CN117580960A - 反应产物消化中的改进或与反应产物消化有关的改进 - Google Patents

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Abstract

本文披露了一种引起体外合成的核酸(尤其是DNA)的酶消化的方法，该方法包括以下步骤：(a)在存在暂时基本上无活性的核酸酶的情况下，将试剂合并以形成体外合成的核酸；以及(b)随后在经过足以允许检测该体外合成的核酸的一段时间后，许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性，使得该体外合成的核酸被该核酸酶消化。

Description

反应产物消化中的改进或与反应产物消化有关的改进
技术领域
本发明提供了一种引起核酸的酶消化的方法，以及可用于进行该方法的组合物。
背景技术
对于本领域技术人员来说，在存在核苷三磷酸(NTP)和核酸聚合酶的情况下，在温度、pH和盐浓度的合适反应条件下，使用合适的模板分子合成核酸是一个简单的过程。
此外，已经操纵核酸合成反应的原理来实现合成多个拷贝的目的核酸序列的核酸扩增反应。因此，这种扩增反应能够形成以下高灵敏度测定的基础，其中目的序列最初可能以非常低的拷贝数存在于样品中，但是通过扩增程序产生多个拷贝的该序列，从而简化了对目的序列的存在的检测。
设计的第一个核酸扩增程序是聚合酶链反应(PCR)，随后开发了许多其他核酸扩增技术，其中大多数是等温的，从而避免了对热循环的需要，而热循环是PCR的基本要求。
此类等温扩增技术的非详尽列表包括：信号介导的RNA扩增技术(“SMART”；WO 99/037805)；基于核酸序列的扩增(“NASBA”，Compton 1991 Nature[自然]350,91-92)；滚环扩增(“RCA”，例如参见Lizardi等人,1998 Nature Genetics[自然遗传学]19,225-232)；环介导的扩增(“LAMP”，参见Notomi等人,2000 Nucl.Acids Res.[核酸研究]28,(12)e63)；重组酶聚合酶扩增(“RPA”，参见Piepenberg等人,2006 PLoS Biology[PLoS生物学]4(7)e204)；链置换扩增(“SDA”)；解旋酶依赖性扩增(“HDA”，Vincent等人,2004 EMBO Rep.[欧洲分子生物学会报告]5,795-800)：转录介导的扩增(“TMA”)，单引物等温扩增(“SPIA”参见Kurn等人,2005 Clinical Chemistry[临床化学]51,1973-81)；自主序列复制(“3SR”)；以及切口酶扩增反应(“NEAR”)。
在‘NEAR’中(例如，如US2009/0017453和EP 2,181,196中所披露的)，正向引物和反向引物(在US2009/0017453和EP 2,181,196中称为“模板”)与双链靶标的相应链杂交并延伸。正向引物和反向引物(过量存在)的另外拷贝与相反引物的延伸产物杂交，并且自身延伸，从而产生“扩增双链体”。如此形成的每个扩增双链体包含朝向每条链的5’端的切口位点(由切口酶切口产生的)，从而允许合成另外的延伸产物。先前合成的延伸产物可以同时与互补引物的另外拷贝杂交，从而使引物延伸，并因而产生“扩增双链体”的另外拷贝。以这种方式，可以实现指数扩增。
又一种扩增反应是“STAR”(选择性温度扩增反应)。与NEAR不同，STAR不是等温的，它涉及到从最初的高温审慎地降低反应物的温度。WO 2018/002649中详细披露和描述了该反应。WO 2019/135074中披露和描述了STAR的定量变型，称为“qSTAR”。
EP2071034披露了一种处理溶液以便在进行扩增RNA分子的扩增反应后破坏任何核糖核酸的方法，目的是降低扩增的RNA污染后续RNA扩增反应的风险。该方法包括在存在核糖核酸酶和至少一种核糖核酸酶抑制剂(使得核糖核酸酶被抑制)的情况下进行RNA扩增反应，并随后灭活核糖核酸酶抑制剂以允许核糖核酸酶降解RNA扩增产物。通过以下来示例该技术：使用猪核糖核酸酶抑制剂(“PRI”)，通过加热至65℃保持10分钟而不可逆地灭活猪核糖核酸酶抑制剂，从而使得未被此类处理灭活的RNA酶A随后消化扩增的RNA。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种引起体外合成的核酸(优选DNA)的酶消化的方法，该方法包括以下步骤：在存在暂时基本上无活性的核酸酶的情况下，将试剂合并以形成体外合成的核酸；以及随后在经过足以允许检测该体外合成的核酸的一段时间后，许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性，使得该体外合成的核酸被该核酸酶消化。
本领域技术人员将会理解，在进行本发明的方法时，在体外合成、核酸的整个时间段中核酸酶完全无活性不是必需的。例如，当对于合成而言必需的核酸试剂(尤其是引物、模板或其他寡核苷酸)大大过量存在时，归因于核酸酶介导的消化的一些损失是易于耐受的。同样，核酸酶在核酸合成反应开始时可以完全或几乎完全无活性，但是反应条件(如反应混合物中镁离子或类似二价金属阳离子的浓度)可以是使得核酸酶在合成反应过程中变得至少部分有活性的情况。
显而易见的是，在核酸合成过程中可以耐受的核酸酶比活性的量将取决于许多因素，包括试剂浓度、反应条件、存在的核酸酶质量、合成反应的持续时间等。因此，下面的讨论仅代表一个准则，并且本领域技术人员可以容易地通过试错法来确定在、任何特定的核酸合成反应中可以耐受的核酸酶活性水平。在优选的实施例中，核酸酶在核酸合成反应开始时将为至少90％无活性(即，将具有当核酸酶被最大限度地再活化时所表现出的比活性的不超过10％)，更优选地核酸酶在核酸合成反应开始时将为至少95％无活性，最优选地为至少99％无活性。这种核酸酶可以被认为是“基本上无活性的”。
反过来说，可能不需要为了获得本发明的益处而完全再活化核酸酶。因此，例如，就其最大比活性而言，仅被80％再活化的核酸酶可能足以彻底消化在体外核酸合成反应中合成的所有核酸。这种核酸酶可以被认为是“有基本的活性”。优选地，一旦被再活化，核酸酶将具有其最大活性的至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％。此外，虽然合成的核酸的完全消化可能是优选的，但可能不是必需的，以至于未被完全再活化的核酸酶仍然足以在根据本发明的方法进行核酸合成反应后大大降低被残留核酸污染的风险。
可以直接或间接检测合成的核酸，并且用于检测核酸的许多技术是本领域技术人员已知的，并且不构成本发明的一部分。间接检测方法包括，例如，检测由于体外合成的核酸的产生和/或存在而形成、稳定化或以其他方式变得可检测的分子或其他部分。检测还可以任选地包括对合成的核酸的定量。
已知有许多适合的检测和/或定量技术，包括：凝胶电泳、质谱法、横向流捕获、掺入带标记的核苷酸、嵌入或其他荧光染料、酶标记、电化学检测技术、分子信标和其他探针，尤其是特异性杂交的寡核苷酸或其他含核酸的分子。
核酸检测方法可以采用允许特异性检测双链DNA的染料。在与DNA或RNA结合时表现出增强荧光的嵌入染料是熟知的。染料可以是例如嵌入荧光团的DNA或RNA，并且尤其可以包括以下：吖啶橙、溴化乙锭、pico green、碘化丙啶、SYBRTMI、SYBRTMII、SYBRTMgold、TOTOTM-3(噻唑橙二聚体)、OliGreenTM和YOYOTM(噁唑黄二聚体)。
在优选实施例中，体外合成的核酸是核酸扩增反应的产物，尤其是非等温扩增，如STAR扩增(例如，如WO2018/002649所述)或qSTAR扩增(例如，如WO2019/135074所述)，两者都需要在反应进行过程中有至少2℃的偏差，更典型地有至少5℃的偏差，并且优选地在反应进行过程中有在5℃-10℃范围内的温度偏差。在STAR的情况下，温度偏差是仅温度降低；而在qSTAR中，温度偏差包括较低温度和较高温度之间的梭动。本领域技术人员非常熟悉所需的试剂、其合适的浓度和合适的反应条件(例如pH、温度、缓冲液和盐浓度)，以便进行体外核酸合成和/或核酸扩增。体外合成的核酸将通常包含DNA或由DNA组成，该合成所需的试剂包含DNA聚合酶、一种或多种dNTP(优选地为包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP中每一种的混合物)、作为单链或呈现为单链的模板序列(可以是RNA或DNA)以及引物、寡核苷酸或其他包含以下部分的核酸序列，该部分可与模板杂交并提供用于通过DNA聚合酶延伸的游离3’端。可替代地，可以使用自引发从而既作为模板又作为引物的发夹寡核苷酸来代替单独的模板和引物。
本领域技术人员已知许多来自原核或真核来源的DNA聚合酶。原则上，这些中的任一种都可以在本发明的方法中使用。各种DNA聚合酶总体上被很好地表征，并且具有不同的性质和特征(例如，不同的温度稳定性；存在或不存在核酸外切酶校读能力)，并且本领域技术人员习惯于根据要执行的DNA和相关的反应条件来选择和应用适当的DNA聚合酶。
特别地，当作为用以检测和/或定量生物材料样品中目的核酸序列的测定过程的一部分而合成核酸时，例如对来自人或动物受试者的生物样品中感染因子(包括但不限于细菌、病毒、真菌和原生动物)的诊断检测，本发明的方法尤其有利。该样品可以例如包括以下或由以下组成：全血、血浆、血清、痰液、唾液、泪液、精液、阴道分泌物、尿液或粪便。可替代地，样品可以是环境样品，如水样，并用来确定水的微生物质量。有利地，本发明的方法全部或至少部分地使用诸如横向流或微流体装置的测定装置(尤其是即时诊断测试装置)来进行，核酸合成反应在这样的诊断测试装置中或在这样的诊断测试装置上进行。作为解释，在本发明的方法中，合成的核酸(和/或最初存在于受试者样品中的核酸)在检测后将至少部分或更优选地全部被再活化后的核酸酶消化。以这种方式，在测定(包括任何检测步骤)完成后消化核酸将大大降低任何设备被可扩增的核酸片段污染的风险，尤其是在将于随后的核酸扩增反应中重复使用该设备的情况下；否则，这种可扩增的片段可能导致假阳性结果。
典型地，在核酸酶恢复基本的活性之前经过的“时间段”(从着手核酸合成反应起测量)为1至48小时，优选为1至12小时，更优选为1至6小时，且最优选为1至2小时。如果希望减少在完成体外核酸合成反应与消化反应混合物中核酸之间经过的时间，当然可以在开始核酸合成反应之前着手核酸酶的再活化。例如，在将核酸酶加入到反应混合物中之前，可以将核酸酶与Mg2+离子混合(如下所述)。
一旦核酸酶恢复活性，核酸酶介导的对合成的核酸的消化可以通过例如对反应混合物的分析容易地确认。出于本发明的目的，如果在用适当的SYBR gold II分子预染色的聚丙烯酰胺凝胶上无法通过电泳分析检测到长于15个核苷酸的多核苷酸，则可认为合成的核酸被核酸酶完全消化。在进行了DNA合成反应之后，可以将测定反应混合物(或在其上或其中进行了反应的任何测定装置)留在合适的条件下，以许可并且优选地促进核酸的消化。这可以仅仅涉及例如将反应混合物(或测定装置，视情况而定)留在室温下。
在本发明方法中使用的核酸酶可以是任何合适的核酸酶，包括核酸外切酶。然而，优选地，核酸酶是核酸内切酶，并且在大多数实施例中，将包括糖非特异性核酸内切酶(如下所述；即，将作用于RNA底物和DNA底物两者)。在一些实施例中，核酸内切酶选自由以下组成的组：热不稳定性盐活化核酸酶(HL-SAN，北极酶公司(ArcticZymes)，P/N70910-202，在美国专利号9422595中描述)、HL-dsDNA酶(北极酶公司，P/N 70800-201，双链DNA特异性核酸内切酶)、CyanaseTM核酸酶(西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)，P/N 1000)、BenzonaseTM核酸酶(西格玛奥德里奇公司，P/N E8263，来自粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的核酸内切酶，在大肠杆菌(E.coli)中表达，并以超纯形式[>99％，根据SDSPAGE判断]提供)、CryonaseTM冷启动核酸酶(Cold-active nuclease)(Takara公司，P/N2670A，为最初来源于嗜冷生物体希瓦氏菌属物种(Shewanella sp.)并通过从大肠杆菌中表达而纯化的重组核酸内切酶)和OmniCleaveTM核酸内切酶(卢西根公司(Lucigen)，P/NOC7850K)。
前述核酸酶都可从所示来源商购。大多数前述核酸内切酶(HL-dsDNA酶除外)被分类为“糖非特异性核酸内切酶”，其需要镁或锰才有活性(Rangarajan和Shankar,2001FEMSMicrobiol.Rev.[欧洲微生物学会联合会微生物学评论]25,583-613)。这些核酸内切酶将切割DNA和RNA两者。HL-dsDNA酶被分类为“糖特异性核酸内切酶”(即，它将只作用于DNA底物，而不会作用于RNA底物)，并且特异性地对双链DNA具有高亲和力。然而，所有前述核酸内切酶都需要镁或锰才有活性，并且预期在这些辅因子存在的情况下将是有活性的。诸位发明人已经发现，低浓度的Mg2+离子(<0.25mM)有希望将核酸酶的活化延长很长一段时间。因此，例如，对于CyanaseTM核酸酶和CryonaseTM冷启动核酸酶(它们典型地从其供应商的储存缓冲液中携带高达0.25mM的Mg2+离子)，在不存在额外的Mg2+离子的情况下，酶在48小时后(在25℃的温度下)基本上不表现出再活化。
然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，核酸合成反应通常需要Mg2+离子或类似的水性二价金属阳离子的存在，因为这些是核酸合成中使用的大多数聚合酶的必需辅因子。因此，虽然核酸酶可以优选地在不存在Mg2+离子的情况下储存(以干燥或冷冻干燥状态)，但着手核酸合成反应(在存在暂时灭活的核酸酶的情况下)将需要添加包含Mg2+离子的缓冲液等，使得暂时灭活的核酸酶开始被再活化。
在优选的实施例中，通过包括将核酸酶与生理还原剂(如二硫代苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或DTBA(二硫代丁胺))接触的过程，将核酸酶暂时灭活。典型地，生理还原剂将以在0.5-10mM、优选地1-10mM、更优选地1-5mM范围内的浓度存在。通常，还将存在pH处于7.5-8.5范围内的合适缓冲液(例如TE)。
引起核酸内切酶可逆灭活所需的优选处理将取决于相关核酸内切酶的特性。
例如，HL-SAN和HL-dsDNA酶(两者均来自北极酶公司)被制造商描述为由于1mMDTT的存在而不可逆地灭活(参见US 9,422,595和制造商网站)。US 9,422,595特别地指出，该酶(HL-SAN)“当在存在10mM DTT的情况下在30℃下孵育15分钟时，基本上(不可逆地)灭活”；并且“当在存在10mM DTT或10mM TCEP的情况下在4℃下孵育6小时时，基本上(不可逆地)灭活”。事实上，令人惊讶且与本领域的传授内容相反，诸位发明人已经发现HL-SAN和HL-dsDNA酶都可以通过用生理还原剂如1-10mM DTT或TCEP处理而可逆灭活。这种可逆灭活可在不加热的情况下实现(例如，在存在10mM DTT或TCEP的情况下，在4℃下保持6小时)。可替代地，HL-SAN或HL dsDNA酶的可逆灭活可以通过在存在生理还原剂(例如1-10mM DTT或TCEP)的情况下加热任一种酶来非常快速地完成。诸位发明人发现，通过在60℃下孵育30分钟，可以实现基本上完全的可逆灭活。这种加热是优选的，因为生理还原剂如DTT可能相当不稳定，尤其是在低浓度下——因此，在低温下长时间孵育可能会使还原剂耗尽，将核酸酶逃脱完全(可逆)灭活和/或使其再活化。这种风险可通过在高温下快速孵育来改善。
一般来说，优选地通过包括在存在生理还原剂的情况下加热酶的过程，将上述其他核酸内切酶(CyanaseTM、BenzonaseTM、CryonaseTM和OmniCleaveTM)可逆地灭活。方便地，生理还原剂包含DTT或TCEP，典型地浓度在1-10mM范围内。有利地，加热包括将酶在60℃下孵育30分钟，在生理还原剂存在的情况下，诸位发明人发现这引起基本上完全的可逆灭活。对于本领域技术人员来说显而易见的是，如果增加孵育的持续时间，通常可以使用低于60℃的温度。
例如，在一些实施例中可以方便地采用在25℃-55℃范围内的温度，更优选地在35℃-55℃范围内的温度。在一些情况下，25℃的温度基本上代表环境温度，因此不需要加热来实现核酸酶的暂时灭活，而在其他环境中则将需要加热来实现25℃的温度。通常将需要加热以达到高于30℃的温度，尤其是高于35℃。所用的温度典型地可至少部分取决于将核酸内切酶保持在所选温度下的时间长度。因此，例如，将核酸内切酶在25℃下保持一周(或更长时间)可能足以导致暂时灭活。通常应避免高于60℃的温度，因为它们往往会引起至少一些核酸内切酶不可逆的灭活。
一旦核酸酶被可逆地灭活，则可能有希望保持酶基本灭活至少直到着手核酸的体外合成，并且可能直到检测到体外合成的核酸。将核酸酶保持在基本(可逆)灭活的形式可以通过多种方式实现或促进，包括但不限于以下一种或多种：(a)将灭活的核酸酶保持在低温(即4℃或低于4℃)下，更优选冷冻该核酸酶(例如典型地在-20℃或低于-20℃)；(b)风干或冻干灭活的核酸酶；(c)将灭活的核酸酶保持在Mg2+或Mn2+离子(核酸酶的辅因子)的浓度处于酶保持基本无活性的水平的环境中——优选地，可用的Mg2+或Mn2+离子的浓度小于0.25mM，更优选等于或低于0.1mM。方便地，可以组合采用(a)和(c)或者(b)和(c)。可以将可逆灭活的核酸酶储存在器皿中，例如管，或者可以将其储存在固体支持物(例如横向流测试条或微流体测试装置)上。在其他实施例中，可以将可逆灭活的核酸内切酶掺入“主混合物”中，随后将该“主混合物”以稀释的形式用于进行核酸反应，例如DNA扩增反应。
期望在反应混合物中存在的核酸酶的量可取决于要消化的核酸的量、期望的消化程度(完全或部分)、在核酸被消化之前需要经过的时间量、温度和其他条件(如pH、盐浓度等)。典型地，暂时灭活的核酸酶可以在0.1单位/μL至500单位/μL的范围内、更典型地在0.2单位/μL至250单位/μL的范围内的浓度存在于反应混合物中。
在核酸合成过程中故意将核酸酶掺入核酸合成反应混合物是违反常理的，因为在这种反应中核酸酶的存在通常预期会消化核酸合成引物(在与互补模板杂交之前和/或之后，取决于核酸酶的特征)，从而对反应产生不利影响。然而，在本发明的方法中，某些核酸酶的灭活(例如，通过将它们与生理还原剂如TCEP(即三(2-羧乙基)膦)或二硫代化合物如DTT(即二硫代苏糖醇)或DTBA(二硫代丁胺)接触，并且典型地还在25℃-60℃范围内的温度下孵育)是暂时的和可逆的，因此在活性核酸合成期间，可以许可在核酸合成反应混合物(尤其是扩增反应混合物)中存在核酸酶，该核酸酶最初是灭活的，但随着时间的推移恢复活性，这使得核酸合成反应基本上不受阻碍地进行足够长的时间，以许可检测合成的核酸。
已知使用诸如核酸酶的酶来消除或减少核酸反应中使用的含核酸样品或试剂和缓冲液等的污染，但是这种常规方法在进行任何扩增步骤之前将该样品/试剂/缓冲液等(视情况而定)与核酸酶接触，并且要求在进行扩增程序之前将酶除去或使其永久且不可逆地灭活。典型地以这种方式使用的酶是DNA修复酶如尿嘧啶N-糖苷酶(“UNG”)或核酸内切酶如DNA酶I，这些酶是热不稳定的并且通过加热到高温(例如95℃保持5分钟或更长时间)而不可逆地灭活。
本发明的优点是，在进行DNA扩增之前，将可逆灭活的核酸酶掺入DNA扩增反应混合物(作为其不可或缺的组成部分)中，允许在例如密封器皿或固体支持物(例如在微流体测试装置中)上进行扩增，并且随后在不需要使用者的任何进一步输入的情况下，核酸酶将被再活化以降解扩增产物或存在的其他核酸，从而降低在进行随后的反应时的污染风险。
在第二方面，本发明提供了用于进行本发明第一方面的方法的组合物，该组合物包含DNA聚合酶、至少一种dNTP和处于可再活化形式的暂时基本上无活性的核酸酶。优选地，在本发明组合物中使用的核酸酶是核酸内切酶，特别是可以作用于DNA底物的核酸内切酶。在一些实施例中，核酸内切酶是糖非特异性核酸内切酶。在优选实施例中，核酸内切酶选自由以下组成的组：热不稳定性盐活化核酸酶(HL-SAN，北极酶公司，P/N70910-202)、HL-dsDNA酶(北极酶公司，P/N 70800-201)、CyanaseTM核酸酶(西格玛奥德里奇公司，P/N1000)、BenzonaseTM核酸酶(西格玛奥德里奇公司，P/N E8263)、CryonaseTM冷启动核酸酶(Takanara公司，P/N 2670A)和OmniCleaveTM核酸内切酶(卢西根公司，P/N OC7850K)。如上所述，优选通过包括将核酸酶与生理还原剂(如二硫代苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或DTBA(二硫代丁胺))接触的过程，使核酸酶暂时基本无活性。暂时灭活核酸酶的合适条件包括将核酸酶与1-10mM浓度(优选1-5mM)的还原剂接触，通常在pH处于大约7.5-8.5范围内的合适缓冲液(如TE)中。其他合适的条件对于本领域技术人员来说是显而易见的，或者可以利用本披露的益处在没有创造性工作的情况下确定。特别地，可以优选地纳入加热以协助暂时灭活核酸酶：为此目的，在一些实施例中，典型地可以采用在25℃-60℃范围内的温度。
该组合物将典型地包含多种NTP，优选地为包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP中每一种的混合物。可替代地或另外，本发明的组合物(和方法)可以涉及使用一种或多种变体NTP(例如尿嘧啶)或NTP类似物，其可以通过DNA聚合酶掺入体外合成的核酸中。许多NTP类似物是本领域技术人员已知的。可替代地或另外，该组合物可以包含DNA聚合酶。
本发明的组合物可以作为多个等分试样提供。典型地，这些等分试样将基本相同，每个等分试样被提供在单独的器皿或容器(如管等)中。本发明的组合物可以例如以液体形式，以冷冻、干燥(例如风干或冻干)形式，或以适于溶于水、蒸馏水、水性缓冲液等的其他固体形式提供。
在其他实施例中，本发明的组合物可以提供在固体支持物如横向流测试条上，或者提供在微流体测试装置上：在这样的实施例中，该组合物可作为液体(例如，在储液器等中)提供，或者可以以干燥形式提供，可能是可释放地在固体支持物上固定化。本发明的组合物可以另外包含其他组分，如一种或多种缓冲液、一种或多种盐(尤其是Mg盐)、防腐剂、冷冻保护剂(例如海藻糖等)等等。
因此，在第三方面，本发明提供了一种用于测试样品中目的核酸序列的存在和/或量的测试装置，该测试装置包含用于进行体外核酸合成反应(优选地DNA扩增反应)的一种或多种试剂，以及处于可再活化形式的暂时基本上无活性的核酸酶。应当理解，在经过足以允许检测该体外合成的核酸的一段时间后，允许该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性，使得该体外合成的核酸被该核酸酶消化。有利地，测试装置可以是随后可在进一步测试中重复使用的装置。测试装置可以包含根据如上所定义的本发明第二方面的组合物。测试装置还可任选地包含用于检测体外合成的核酸的存在的一种或多种试剂，如分子信标、标记探针等。
现在将通过说明性实例并参考附图进一步描述本发明，在附图中：
图1是柱状图，显示了在存在或不存在Mg2+离子的情况下，在25℃下储存不同时间段后，热不稳定性盐活化核酸酶(HL-SAN)的核酸内切酶活性；
图2是柱状图，显示了在存在或不存在Mg2+离子的情况下，在25℃下储存不同时间段后，各种不同核酸内切酶的核酸内切酶活性；
图3A-3C是相对荧光(任意单位)关于时间(分钟)的图形，显示了通过使用包括热不稳定性盐活化核酸酶(HL-SAN)在内的试剂，在没有事先储存(图3A)的情况下或在25℃(图3B)或50℃(图3C)下储存1个月后进行STAR核酸扩增反应生成的荧光量(指示核酸扩增的量)；并且
图4.1(a-c)、4.2(a、b)和4.3(a、b)是在暴露于或不暴露于再活化的HL-SAN核酸内切酶的情况下加载有扩增反应产物的琼脂糖凝胶的图像。
实例
本发明涉及利用核酸酶来消化核酸扩增测定产物。在下面的实例中，在不会对测定的性能产生不利影响的情况下，将核酸内切酶掺入到测定中，并通过在测定完成24至48小时内消化核酸(包括扩增产物)来防止污染。
暂时灭活核酸酶涉及暴露于生理还原剂及任选地高温。一旦暂时灭活，就可以将核酸酶掺入扩增测定混合物中，例如像STAR测定主混合物(见下面的实例3)，随后将其在室温下干燥。在核酸酶不影响测定性能的情况下运行STAR测定。在测定运行完成后，将反应置于室温下，并使用琼脂糖凝胶电泳进行分析，以确认核酸内切酶再活化。随着还原剂失去其断裂二硫键的能力(由于还原剂的大气氧化)，核酸内切酶随时间再活化，使核酸酶回到其活性形式。该方法的主要优点是核酸酶再活化率可以通过调节蛋白质浓度、调节还原剂浓度和/或改变储存条件来操纵。
实例1：HL-SAN的可逆灭活：
将热不稳定性盐活化核酸酶(HL-SAN)与1mM还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)在Tris-EDTA(TE)缓冲液(pH 8)中合并。可替代地，可以将二硫代化合物如二硫代苏糖醇(DTT)用作还原剂。HL-SAN母液的浓度为615U/μL(北极酶公司，批号：RD1742-c，不含甘油，不含镁)，并被稀释至200U/μL进行灭活。通过在60℃下孵育30分钟，将HL-SAN灭活。将灭活的HL-SAN平衡至室温10分钟。测试前，将灭活的HL-SAN在40℃下储存1小时。使用内部测定(双标记探针消化测定，或“DLP-DA”)来测量灭活和再活化。
DLP-DA包括在特定缓冲液中的具有5’-荧光团和3’-淬灭物的双标记探针(DLP)。DLP在5’和3’端设计有互补的DNA序列，使得当互补区域相互杂交时形成长的双链DNA茎。当茎闭合时，荧光团因淬灭物的接近而被抑制。在存在核酸内切酶的情况下，双链DNA茎被消化和去稳定化。最终，荧光团与淬灭物分离并生成荧光信号。在不存在和存在镁离子的情况下，用DLP-DA在10U/μL下测试HL-SAN。在不同时间点在室温下孵育反应，并在StratageneMX3005P仪器上测量终点荧光。结果如图1所示。
在具有灭活的HL-SAN(HLS+)或不具有灭活的HL-SAN(对照)的反应之间比较核酸酶活性。对于每种条件，在25℃下孵育四个反应重复，并在几个时间点分析原始荧光(RF)。荧光的增加与核酸酶活性的增加直接相关。在图1中，柱的不同底纹代表实验的不同重复，较深的底纹代表重复1和2的结果，较浅的底纹显示重复3和4的结果。
在不存在Mg2+离子的情况下，在25℃下10分钟后，HL-SAN保持无活性(图1柱A、B)：对照的荧光值(<9,500RF)(图1柱A)与灭活的HL-SAN的荧光值(<9,500RF)(图1柱B)相似。在存在镁的情况下，在25℃下10分钟后，HL-SAN保持无活性(图1柱C、D)。对照的荧光值(<9,500RF)(图1柱C)与灭活的HL-SAN的荧光值(<9,500RF)(图1柱D)相似。
在不存在Mg2+离子的情况下，在25℃下24小时后，HL-SAN保持无活性(图1柱E、F)。对照的荧光值(<9,500RF)(图1柱E)与灭活的HL-SAN的荧光值(<9,500RF)(图1柱F)相似。在存在镁的情况下，在25℃下24小时后，观察到低水平的核酸酶活性(图1柱G、H)。观察到灭活的HL-SAN的荧光值升高(>10,000RF)(图1柱H)。
在不存在Mg2+离子的情况下，在25℃下48小时后，HL-SAN保持无活性(图1柱I、J)。对照的荧光值(<9,500RF)(图1柱I)与灭活的HL-SAN的荧光值(<9,500RF)(图1柱J)相似。在存在Mg2+离子的情况下，在25℃下48小时后，观察到稳健的核酸酶活性(图1柱K、L)。观察到灭活的HL-SAN的荧光值最大(>55,000RF)(图1柱L)。
数据显示，HL-SAN的灭活方法是有效的。在不存在Mg2+离子的情况下，在25℃下长达48小时的时间段后，HL-SAN保持无活性。这种(延迟的)再活化仅发生在存在Mg2+离子的情况下。该特征使得HL-SAN成为适合掺入例如STAR测定配制品中的核酸内切酶。为了延长灭活时间，重要的是，核酸内切酶储存缓冲液基本上不含Mg2+离子(例如低于0.1mM，更优选低于0.05mM)，并且优选基本上不含类似的二价金属离子，如锰离子。
实例2：各种核酸内切酶的可逆灭活
决定测试HL-SAN以外的核酸内切酶，看看它们是否也能可逆灭活。
在本实验中，所有核酸内切酶均标准化为2U/μL。所有核酸内切酶都在具有1-5mM镁的含50％甘油的缓冲液中提供。HL-SAN母液的浓度为25.4U/μL(北极酶公司，P/N 70910-202)。HL-dsDNA酶母液的浓度为2U/μL(北极酶公司，P/N 70800-201)。CyanaseTM核酸酶母液的浓度为50U/μL(Ribosolutions，P/N 1000)。BenzonaseTM核酸酶母液浓度>250U/μL(西格玛奥德里奇公司，P/N E8263)。CryonaseTM冷启动核酸酶母液的浓度为20U/μL(Takanara公司，P/N 2670A)。OmniCleaveTM核酸内切酶母液的浓度为200U/μL(卢西根公司，P/NOC7850K)。灭活步骤与先前描述的方法相同(上面的实例1)。将核酸内切酶稀释至1U/μL进行灭活。测量核酸酶灭活和再活化的方法与上述关于HL-SAN的方法相同。在不存在和存在Mg2+离子的情况下，使用DLP-DA在0.2U/μL下测试核酸内切酶。
结果如图2所示。
在具有灭活的核酸内切酶和不具有灭活的核酸内切酶(对照)的反应之间比较核酸酶活性。对于每种条件，在25℃下孵育两个反应重复，并在几个时间点分析原始荧光。在柱状图上用以下命名法表示灭活的核酸内切酶：
对照： 无核酸内切酶
HLS： HL-SAN(北极酶公司，P/N 70910-202)
HLdsDN： HL-dsDNA酶(北极酶公司，P/N 70800-201)
CyaN： CyanaseTM核酸酶(Ribosolutions，P/N 1000)
BenN： BenzonaseTM核酸酶(西格玛奥德里奇公司，P/N E8263)
CryN： CryonaseTM冷启动核酸酶(Takanara公司，P/N 2670A)
OmniC： OmniCleaveTM核酸内切酶(卢西根公司，P/N OC7850K)
在基本上不存在Mg2+离子的情况下，在25℃下10分钟后，核酸内切酶保持无活性(图2柱A1-A7)。对照的荧光值(<9,500RF)(图2柱A1)与所有灭活的核酸内切酶的荧光值(<9,500RF)(图2柱A2-A7)相似。
在存在Mg2+的情况下，在25℃下10分钟后，观察到一些核酸内切酶的核酸酶活性水平非常低(CyanaseTM&CryonaseTM柱B4、B6)，同时对照的荧光值(<9,500RF)(图2柱B1)与其他四种灭活的核酸内切酶(<9,500RF)(图2柱B2、B3、B5、B7)相似。
在不存在Mg2+的情况下，在25℃下24小时后，所有核酸内切酶基本上保持无活性(图2柱C1-C7)。对照的荧光值(<9,500RF)(图2柱C1)与所有灭活的核酸内切酶的荧光值(<9,500RF)(图2柱C2-C7)相似。在存在镁的情况下，在25℃下24小时后，观察到核酸酶活性(图2柱D1-D7)。观察到其中两种灭活的核酸内切酶的荧光值略有升高(>9,500RF)(图2柱D2、D3)，同时观察到其中四种灭活的核酸内切酶的荧光值最大(>55,000RF)(图2柱D4-D7)。
在不存在Mg2+离子的情况下，在25℃下48小时后，测量核酸内切酶的核酸酶活性(图2柱E1-E7)。对照反应的荧光值(<9,500RF)(图2柱E1)与其中三种灭活的核酸内切酶的荧光值(<9,500RF)(图2柱E3、E4、E6)相似。观察到其中三种灭活的核酸内切酶的荧光值升高(>15,000RF)(图2柱E2、E5、E7)。在存在Mg2+离子的情况下，在25℃下48小时后，观察到核酸酶活性(图2柱F1-F7)。观察到其中一种灭活的核酸内切酶的荧光值升高(>10,000RF)(图2柱F3)，同时观察到其余灭活的核酸内切酶的荧光值最大(>55,000RF)(图2柱F2、F4-F7)。
数据显示，暂时灭活HL-SAN的方法也可以应用于其他核酸内切酶。在最初灭活后，在存在镁离子的情况下，所有核酸内切酶被再活化。然而，重要的是，在大多数核酸内切酶储存缓冲液中存在镁离子，这使得很难长时间维持灭活。当在无镁缓冲液中提供HL-SAN时，在25℃下48小时内失活更有效地维持(图1柱B、F、J)。
实例3：在掺入核酸内切酶的情况下的STAR测定性能
该实例涉及STAR(“选择性温度扩增反应”)的性能，它是WO 2018/002649中描述的核酸扩增技术。本研究选择了用于检测乙型肝炎病毒DNA的STAR测定，但原则上本发明的方法可以与任何已知的DNA扩增反应和任何扩增子结合使用。选择作为扩增靶标的HBV基因组区域先前已经提交给Genbank，登录号MN047437(Koyaweda等人,Int.J.Infect.Dis.[国际传染病杂志]90(2020)138-144)，并相应地设计适当的STAR测定引物。10μl STAR主混合物含有下列试剂：15mM的MgSO4、90mM的Tris-HCl(pH 8.5)、300μM的各种dNTP、15mM的(NH4)2SO4、15mM的Na2SO4、1mM的DTT、0.01％的Triton X-100、7U的切口核酸内切酶和48U的聚合酶。将干燥的STAR测定主混合物用盐混合物再水合。将Tris-EDTApH 8.0(TE)添加到无靶标对照(NTC)孔中。将HBV靶标添加到靶标孔(10IU，10,000IU)中。启动HBV STAR测定扩增，并收集实时数据。将HBV STAR测定干燥试剂储存在25℃和50℃下，然后在1个月后进行随后测试。结果如图3A-3C所示。
图3A：
该曲线示出了在干燥过程完成后HBV STAR测定干燥试剂生成的实时扩增曲线。对于图3A，曲线的颜色梯度(深色、中等、较浅、最浅)代表每个反应中HL-SAN的递增量(对照0U、50U、100U、140U)。在存在(图3A点划线、实线)或不存在(图3A点线)HBV靶标的情况下，比较测定性能。对于阴性靶标对照反应(图3A点线)，在对照(图3A深色点线)与具有灭活的HL-SAN的反应(图3A点划线、实线)之间没有观察到差异。所有反应均未显示扩增。
关于10IU靶标反应(图3A虚线)，在对照(图3A深色实线)与具有灭活的HL-SAN的反应(图3A中等、较浅、最浅实线)之间没有观察到差异。所有反应都显示出相似的扩增曲线。
对于10,000IU靶标反应(图3A实线)，在对照(图3A黑色实线)与具有灭活的HL-SAN的反应(图3A中等、较浅、最浅实线)之间没有观察到差异。所有反应都显示出相似的扩增曲线。
这些结果揭示，HBV STAR测定干燥试剂的性能没有差异。灭活的HL-SAN的存在对测定性能没有影响。
图3B：
该图示出了在25℃下储存1个月的HBV STAR测定干燥试剂生成的实时扩增曲线。该图示出了在25℃下储存1个月的HBV STAR测定干燥试剂生成的实时扩增曲线。对于图3B，曲线的颜色梯度(深色、中等、较浅、最浅)代表每个反应中HL-SAN的递增量(对照0U、50U、100U、140U)。在存在(图3B点划线、实线)或不存在(图3B点线)HBV靶标的情况下，比较测定性能。
对于阴性靶标对照反应(图3B点线)，在对照(图3B深色点线)与具有灭活的HL-SAN的反应(图3B中等、较浅、最浅点线)之间没有观察到差异。所有反应均未显示扩增。
关于10IU靶标反应(图3B点划线)，在对照(图3B深色点划线)与具有灭活的HL-SAN的反应(图3B中等、较浅和最浅点划线)之间没有观察到差异。所有反应都显示出相似的扩增曲线。
对于10,000IU靶标反应(图3B实线)，在对照(图3B深色实线)与具有灭活的HL-SAN的反应(图3B中等、较浅、最浅实线)之间没有观察到差异。所有反应都显示出相似的扩增曲线。
图3C：
该图示出了在50℃下储存1个月的HBV STAR测定干燥试剂生成的实时扩增曲线。对于图3C，曲线的颜色梯度(深色、中等、较浅、最浅)代表每个反应中HL-SAN的递增量(分别为对照0U、50U、100U、140U)。在存在(图3C点划线、实线)或不存在(图3C点线)HBV靶标的情况下，比较测定性能。
对于阴性靶标对照反应(图3C点线)，在对照(图3C深色点线)与具有灭活的HL-SAN的反应(图3C中等、较浅和最浅点线)之间没有观察到差异。所有反应均未显示扩增。
关于10IU靶标反应(图3C点划线)，在对照(图3C深色点划线)与具有50U灭活的HL-SAN的反应(图3C中等点划线)之间没有观察到差异。在与对照(图3C深色点划线)相比时，具有100U和140U HL-SAN的反应(分别为图3C较浅和最浅点划线)生成了升高的荧光。
对于10,000IU靶标反应(图3C实线)，在对照(图3C深色实线)与具有50U和100U灭活的HL-SAN的反应(分别为图3C中等、较浅实线)之间没有观察到差异。在与对照(图3C深色实线)相比时，具有140U HL-SAN的反应(图3C最浅实线)生成了升高的荧光。
这些结果揭示，在掺入100U和140U HL-SAN时，在50℃下储存的HBV STAR测定干燥试剂生成了升高的荧光。灭活的HL-SAN的存在对测定性能没有影响。
实例4对消化的STAR测定产物的琼脂糖凝胶分析
在完成HBV STAR测定测试后，将反应储存在室温下用于随后的琼脂糖凝胶分析(图3A、3B和3C中的反应)。将反应稀释并加载到英杰公司(Invitrogen)4％EX E-凝胶(英杰公司P/N G401004)上。在英杰公司Power-Snap E-凝胶系统(英杰公司P/N G8100)上进行电泳。使用英杰公司Power-Snap照相机(英杰公司P/N G8200)捕获/存储图像。为了提高扩增产物的分辨率，将图像颜色反转。在0小时(与测试同一天)以及在24小时和48小时后进行HBV STAR测定反应测试。结果如图4.1-4.3所示。
图4.1：
3个凝胶图像(图4.1a、4.1b、4.1c)示出了在25℃下24和48小时时间段内HL-SAN的再活化。显示出扩增产物(HBV STAR扩增子)大量损失的那些反应表现出HL-SAN再活化。
在有靶标和无靶标的情况下测试HBV STAR测定干燥试剂(图3.1)。测定完成后，将HBV STAR测定反应稀释并加载到4％EX E-凝胶上(图4.1a)。
以下图例描述了加载到凝胶上的反应：
泳道M：超低范围DNA梯状条带(英杰公司P/N 10488096)。
泳道1-2：分别具有100U和140U HL-SAN的无靶标对照(ntc)反应。
泳道3：具有10IU HBV靶标的对照反应(无核酸内切酶)。
泳道4-6：具有分别掺入50U、100U和140U HL-SAN的10IU HBV靶标的反应。
泳道7：具有10,000IU HBV靶标的对照反应(无核酸内切酶)
泳道8-10：具有分别掺入50U、100U和140U HL-SAN的10,000IU HBV靶标的反应。
在0小时(图4.1a)，如预期的那样，在NTC反应中仅观察到非特异性产物(图4.1a泳道1-2)。具有HL-SAN的反应的扩增产物(图4.1a泳道4-6、8-10)显示出与对照反应(图4.1a泳道3、7)相似的条带。
在24小时(图4.1b)，在具有100U HL-SAN的NTC反应中观察到扩增产物的可测量损失(图4.1b泳道1)。具有140U HL-SAN的NTC反应(图4.1b泳道2)显示出扩增产物的完全损失。在与对照相比时，具有50U和100U HL-SAN的靶标反应(图4.1b泳道4、5、8、9)显示出扩增产物的可测量损失(图4.1b泳道3、7)。具有140U HL-SAN的靶标反应(图4.1b泳道6、10)显示出扩增产物的完全损失。
在48小时(图4.1c)，在具有HL-SAN的所有反应中都观察到扩增产物的完全损失(图4.1c泳道1-2、4-6、8-10)。在具有被掺入HBV STAR测定干燥试剂中的140U HL-SAN的反应中，在24小时后观察到核酸酶再活化。在较低的浓度(50U和100U)下，核酸酶完全再活化需要48小时。
图4.2：
两个凝胶图像(图4.2a、4.2b)示出了在25℃下24小时时间段内HL-SAN的再活化。显示出扩增产物(HBV STAR扩增子)大量损失的那些反应表现出HL-SAN再活化。
将HBV STAR测定干燥试剂在25℃下储存1个月，并在有靶标和无靶标的情况下进行测试(图4.2)。
测定完成后，将HBV STAR测定反应稀释并加载到4％EX E-凝胶上(图4.2a)。
以下图例描述了加载到凝胶上的反应：
泳道M：超低范围DNA梯状条带(英杰公司P/N 10488096)。
泳道1-2：分别具有100U和140U HL-SAN的无靶标对照(ntc)反应。
泳道3：具有10IU HBV靶标的对照反应(无核酸内切酶)。
泳道4-6：具有分别掺入50U、100U和140U HL-SAN的10IU HBV靶标的反应。
泳道7：具有10,000IU HBV靶标的对照反应(无核酸内切酶)。
泳道8-10：具有分别掺入50U、100U和140U HL-SAN的10,000IU HBV靶标的反应
在0小时(图4.2a)，如预期的那样，在NTC反应中仅观察到非特异性产物(图4.2a泳道1-2)。具有HL-SAN的反应的扩增产物(图4.2a泳道4-6、8-10)显示出与对照反应(图4.2a泳道3、7)相似的条带。
在24小时(图4.2b)，在具有100U和140U HL-SAN的NTC反应中观察到扩增产物的完全损失(图4.2b泳道1、2)。在与对照相比时，具有50U HL-SAN的靶标反应(图4.2b泳道4、8)显示出扩增产物的可测量损失(图4.2b泳道3、7)。具有100U和140U HL-SAN的靶标反应(图4.2b泳道5、6、10)显示出扩增产物的完全损失。
在具有被掺入HBV STAR测定干燥试剂中的100U和140U HL-SAN的反应中，在24小时后观察到核酸酶再活化。在50U的情况下，核酸酶完全再活化需要超过24小时。在与最初的测试运行相比时，在100U的情况下，在25℃下储存1个月的干燥试剂显示出HL-SAN再活化率增加(图4.1)。
图4.3：
两个凝胶图像(图4.3a、4.3b)示出了在25℃下24小时时间段内HL-SAN的再活化。显示出扩增产物(HBV STAR扩增子)大量损失的那些反应表现出HL-SAN再活化。
将HBV STAR测定干燥试剂在50℃下储存1个月，并在有靶标和无靶标的情况下进行测试(图3.3)。测定完成后，将HBV STAR测定反应稀释并加载到4％EX E-凝胶上(图4.3a)。
以下图例描述了加载到凝胶上的反应：
泳道M：超低范围DNA梯状条带(英杰公司P/N 10488096)。
泳道1-2：分别具有100U和140U HL-SAN的无靶标对照(ntc)反应。
泳道3：具有10IU HBV靶标的对照反应(无核酸内切酶)。
泳道4-6：具有分别掺入50U、100U和140U HL-SAN的10IU HBV靶标的反应。
泳道7：具有10,000IU HBV靶标的对照反应(无核酸内切酶)。
泳道8-10：具有分别掺入50U、100U和140U HL-SAN的10,000IU HBV靶标的反应。
在0小时(图4.3a)，如预期的那样，在NTC反应中仅观察到非特异性产物(图4.3a泳道1-2)。具有HL-SAN的反应的扩增产物(图4.3a泳道4-6、8-10)显示出与对照反应(图4.3a泳道3、7)相似的条带。
在24小时(图4.3b)，在具有HL-SAN的所有反应中都观察到扩增产物的完全损失(图4.3b泳道1-2、4-6、8-10)。
在具有被掺入HBV STAR测定干燥试剂中的HL-SAN的反应中，在24小时后观察到核酸酶再活化。在与最初的测试运行相比时，对于所有HL-SAN浓度，在50℃下储存1个月的干燥试剂都显示出HL-SAN再活化率增加(图4.1)。实验还表明，HL-SAN在检测到扩增产物后可以消化它们，并且将HL-SAN掺入扩增反应中并不阻止扩增反应的发生。

Claims (24)

1.一种引起体外合成的核酸的酶消化的方法，该方法包括以下步骤：(a)在存在暂时基本上无活性的核酸酶的情况下，将试剂合并以形成体外合成的核酸；以及(b)随后在经过足以允许检测该体外合成的核酸的一段时间后，许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性，使得该体外合成的核酸被该核酸酶消化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该核酸酶是作用于DNA底物的核酸外切酶或核酸内切酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该核酸酶需要存在水性镁和/或锰离子才有核酸酶活性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸酶选自由以下组成的组：热不稳定性盐活化核酸酶HL-SAN；HL-dsDNA酶；Cyanase核酸酶；Benzonase核酸酶；Cryonase冷启动核酸酶；以及OmniCleave核酸内切酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中体外核酸合成是合成为DNA扩增反应的产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中核酸扩增反应是等温或非热循环扩增。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括使该核酸酶与生理还原剂接触的过程，将该核酸酶暂时基本上灭活。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该生理还原剂包含二硫代苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸酶是热不稳定的，并且通过包括将该核酸酶在25℃-60℃范围内的温度下孵育至少15分钟的过程，将该核酸酶暂时灭活。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中许可或引起该基本上无活性的核酸酶恢复基本的核酸酶活性的步骤包括将该核酸酶与水性镁和/或锰离子接触。
11.根据权利要求10所述的方法，该方法包括将该核酸酶与浓度范围为10mM至100mM的水性镁和/或锰离子接触，以促进该核酸酶的再活化。
12.一种进行体外DNA合成反应的方法，该方法包括以下步骤：形成包含进行该DNA合成反应所需的所有反应物的DNA合成反应混合物，该反应混合物进一步包含最初基本上无活性但处于可再活化的形式的DNA核酸酶；进行该DNA合成反应；以及许可或引起该DNA核酸酶恢复基本的核酸酶活性，从而降解该DNA合成反应的产物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中该体外DNA合成反应包括DNA扩增反应。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在被再活化的核酸酶消化之前，该DNA合成反应的一种或多种产物被直接或间接检测到。
15.根据权利要求12-14中任一项所述并且进一步根据权利要求1-11中任一项的方法。
16.一种用于进行根据前述权利要求中任一项所述的方法的组合物，该组合物包含DNA聚合酶、至少一种dNTP和处于可再活化形式的暂时基本上可逆灭活的核酸酶。
17.根据权利要求16所述的组合物，该组合物包含多种NTP，优选地为包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP中每一种的混合物。
18.根据权利要求16或17所述的组合物，其中该核酸酶是作用于DNA底物的核酸外切酶或核酸内切酶。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中该核酸酶选自由以下组成的组：热不稳定性盐活化核酸酶HL-SAN；HL-dsDNA酶；Cyanase核酸酶；Benzonase核酸酶；Cryonase冷启动核酸酶；以及OmniCleave核酸内切酶。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的组合物，其中该组合物作为多个基本上相同的等分试样提供，每个等分试样在单独的器皿或容器中提供。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中这些等分试样以干燥形式、冷冻形式或冻干形式提供。
22.一种用于测试样品中目的核酸序列的存在和/或量的测试装置，该测试装置包含用于进行体外核酸合成反应的一种或多种试剂，以及处于可再活化形式的暂时基本上无活性的核酸酶。
23.根据权利要求22所述的测试装置，该测试装置包含根据权利要求16-21中任一项所述的组合物。
24.根据权利要求22或23所述的测试装置，该测试装置为横向流或微流体测试装置。
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