CN117562996A - 一种可降解双金属多模式治疗纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可降解双金属多模式治疗纳米药物及其制备方法和应用，该可降解双金属纳米药物，包括Cu、Fe、Mn、Ag、Au、Pt、Pd、Co、Ni金属离子中的任意两种、6‑硫鸟嘌呤和Meso‑四(4‑羧基苯基)卟吩，其摩尔比为1:1:3:3‑3:3:2:2。本发明通过水热法合成制备的双金属纳米药物是一种全新的可生物降解的纳米药物，制备的双金属纳米药物展现出较强的催化能力，实现联合治疗肿瘤目的。同时本发明制备的双金属纳米药物还是一种全新的可生物降解的纳米抗菌剂，结合光照，产生的反应氧物种导致膜受损变形和内容物的泄漏，导致细菌死亡。因此，本发明制备的双金属纳米药物可应用于癌症多模式治疗及抗菌治疗。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料领域，具体涉及一种可降解双金属多模式治疗纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症，也被称为恶性肿瘤，是一种全世界公认的严重威胁人类生命的疾病，其特征是细胞异常增殖，具有侵袭和转移，以及逃避免疫破坏的能力。与正常组织相比，肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)为癌细胞提供了独特的生物物理和化学环境，包括H2O2的高表达、缺氧和酸化等。复杂的TME不仅加速了肿瘤的发展和转移，而且通过快速调节其自身的稳态，限制了大多数治疗技术的有效性和特异性。另一方面，独特的TME也被广泛用于设计纳米药物或调节纳米药物功效，以提高癌症治疗的有效性。例如，TME响应型纳米药物可以促进全身给药的化疗药物的靶点积累，从而提高化疗疗效并将其毒性降至最低。此外，为了克服由缺氧引起的光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)治疗阻力，发展了多种纳米催化剂药物用于肿瘤内部的原位氧气生成，从而增强对肿瘤的光动力损伤疗法。在化动力治疗(Chemodynamic therapy,CDT)中，TME中丰富的H2O2可以通过治疗性反应被催化转化为高毒性的ROS。其中，金属基纳米催化材料(如Cu,Fe,Co,Mn等等)是最有前景的CDT治疗试剂之一。虽然这些治疗方案在丰富抗癌治疗方法方面取得了相当大的进展，但由于TME的内在复杂性和自我调节能力，单一治疗通常呈现出有限的抗癌效果。
近年来，TME响应的多模式协同治疗因其综合了各种治疗方法的优点而在肿瘤消除方面显示出巨大的潜力。而且大量证据证明，结合低氧调节能力的化疗-光动力疗法可以缓和肿瘤免疫抑制微环境，提高抗肿瘤效果。然而，目前用于多模式治疗的纳米药物大多是多种功能材料或药物分子的复合体，需要复杂的合成和组装过程或繁琐的修饰步骤，不利于纳米药物的临床转化。同时，纳米药物制备的复杂性也使得确定它们在机体内的潜在毒性和纳米免疫相互作用具有相当大的挑战性。因此，通过简单的方法合成用于多模式协同治疗且可降解的替代纳米材料十分重要，但仍然是一项艰巨的任务。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的多模式治疗药物制备复杂，以及药物代谢难，易引起长期毒性的问题，本发明通过简单的一步水热法，制备了一种新型的可生物降解棒状多模式治疗双金属纳米药物，不仅具有良好的生物安全性，并且实现了多模式治疗，大大改善了CDT单一治疗的局限性，可以有效应用于肿瘤多模式协同治疗以及抗菌治疗。本发明提供所述可生物降解双金属纳米药物的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种可降解双金属纳米药物，其特征在于，包括Cu、Fe、Mn、Ag、Au、Pt、Pd、Co、Ni金属离子中的任意两种、6-硫鸟嘌呤(TG)和Meso-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)，其摩尔比为1:1:3:3-3:3:2:2。
作为优选：采用Cu、Fe双金属离子、6-硫鸟嘌呤(TG)和Meso-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)摩尔比为1:1:1:1，反应所获得的双金属纳米药物，简称为纳米药物。
其中，所述可降解双金属纳米药物的颗粒为纳米棒形状。
其中，所述可降解双金属纳米药物的颗粒横向尺寸约20nm左右，纵向尺寸约200nm左右。
本发明所述的可降解双金属纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
将两种金属盐试剂和稳定剂溶于去离子水中进行搅拌反应得到溶液A，取去质子化剂加入溶液A继续搅拌反应，另取TG和TCPP配体溶于去离子水中，充分溶解得到溶液B，将两种溶液混合搅拌后得到混合液C，进行水热法加热反应；反应结束后，通过离心(10000r/min，3min)去掉上清液，将沉淀物洗涤干净后烘干，得到双金属纳米药物。
其中，所述稳定剂为铅盐类稳定剂、金属皂类稳定剂、有机锡稳定剂、稀土稳定剂或者有机辅助稳定剂。
其中，有机辅助稳定剂包括亚磷酸酯类、环氧化合物类、多元醇类等。
作为优选，有机辅助稳定剂为泊洛沙姆，一种聚氧乙烯聚氧丙烯醚三嵌段共聚物(Pluronic F127)。
其中，所述去质子化剂为甲酸、冰醋酸或者丙酸等弱酸试剂。
作为优选，去质子化剂为冰醋酸。
其中，所述得到溶液A的搅拌时间为30min～150min，加入去质子化剂后搅拌时间为1-2h，溶液A和溶液B混合搅拌的时间为1h～3h。
其中，所述溶液C倒入聚四氟乙烯内胆反应釜中，放入烘箱，在100℃～150℃条件下加热反应4h～18h。
作为优选，在不同温度条件下100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃加热反应；最优选的为110℃反应时间为16h。
本发明所述的可降解双金属纳米药物在制备抗肿瘤和抗菌药物中的应用。
本发明所述的可降解双金属纳米药物联合H2O2和光照在制备抗菌药物或者工具或者试剂中的应用。
其中，所述菌为大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌。
其中，所述可降解双金属纳米药物在癌细胞内微酸性环境下会发生降解，释放的双金属离子如Cu离子和Fe离子，可以发生类芬顿反应，产生高氧化性羟基自由基，继而诱导细胞凋亡；释放的光敏剂TCPP可以催化产生单线态氧，实现肿瘤的光动力治疗；而释放的化疗药物TG可以应用于肿瘤化疗，因此，所制备的可降解双金属纳米药物可以用于肿瘤的联合化疗/化动力治疗/光动力治疗三模式治疗。同时，该纳米药物还可以通过光敏剂TCPP的光动力效应和金属离子的类芬顿效应产生的·OH、1O2协同作用于细菌，达到抗菌效果。更重要的是，降解的Cu，Fe等金属离子在完成治疗作用后，可经过肾脏代谢出体外，避免了纳米药物对生物体的长期毒性。
本发明中利用金属离子如Cu、Fe金属离子、6-硫鸟嘌呤(TG)和Meso-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)，在聚四氟乙烯高温反应釜中进行反应。制得了双金属纳米药物合成的纳米颗粒具有良好的催化性能，由Michaelis-Menten曲线和Lineweaver-Burk拟合可得其催化活性与过氧化物酶相当。在微酸性环境下可发生降解，释放出Cu离子，Fe离子，光敏剂TCPP，以及化疗药物TG，触发CDT/PDT/Chemotherapy协同三模式治疗。体外细胞的增殖抑制实验和体内抑制作用研究实验表明合成的棒状纳米药物具有良好的抗肿瘤效应，并且，降解的Cu，Fe等金属离子在完成治疗作用后，可经过肾脏代谢出体外，避免了纳米药物对生物体的长期毒性。体外细菌的增殖抑制作用研究实验和体内抑制作用研究实验表明合成的纳米颗粒具有良好的抗菌效应，可应用于生物医药领域。
本发明的双金属如Cu、Fe金属离子、6-硫鸟嘌呤(TG)和Meso-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)在高温下通过配位反应聚合成纳米小颗粒，形成的棒状纳米颗粒具有良好的催化性能，可降解性和优异的多模式治疗效应。
本发明通过水热法合成制备的双金属纳米药物是一种全新的可生物降解的纳米药物，制备的双金属纳米药物展现出较强的催化能力，可以催化过氧化氢(H2O2)产生氧气(O2)，改善肿瘤的乏氧环境。同时具有过氧化物模拟酶的性质，可以用于催化癌细胞内高氧化性羟基自由基(·OH)的产生，继而诱导癌细胞凋亡，降解后，试剂中所含的TG可用于肿瘤化疗，TCPP可用于肿瘤光动力学治疗(PDT)，产生单线态氧(1O2)，达到联合治疗目的。同时本发明制备的双金属纳米药物还是一种全新的可生物降解的纳米抗菌剂，在低浓度的H2O2存在下，材料可通过芬顿(Fenton)效应，催化生成·OH，导致细胞膜损伤。结合光照，产生的1O2导致细菌死亡。因此，本发明制备的双金属纳米药物可应用于癌症多模式治疗及抗菌治疗。本发明的制备方法简单方便，原料来源广，成本低，可重复性，适用于工业化生产应用。
本发明的可生物降解双金属纳米药物在微酸性条件下可发生降解，释放出Cu离子，Fe离子，光敏剂TCPP，以及化疗药物TG。其中，Cu离子和Fe离子作为类芬顿试剂可以用于催化癌细胞内高氧化性羟基自由基的产生，继而诱导癌细胞凋亡；光敏剂TCPP可以催化产生单线态氧，实现肿瘤的光动力治疗；而释放的化疗药物TG可以应用于肿瘤化疗，因此，所制备的可降解双金属纳米药物可以用于肿瘤的化疗/化动力治疗/光动力治疗三模式治疗。此外，该纳米药物还可以通过光敏剂TCPP的光动力效应和金属离子的类芬顿效应用于快速有效地细菌清除，加速脓肿消融。更重要的是，降解的Cu，Fe等金属离子在完成治疗作用后，可经过肾脏代谢出体外，避免了纳米药物对生物体的长期毒性。
本发明合成方法简单，采用一步水热法将多种抗癌试剂综合于一个纳米颗粒内，实现多模式治疗，有效实现一锅法合成。合成的纳米药物不仅具有多模式治疗，并且具有肿瘤微环境(微酸性)响应可降解的特性，可通过肾脏代谢，降低纳米药物全身毒性。
现有方案主要通过多种纳米材料的层层组装或多种药物分子的负载来实现多模式治疗。合成步骤复杂繁琐，难以实现量产和临床转化。同时大多非降解型多模式纳米药物易在体内滞留，引起长期毒性和副作用。本发明所制备的新型可降解双金属纳米棒，制备方法简单，可作为多模式治疗纳米药物，进行多模式肿瘤治疗和抗菌治疗，且易于降解经肾脏排出体外，避免了长期毒性。本发明通过双金属离子Fe和Cu与有机小分子TG、TCPP的配位作用经过一步水热法即可合成双金属复合纳米棒，该纳米棒同时具有过氧化氢酶和过氧化物酶性质，并且，在弱酸性环境下可降解，释放类芬顿试剂(Cu离子和Fe离子)、光敏剂TCPP、以及化疗药物TG，实现联合PDT/CDT/Chemotherapy三模式治疗。其降解产物可通过肾脏排出，避免药物分子的长期毒性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过简单的一锅水热法制备了全新的可生物降解的纳米药物该纳米药物同时具有过氧化氢酶和过氧化物酶性质，并且，在肿瘤微环境弱酸性环境下可降解，释放类芬顿试剂(Fe离子和Cu离子)、光敏剂TCPP、以及化疗药物TG，实现联合PDT/CDT/Chemotherapy三模式治疗肿瘤，肿瘤抑制效果显著，并且其降解产物可通过肾脏排出，避免药物分子的长期毒性。此外，还可以利用金属离子的类Fenton效应和光敏剂TCPP的光动力效应用于快速有效地清除细菌，加速脓肿消融。同时本发明的制备方法简单方便，原料来源广，成本低，可重复性，适用于工业化生产应用。
附图说明
图1为本发明在110℃反应16h制备的Fe-TG-TCPP单金属纳米药物的TEM图；
图2为本发明在110℃反应16h制备的Fe-TG-TCPP单金属纳米药物的催化效果表征图；
图3为本发明在110℃反应16h制备的Cu-TG-TCPP单金属纳米药物材料的TEM图；
图4为本发明在110℃反应16h制备的Cu\Fe-TG-TCPP双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:3:3)的TEM图；
图5为本发明在110℃反应16h制备的Cu\Fe-TG-TCPP双金属纳米药物(DMNRs)材料(摩尔比为1:1:1:1)的TEM及HAADF-STEM mapping图；(a-b)Fe-Cu-TG-TCPP(1:1:1:1)的TEM图像，(c)Fe-Cu-TG-TCPP(1:1:1:1)的HAADF-STEM图像。Cu,Fe,O,N,C,S在Fe-Cu-TG-TCPP(1:1:1:1)中的EDXS元素映射(d-j)；
图6为本发明在110℃反应16h制备的Cu\Fe-TG-TCPP双金属纳米药物材料(摩尔比为3:3:2:2)的TEM图；
图7为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的XRD图；
图8为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的XPS图；
图9为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的紫外吸收图谱；
图10为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的红外光谱图；
图11为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的pH依赖性降解TEM表征图
图12为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的pH依赖性Cu\Fe离子释放实验；左图为不同pH值下DMNRs的Fe3+离子释放曲线；右图为不同pH值下DMNRs的Cu2+离子释放曲线；
图13为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的pH依赖性TG药物释放实验；
图14为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的pH依赖性TCPP药物释放实验；
图15为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的催化性能实验；其中(a)在DMNRs存在的情况下，加入不同浓度H2O2后TMB的UV-vis吸收光谱，(b)含DMNRs和TMB的PBS(pH＝6.0)在不同H2O2浓度下的652nm时程吸光度，(c)基于图(b)的DMNRs的Michaelis-Menten动力学，(d)DMNRs的Lineweaver-Burk图；
图16为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的溶解氧测定实验；其中(a)添加DMNRs后氧含量的时间-过程曲线，(b)添加H2O2或光照时DMNRs的ESR光谱；
图17为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的单线态氧测定实验；(a)不同浓度DPHA的UV-vis吸收和(b)标准绘图。(c)在DMNRs存在下，不同H2O2浓度下DPHA的时程吸收变化，(d)DPHA与DMNRs不同时间吸收变化，(e)DPHA与MB不同时间吸收变化，(f)DMNRs和MB同DPHA反应吸收在355nm处随时间变化的衰减曲线；
图18为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的细胞毒性实验；PBS、TG、TCPP、DMNRs或DMNRs+光孵育后4T1细胞的相对存活率；
图19为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的活\死细胞成像实验；不同配方处理后4T1细胞与钙黄素AM/PI共染色的荧光图像，刻度条代表10μm。
图20为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的活性氧细胞成像实验；DCF染色4T1细胞的CLSM图像，比例尺为10μm；
图21为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的细胞内金属含量实验；细胞与DMNRs孵育4、6、8、10、12、24h后细胞内金属含量，a图为Fe离子含量，b图为Cu离子含量；
图22为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的溶血效果实验；水、PBS和不同浓度DMNRs的相对溶血率；
图23为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的活体成像及生物分布实验；其中(a)在不同时间点后注射DMNRs的小鼠肿瘤荧光图像。上图为背部肿瘤，下图为腹部器官。(b)注射DMNRs纳米颗粒后120小时小鼠主要器官和肿瘤的离体荧光成像。(c)(a)中肿瘤部位的荧光强度。(d)(b)中主要器官和肿瘤的离体荧光强度。(e)DMNRs在治疗24小时后的生物分布；(f)注射DMNRs 24小时、36小时或48小时后收集的尿液中的铁和铜含量；
图24为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的抗肿瘤疗效实验；其中(a)第18天用不同制剂处理后小鼠异种移植肿瘤的代表性图像。G1：PBS，G2：light，G3：Fe-Cu-TG-TCPP(2:2:3:3)，G4：DMNRs，G5：DMNRs+light。(b)不同制剂给药后荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线。误差棒表示SD(n＝4)。(c)治疗期间荷瘤小鼠的体重变化。(d)用不同制剂处理后从小鼠身上解剖异种移植肿瘤的照片。比例尺，2cm。(e)用不同制剂处理后从小鼠身上解剖异种移植肿瘤的瘤重。(f)施用不同制剂的小鼠的肿瘤组织切片的TUNEL染色测定。标尺，50μm。G1：PBS，G2：light，G3：Fe-Cu-TG-TCPP(2:2:3:3)，G4：DMNRs，G5：DMNRs+light。(g)施用不同制剂的小鼠的肿瘤组织切片的H&E染色测定。标尺，50μm。G1：PBS，G2：light，G3：Fe-Cu-TG-TCPP(2:2:3:3)，G4：DMNRs，G5：DMNRs+light。(h)DMNRs治疗后正常组织的组织学观察；
图25为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的细菌毒性实验；其中(a)金黄色葡萄球菌和(b)大肠杆菌暴露于PBS、H2O2、mNFs、DMNRs、DMNRs+H2O2、PBS+Light、H2O2+Light、DMNRs+Light和DMNRs+H2O2+Light形成的菌落照片，(c)和(d)分别为(a)和(b)对应的存活率，DMNRs和H2O2的浓度分别为20μg/mL和1mM；
图26为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的活\死细菌成像实验；(a)和(b)为不同处理组的荧光染色图像，活菌用钙黄素am标记为绿色，死菌用PI标记为红色；
图27为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的抗菌疗效实验(一)；(a)用(G1)PBS、(G2)H2O2(1mM)、(G3)DMNRs(60μg/mL)、(G4)DMNRs+H2O2、(G5)DMNRs+H2O2+Light处理的金黄色葡萄球菌感染脓肿的照片及相应的组织学切片。比例尺，200微米，(b)DMNRs治疗后正常组织的组织学观察；
图28为本发明在110℃反应16h制备的双金属纳米药物材料(摩尔比为1:1:1:1)的抗菌疗效实验(二)；(a)抗菌治疗期间小鼠的体重变化。(b)分别用PBS、H2O2、DMNRs、DMNRs-H2O2、DMNRs-H2O2-Light处理10天d小鼠的血清生化指标水平。(c)DMNRs在小鼠体内的积累情况。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
Pluronic F127(聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇)，6-硫鸟嘌呤(TG)，Meso-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP，中-四(4-羧基苯基)卟吩)购买于Aladdin。
实施例1
合成单金属Fe纳米药物材料
称取0.016g的Pluronic F127和0.0107g的FeCl3于圆底烧瓶中，加15ml去离子水超声溶解。在恒温磁力搅拌器上连接好装置，与25℃下800rpm搅拌1h。然后于烧瓶中加入15μl冰醋酸溶液，再800rpm搅拌1h。紧接着加入溶于5ml去离子水的0.0055g TG和0.0261gTCPP于到烧瓶中，得到的溶液进一步800rpm搅拌2h。搅拌结束后，将溶液转移至聚四氟乙烯内胆高温反应釜，于鼓风干燥箱内110℃条件下反应16h达到结晶。反应结束后，10000r/min离心反应溶液3min，以去除反应过程中生成的大颗粒。丢弃上清液后，将得到的黑紫色固体产物用水清洗三次，去除多余的反应物，并将所得的材料烘干收集，得到纳米颗粒；图1是制备纳米材料Fe-TG-TCPP的TEM图(Fe、TG、TCPP摩尔比为2：1：1)，可见制备材料为纳米花。
实施例2
合成单金属Cu纳米药物材料
称取0.016g的Pluronic F127和5.7mg CuCl2于圆底烧瓶中，加15ml去离子水超声溶解。在恒温磁力搅拌器上连接好装置，与25℃下800rpm搅拌1h。然后于烧瓶中加入15μl冰醋酸溶液，再800rpm搅拌1h。紧接着加入溶于5ml去离子水的0.0055g TG和0.0261gTCPP于到烧瓶中，得到的溶液进一步800rpm搅拌2h。搅拌结束后，将溶液转移至聚四氟乙烯内胆高温反应釜，于鼓风干燥箱内110℃条件下反应16h达到结晶。反应结束后，10000r/min离心反应溶液3min，以去除反应过程中生成的大颗粒。丢弃上清液后，将得到的综黑色固体产物用水清洗三次，去除多余的反应物，并将所得的材料烘干收集，得到纳米颗粒；图3是制备纳米材料Cu-TG-TCPP的TEM图(Cu、TG、TCPP摩尔比为2：1：1)，可见制备材料为大尺寸纳米棒。
实施例3
合成双金属纳米药物材料
称取0.016g的Pluronic F127，5.7mg CuCl2和5.4mg FeCl3于圆底烧瓶中，加15ml去离子水超声溶解。在恒温磁力搅拌器上连接好装置，与25℃下800rpm搅拌1h。然后于烧瓶中加入15μl冰醋酸溶液，再800rpm搅拌1h。紧接着加入溶于5ml去离子水的0.0783g TCPP和0.0165g TG于到烧瓶中，得到的溶液进一步800rpm搅拌2h。搅拌结束后，将溶液转移至高温反应釜，于鼓风干燥箱内110℃条件下反应16h达到结晶。反应结束后，10000r/min离心反应溶液3min，以去除反应过程中生成的大颗粒。丢弃上清液后，将得到的黑紫色固体产物用水清洗三次，去除多余的反应物，并将所得的材料烘干收集，得到纳米颗粒；图4是制备纳米材料Cu-Fe-TG-TCPP的TEM图(摩尔比为1:1:3:3)，可见制备材料纳米棒状，但尺寸不均一，尺寸在50～200nm*1.5μm左右。
实施例4
合成双金属纳米药物材料
称取0.016g的Pluronic F127，5.7mg CuCl2和5.4mg FeCl3于圆底烧瓶中，加15ml去离子水超声溶解。在恒温磁力搅拌器上连接好装置，与25℃下800rpm搅拌1h。然后于烧瓶中加入15μl冰醋酸溶液，再800rpm搅拌1h。紧接着加入溶于5ml去离子水的0.0261g TCPP和0.0055g TG于到烧瓶中，得到的溶液进一步800rpm搅拌2h。搅拌结束后，将溶液转移至高温反应釜，于鼓风干燥箱内110℃条件下反应16h达到结晶。反应结束后，10000r/min离心反应溶液3min，以去除反应过程中生成的大颗粒。丢弃上清液后，将得到的黑紫色固体产物用水清洗三次，去除多余的反应物，并将所得的材料烘干收集，得到纳米颗粒；图5是制备纳米材料Cu-Fe-TG-TCPP的TEM(图5a-b)和HAADF-STEM(图5c)图(摩尔比1:1:1:1)，可见制备材料为纳米棒状，形貌均一，尺寸在20nm*200nm左右，元素映射分析证实了每种元素(Cu、Fe、O、C、N和S)在纳米颗粒上的均匀分布(图5d-j)，为双金属复合纳米棒的成功合成提供了可视化证据。
实施例5
合成双金属纳米药物材料
称取0.016g的Pluronic F127，17.1mg CuCl2和16.2mg FeCl3于圆底烧瓶中，加15ml去离子水超声溶解。在恒温磁力搅拌器上连接好装置，与25℃下800rpm搅拌1h。然后于烧瓶中加入15μl冰醋酸溶液，再800rpm搅拌1h。紧接着加入溶于5ml去离子水的0.0522gTCPP和0.0011g TG于到烧瓶中，得到的溶液进一步800rpm搅拌2h。搅拌结束后，将溶液转移至高温反应釜，于鼓风干燥箱内110℃条件下反应16h达到结晶。反应结束后，10000r/min离心反应溶液3min，以去除反应过程中生成的大颗粒。丢弃上清液后，将得到的黑紫色固体产物用水清洗三次，去除多余的反应物和表面活性剂，并将所得的材料烘干收集，得到纳米颗粒；图6是制备纳米材料Cu-Fe-TG-TCPP的TEM图(摩尔比为3:3:2:2)，可见制备材料纳米棒状，但尺寸不均一，尺寸在10～100nm*200～800nm左右。
通过实施例1-3进行了材料形貌对比，若材料形貌不合适，如尺寸太大，无法注射入体内，也无法进入细胞，即无法作纳米药物治疗肿瘤。进一步通过实施例3-5进行比较，在Cu-Fe-TG-TCPP摩尔比1:1:1:1(命名为DMNRs)时，形貌最优，最适合用于抗肿瘤和抗菌。
试验例1
对本发明制备的双金属纳米药物进行表征测试，包括紫外吸收、XRD、XPS、红外吸收等。
采用实施例4的制备方法制备得到双金属纳米药物颗粒(DMNRs)。图7为制备双金属纳米药物纳米材料(摩尔比为1:1:1:1)的XRD图，在X射线衍射图中计算的Bragg方程的结果显示了CuO\Fe2O3的特征峰，其他峰归属于配位的Cu\Fe-TG或Cu\Fe-TCPP化合物。图8为制备双金属纳米药物的纳米颗粒的XPS图谱，X射线光电子能谱(XPS)进一步证实了每种元素(Cu、Fe、O、C、N和S)的存在。在高分辨率XPS中，711.4eV(Fe 2p3/2)和724.7eV(Fe 2p1/2)处的峰表明铁的价态为三价，952.8eV(Cu 2p 1/2)、934eV(Cu 2p 3/2)处的峰表明铜的价态为二价。此外，N 1s光谱中-NH-和-C＝N-的存在以及S 2p光谱中S-H的存在证实了N和S在制备的纳米颗粒中的成功配位。图9为制备双金属纳米药物的纳米颗粒的紫外吸收图谱，紫外-可见吸收光谱也证明了对应于TCPP和TG的特征吸收的共存。图10为制备双金属纳米药物的纳米颗粒的红外图谱，在1683cm-1处减弱的C＝O伸缩振动FTIR峰和在1651cm-1处出现的新峰进一步支持了制备的纳米颗粒中卟吩羧基的配位。而且，963cm-1处未触及的面内振动表明卟吩中心未被金属配位占据。另外，TG的配位则通过消失的N-H(3100cm-1)和S-H(2500-2990cm-1)FTIR峰得到证实，证明本发明有效合成了双金属纳米药物。
试验例2
测试双金属纳米药物的pH依赖性降解，通过实施例4制备的纳米材料Cu-Fe-TG-TCPP(DMNRs)，将0.1mg DMNRs分散到1mL PBS(10mM，pH：7.4、6.5或5.0)中。在预定的时间间隔，制备TEM样品，然后使用透射电子显微镜进行表征。图11为纳米颗粒的pH依赖性降解TEM图，表明该双金属纳米药物在弱酸性条件下可降解。
试验例3
测试双金属纳米药物的pH依赖性药物释放，通过将实施例4制备的0.1mg DMNRs分散到1mL PBS(10mM，pH：7.4、6.5或5.0)中。在预定的时间间隔，取出100μL溶液并以9000rpm的速度离心15分钟。然后收集上清液中游离的TCPP和TG，并通过酶标仪分别记录它们在413nm和342nm处的吸光度，然后使用标准曲线确定时间依赖性释放行为。图12为纳米颗粒的pH依赖性金属离子释放实验，通过ICP-OES测试获得。图13为纳米颗粒的pH依赖性TG释放实验；图14为纳米颗粒的pH依赖性TCPP释放实验；降解产物上清液在350nm处的紫外-可见吸收峰与TG和TCPP的吸收光谱高度匹配，表明TG和TCPP随着DMNRs的逐渐降解而有效释放。
由图12、图13和图14可得，在24小时内，只有少量的Fe3+\Cu2+从PBS 7.4溶液中的DMNRs中泄漏，而在PBS 4.5、6.5和5.0溶液中观察到TCPP、TG或Fe3+\Cu2+的释放百分比显著增加。在不同pH值的溶液中进一步研究了纳米颗粒的pH响应性，有效证明纳米药物可以特异性响应肿瘤弱酸性微环境，达到治疗的目的。
试验例4
测试双金属纳米药物分解产生的Fe3+\Cu2+可以催化H2O2通过类Fenton反应生成·OH，通过检测实施例4制备的DMNRs的时间过程比色进一步研究了纳米颗粒在酸性缓冲溶液中的Michaelis-Menten稳态动力学。使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)作为显色剂进行测定，在652nm处具有特征吸光度。图15为DMNRs的催化性能实验，具体而言，将不同终浓度的H2O2(1.25×10-5、1.875×10-5、2.5×10-5和3.75×10-5M)添加到含有1mg/mL DMNRs和0.8mg/mL TMB的pH6.5 PBS中室温下反应，然后绘制反应溶液在652nm处的时程吸光度(图15a-b)。然后，相应地绘制TMB氧化的初始速度(ν0)与[H2O2]的关系以获得Michaelis-Menten曲线(图15c)。通过线性双倒数变换进一步进行Lineweaver拟合，得到Vmax(最大初速度)和Km(Michaelis-Menten常数)(图15d)，分别为1.37×10-5M S-1和4.05×10-5M。这种催化活性与辣根过氧化物酶相当，证明了在TME的酸性条件下本发明制备的DMNRs具有将H2O2转化为·OH的高催化效率。并与实施例1制备的单金属Fe-TG-TCPP在相同的实验条件下相比(图2)，催化效率更高，而实施例2制备单Cu金属制备纳米棒尺寸大，无法进入细胞作为纳米药物。
试验例5
测试双金属纳米药物活性氧的产生，通过将实施例4制备的1mg/mL NFs水溶液与10mL H2O2(500μM)混合，然后分别在0、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330和360秒时用氧量计测定混合液的氧含量。H2O2(10mL，500μM)用作对照。图16为纳米颗粒的溶解氧测定情况和ESR测试，由图可知，添加DMNRs后氧含量瞬间增加，证实DMNRs可以有效催化H2O2产生溶解氧，有利于1O2的形成(图16a)。
为了探索DMNRs的催化功能，应用电子自旋共振光谱(ESR)来探测·OH和1O2的产生(图16b)。5；5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)和2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP)分别用于捕获·OH或1O2以形成适度长寿命的加合物以供检测。ESR光谱在加入H2O2或光照后显示出特征性的·OH或1O2信号，而在没有H2O2的情况下没有观察到信号，表明DMNRs具有优异的催化活性。
试验例6
进一步测试实施例4制备的双金属纳米药物1O2信号的产生，具体而言就是首先通过测不同浓度的实施例4制备的材料，以确定合适的材料浓度(1mg/mL)。接着通过测不同浓度的DPHA测定合适的浓度进行时间梯度实验，也就是将确定浓度的材料100微升加同浓度的DPHA 2mL加400微升H2O2(原液)加400微升pH6.5的PBS，观察355nm处的吸收峰，确定合适的DPHA浓度。材料和DPHA确定合适的浓度后，进行时间梯度测试。图17为纳米颗粒的单线态氧测定情况，9,10-二苯蒽(DPHA)被用来监测生成的1O2。由图17可知随着H2O2浓度的增加，DPHA的UV-vis吸收降低，说明纳米材料释放的TCPP能在氧气气氛下有效分解H2O2，提高1O2的产率，量子产率为65％。
试验例7
测试实施例4制备的双金属纳米药物的细胞毒性，具体而言，将4T1细胞以4×104个细胞/孔培养12小时，然后与不同配方、不同浓度的纳米药物再孵育24小时。之后，将其中一个的培养基更换为新鲜培养基，并在660nm激光下光照15分钟。所有孔均加入100μL MTT(5μg/mL)，孵育30分钟。最后，用酶标仪记录490nm处的吸光度值。
图18将不同浓度的纳米颗粒、药物与4T1细胞共同孵育及光照/不光照24h后的细胞毒性，由图18可知单独使用TG或TCPP的情况下，即使浓度达到100μg/mL，观测到的细胞毒性也几乎可忽略不计。而本发明实施例4制备的纳米颗粒有效地抑制了细胞增殖。在用光照射后，制备的纳米颗粒对癌细胞导致更高的杀伤力，证实了联合治疗的出色协同作用。
试验例8
测试双金属纳米药物孵育细胞的细胞成像，将4T1细胞以4×104个细胞/孔培养12小时，将实施例4制备的DMNRs(10μg/mL)与4T1细胞共同孵育后24h后，用Calcein AM/PI(绿/红，活/死)共染色试剂盒(Beyotime Biotechnology C2015S)研究纳米颗粒诱导的癌细胞死亡。如图19所示，在有光照存在的情况下(660nm激光下光照15分钟)，PBS处理对4T1细胞的影响很小。在用纳米颗粒处理后，由于TG和类Fenton反应产生的·OH的化学/化学动力学治疗，很大一部分细胞已经死亡。在光照下，生成的1O2与TG和·OH协同作用，几乎杀死了所有的4T1细胞。
用活性氧检测试剂盒(Beyotime Biotechnology S0033S)检测活性氧的产生，用PBS或DMNRs培养4T1细胞6小时后，将细胞与DCFH-DA(10μM)与Hoechst 33342一起再孵育30分钟。然后，用PBS洗涤3次。使用Olympus倒置荧光显微镜拍摄图像。
如图20所示，用活性氧检测试剂盒检测活性氧的产生，用2，7-二氯二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)检测4T1细胞与纳米颗粒孵育后ROS的产生，纳米颗粒被·OH或1O2氧化后荧光被激发。图20中的荧光图像显示，由于Fe3+\Cu2+诱导的类Fenton反应，与对照组相比，纳米颗粒孵育的细胞的绿色荧光显著增强。然而，当加入ROS清除剂去除产生的ROS时，细胞内的荧光大大减少，进一步验证了分解的纳米颗粒的级联催化作用，涉及·OH和1O2的产生。
用电感耦合等离子体质谱(ICP-OES)检测不同时间点纳米颗粒处理细胞后细胞内金属的含量，通过将实施例4制备的0.1mg DMNRs分散到1mL PBS(10mM，pH：7.4、6.5或5.0)中。在预定的时间间隔，取出100μL溶液并在特定时间点离心(9000rpm，15分钟)之后，收集上清液用于ICP-OES测量。
图21可知4T1细胞内的纳米颗粒具有时间依赖性的内吞作用，且Fe、Cu的积累显著增强，这有利于Fe3+、Cu2+、TCPP和TG的释放及其联合治疗。
试验例9
测试双金属纳米药物对红细胞的影响，用小鼠新鲜血液进行溶血试验。离心(10000r/min，5min)收集红细胞(RBCs)，用20mM PBS 7.4洗涤5次，将所得的400μL RBCs加入到7.6mL PBS中，制备原料分散体。将不同浓度的实施例4制备的纳米药物材料溶液(700μL，PBS)与300μL PBCs原料分散体轻轻混合，室温下孵育4h后，离心上清液用Multiskan FC微板仪测定492nm处吸光度。图22为纳米材料的溶血情况。由图22可知，水处理的红细胞上清液呈鲜红色，而PBS处理组和纳米颗粒处理组是无色透明的，可见纳米颗粒的溶血率可以忽略不计。当纳米颗粒浓度为30μg/mL时，溶血率仅为16.6％。因此，纳米颗粒具有良好的生物相容性，可用于体内。
试验例10
测试双金属纳米药物体内成像效果和生物分布情况，为了建立肿瘤异种移植模型，在6周的BALB/c小鼠的左侧，也就是腹部区域进行皮下注射，种植100000个4T1细胞，种植两周后注射1mg/mL实施例4制备的纳米颗粒100μL，用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积表示为V＝L×W2/2(L和W分别指定为肿瘤的长度和宽度)。图23为小鼠静脉注射1mg/mL纳米颗粒100μL，在特定时间点使用FOBI体内成像系统拍摄小鼠的全身荧光图像。之后，对所有小鼠实施处死，剥离主要器官和肿瘤，使用同一成像仪进行离体器官组织成像。对于生物分布研究，使用浓硝酸消化所有器官组织以进行ICP-OES测定。由图23可知，纳米颗粒在肿瘤中高度聚集(图23a和图23c)，器官离体后在肿瘤上可见明亮的荧光，而心、脾、肾的荧光相对较弱(图23b和图23d)。通过测量主要器官和肿瘤的铁/铜含量来评价纳米颗粒的生物分布情况(图23e)。注射后24h，肿瘤组织中铁/铜含量较高，与荧光成像结果一致(图23f)。药代动力学评价表明，纳米颗粒可以很容易地通过肾脏清除从体内代谢，进一步证明了协同联合治疗的良好生物相容性。这些结果证明了纳米颗粒在提高抗癌效果同时降低纳米药物副作用方面的优势。
试验例11
测试双金属纳米药物体内抗肿瘤疗效及生物安全性，图24为按试验例10小鼠静脉注射纳米颗粒，进行抗肿瘤实验(G1:PBS；G2:TG G3:TCPP+光照G4:DMSRs G5:DMSRs+光照)，经过治疗后，小鼠和切除肿瘤的照片反映了五个实验组中肿瘤大小的变化(图24a-b)。此外，肿瘤生长曲线还证明了包含不同成分的纳米药物的不同治疗效果(图24c)。光照射的应用G5组导致了相对较高的肿瘤抑制，突出了与PDT协同治疗的作用。通过TME特异性分解纳米材料和协同多模式抗癌治疗，有效抑制了纳米材料治疗小鼠的肿瘤生长。因此，肿瘤重量统计显示出类似的肿瘤抑制趋势，抑制率高达87％(图24d-e)，证明了纳米药物抑制肿瘤生长的能力。治疗后，对所有小鼠实施处死，剥离主要器官和肿瘤，进行切片H&E染色和TUNEL分析(图24f-h)。通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析效果显着改善。此外，纳米材料对主要器官造成的病理损伤可忽略不计，表明它们的副作用很小。进一步地，为了确定纳米材料对肿瘤的损伤程度，在药物注射后对HE染色的肿瘤组织切片进行组织学检查。纳米材料组显示大面积坏死，坏死区域周围可见无结构的嗜酸性物质和大量坏死细胞碎片，证实了纳米材料的显著有效的肿瘤治疗效果。
试验例12
测的双金属纳米药物体外抗菌效果，以革兰氏阴性大肠埃希菌(E-coli)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S-aureus)为模式菌。用PBS(7.4)将OD600＝1.6的细菌分散体稀释100X。将800μL菌悬体同200μL PBS、5mM H2O2、纳米材料、纳米材料+5mM H2O2均孵育20min。将800μL菌悬体同200μL PBS+光照、5mM H2O2+光照、纳米材料+光照、纳米材料+5mM H2O2+光照，各组均孵育15min，其中光照为用660nm(2.0W/cm2)照5min，其中上述纳米材料具有实施例4制备或者实施例2制备，体系中终浓度0.2mg/mL，H2O2 5mM)。将100μL经最终处理后的菌悬液铺在固体培养基上，37℃培养18h，计数菌落数(CFu)，计算存活率。
图25为纳米颗粒对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌的体外协同抗菌作用。在针对金黄色葡萄球菌方面PBS组和PBS+光照组形成了大量的活菌落，表面单独照射条件不对细菌造成影响。H2O2组和H2O2+照射组抗菌效果较弱，原因是低浓度H2O2杀菌效果较差。在无光照和无H2O2的条件下，单Fe金属纳米药物(mNFs)与本发明双金属纳米药物(DMNRs)均只有少量的菌落数减少对这种结果的解释是，纳米颗粒在其表面吸附了细菌，从而导致去除材料后菌悬液中数量减少。显然，材料自身可以一定程度杀死菌，但抗菌性不强。当H2O2存在的条件下，单Fe金属纳米药物(mNFs)与本发明双金属纳米药物(DMNRs)组菌落数大大降低，说明金属纳米药物可以通过Fenton反应催化H2O2分解产生高毒性的羟基自由基，从而杀灭细菌。其中DMNRs的效果显著优于单Fe金属纳米药物(mNFs)，说明双金属纳米药物具有更高的催化活性。当进一步增加光照处理后，DMNRs处理组仅观察到少量菌落。抑菌率达到81.7％，表明Fenton反应与PDT协同作用具有优异的抗菌能力。
在杀灭大肠杆菌方面，相应的处理组表现出与金黄色葡萄球菌相同的抗菌趋势，DMNRs纳米颗粒+H2O2+照射组的杀菌效率达到76％。
试验例13
进一步测试双金属纳米药物体外抗菌效果，通过钙黄绿素AM/碘化丙啶(PI)共染色方法评估DMNRs引发的细菌死亡。将OD600＝1.6的大肠杆菌菌悬液与实施例4制备的双金属纳米药物(1mg/mL)和5mM H2O237℃孵育24小时。之后，将其中一个的培养基更换为新鲜培养基，并在660nm激光下光照15分钟。所有孔均加入钙黄绿素AM(2μM)和PI(4μM)，孵育30分钟，以PBS、5mM H2O2、单独纳米药物以及上述的无光照组作为对照。最后，观察到细菌来自钙黄绿素AM/PI的绿色/红色荧光。
图26为纳米颗粒的活/死细菌细胞染色试验。由图26可得，PBS和PBS+照射处理组发出强绿色荧光，几乎没有红色荧光。结果显示，仅用光照治疗对细菌的活力影响很小。在H2O2存在的情况下，观察到小的红色荧光信号，表明低浓度H2O2的抑菌效果较弱。在纳米颗粒处理组，大部分标记为绿色，只有少数红色出现。而当用纳米颗粒+H2O2处理细菌时，红点明显增多，说明芬顿反应显著增强了杀菌效果。在引入光照后照射后未见绿色斑点，所有细菌均呈红色荧光。这一结果证明了PDT和催化作用可以协同杀灭细菌。
试验例14
测试实施例4制备的双金属纳米药物体内抗菌效果，建立脓肿异种移植模型，在6周的BALB/c小鼠的左侧，也就是说腹部区域进行皮下注射，种植100μL(107CFU/mL)S-aureus。48h后，小鼠皮下形成感染脓肿。根据脓肿大小分组(每组5只小鼠)：PBS(G1)、H2O2(G2)、DMNRs(G3)、DMNRs+H2O2(G4)、DMNRs+H2O2+光照(G5)。其中各组中材料DMNRs为30μL(20μg/mL)，H2O2为20μL(1mM)，注射15min后，660nm光照2min。每天拍摄脓肿照片，称重，治疗10天后，取皮肤组织、心、肝、脾、肺、肾，用4％多聚甲醛固定，H&E染色分析。对于生物分布研究，小鼠(n＝5)被静脉注射DMNRs，然后在48小时处死。剥离伤口组织和主要器官并称重。然后，使用浓硝酸消化所有组织以进行ICP-OES测定。
图27和28以金黄色葡萄球菌感染的小鼠皮下脓肿为模型，进一步研究了纳米颗粒的体内治疗效果。由图可得，第1天，除(Ⅰ)PBS和(Ⅱ)H2O2治疗组外，其余各治疗组均出现瘢痕。时间越长，疤痕颜色加深，尺寸减小，说明感染被抑制，伤口正在愈合。(Ⅲ)纳米颗粒组、(Ⅳ)纳米颗粒+H2O2组和(Ⅶ)纳米颗粒+H2O2+照射组疤痕率均显著优于其他两组。(Ⅶ)纳米颗粒+H2O2+照射组治疗10d后疤痕消失，创面基本愈合，说明材料在创面愈合中发挥了重要作用，因为Fenton反应与PDT的协同作用。(Ⅰ)PBS治疗组瘢痕虽消失，但创面未闭合，创面内仍可见ichor。此外，伤口周围出现新的皮下脓肿，这可能与细菌感染的扩散有关。H&E染色进一步评价感染伤口的愈合情况(图27a)。纳米颗粒+H2O2+照射组创面组织表皮层完整，炎症细胞较少，其他各组创面组织表皮层紊乱，炎症细胞浸润明显(图27a)。因此，联合应用为纳米颗粒在体内治疗感染伤口提供了可能。此外，包含不同成分的抗菌药物在10天的治疗中引起的体重变化微不足道(图28a)。关键器官的组织学分析结果显示(27b)，未见明显的炎性病变、损伤或坏死。它证实了在我们使用的剂量下，长期毒性是微不足道的，进一步证明了协同联合治疗的良好生物相容性。
此外，血液生化评估还为拟议的纳米抗菌药物可忽略的长期潜在毒性提供了证据。与注射PBS的小鼠相比，注射DMNRs的小鼠的谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)和肌酐(CR)等指标水平无明显变化，表明纳米药物的全身毒性微不足道(图28b)。如图28c所示，治疗组中，由于网状内皮系统的作用，DMNRs主要积聚在疤痕和肾脏等代谢器官中。药代动力学评价表明，DMNRs可以很容易地通过肾脏清除从体内代谢，同时也再次表明材料作为治疗感染药物的必要性，效果显著，体内毒性低。
Claims (10)
1.一种可降解双金属纳米药物，其特征在于，包括Cu、Fe、Mn、Ag、Au、Pt、Pd、Co、Ni金属离子中的任意两种、6-硫鸟嘌呤(TG)和Meso-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)，其摩尔比为1:1:3:3-3:3:2:2。
2.根据权利要求1所述的棒状的可降解双金属纳米药物，其特征在于，所述可降解双金属纳米药物的颗粒为纳米棒形状。
3.根据权利要求1所述的可降解双金属纳米药物，其特征在于，所述可降解双金属纳米药物的颗粒横向尺寸约20nm左右，纵向尺寸约200nm左右。
4.一种权利要求1所述的可降解双金属纳米药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将两种金属盐试剂和稳定剂溶于去离子水中进行搅拌反应得到溶液A，取去质子化剂加入溶液A继续搅拌反应，另取TG和TCPP配体溶于去离子水中，充分溶解得到溶液B，将两种溶液混合搅拌后得到混合液C，进行水热法加热反应；反应结束后，通过离心去掉上清液，将沉淀物洗涤干净后烘干，得到双金属纳米药物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述稳定剂优选为铅盐类稳定剂、金属皂类稳定剂、有机锡稳定剂、稀土稳定剂或者有机辅助稳定剂。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述去质子化剂为弱酸试剂。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述得到溶液A的搅拌时间为30min～150min，加入去质子化剂后继续搅拌时间为1-2h，溶液A和溶液B混合搅拌的时间为1h～3h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述溶液C倒入聚四氟乙烯内胆反应釜中，放入烘箱，在100℃～150℃条件下加热反应4h～18h。
9.一种权利要求1所述的可降解双金属纳米药物在制备抗肿瘤和抗菌药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述可降解双金属纳米药物催化癌细胞内高氧化性羟基自由基的产生继而诱导细胞凋亡，用于联合化学/化学动力学/光动力学癌症治疗，同时产生的·OH、1O2在体内外协同作用于细菌，达到抗菌效果。
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| CN117664887A (zh) * | 2024-01-29 | 2024-03-08 | 云南伦扬科技有限公司 | 一种酚类配位聚合物纳米酶基快速检测铅和玉米赤霉烯酮方法 |
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