CN117568144A - 液路装置、液路装置的使用方法与基因测序仪 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因测序仪技术领域，具体涉及一种液路装置、液路装置的使用方法与基因测序仪，基因测序仪液路装置设置有注射泵作为动力源，注射泵上设置有包括第一孔位至第六孔位的旋转换向阀；测序单元连通于第一孔位，用于进行基因测序反应；废液储存单元连通于第二孔位，用于收集基因测序反应产生的废液；取样单元连通于第三孔位和第四孔位，用于获取和暂时储存待测序的文库；反应单元连通于第五孔位，用于对文库进行变性与稀释；清洁单元连通于第六孔位和测序单元，用于清洁液路装置。由此，能够自动完成文库的变性和稀释，提高基因测序仪的自动化程度，全封闭式的液路装置能够封装在密闭腔体内，有助于在实验室以外的环境下实现DNA原位基因测序。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序仪技术领域，具体提供一种液路装置、液路装置的使用方法与基因测序仪。
背景技术
高通量基因测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），能够快速、准确、高效地测定DNA和RNA序列信息，目前已在生命科学、医学、基因组学、生物学等领域得到广泛应用。NGS对环境DNA（eDNA, enviromental DNA）的测序被认为是NGS应用的下一个前沿。环境DNA是指从土壤、水或空气等各种环境样本中采集的DNA，通过高通量测序方法，可以在不破坏生态系统的情况下检测物种是否存在或进行具体属种的鉴定，在不同时间点采样，可以用来研究生物多样性并检测生态系统的改变。eDNA NGS 正在成为研究生态系统生物多样性的强大工具。
环境DNA分析技术主要步骤可分为样品采集、eDNA提取、文库构建、上机测序及数据处理分析等。对于采样困难、采样周期长的样本来说，样品冷冻和保存剂有影响结果的风险，原位现场检测更容易获得真实的结果，开发出小型化、可自动运行并用于eDNA现场检测的基因测序及前处理仪器是eDNA NGS未来的发展方向。
目前的基因测序仪，在上机前仍然需要操作人员对文库进行手动变性和稀释，自动化程度不足；同时，目前的高通量基因测序仪主要采用试剂进样针结合试剂盒的流路装置，在进样针刺破封装试剂的铝箔之后，试剂储存腔处于开放状态，只适合在实验室中使用，开放式液路装置无法满足在河流、海洋、船舶或者野外环境中的使用需求。另外，依赖手工操作的基因测序方法，无法进行大范围和连续时空的生态数据收集和统计分析，无法满足对生态系统的动态规律研究，目前缺乏能够在野外、船舶等环境中使用的可自动运行的基因测序仪。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种液路装置、液路装置的使用方法与基因测序仪，能够在测序前自动完成文库的变性和稀释，提高基因测序仪的自动化程度，同时，全封闭式的液路装置能够被封装在密闭腔体内部，有助于在实验室以外的环境下实现环境DNA原位基因测序。
本发明第一方面的实施例提供的一种应用于基因测序仪的液路装置，具体包括注射泵、测序单元、废液储存单元、取样单元、反应单元和清洁单元，注射泵上设置有旋转换向阀，旋转换向阀包括依次设置的第一孔位至第六孔位，注射泵用于作为液路装置的动力源；测序单元连通于第一孔位，测序单元用于进行基因测序反应；废液储存单元连通于第二孔位，废液储存单元用于收集基因测序反应产生的废液；取样单元连通于第三孔位和第四孔位，取样单元用于获取和暂时储存待测序的文库；反应单元连通于第五孔位，反应单元用于对文库进行变性与稀释；清洁单元连通于第六孔位和测序单元，清洁单元用于清洁液路装置。
优选地，测序单元包括第一二位三通电磁阀和测序芯片，第一二位三通电磁阀上设置有第一公共端口、第一常开端口和第一常闭端口，第一公共端口连通于第一孔位；测序芯片上设置有试剂出口和试剂进口，试剂出口连通于第一常开端口，试剂进口连通于第一常闭端口和进液单元。
优选地，进液单元包括三通连接接头、旋转剪切阀和液体储存装置，三通连接接头上设置有第二公共端口、第一出口和第二出口，第一出口连通于试剂进口，第二出口连通于第一常闭端口；旋转剪切阀上设置有第三公共端口和多个进液端口，第三公共端口连通于第二公共端口；液体储存装置连通于进液端口，液体储存装置用于储存基因测序反应中所需的试剂、清洗液或水。
优选地，液体储存装置包括进液管、接头、离心管和密封螺栓，进液管的进口连通于进液端口；接头套设于进液管路，接头底部设置有第一螺纹、顶部设置有第二螺纹；离心管顶部设置有第三螺纹，第三螺纹适于旋接于第一螺纹，其中，进液管路的出口位于离心管的底部；密封螺栓适于旋接于第二螺纹。
优选地，液体储存装置还包括密封圈、卡套和通气孔，第一螺纹的底部开设有密封槽，密封圈套设于进液管上，且位于密封槽内部；卡套套设于进液管路上，且位于接头与密封螺栓之间；通气孔设置于接头上，通气孔位于密封圈与卡套之间，通气孔的出口设置有防水透气膜。
优选地，取样单元包括第二二位三通阀和暂存管，第二二位三通电磁阀上设置有第四公共端口、第二常开端口和第二常闭端口，第四公共端口连通于第三孔位，第二常开端口用于连通文库接口，第二常闭端口用于连通纯水接口；暂存管连通于第四孔位。
优选地，反应单元包括第三二位三通电磁阀、缓存管和处理管，第三二位三通电磁阀包括第五公共端口、第三常开端口和第三常闭端口，第五公共端口连通于第五孔位；缓存管连通于第三常开端口；处理管连通于第三常闭端口，处理管用于作为文库变性与稀释的反应腔室。
优选地，清洁单元包括第一空气过滤器和第二空气过滤器，第一空气过滤器连通于第六孔位；第二空气过滤器连通于旋转剪切阀。
本发明第二方面的实施例提供的一种如第一方面的实施例提供的液路装置的使用方法，具体包括以下步骤：
S1：清洗注射泵与测序单元；
S2：使用取样单元获取并暂时储存待测序的文库；
S3：使用反应单元对文库进行变性；
S4：清洗注射泵与测序单元；
S5：使用反应单元对文库进行稀释；
S6：使用测序单元对文库进行混合；
S7：清洗注射泵与测序单元；
S8：灌注测序试剂；
S9：使用测序单元进行基因测序反应；
S10：清洗液路装置。
优选地，使用反应单元对文库进行变性包括：
S3-1：连通注射泵与第四孔位，启动注射泵抽取少量文库，连通注射泵与第二孔位，排出文库；
S3-2：连通注射泵与第四孔位，启动注射泵抽取定量文库，连通注射泵与第五孔位，排出文库；
S3-3：连通注射泵与第一孔位，将旋转剪切阀切换至连通变性试剂，启动注射泵抽取少量变性试剂，连通注射泵与第二孔位，排出变性试剂；
S3-4：连通注射泵与第一孔位，将旋转剪切阀切换至连通变性试剂，启动注射泵抽取定量变性试剂，连通注射泵与第五孔位，排出变性试剂；
S3-5：使用注射泵持续抽取空气并快速排出至处理管，以促进变性试剂与文库充分混合。
优选地，变性试剂为浓度为0.2N的NaOH溶液；变性试剂与文库1：1混合。
优选地，使用反应单元对文库进行稀释包括：
S5-1：连通注射泵与第一孔位，将旋转剪切阀切换至连通文库稀释液，启动注射泵抽取足量文库稀释液，连通注射泵与第二孔位，排出文库稀释液；
S5-2：连通注射泵与第一孔位，将旋转剪切阀切换至连通文库稀释液，启动注射泵抽取定量文库稀释液，连通注射泵与第五孔位，排出文库稀释液；
S5-3：使用注射泵持续抽取空气并快速排出至处理管，以促进文库稀释液与文库充分混合。
优选地，文库稀释液为分子级纯水或10 mM Tris-HCl pH 8.5溶液或杂交缓冲液。
优选地，使用测序单元对文库进行混合包括：
S6-1：连通注射泵与第五孔位，启动注射泵抽取少量稀释文库，连通注射泵与第二孔位，排出稀释文库；
S6-2：连通注射泵与第五孔位，启动注射泵抽取定量稀释文库，将旋转剪切阀切换至连通标准文库，连通注射泵与第一孔位，排出稀释文库；
S6-3：使用注射泵持续抽取空气并快速排出至标准文库管，以促进稀释文库与标准文库充分混合。
优选地，灌注测序试剂包括：
S8-1：连通注射泵与第一孔位，启动注射泵抽取测序试剂，连通注射泵与第二孔位，排出测序试剂；
S8-2：将旋转剪切阀切换至连通缓冲液，启动注射泵抽取缓冲液，连通注射泵与第二孔位，排出缓冲液。
优选地，使用测序单元进行基因测序反应包括：
S9-1：将旋转剪切阀切换至连通分子级纯水，启动注射泵抽取分子级纯水，以测试测序芯片是否密封；
S9-2：将旋转剪切阀切换至连通测序试剂，启动注射泵抽取测序试剂并输送至测序芯片进行反应；连通注射泵与第二孔位，排出剩余测序试剂。
优选地，清洗液路装置包括：
S10-1：连通注射泵与第三孔位，启动注射泵抽取清洗试剂，连通注射泵与第二孔位，排出废液，以清洗注射泵；
S10-2：连通注射泵与第三孔位，启动注射泵抽取清洗试剂，连通注射泵与第一孔位，以清洗测序单元；
S10-3：连通注射泵与第三孔位，启动注射泵抽取清洗试剂，连通注射泵与第一孔位，将旋转剪切阀切换至连通废液袋，排出废液；
S10-4：连通注射泵与第三孔位，启动注射泵抽取清洗试剂，连通注射泵与第四孔位与第五孔位，以清洗处理管和暂存管；
S10-5：重复步骤S10-1，以清洗注射泵。
优选地，清洗试剂为分子级纯水、5%吐温20溶液或0.01%次氯酸钠溶液。
本发明第三方面的实施例提供的一种基因测序仪，具体包括如第一方面的实施例提供的液路装置。
与现有技术相比，本发明能够取得如下有益效果：液路装置、液路装置的使用方法与基因测序仪，基因测序仪液路装置设置有注射泵作为动力源，注射泵上设置有包括第一孔位至第六孔位的旋转换向阀；测序单元连通于第一孔位，用于进行基因测序反应；废液储存单元连通于第二孔位，用于收集基因测序反应产生的废液；取样单元连通于第三孔位和第四孔位，用于获取和暂时储存待测序的文库；反应单元连通于第五孔位，用于对文库进行变性与稀释；清洁单元连通于第六孔位和测序单元，用于清洁液路装置。由此，能够自动完成文库的变性和稀释，提高基因测序仪的自动化程度，全封闭式的液路装置能够封装在密闭腔体内，有助于在实验室以外的环境下实现DNA原位基因测序。
其中，本发明提供了基于离心管的液体储存装置，与采样针结合铝箔封闭的试剂卡盒形式相比，封闭式结构在整机发生短暂的摇晃、倾斜、翻转时，液体不会外溢和泄漏；并且相比于一次性无菌试剂袋封装，能够减少试剂的额外损耗，实现小体积试剂封装，降低成本。
其中，本发明提供的液路装置结构简单，能够实现布放在海洋、河流等水环境中，也可以在船舶、野外中使用，在有无人值守的自动化运行场景下，能够发挥较大优势，为开发出小型化、可自动运行并用于eDNA现场检测的基因测序仪奠定基础。
附图说明
图1是根据本发明实施例提供的一种应用于基因测序仪的液路装置的结构示意图；
图2是根据本发明实施例提供的注射泵与旋转换向阀第一孔位处于连通状态的示意图；
图3是根据本发明实施例提供的注射泵与旋转换向阀第二孔位处于连通状态的示意图；
图4是根据本发明实施例提供的注射泵与旋转换向阀第三孔位处于连通状态的示意图；
图5是根据本发明实施例提供的注射泵与旋转换向阀第四孔位处于连通状态的示意图；
图6是根据本发明实施例提供的注射泵与旋转换向阀第五孔位处于连通状态的示意图；
图7是根据本发明实施例提供的注射泵与旋转换向阀第六孔位处于连通状态的示意图；
图8是根据本发明实施例提供的液体储存装置的爆炸结构示意图；
图9是根据本发明实施例提供的液体储存装置的剖面结构示意图；
图10是根据本发明实施例提供的一种液路装置的使用方法的流程示意图。
其中的附图标记包括：1注射泵，11第一孔位，12第二孔位，13第三孔位，14第四孔位，15第五孔位，16第六孔位，21第一二位三通电磁阀，22第一公共端口，23第一常开端口，24第一常闭端口，25测序芯片，26试剂出口，27试剂进口，31第二公共端口，32第一出口，33第二出口，34旋转剪切阀，35第三公共端口，36进液端口，41进液管，42接头，421第一螺纹，422第二螺纹，43离心管，44密封螺栓，45密封圈，46卡套，47通气孔，48防水透气膜，51第二二位三通电磁阀，52第四公共端口，53第二常开端口，54第二常闭端口，55暂存管，61第三二位三通电磁阀，62第五公共端口，63第三常开端口，64第三常闭端口，71第一空气过滤器，72第二空气过滤器。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
下面参照图1至图9描述根据本发明一些实施例提供的一种液路装置、液路装置的使用方法与基因测序仪。
如图1至图7所示，根据本发明第一方面的实施例提供的一种应用于基因测序仪的液路装置，包括注射泵1、测序单元、废液储存单元、取样单元、反应单元和清洁单元，注射泵1上设置有旋转换向阀，旋转换向阀包括依次设置的第一孔位11(Port1)至第六孔位16(Port6)，通过切换旋转换向阀，能够实现注射泵1与不同孔位之间的连通或断开，从而实现液路装置的不同功能；注射泵1用于作为液路装置的动力源，能够产生负压使得液路装置内部的液体流动；测序单元连通于第一孔位11，测序单元用于进行基因测序反应；废液储存单元连通于第二孔位12(Port2)，废液储存单元用于收集基因测序反应产生的废液；取样单元连通于第三孔位13(Port3)和第四孔位14(Port4)，取样单元用于获取和暂时储存待测序的文库；反应单元连通于第五孔位15(Port 5)，反应单元用于对文库进行变性与稀释；清洁单元连通于第六孔位16和测序单元，清洁单元用于清洁液路装置。由此，能够在测序前自动完成文库的变性和稀释，提高基因测序仪的自动化程度，同时，全封闭式的液路装置能够被封装在密闭腔体内部，有助于在实验室以外的环境下实现环境DNA原位基因测序。
如图2至图7所示，为旋转换向阀将注射泵1依次连通于第一孔位11至第六孔位16的示意图，其中，标示黑色的液路代表处于连通状态。具体地，当旋转换向阀切换至第一孔位时，注射泵连通于测序单元；当旋转换向阀切换至第二孔位时，注射泵连通于废液储存单元；当旋转换向阀切换至第三孔位和第四孔位时，注射泵连通于取样单元；当旋转换向阀切换至第五孔位时，注射泵连通于反应单元；当旋转换向阀切换至第六孔位时，注射泵连通于清洁单元。
其中，液路装置为全封闭式结构，能够被封装在密闭腔体内部，从而实现在野外、船舶、水下的布放和自动化运行。
其中，废液储存单元用于收集基因测序反应产生的废液，通常采用一次性无菌储液袋作为液体储存装置，如Flexboy®（Sartorius）储液袋、迪瑞尔储液袋（Dreure，中国）等。储液袋通常采用鲁尔接头42，能够保证液体在储存和输送过程中处于密封状态；同时，储液袋具有良好的生物相容性，能够减少使用过程中的交叉污染。
如图1所示，测序单元包括第一二位三通电磁阀21和测序芯片25，第一二位三通电磁阀21用于控制液体在测序单元内部的液路方向，第一二位三通电磁阀21上设置有第一公共端口22、第一常开端口23和第一常闭端口24，第一公共端口22连通于第一孔位11，用于接收通过注射泵1输入的液体；测序芯片25用于进行基因测序反应，测序芯片25上设置有试剂出口26和试剂进口27，试剂出口26连通于第一常开端口23，试剂进口27连通于第一常闭端口24和进液单元。
如图1所示，进液单元包括三通连接接头、旋转剪切阀34和液体储存装置，三通连接接头上设置有第二公共端口31、第一出口32和第二出口33，用于实现将试剂进口27同时连通于第一常闭端口24和旋转剪切阀34；第一出口32连通于试剂进口27，第二出口33连通于第一常闭端口24；旋转剪切阀34上设置有第三公共端口35和多个进液端口36，第三公共端口35连通于第二公共端口31，液体储存装置连通于进液端口36，通过调节旋转剪切阀34，能够将不同的进液端口36分别连通于第三公共端口35，从而实现向测序单元输入不同的液体储存装置中储存的液体；液体储存装置用于储存基因测序反应中所需的试剂、清洗液或水。
具体地，当旋转换向阀切换至第一孔位11，第一二位三通电磁阀21处于断电状态时，第一孔位11-第一常开端口23-测序芯片25-第一出口32-第二公共端口31-旋转剪切阀34组成测序通路，此时注射泵1吸液，液路装置内部的负压将试剂输送至测序芯片25进行基因测序反应；当第一二位三通电磁阀21处于上电状态时，第一孔位11-第一公共端口22-第一二位三通电磁阀21-第二出口33-第二公共端口31-旋转剪切阀34组成旁路，旁路用于在进行基因测序反应以前，向旋转剪切阀34与液体储存装置之间的管道内部注满新鲜试剂，以便于进行基因测序反应。
其中，旋转剪切阀34上设置有多个进液端口36，用于连通于储存标准文库、NaOH溶液、杂交缓冲液、多种不同的清洗试剂、测序试剂等的液体储存装置，以便于满足基因测序反应的需求。
可以理解的是，对于废液的收集或是大消耗量试剂的储存，如测序缓冲液、纯水等，可采用一次性无菌储液袋作为液体储存装置。然而，进行基因测序反应还需要多种需求量较少的试剂，如测序引物、文库模板等，总用量不足1ml，但是常见的一次性储液袋容积一般在5ml以上，并且接口管路相对较粗、较长，使用储液袋将增加试剂的损耗，提高成本。
因此，如图8至图9所示，本发明还包括一种基于离心管的试剂储存装置，用于储存需求量较少的试剂，能够极大减少试剂损耗、降低成本。具体地，液体储存装置包括进液管41、接头42、离心管43和密封螺栓44，进液管41的进口连通于进液端口36，用于通过进液端口36向测序单元输送液体；接头42套设于进液管41，接头42底部设置有第一螺纹421、顶部设置有第二螺纹422，用于连接离心管43和密封螺栓44；离心管43顶部设置有第三螺纹，第三螺纹适于旋接于第一螺纹421，其中，离心管43连接于第三螺纹时，进液管41的出口位于离心管43的底部；密封螺栓44适于旋接于第二螺纹422。
其中，接头42上开设有适配于进液管41的小孔，使得接头42套设于进液管41时，不会沿进液管41上下滑动，以便于将离心管43连接于接头42时，能够保证进液管41的出口位于离心管43底部。
优选地，离心管43为锥底离心管，并且根据进液单元的实际工况装入合适的液体量；如果液体储存装置有倾斜的可能，需要放入足够的液体，以保证液体储存装置在倾斜姿态下，进液管41仍能够吸入液体。
优选的，第一螺纹421和第二螺纹422为内螺纹，第三螺纹为外螺纹，密封螺栓44上设置有外螺纹，能够便于拆卸和安装。
可以理解的是，这里的进液管41、离心管43和密封螺栓44可以选择商品化的进液管41、离心管43和密封螺栓44，以便于降低成本。第一螺纹421和第二螺纹422分别根据密封螺栓44和离心管43的螺纹加工，只需要实现接头42、离心管43和密封螺栓44之间的螺纹配合连接；密封螺栓44和卡套46的尺寸根据进液管41的外径选择；进液管41的外径可以选择1/16、1/8、3/16英寸等尺寸。优选地，进液管41的外径选择1/16英寸，能够满足少量吸取试剂的需求。
如图8至图9所示，液体储存装置还包括密封圈45、卡套46和通气孔47，第一螺纹421的底部开设有密封槽，密封圈45套设于进液管41上，且位于密封槽内部，使得将离心管43旋接于接头42时能够压紧密封圈45，从而保证离心管43与接头42之间处于密封状态；卡套46套设于进液管41路上，且位于接头42与密封螺栓44之间，使得将密封螺栓44旋接于接头42时能够压紧卡套46，从而实现卡套46与接头42、进液管41与卡套46之间处于密封状态；通气孔47设置于接头42上，通气孔47位于密封圈45与卡套46之间，能够保持离心管43内部的压力与外界气压相同；通气孔47的出口设置有防水透气膜48，用于避免离心管43内部的液体外溢。
具体地，通过密封圈45、卡套46和通气孔47的配合，能够在密封储存试剂的同时，维持离心管43内部的气压恒定，进而保证试剂能够在负压下正常输送至测序芯片25或其它反应腔室。
如图1所示，取样单元包括第二二位三通阀和暂存管55，第二二位三通电磁阀51用于控制液体在取样单元内部的液路方向，第二二位三通电磁阀51上设置有第四公共端口52、第二常开端口53和第二常闭端口54，第四公共端口52连通于第三孔位13，用于接收通过注射泵1输入的液体；第二常开端口53用于连通文库接口，从而将前端产物文库吸入至注射泵1中；第二常闭端口54用于连通纯水接口，从而获取基因测序反应所需的纯水；暂存管55连通于第四孔位14，用于暂时储存吸入的前端产物文库。
优选地，为了减少液路对文库造成的额外损耗，连通暂存管55的管路通常选择较小的内径，如0.01或0.02英寸。
如图1所示，反应单元包括第三二位三通电磁阀61、缓存管和处理管，第三二位三通电磁阀61用于控制液体在反应单元内部的液路方向，第三二位三通电磁阀61包括第五公共端口62、第三常开端口63和第三常闭端口64，第五公共端口62连通于第五孔位15，用于接收通过注射泵1输入的液体；缓存管连通于第三常开端口63，处理管连通于第三常闭端口64，处理管用于作为文库变性与稀释的反应腔室。
由此，本发明通过设置带有旋转换向阀的注射泵1作为液路装置的动力源，配合第一二位三通电磁阀21、第二二位三通电磁阀51、第三二位三通电磁阀61和旋转剪切阀34作为流动控制元件，能够实现自动将测序反应试剂或其他液体输送至测序芯片进行基因测序反应，实现自动在反应单元的处理管中对文库进行变性和稀释，相比于现有技术中，基因测序反应在上机前需要手动操作，本发明能够进一步提高基因测序流程的自动化程度。
如图1所示，清洁单元包括第一空气过滤器71和第二空气过滤器72，用于连通液路装置与外部空气，通过吸入和排出洁净空气能够将液路装置中的液体全部排出，并对液路装置进行吹干。具体地，第一空气过滤器71连通于第六孔位16，第二空气过滤器72连通于旋转剪切阀34，旋转剪切阀34还包括连接有储液袋的排出端口，通过设置储液袋用于接收使用第二空气过滤器72排出的废液。优选地，第一空气过滤器71和第二空气过滤器72是无需插电运行的空气过滤器，便于携带，使得液路装置适用于实验室以外的环境下使用。
可以理解的是，这里也可以使用干燥的氮气代替通入空气过滤器71的外部空气。
根据本发明第二方面的实施例提供的一种液路装置的使用方法，包括以下步骤：
S1：清洗注射泵1与测序单元。
具体地，S1包括以下步骤：
S1-1：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，保持第一二位三通电磁阀21处于上电状态，将旋转剪切阀34切换至清洗试剂位置，启动注射泵1抽取清洗试剂（通常为纯水），对后续待测文库所经过的液路以及注射泵1进行清洗。
S1-2：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，排出废液至废液储存单元。
S1-3：重复上述S1-1至S1-2步骤5次。
其中，清洗结束后可将旋转剪切阀34切换至第二空气过滤器72位置，抽取洁净空气对液路以及注射泵1进行吹干。
S2：使用取样单元获取并暂时储存待测序的文库。
具体地，S2包括以下步骤：
S2-1：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第三孔位13，打开第二二位三通电磁阀51，使得注射泵1连通于文库接口，启动注射泵1抽取文库。
S2-2：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第四孔位14，将抽取的文库排出至暂存管55中暂时储存，抽取结束后，将第三二位三通电磁阀61断电。
通常情况下，文库制备的产物较少，为减少不必要的损耗，应保证所有的文库都进入暂存管55。具体地，将旋转换向阀切换至第六孔位16，启动注射泵1抽取洁净空气，然后将旋转换向阀切换至第四孔位14，利用空气带动液路中的剩余文库排出至暂存管55。
可以理解的是，当采用全流程自动化模块制备文库时，本发明能够发挥最大优势。具体地，前端文库制备流程结束后，将文库产物储存在容器中；需要进行测序时，第三二位三通电磁阀61上电，启动注射泵1抽取文库，抽取结束后关闭电磁阀。其中，当电磁阀处于关闭状态时，前端文库制备模块和采样单元的液路相互隔离，能够避免相互污染。另外，也可以直接使用手动制备的文库，将文库储存在容器中，用于在进行基因测序时抽取。
S3：使用反应单元对文库进行变性。
具体地，S3包括以下步骤：
S3-1：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第四孔位14，启动注射泵1抽取少量暂存管55中的文库，使得连通暂存管55的液路中充满液体；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，排出注射泵1中多余的文库至废液储存单元。
其中，在使用注射泵1将文库转移至反应单元时，管路内部会存在不可避免的残留，预先使用文库湿润管路内部，能够排除残留液体对文库用量的影响，以实现后续的准确定量。
S3-2：打开第二二位三通电磁阀51，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第四孔位14，启动注射泵1定量抽取暂存管55中的文库；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第五孔位15，排出文库至处理管。
其中，排出文库至处理管之后，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第六孔位16，启动注射泵1抽取清洁空气，然后将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第五孔位15，利用空气带动液路中的剩余文库排出至处理管。
S3-3：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，保持第一二位三通电磁阀21处于上电状态，将旋转剪切阀34切换至连通变性试剂进液端口36，启动注射泵1抽取少量变性试剂，使得连通处理管的液路中充满液体；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，排出注射泵1中多余的变性试剂至废液储存单元。
S3-4：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，将旋转剪切阀34切换至连通变性试剂进液端口36，启动注射泵1定量抽取变性试剂；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第五孔位15，排出变性试剂至处理管。
其中，排出变性试剂至处理管之后，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第六孔位16，启动注射泵1抽取清洁空气，然后将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第五孔位15，利用空气带动液路中的剩余变性试剂排出至处理管。
S3-5：使用注射泵1持续抽取空气并快速排出至处理管，能够利用气泡促进变性试剂与文库的充分混合；混合后等待混合液体孵育5分钟以充分反应。
优选的，变性试剂可采用浓度为0.2N的NaOH溶液，NaOH溶液与文库1：1混合。
S4：清洗注射泵1与测序单元。
具体地，S4包括以下步骤：
S4-1：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，保持第一二位三通电磁阀21处于上电状态，将旋转剪切阀34切换至清洗试剂位置，启动注射泵1抽取清洗试剂（通常为纯水）。
S4-2：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，排出废液至废液袋。
S4-3：重复上述S4-1至S4-2步骤5次。
其中，清洗结束后可将旋转剪切阀34切换至第二空气过滤器72位置，抽取洁净空气对液路以及注射泵1进行吹干。
S5：使用反应单元对文库进行稀释。
具体地，S5包括以下步骤：
S5-1：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，将旋转剪切阀34切换至文库稀释液位置，保持第一二位三通电磁阀21处于上电状态，启动注射泵1抽取足量文库稀释液充分灌注液路；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，排出注射泵1中多余的文库稀释液至废液储存单元。
其中，S5-1步骤可重复多次，以便于将注射泵1中极少的残余液体充分替换为文库稀释液。
S5-2：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，将旋转剪切阀34切换至文库稀释液位置，保持第一二位三通电磁阀21处于上电状态，启动注射泵1定量抽取文库稀释液，保持第二二位三通电磁阀51处于上电状态，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第五孔位15，将定量文库稀释液排出至处理管。
其中，排出文库稀释液至处理管之后，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第六孔位16，启动注射泵1抽取清洁空气，然后将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第五孔位15，利用空气带动液路中的剩余文库稀释液排出至处理管。
S5-3：使用注射泵1持续抽取空气并快速排出至处理管，能够利用气泡促进文库稀释液与变性文库的充分混合；混合后等待混合液体孵育2分钟以充分反应。
优选地，文库稀释液可根据实际情况选择分子级纯水、10 mM Tris-HCl pH 8.5溶液或特定杂交缓冲液。
S6：使用测序单元对文库进行混合。
具体地，S6包括以下步骤：
S6-1：将旋转剪切阀34切换至连通注射泵1与第五孔位15，保持第二二位三通电磁阀51处于上电状态，启动注射泵1抽取少量处理管中的稀释文库，使得处理管与第五孔位15之间的液路注满稀释文库，多余液体通过第二孔位12排出至废液储存单元。
其中，在进行步骤S6-1之前，将旋转剪切阀34切换至第六孔位16，保持第一二位三通电磁阀21处于上电状态，启动注射泵1抽取空气，通过空气带动液路内部剩余液体排出至废液储存单元，并吹干液路。
S6-2：将旋转剪切阀34切换至连通注射泵1与第五孔位15，启动注射泵1定量抽取稀释文库，保持第一二位三通电磁阀21与第二二位三通电磁阀51处于上电状态，将旋转剪切阀34切换至连通标准文库的进液端口36，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，启动注射泵1将定量稀释文库排出至标准文库管中。
其中，步骤S6-2结束后，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第六孔位16，启动注射泵1抽取清洁空气，然后将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，利用空气带动液路中的剩余稀释文库排出至标准文库管。
S6-3：使用注射泵1持续抽取空气并快速排出至标准文库管，能够利用气泡促进稀释文库与标准文库的充分混合；混合后等待混合液体孵育2分钟以充分反应。上述过程结束后，将第二二位三通电磁阀51断电。
其中，标准文库为预先完成变性和稀释的质控文库，如illumina 公司的Phix，用于对待测文库进行碱基平衡。可以理解的是，待测文库的稀释比例、待测文库与标准文库的混合比例可根据实际需要调整，文库稀释液进入标准文库管的过程也可以起到二次稀释的作用。
在一些情况下，预置的文库需要经过一定时间后才会使用，当储存时间较长时，经过变性的单链文库不利于保存。因此，可将定量未经变性和稀释的双链标准文库预置在文库处理管中，在待测文库混合后再进行变性和稀释。
S7：清洗注射泵1与测序单元液路。
具体地，S7包括以下步骤：
S7-1：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，保持第一二位三通电磁阀21处于上电状态，将旋转剪切阀34切换至清洗试剂位置，启动注射泵1抽取清洗试剂（通常为纯水）。
S7-2：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，排出废液至废液储存单元。
S7-3：重复上述S7-1至S7-2步骤5次。
其中，清洗结束后可将旋转剪切阀34切换至第二空气过滤器72位置，抽取洁净空气对液路以及注射泵1进行吹干。
S8：灌注测序试剂。
具体地，S8包括以下步骤：
S8-1：保持第一二位三通电磁阀21处于上电状态，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，启动注射泵1抽取测序试剂；其中，通过切换旋转剪切阀34能够完成不同测序测序试剂的灌注；多余测序试剂通过第二孔位12排出至废液储存单元。
S8-2：测序试剂灌注结束后，将旋转剪切阀34切换至连通于缓冲液进液端口36，启动注射泵1抽取缓冲液并冲洗液路，产生的废液通过第二孔位12排出至废液储存单元；重复上述过程多次。
其中，大部分测序试剂都需要在2至8℃条件下保存，因此，进液单元还设置有温度控制模块，用于在基因测序反应过程中保存测序试剂，以避免液路中的测序试剂暴露在空气中长时间停留，导致无法保证反应效果。在进行基因测序反应前，需要将试剂提前灌注至液路中，同时在测序时，将液路中原有的测序试剂替换为新鲜的测序试剂。
其中，在旁路中进行液路灌注，能够避免对测序芯片25造成污染；旁路中的测序缓冲液能够将其他试剂替换掉，同时降低三通连接接头位置的其他残余试剂在测序过程中造成的污染。
S9：使用测序单元进行基因测序反应。
具体地，S9包括以下步骤：
S9-1：保持第一二位三通电磁阀21处于断电状态，将旋转剪切阀34切换至分子级纯水的进液端口36，启动注射泵1抽取分子级纯水，测试测序芯片25是否正常密封；同时，向测序单元的测序通路灌注分子级纯水。
S9-2：将旋转剪切阀34切换至测序试剂的进液端口36，启动注射泵1抽取不同种类的测序试剂，将不同种类的测序试剂依次输送至测序芯片25进行反应；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，排出剩余的测序试剂至废液储存单元。
S10：清洗所述液路装置。
具体地，S10包括以下步骤：
S10-1：保持第三二位三通电磁阀61处于断电状态，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第三孔位13，启动注射泵1抽取清洗试剂；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，排出废液至废液储存单元；重复5次，以清洗注射泵1。
可以理解的是，对于长期布放野外的原位基因检测液路装置，应在基因测序反应后尽可能短的时间内进行清洗，从而减小测序试剂在液路上的吸附，降低后续清洗和维护的难度。
S10-2：保持第一二位三通电磁阀21处于断电状态，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第三孔位13，启动注射泵1抽取清洗试剂；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，从而完成对测序单元的测序通路的清洗。
S10-3：保持第三二位三通电磁阀61处于断电状态，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第三孔位13，启动注射泵1抽取清洗试剂；将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第一孔位11，将旋转剪切阀34切换至连通于冲洗废液袋进液端口36，从而完成排出清洗进液单元的废液。
S10-4：当后续过程无需使用处理管和暂存管中的文库液体时，可通过第三孔位13抽取清洗试剂，并通过第四孔位14和第五孔位15分别排出，重复多次以完成对处理管的管路和暂存管的管路的清洗。
S10-5：将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第三孔位13，启动注射泵1抽取清洗试剂，将旋转换向阀切换至连通注射泵1与第二孔位12，启动注射泵1排出废液至废液储存单元；多次重复，完成清洗注射泵1。
其中，对于野外和原位使用的情况，可等待基因测序仪返回实验室后，进行步骤S10的清洗过程，对液路装置进行清洗和维护。
优选地，对于在实验室中使用的情况，可将液体储存装置中的离心管43取下，替换为新的离心管43，离心管43内部可使用5%吐温20（Tween 20）和分子级纯水对液路装置和注射泵1进行充分清洗。对于文库流经的液路，可使用0.01%次氯酸钠（NaClO）溶液冲洗，以减少下次进行基因测序反应时所产生的交叉污染。清洗结束后可将旋转剪切阀34切换至第二空气过滤器72位置，抽取洁净空气或干燥氮气对液路装置以及注射泵1进行吹干。
根据本发明第三方面的实施例提供的一种基因测序仪，基因测序仪中包括如第一方面的实施例提供的液路装置。由此，能够自动完成文库的变性和稀释，提高基因测序仪的自动化程度，全封闭式的液路装置能够封装在密闭腔体内，有助于在实验室以外的环境下实现DNA原位基因测序。
其中，液路装置采用三个二位三通电磁阀和一个旋转剪切阀34作为流动控制元件，将基因测序反应所需的试剂或其他液体自动输送至测序芯片25和处理管中进行反应。当本发明提供的液路装置应用于基因测序仪当中时，使用基因测序仪对液路装置进行供电。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (19)
1.一种液路装置，应用于基因测序仪，其特征在于，包括：
注射泵(1)，所述注射泵(1)上设置有旋转换向阀，所述旋转换向阀包括依次设置的第一孔位(11)至第六孔位(16)，所述注射泵(1)用于作为所述液路装置的动力源；
测序单元，所述测序单元连通于所述第一孔位(11)，所述测序单元用于进行基因测序反应；
废液储存单元，所述废液储存单元连通于所述第二孔位(12)，所述废液储存单元用于收集所述基因测序反应产生的废液；
取样单元，所述取样单元连通于所述第三孔位(13)和所述第四孔位(14)，所述取样单元用于获取和暂时储存待测序的文库；
反应单元，所述反应单元连通于所述第五孔位(15)，所述反应单元用于对所述文库进行变性与稀释；
清洁单元，所述清洁单元连通于所述第六孔位(16)和所述测序单元，所述清洁单元用于清洁所述液路装置。
2.根据权利要求1所述的液路装置，其特征在于，所述测序单元包括：
第一二位三通电磁阀(21)，所述第一二位三通电磁阀(21)上设置有第一公共端口(22)、第一常开端口(23)和第一常闭端口(24)，所述第一公共端口(22)连通于所述第一孔位(11)；
测序芯片(25)，所述测序芯片(25)上设置有试剂出口(26)和试剂进口(27)，所述试剂出口(26)连通于所述第一常开端口(23)，所述试剂进口(27)连通于所述第一常闭端口(24)和进液单元。
3.根据权利要求2所述的液路装置，其特征在于，所述进液单元包括：
三通连接接头，所述三通连接接头上设置有第二公共端口(31)、第一出口(32)和第二出口(33)，所述第一出口(32)连通于所述试剂进口(27)，所述第二出口(33)连通于所述第一常闭端口(24)；
旋转剪切阀(34)，所述旋转剪切阀(34)上设置有第三公共端口(35)和多个进液端口(36)，所述第三公共端口(35)连通于所述第二公共端口(31)；
液体储存装置，所述液体储存装置连通于所述进液端口(36)，所述液体储存装置用于储存基因测序反应中所需的试剂、清洗液或水。
4.根据权利要求3所述的液路装置，其特征在于，所述液体储存装置包括：
进液管(41)，所述进液管(41)的进口连通于所述进液端口(36)；
接头(42)，所述接头(42)套设于所述进液管(41)，所述接头(42)底部设置有第一螺纹(421)、顶部设置有第二螺纹(422)；
离心管(43)，所述离心管(43)顶部设置有第三螺纹，所述第三螺纹适于旋接于所述第一螺纹(421)，其中，所述进液管(41)路的出口位于所述离心管(43)的底部；
密封螺栓(44)，所述密封螺栓(44)适于旋接于所述第二螺纹(422)。
5.根据权利要求4所述的液路装置，其特征在于，所述液体储存装置还包括：
密封圈(45)，所述第一螺纹(421)的底部开设有密封槽，所述密封圈(45)套设于所述进液管(41)上，且位于所述密封槽内部；
卡套(46)，所述卡套(46)套设于所述进液管(41)上，且位于所述接头(42)与所述密封螺栓(44)之间；
通气孔(47)，所述通气孔(47)设置于所述接头(42)上，所述通气孔(47)位于所述密封圈(45)与所述卡套(46)之间，所述通气孔(47)的出口设置有防水透气膜(48)。
6.根据权利要求1所述的液路装置，其特征在于，所述取样单元包括：
第二二位三通电磁阀(51)，所述第二二位三通电磁阀(51)上设置有第四公共端口(52)、第二常开端口(53)和第二常闭端口(54)，所述第四公共端口(52)连通于所述第三孔位(13)，所述第二常开端口(53)用于连通文库接口，所述第二常闭端口(54)用于连通纯水接口；
暂存管(55)，所述暂存管(55)连通于所述第四孔位(14)。
7.根据权利要求1所述的液路装置，其特征在于，所述反应单元包括：
第三二位三通电磁阀(61)，所述第三二位三通电磁阀(61)包括第五公共端口(62)、第三常开端口(63)和第三常闭端口(64)，所述第五公共端口(62)连通于所述第五孔位(15)；
缓存管，所述缓存管连通于所述第三常开端口(63)；
处理管，所述处理管连通于所述第三常闭端口(64)，所述处理管用于作为所述文库变性与稀释的反应腔室。
8.根据权利要求3所述的液路装置，其特征在于，所述清洁单元包括：
第一空气过滤器(71)，所述第一空气过滤器(71)连通于所述第六孔位(16)；
第二空气过滤器(72)，所述第二空气过滤器(72)连通于所述旋转剪切阀(34)。
9.一种如权利要求1至8任一所述的液路装置的使用方法，其特征在于，包括：
S1：清洗所述注射泵(1)与所述测序单元；
S2：使用所述取样单元获取并暂时储存待测序的所述文库；
S3：使用所述反应单元对所述文库进行变性；
S4：清洗所述注射泵(1)与所述测序单元；
S5：使用所述反应单元对所述文库进行稀释；
S6：使用所述测序单元对所述文库进行混合；
S7：清洗所述注射泵(1)与所述测序单元；
S8：灌注测序试剂；
S9：使用所述测序单元进行基因测序反应；
S10：清洗所述液路装置。
10.根据权利要求9所述的液路装置的使用方法，其特征在于，使用所述反应单元对所述文库进行变性包括：
S3-1：连通所述注射泵(1)与所述第四孔位(14)，启动所述注射泵(1)抽取少量所述文库，连通所述注射泵(1)与所述第二孔位(12)，排出所述文库；
S3-2：连通所述注射泵(1)与所述第四孔位(14)，启动所述注射泵(1)抽取定量所述文库，连通所述注射泵(1)与所述第五孔位(15)，排出所述文库；
S3-3：连通所述注射泵(1)与所述第一孔位(11)，将所述旋转剪切阀(34)切换至连通变性试剂，启动所述注射泵(1)抽取少量所述变性试剂，连通所述注射泵(1)与所述第二孔位(12)，排出所述变性试剂；
S3-4：连通所述注射泵(1)与所述第一孔位(11)，将所述旋转剪切阀(34)切换至连通变性试剂，启动所述注射泵(1)抽取定量所述变性试剂，连通所述注射泵(1)与所述第五孔位(15)，排出所述变性试剂；
S3-5：使用所述注射泵(1)持续抽取空气并快速排出至所述处理管，以促进所述变性试剂与所述文库充分混合。
11.根据权利要求10所述的液路装置的使用方法，其特征在于：
所述变性试剂为浓度为0.2N的NaOH溶液；
所述变性试剂与所述文库1：1混合。
12.根据权利要求9所述的液路装置的使用方法，其特征在于，使用所述反应单元对所述文库进行稀释包括：
S5-1：连通所述注射泵(1)与所述第一孔位(11)，将所述旋转剪切阀(34)切换至连通文库稀释液，启动所述注射泵(1)抽取足量所述文库稀释液，连通所述注射泵(1)与所述第二孔位(12)，排出所述文库稀释液；
S5-2：连通所述注射泵(1)与所述第一孔位(11)，将所述旋转剪切阀(34)切换至连通文库稀释液，启动所述注射泵(1)抽取定量所述文库稀释液，连通所述注射泵(1)与所述第五孔位(15)，排出所述文库稀释液；
S5-3：使用所述注射泵(1)持续抽取空气并快速排出至所述处理管，以促进所述文库稀释液与所述文库充分混合。
13.根据权利要求12所述的液路装置的使用方法，其特征在于：
所述文库稀释液为分子级纯水或10 mM Tris-HCl pH 8.5溶液或杂交缓冲液。
14.根据权利要求9所述的液路装置的使用方法，其特征在于，使用所述测序单元对所述文库进行混合包括：
S6-1：连通所述注射泵(1)与所述第五孔位(15)，启动所述注射泵(1)抽取少量稀释文库，连通所述注射泵(1)与所述第二孔位(12)，排出所述稀释文库；
S6-2：连通所述注射泵(1)与所述第五孔位(15)，启动所述注射泵(1)抽取定量所述稀释文库，将所述旋转剪切阀(34)切换至连通标准文库，连通所述注射泵(1)与所述第一孔位(11)，排出所述稀释文库；
S6-3：使用所述注射泵(1)持续抽取空气并快速排出至所述标准文库管，以促进所述稀释文库与所述标准文库充分混合。
15.根据权利要求9所述的液路装置的使用方法，其特征在于，灌注测序试剂包括：
S8-1：连通所述注射泵(1)与所述第一孔位(11)，启动所述注射泵(1)抽取测序试剂，连通所述注射泵(1)与所述第二孔位(12)，排出所述测序试剂；
S8-2：将所述旋转剪切阀(34)切换至连通缓冲液，启动所述注射泵(1)抽取缓冲液，连通所述注射泵(1)与所述第二孔位(12)，排出所述缓冲液。
16.根据权利要求9所述的液路装置的使用方法，其特征在于，使用测序单元进行基因测序反应包括：
S9-1：将所述旋转剪切阀(34)切换至连通分子级纯水，启动所述注射泵(1)抽取分子级纯水，以测试所述测序芯片(25)是否密封；
S9-2：将所述旋转剪切阀(34)切换至连通测序试剂，启动所述注射泵(1)抽取所述测序试剂并输送至所述测序芯片(25)进行反应；连通所述注射泵(1)与所述第二孔位(12)，排出剩余所述测序试剂。
17.根据权利要求9所述的液路装置的使用方法，其特征在于，清洗所述液路装置包括：
S10-1：连通所述注射泵(1)与所述第三孔位(13)，启动所述注射泵(1)抽取清洗试剂，连通所述注射泵(1)与所述第二孔位(12)，排出废液，以清洗所述注射泵(1)；
S10-2：连通所述注射泵(1)与所述第三孔位(13)，启动所述注射泵(1)抽取清洗试剂，连通所述注射泵(1)与所述第一孔位(11)，以清洗所述测序单元；
S10-3：连通所述注射泵(1)与所述第三孔位(13)，启动所述注射泵(1)抽取清洗试剂，连通所述注射泵(1)与所述第一孔位(11)，将旋转剪切阀(34)切换至连通废液袋，排出废液；
S10-4：连通所述注射泵(1)与所述第三孔位(13)，启动所述注射泵(1)抽取清洗试剂，连通所述注射泵(1)与所述第四孔位(14)与所述第五孔位(15)，以清洗所述处理管和所述暂存管；
S10-5：重复步骤S10-1，以清洗所述注射泵(1)。
18.根据权利要求17所述的液路装置的使用方法，其特征在于：
所述清洗试剂为分子级纯水、5%吐温20溶液或0.01%次氯酸钠溶液。
19.一种基因测序仪，其特征在于，包括：
如权利要求1至8任一所述的液路装置。
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