导致TSPO和TIM23降解，而蛋白酶体抑制剂MG132不能阻断MEC1降解TSPO和TIM23的效应，说明MEC1修复损伤线粒体的作用不依赖于蛋白酶体途径。

采用Mitosox对线粒体超氧化物进行检测，评估Bafilomycin A1和MG132在LPS+Nigericin处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中MEC1对线粒体ROS的作用，如图63(a)所示。

具体包括以下步骤：将BMDM细胞按照每孔30万细胞分至24孔中，过夜后将培养基换成减血清培养基Opti-MEM，并按照如下分组方式处理：单独100钠克每毫升脂多糖LPS处理组(Mock)，先用LPS处理3小时再用5微摩尔尼日利亚菌素Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1处理3小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1和100纳摩尔Bafilomycin A1联合处理3小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1+BafA1)，先用LPS处理3小时，加入100纳摩尔MEC1和20微摩尔MG132联合处理3小时，最后加入5微摩尔Nigericin处理30分钟组(LPS+Nig+MEC1+MG132)，随后按照Mitosox试剂盒说明书对细胞进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescencemicroscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析，荧光图的比例尺为20微米。

结果显示，MEC1抑制线粒体ROS水平，BafA1+MECl红色荧光恢复，MG132+MEC1红色荧光不能恢复，说明MEC1修复损伤线粒体的效应依赖于自噬途径而非蛋白酶体途径。

采用活性氧ROS检测实验，评估Bafilomycin A1和MG132在LPS+Nigericin处理和不处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞BMDM中MEC1对整体ROS的作用，如图63(b)所示。

细胞处理方式同上，随后按照ROS试剂盒说明书对细胞进行染色，染色30分钟后用PBS洗涤，最后用荧光显微镜(Nikon TI fluorescence microscopy；Nikon，TI-DH，Japan)拍摄，采用尼康相机自带的软件进行图像的分析，荧光图的比例尺为20微米。

结果显示，MEC1降低整体ROS水平，BafA1+MEC1绿色荧光恢复，MG132+MEC1绿色荧光不能恢复，说明MEC1修复损伤线粒体的效应依赖于自噬途径而非蛋白酶体途径。

实施例8MEC1小分子在小鼠体内抑制NLRP3炎症小体活化

1)MSU诱导的腹膜炎模型

将8周龄C57B16小鼠随机分为模型组和给药组，给药组分MEC1 1μg组和MEC1 5μg组，给药组于前一天腹腔注射MEC1小分子，模型组平行腹腔注射生理盐水，第二天给药组腹腔注射MEC1小分子，模型组平行注射生理盐水，1小时后按50mg/kg剂量腹腔注射MSU混悬液，6小时后取腹腔灌洗液，流式细胞仪检测单核细胞比例，以及ELISA检测IL-1β水平，具体包括以下步骤：

流式细胞仪检测单核细胞：用1ml PBS缓冲液冲洗小鼠腹腔收集到1.5ml EP管中，2000rpm，离心10min弃上清，加入1ml红细胞裂解液，2-3min；9ml DMEM中和，2000rpm，10min离心；弃上清，1ml DMEM重悬，过滤至1.5ml Ep管，3000rpm，1min离心；弃上清，80μ1血清冰上封闭30min；混匀，取5μl/管到100μl PBS+Ab(1y6G pp5.5)，冰上30min；加入1ml PBS，3000rpm，5min，再用300μl PBS重悬，过滤至流式管中准备上机检测。

Elisa检测IL-1β的水平：

1、从板框上取下待用的微孔板条，将剩余的板条放回装有干燥剂的铝箔袋中，然后重新密封保存。

2、每孔加入1x洗涤缓冲液350μL，静置40秒后弃去液体，该步骤共洗涤3次。

3、在空白孔中添加100μL标准品/样本稀释液(R1)。

4、在其他孔中分别加入100μL不同浓度的标准品或样品，用提供的封板膜封闭板孔，37℃孵育2小时。

5、在使用前15分钟配制好生物素化抗体(100x)工作液。

6、弃去孔中液体，重复步骤2中的洗涤步骤。

7、每孔中加入生物素化抗体工作液(100μL/孔)，并盖上新的封板膜，37℃下孵育1小时。

8、使用前15分钟配制好链霉亲和素-HRP(100x)的工作液。

9、弃去孔中液体，重复步骤2中的洗涤步骤。

10、每孔中加入链霉亲和素-HRP工作液(100μL/孔)，并盖上新的封板膜，37℃孵育30分钟。

11、预热酶标仪。

12、弃去孔中液体，重复步骤2中的洗涤步骤。

13、向孔中加入TMB底物(100μL/孔)。在37℃下避光孵育15-20分钟14。加入终止液(50μL/孔)，并立即放入酶标仪，在5min内测定每个孔450nm的OD值。

如图64所示，结果显示，MEC1 5μg组单核细胞水平和IL-β水平明显低于模型组。

2)ALUM诱导的腹膜炎模型

将8周龄C57B16小鼠随机分为模型组和给药组，给药组分MEC1 5μg组和MEC1 12.5μg组，给药组于前一天腹腔注射MEC1小分子，模型组平行腹腔注射生理盐水，第二天给药组腹腔注射MEC1小分子，模型组平行注射生理盐水，1小时后按50mg/kg剂量腹腔注射ALUM混悬液，6小时后取腹腔灌洗液，流式细胞仪检测单核细胞比例以及ELISA检测IL-1β水平，具体包括以下步骤：Elisa检测IL-1β的水平和流式细胞仪检测同MSU诱导的腹膜炎模型。

如图64所示，结果显示MEC1 5μg组单核细胞水平和IL-β水平均低于模型组。

3)LPS+D-Gal诱导急性肝损伤模型

将9周龄C57B16小鼠随机分为模型组和给药组，给药组分MEC10.125mg/kg、0.5mg/kg和2mg/kg三组，给药组于前一天腹腔注射MEC1小分子，模型组平行腹腔注射生理盐水，第二天给药组腹腔注射MEC1小分子，模型组平行注射生理盐水，1小时后腹腔注射80μg/kgLPS+200mg/kg D-Gal，5小时后取血，离心取上清用于转氨酶检测。

如图65所示，LPS+D-Gal导致严重肝损伤，AST和ALT两种转氨酶均显著升高，MEC1剂量依赖地抑制肝损伤，0.5mg/kg剂量最佳，但2mg/kg时反而作用下降，提示在活体动物中也存在细胞实验中明显的”hook”效应。

实施例9MEC1小分子在高脂诱导的小鼠肥胖模型中的预防及治疗效应

1)体重变化：4周龄雄性C57Bl6小鼠适应环境一周后分为正常饲料组和60％高脂饲料组，每周称量小鼠体重变化，第九周开始将高脂饲料组进一步分为高脂对照组(HFD)和高脂给药组(HFD+MEC1 5μg)，高脂给药组每隔一天腹腔注射MEC1小分子(5μg)，普通饲料组和高脂对照组平行腹腔注射生理盐水，直到第19周。MEC1的给药溶液配置如下：称取5mgMEC1小分子粉末溶于500μl DMSO中，配成10mg/ml的母液，稀释时用含1％吐温-80的生理盐水溶解，每只小鼠腹腔注射100μl。

如图66(a)所示，结果显示，从给药那天开始，相较高脂对照组，高脂给药组体重增加显著减缓，其体重增加速度回复到正常饲料组的水平。第19周的小鼠代表性图片见图66(b)。

2)代谢笼：使用综合实验室监测系统(哥伦布仪器)监测连续48小时同时监测正常小鼠(ND)、高脂饲养小鼠(HFD)以及给予MEC1治疗的高脂饲养小鼠(HFD+MEC1)的耗氧量(VO₂)和二氧化碳产生(VCO₂)，数值按体重归一化。周龄性别相同但用常规饲料喂养的小鼠(ND)作为对照，具体包括以下步骤：

将待检测的每只小鼠放置到综合实验室监测系统(哥伦布仪器)的独立笼盒中，小鼠可以自由获得水和对应的饲料，在22±0.5℃的恒温条件下维持12h的光暗循环，在饲养过程中利用该系统测量单笼小鼠的氧气消耗和二氧化碳产生，连续测量48个小时，以反映单个小鼠的能量消耗。

如图67所示，结果显示，与常规饲料喂养的对照小鼠相比，高脂喂养的小鼠(HFD)的VO₂和VCO₂均显著下降，但MEC1给药组小鼠(HDF+MEC1)的二氧化碳产生和氧气消耗有相当程度恢复，提示MEC1能促进肥胖小鼠的脂肪能量消耗。

3)葡萄糖耐受试验(GTT)

具体包括以下步骤：

小鼠禁食16小时，期间不禁水，按1.5mg/g的剂量给小鼠腹腔注射50％高糖溶液，用三诺牌血糖仪分别在注射前(0分钟)、注射后15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟后采用血糖试纸检测小鼠尾静脉血糖。

如图68(a)所示，结果显示，高脂对照组的血糖在30分钟后的时间点均显著高于普通饲料组，体现降低的葡萄糖清除能力，而给予MEC1的小鼠葡萄糖耐受能力有所恢复。对120min内的曲线下面积进行计算，如图68(b)所示，结果显示，高脂给药组与高脂模型组相比具有统计学差异。

4)对小鼠进行解剖，取附睾白色脂肪(eWAT)、腹股沟白色脂肪(iWAT)以及棕色脂肪(BAT)，并测量其重量。如图69所示，结果显示，与HFD组比较，HDF+MEC1组小鼠脂肪重量均显著低于HFD组。

5)小鼠采用摘眼球取血的方法，取全血到1.5ml EP管中，约600μl。静置5分钟，3000rpm离心10min，取上清至另一新的1.5ml EP管中，用自动生化检测仪检测ALT、AST、总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白等指标，其中ALT和AST是肝功能的两个指标，总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白是脂肪代谢的重要指标。

如图70所示，结果显示，与HFD组相比，HFD+MEC1组上述各项指标均低于HFD组，提示MEC1能减少肝脏脂肪合成并抑制高脂导致的肝损伤。

6)肝脏和脂肪组织用4％多聚甲醛固定后做HE染色，具体包括以下步骤：①肝脏组织在甲醛溶液中固定后，进行逐级乙醇脱水，然后用石蜡包埋；染色之前将组织切成4μm的薄片，脱蜡之后进行H&E染色如下：

②苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

③伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

④脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇III5min-二甲I 5min-二甲苯II 5min透明，中性树胶封片。

如图71所示，结果显示，肝脏组织中HFD组有明显的脂滴空泡，相较与HFD组，HFD+MEC1组脂滴较小。脂肪组织中结果显示，HFD组脂肪细胞明显增大，相较于HFD组，HFD+MEC1组脂肪细胞数量增多且体积变小。比例尺为40μm。

7)肝脏和脂肪组织通过电镜(Tecnai G2 Spirit)观察线粒体。

如图72所示，结果显示，在肝脏及脂肪组织中，正常饲料组(ND)具有正常的线粒体形态，不皱缩，线粒体的嵴分布整齐而高脂饲养组(HFD)线粒体明显皱缩，线粒体变小，此外线粒体的嵴难以分辨。而给予MEC1治疗后，线粒体形态有所恢复，可见嵴的分布。比例尺为5μm。

8)转录组测序：为了进一步探究MEC1治疗肥胖的机制，我们对肝脏组织进行了RNA测序。具体包括以下步骤：

①肝脏RNA提取

向肝脏组织匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5分钟。12000g 4℃离心15分钟后，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，吸取上清液转移至另一新的离心管中。向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，冰上静置10分钟。将已经加入异丙醇的样品分批转移至RNA提取柱上，12000g×1min离心弃掉收集管中的液体，直到所有的样品都过柱好。加入乙醇到RNA提取柱中，12000g×1min弃掉收集管中的液体，重复该步骤一次。最后一次弃掉收集管中的液体后，空转一次，12000g×1min，彻底甩干提取柱中的乙醇。

②RNA文库构建与质检：

肝脏组织提取的总RNA通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，随后在Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成eDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选370～420bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。文库构建完成后，先使用Qubit2.0Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nM)，以保证文库质量。

③数据分析

测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)。测序获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads。为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对原始数据进行过滤。主要包括去除带接头(adapter)的reads、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、去除低质量reads(Qphred＜＝20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。同时，对clean data进行Q20，Q30和GC含量计算。后续所有分析均是基于clean data进行的高质量分析。

使用STAR-2.5.2b软件将测序读数与小鼠参考基因组GRCm38进行比对。简而言之，对表达值进行归一化并使用DeSeq2包进行差异表达分析。使用R中的Pheatmap库进行归一化计数后，使用z分数生成热图。基因集富集分析(GSEA)使用从MSigDB下载的软件(版本4.2.3)进行重新排序，用于评估与对照组相比，HFD小鼠的MEC1处理肝组织中是否显着富集了特定基因。

对脂质合成相关基因的表达水平分析在图73的(a)中可见，相当一部分脂质合成相关基因在高脂模型组小鼠(HFD)中的表达水平显著高于常规饲料组小鼠(ND)，但这些基因的表达水平在高脂给药组小鼠(HFD+MEC1)中降低。基因集的富集评分分析(ES，见图73的(b))进一步支持脂质合成相关基因倾向于在高脂模型组小鼠高表达但MEC1给药遏制这个倾向的结论。上述结果提示，MEC1抑制高脂喂养下的小鼠肥胖作用有可能是通过减少肝脏组织的脂质合成这个机制实现的。

9)对转录组测序结果里面线粒体自噬相关基因进行了分析，如图74所示，结果显示，MEC1组与HFD组相比，对LC3(Mapllc3b)，ATG13，NBR1，ATG9A及ULK1等自噬相关基因有个明显的上调作用，进一步证明MEC1小分子通过增强线粒体自噬对肥胖具有改善作用。

最后说明的是，以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种增强线粒体自噬的嵌合分子，其特征在于，所述嵌合分子的结构如式1所示：

M-L-O

式1

其中，M表示MAP3K1的配体，L表示连接链，O表示线粒体外膜蛋白的配体；

M的结构式包括：

L为烷氧基类链，包括：-(CH₂CH₂O)_a-、-(CH₂CH₂CH₂O)_b-，其中a、b分别为大于等于1的自然数。

2.根据权利要求1所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，其特征在于，所述线粒体外膜蛋白包括TSPO、VDAC、MIRO1、MFN等。

3.根据权利要求2所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，其特征在于，所述O的结构式包括：

其中，X为卤素。

4.根据权利要求1所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，其特征在于，所述嵌合分子的结构式如式2或式3所示：

其中，n为1-10的自然数；X¹为卤素；

其中，m为1-10的自然数；X²、X³、X⁴均为卤素。

5.根据权利要求1所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，其特征在于，所述X选自氟、氯、溴、碘中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，其特征在于，n为1-5的自然数。

7.根据权利要求4所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，其特征在于，m为1-5的自然数。

8.根据权利要求4所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，其特征在于，所述嵌合分子选自：

9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-6中任一项所述的增强线粒体自噬的嵌合分子，以及任选的药用辅料。

10.权利要求1-8任一项所述的增强线粒体自噬的嵌合分子、权利要求9所述的药物组合物在制备预防或治疗线粒体功能障碍的疾病的药物中的应用。