CN117561271A - 环状细胞穿透肽 - Google Patents

Abstract

本公开涉及细胞穿透肽，包括具有高胞质递送效率和减少的毒性的环状细胞穿透肽，这些环状细胞穿透肽能够有效地将货物递送至细胞内以治疗多种病症和疾病。

Description

环状细胞穿透肽

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年3月31日提交的美国临时专利申请号63/168,888、于2021年4月7日提交的美国临时专利申请号63/171,860、于2021年9月1日提交的美国临时专利申请号63/239,671、于2021年12月17日提交的美国临时专利申请号63/290,960、于2022年1月11日提交的美国临时专利申请号63/298,565、于2022年2月25日提交的美国临时专利申请号63/268,577的优先权，其每一者的公开内容据此全文以引用方式并入。

背景技术

核酸及其合成类似物作为治疗剂具有巨大的潜力，尤其是针对对常规药物形式具有挑战性的靶标(例如，由遗传突变引起的缺失/缺陷蛋白质)。

然而，将此类疗法的潜力转移至临床的主要问题是当全身施用时它们获得进入细胞内区室的能力有限。载剂系统，诸如聚合物、阳离子脂质体或化学修饰(例如通过胆固醇分子的共价连接)，已用于促进细胞内递送。不过，通过这些方法实现的细胞内递送效率通常较低，并且提高细胞内递送的功效的改进的递送系统仍然是难以捉摸的。

在20世纪80年代末，发现高度带正电荷的HIV Tat肽可跨哺乳动物细胞膜易位。随后，已发现其他“细胞穿透肽”(CPP)能够以低微摩尔浓度穿透细胞膜而不引起显著的膜损伤。Qian等人(2016)“Discovery and Mechanism of Highly Efficient Cyclic Cell-Penetrating Peptides.”Biochem.55:2601-2612。然而，许多这些CpPS的有效胞质递送受到不良内体逃逸效率的限制。

因此，需要具有合适的毒性特征的新的细胞穿透肽和包含这些肽的组合物。

本文公开的组合物和方法解决了这些和其他需要。

发明内容

破坏膜屏障并将药物递送到细胞中的一种潜在策略是将它们附着到“细胞穿透肽”(本文也称为CPP或EEV(内体逃逸载体))。促进细胞质递送的某些残基(诸如精氨酸)已被认为是造成全身器官毒性的重要因素。

提供了具有合适毒性特征的新的细胞穿透肽和包含这些肽的组合物。

本文公开的组合物和方法解决了这些和其他需要。

附图说明

图1示出了用于递送货物的含有精氨酸替代物的cCPP的非限制性示例。

图2示出了在化合物1b和PMO之间形成的缀合产物化合物1b-PMO(EEV-PMO-MDX-1)的结构。

图3示出了在用各种浓度的EEV12和化合物1b后人成纤维细胞系WI38中细胞活力的变化。

图4示出了在用各种浓度的EEV12和化合物1b处理后从人成纤维细胞系WI38释放的乳酸脱氢酶(LDH)的定量。

图5示出了在用各种浓度的EEV12和化合物1b处理后原代人肾近端小管上皮细胞(RPTEC)中的细胞活力的变化。

图6示出了在用各种浓度的EEV12和化合物1b处理后从原代人肾近端小管上皮细胞(RPTEC)释放的乳酸脱氢酶(LDH)的定量。

图7示出了在用各种浓度的EEV12和化合物1b处理后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中细胞活力的变化。

图8示出了在用各种浓度的EEV12和化合物1b处理后人外周血单核细胞(hPBMC)中细胞活力的变化。

图9示出了在静脉内注射各种量的EEV12和化合物1b后在雄性C57BL/6小鼠中通过LC/MS对血清组胺水平的定量。

图10A-图10E示出了在静脉内注射各种量的EEV-MDX-PMO-1或EEV-MDX-PMO-2后7天在mdx小鼠中如通过RT-PCR确定的外显子23跳跃的定量。图10A示出了横腹肌中外显子23跳跃的定量。图10B示出了心脏中外显子23跳跃的定量。图10C示出了横隔膜中外显子23跳跃的定量。图10D示出了在胫骨前肌中外显子23跳跃的定量。图10E示出了四头肌中外显子23跳跃的定量。

图11示出了如实施例4中所述静脉内注射各种量的EEV-MDX-PMO-1或EEV-MDX-PMO-2后7天在mdx小鼠中抗肌萎缩蛋白产生的Western印迹定量。给出的值是相对于野生型C57BL/10小鼠中指定组织中的抗肌萎缩蛋白水平。

图12示出了在化合物4b和PMO之间形成的缀合产物EEV-MDX-PMO-3的结构。

图13示出了在静脉内注射40mpk的EEV-MDX-PMO-2和40mpk的EEV-MDX-PMO-3后3天在mdx小鼠中外显子23跳跃的PCR琼脂糖凝胶图像。

图14A-图14C示出了分别在静脉内注射各种量的EEV-MDX-PMO-2或EEV-MDX-PMO-3或R6-PMO后3或7天在mdx小鼠中如通过RT-PCR确定的外显子23跳跃的定量。图14A示出了四头肌中外显子23跳跃的定量。图14B示出了横隔膜中外显子23跳跃的定量。图14C示出了心脏中外显子23跳跃的定量。

图15A-15D示出了在静脉内注射40mg/kg的EEV-MDX-PMO-2或EEV-MDX-PMO-3后3天在mdx小鼠中抗肌萎缩蛋白产生的Western印迹定量。所有值均以相对于野生型C57BL/10小鼠中抗肌萎缩蛋白水平的抗肌萎缩蛋白水平给出。图15A示出了心脏中抗肌萎缩蛋白水平的相对定量。图15B示出了横膈膜中抗肌萎缩蛋白水平的相对定量。图15C示出了胫骨前肌中抗肌萎缩蛋白水平的相对定量。图15D示出了四头肌中抗肌萎缩蛋白水平的相对定量。

图16A和图16B示出了用于将治疗性部分(TM)诸如反义化合物(AC)连接到细胞穿透肽(CPP)的缀合化学。可采用其他化学，例如硫醇马来酰亚胺或铜催化的点击化学

图17示出了用含有聚乙二醇(PEG)部分的附加接头模式连接样品寡核苷酸和cCPP的缀合化学。

图18A-图18C示出了EEV-PMO-DMD44-1(图18A)、EEV-PMO-DMD44-2(图18B)和EEV-PMO-DMD44-3(图18C)的合成方案

图19示出了如通过Western印迹定量的在用EEV-PMO-DMD44-1、EEV-PMO-DMD44-2或EEV-PMO-DMD44-3处理的DMDΔ45肌细胞中抗肌萎缩蛋白表达的恢复。

图20A-图20B示出了在经由IV注射用EEV-PMO-DMD44-1(图20A)和EEV-PMO-DMD44-2(图20B)处理的hDMD小鼠的组织中的外显子跳跃和药物浓度。

图21A-图21B描绘了NHP模型中EEV-PMO-DMD44-1的外显子跳跃(图21A)和药物暴露(图21B)。

图21C-图21D描绘了NHP模型中EEV-PMO-DMD44-2的外显子跳跃(图21C)和药物暴露(图21D)。

图22A-图22F展示了Mbnl1(对于外显子5内含物；图23A)、Bin1(对于外显子11内含物；图22B)、IR(对于外显子11内含物；图22C)、DMD(对于外显子78内含物；图22D)、LDB3(对于外显子11内含物；图22E)和Sos1(对于外显子25内含物；图22F)的RNA剪接测量。经处理与未处理的DM1肌管的T检验*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图23A-图23B描绘了使用用于外显子44跳跃的化合物在携带全长人DMD基因的转基因小鼠的患者来源的肌细胞中的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白的恢复(图23A)以及心肌和骨骼肌中的外显子跳跃(图23B)。

图24A-图24C描绘了用于外显子44跳跃的化合物在携带全长人DMD基因的转基因小鼠的心脏(图24A)、胫骨前肌(图24B)和横膈膜(图25C)中的组织浓度和外显子跳跃百分比。

图25描绘了将用于外显子44跳跃的化合物施用于NHP后随时间推移的血浆水平。

图26展示了在施用用于外显子跳跃的化合物的NHP的骨骼肌和心脏两者中有意义的外显子跳跃水平。

图27示出了在本文所述的反义寡核苷酸中使用的经修饰的核苷酸。

图28A-图28D提供了用于合成二氨基磷酸酯连接的吗啉代寡聚物的吗啉代亚基单体的结构。图28A提供了腺嘌呤吗啉代单体的结构。图28B提供了胞嘧啶吗啉代单体的结构。图28C提供了鸟嘌呤吗啉代单体的结构。图28D提供了胸腺嘧啶吗啉代单体的结构。

图29A-图29D说明了用于将AC连接到环状细胞穿透肽(cCPP)的缀合化学。图29A示出了具有羧酸基团或具有TFP激活酯的肽与AC的5'端的伯胺残基之间的酰胺键形成。图29B示出了仲胺或伯胺修饰的AC在3'处与肽-TFP酯通过酰胺键形成的缀合。图29C示出了肽-叠氮化物经由无铜叠氮化物-炔环加成与5'环辛炔修饰的AC的缀合。图29D展示了3'修饰的环辛炔AC或3'修饰的叠氮化物AC与含有接头-叠氮化物或接头-炔/环辛炔部分的cCPP之间分别经由不含铜的叠氮化物-炔环加成或铜催化的叠氮化物-炔环加成(点击反应)的另一种缀合。

图30示出了用含有聚乙二醇(PEG)部分的附加接头模式连接AC和cCPP的缀合化学。可采用其他缀合化学。

图31A示出了经由外显子跳跃的GYS1敲低的示意图，并且图31B示出了经由外显子跳跃的IRF-5敲低的示意图。

图32A-图32D示出了在GAA敲除小鼠模型中未处理的小鼠、用PMO处理的小鼠和用各种浓度的EEV-PMO处理的小鼠的GYS1 mRNA表达水平。图32A是示出小鼠横膈膜中GYS1表达水平的凝胶，并且图32B是图32A中数据的图。图32C是示出小鼠心肌中GYS1表达水平的SDS-PAGE凝胶，并且图32D是图32C中数据的图。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)

图33A-图33D示出了未处理小鼠、用PMO处理的小鼠和用EEV-PMO处理的小鼠在处理后不同时间点的心脏(图33A)、横膈膜(图33B)、四头肌(图33C)和三头肌(图33D)中GYS1蛋白表达水平的图。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)

图34A-图34C是示出在用各种浓度的EEV-PMO处理的小鼠的肝脏(图34A)、小肠(图34B)和胫骨前肌(图34C)中IRF5表达水平的图。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)

图35是示出在用各种浓度的EEV-PMO-IRF5-1处理小鼠巨噬细胞的体外实验中IRF5表达水平的图。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)

图36是示出体外实验中IRF5表达水平的图，其中小鼠巨噬细胞用各种EEV-PMO构建体处理，然后用R848刺激。(P>0.05＝NS；P≤0.05＝*；P≤0.01＝**；P≤0.001＝***)。

图37A-图37E示出了各种EEV-PMO化合物的序列(图37A)和结构(图37B-图37E)。图37B是EEV-PMO-IRF5-1的结构。图37C是EEV-PMO-IRF5-3的结构。图37D是EEV-PMO-IRF5-4的结构。图37E是EEV-PMO-IRF5-2的结构。

图38是示出在用各种浓度的化合物处理、接着用R848刺激后RAW 264.7单核细胞/巨噬细胞中IRF5表达水平的柱状图。

图39是示出在用各种浓度的化合物处理后RAW 264.7单核细胞/巨噬细胞中外显子4跳跃水平的柱状图。NT＝未处理。

图40是示出在用各种浓度的化合物处理后RAW 264.7单核细胞/巨噬细胞中的转录水平的柱状图。

图41A-图41D示出了在用EEV-PMO-DM1-3注射HSA-LR小鼠后1周四头肌中MBNL1下游基因的剂量依赖性校正；图41A：Atp2a1，图41B：Nfix，图41C：Clcn1，图41D：Mbnl1。

图42A-图42D示出了在用EEV-PMO-DM1-3注射HSA-LR小鼠后1周腓肠肌中MBNL1下游基因的剂量依赖性校正；图42A：Atp2a1，图42B：Nfix，图42C：Clcn1，图42D：Mbnl1。

图43A-图43D示出了在用EEV-PMO-DM1-3注射HSA-LR小鼠后1周胫骨前肌中MBNL1下游基因的剂量依赖性校正；图43A：Atp2a1，图43B：Nfix，图43C：Clcn1，图43D：Mbnl1)。

图44A-图44D示出了在用EEV-PMO-DM1-3注射HSA-LR小鼠后1周前三头肌中MBNL1下游基因的剂量依赖性校正；图44A：Atp2a1，图44B：Nfix，图44C：Clcn1，图44D：Mbnl1)。

图45A-图45D提供了图41A-D、图42A-D、图43A-D和图44A-D中所示数据的叠加。

图46A-图46D示出施用EEV-PMO-DM1-3导致HSA-LR小鼠的骨骼肌中约50％-70％HSA mRNA敲低：图46A：四头肌；图46B：腓肠肌；图46C：三头肌；图46D：胫骨前肌。相对于HSA-LR媒介物处理组(n＝3)，通过单向ANOVA计算统计学显著性。剂量基于PMO。

图47A-图47F是示出在施用EEV-PMO-DM1-3的小鼠中各种肌肉组织中药物水平的剂量依赖性反应的图。图47A：四头肌；图47B：三头肌；图47C：心脏；图47D：腓肠肌；图47E：胫骨前肌；以及图47F：横膈膜。

图48示出了体内检测到的主要代谢物PMO-DM1。

图49A-图49C描绘了在以15mpk、30mpk、60mpk和90mpk施用后脑(图49A)、肝(图49B)和肾(图49C)中的EEV-PMO-DM1-3暴露。

图50示出了EEV-PMO-DM1-3处理1周后减少HSA-LR小鼠TA肌肉中的CUG团簇。

图51是示出EEV-PMO-DM1-3处理1周后减少HSA-LR小鼠TA肌肉中的CUG团簇的图。

图52示出了在用15mpk、30mpk、60mpk和90mpk的EEV-PMO-DM1-3处理后7天HSA-LR小鼠中的剂量依赖性肌强直减少。

图53A-图53C示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠中的Atp2a1外显子22内含物的作用持续时间。胫骨前肌(图53A)；三头肌(图53B)；和四头肌(图53C)

图54A-图54C示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠中Nfix外显子7内含物的作用持续时间。胫骨前肌(图54A)；三头肌(图54B)；和四头肌(图54C)。

图55A-图55C示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠中Mbnl1外显子5内含物的作用持续时间。胫骨前肌(图55A)；三头肌(图55B)；和四头肌(图55C)。

图56A-图56C示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠的腓肠肌中外显子22内含物的作用持续时间。Atp2a1(图56A)；Nfix(图56B)；和Mbnl1(图56C)。

图57示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)在HSA-LR小鼠的腓肠肌、三头肌、胫骨前肌和四头肌中的作用持续时间。

图58A-图58D示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)在HSA-LR小鼠的肌肉组织中的作用持续时间。图58A：四头肌，图58B：腓肠肌，图58C：三头肌；图58D：胫骨前肌。

图59A-图59D示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠中Clcn1外显子7a内含物的作用持续时间。图59A：胫骨前肌；图59B：三头肌；图59C：四头肌；图59D：腓肠肌。

图60A-图60D示出EEV-PMO-DM1-3在注射后1周和4周显示HSA mRNA敲低趋势。图60A：胫骨前肌；图60B：三头肌；图60C：四头肌；图60D：腓肠肌。

图61A-图61D示出了肌肉组织中80mpk EEV-PMO-DM1-3在1周至4周后药物水平的降低。图61A：胫骨前肌；图61B：腓肠肌；图61C：三头肌；图61D：腓肠肌。EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物，80mpk全药物)在处理1周后完全校正腓肠肌、三头肌、胫骨前肌和四头肌中的错误剪接。

图62A-图62B示出了在肝和肾中用80mpk剂量的EEV-PMO-DM1-3在1周至4周后观察到药物水平的降低。

图63A-图63C示出EEV-PMO-DM1-3促进DM1患者来源的肌细胞中显著的生物标志物剪接校正。

图64A-图64C示出EEV-PMO-DM1-3减少DM1患者来源的肌细胞中的核团簇。

图65A-图65B示出用高达约800微摩尔的PMO-DM1和EEV-PMO-DM1-3没有观察到耐受性问题。

具体实施方式

内体逃逸载体(EEV)

本文提供了内体逃逸载体(EEV)，其可用于转运货物穿过细胞膜，例如，将货物递送至细胞的胞质溶胶或细胞核。货物可包括大分子，例如肽或寡核苷酸，或小分子。EEV可包含细胞穿透肽(CPP)，例如，与环外肽(EP)缀合的环状细胞穿透肽(cCPP)。EP可互换地称为调节肽(MP)。EP可包含核定位信号(NLS)的序列。EP可与货物偶联。EP可与cCPP偶联。EP可与货物和cCPP偶联。EP、货物、cCPP或它们的组合之间的偶联可以是非共价的或共价的。EP可通过肽键附接到cCPP的N-末端。EP可通过肽键附接到cCPP的C-末端。EP可通过cCPP中氨基酸的侧链附接到cCPP。EP可通过赖氨酸的侧链附接到cCPP，赖氨酸可与cCPP中的谷氨酰胺的侧链缀合。EP可与寡核苷酸货物的5'或3'端缀合。EP可与接头偶联。环外肽可与接头的氨基基团缀合。EP可经由EP和cCPP的C-末端通过cCPP和/或EP上的侧链与接头偶联。例如，EP可包含末端赖氨酸，其然后可通过酰胺键与含有谷氨酰胺的cCPP偶联。当EP含有末端赖氨酸并且赖氨酸的侧链可用于附接cCPP时，C-末端或N-末端可附接到货物上的接头。

环外肽

环外肽(EP)可包含2至10个氨基酸残基，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基，包括其间的所有范围和值。EP可包含6至9个氨基酸残基。EP可包含4至8个氨基酸残基。

环外肽中的每个氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指一种有机化合物，它是天然氨基酸的同属种，因为它具有与天然氨基酸类似的结构，从而模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸可以是经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，其不是20种常见天然存在的氨基酸或稀有天然氨基酸硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸中的一种。非天然氨基酸也可以是天然氨基酸的D-异构体。合适的氨基酸的示例包括但不限于丙氨酸、别亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、萘基丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、它们的衍生物或它们的组合。这些和其他氨基酸连同它们在本文中使用的缩写列于表1中。例如，氨基酸可以是A、G、P、K、R、V、F、H、Nal或瓜氨酸。

EP可包含至少一个带正电荷的氨基酸残基，例如至少一个赖氨酸残基和/或至少一个包含含有胍基或其质子化形式的侧链的胺酸残基。EP可包含1或2个氨基酸残基，其包含含有胍基或其质子化形式的侧链。包含含有胍基的侧链的氨基酸残基可以是精氨酸残基。质子化形式在整个公开内容中可指其盐。

EP可包含至少两个、至少三个或至少四个或更多个赖氨酸残基。EP可包含2、3或4个赖氨酸残基。每个赖氨酸残基的侧链上的氨基基团可被保护基团取代，该保护基团包括例如三氟乙酰基(-COCF₃)、烯丙氧基羰基(Alloc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)或(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基-3)-甲基丁基(ivDde)。每个赖氨酸残基的侧链上的氨基基团可被三氟乙酰基(-COCF₃)取代。可包括保护基团以实现酰胺缀合。可在EP与cCPP缀合后去除保护基团。

EP可包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸残基。具有疏水侧链的氨基酸残基可选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸。具有疏水侧链的氨基酸残基可以是缬氨酸或脯氨酸。

EP可包含至少一个带正电荷的氨基酸残基，例如至少一个赖氨酸残基和/或至少一个精氨酸残基。EP可包含至少两个、至少三个或至少四个或更多个赖氨酸残基和/或精氨酸残基。

EP可包含KK、KR、RR、HH、HK、HR、RH、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKH、KHK、HKK、HRR、HRH、HHR、HBH、HHH、HHHH、KHKK、KKHK、KKKH、KHKH、HKHK、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、HBHBH、HBKBH、RRRRR、KKKKK、KKKRK、RKKKK、KRKKK、KKRKK、KKKKR、KBKBK、RKKKKG、KRKKKG、KKRKKG、KKKKRG、RKKKKB、KRKKKB、KKRKKB、KKKKRB、KKKRKV、RRRRRR、HHHHHH、RHRHRH、HRHRHR、KRKRKR、RKRKRK、RBRBRB、KBKBKB、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG，其中B是β-丙氨酸。EP中的氨基酸可具有D或L立体化学。

EP可包含KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。EP可包含PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH，其中B是β-丙氨酸。EP中的氨基酸可具有D或L立体化学。

EP可由KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG组成。EP可由PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH组成，其中B是β-丙氨酸。EP中的氨基酸可具有D或L立体化学。

EP可包含本领域中鉴定为核定位序列(NLS)的氨基酸序列。EP可由本领域中鉴定为核定位序列(NLS)的氨基酸序列组成。EP可包含含有氨基酸序列PKKKRKV的NLS。EP可由包含氨基酸序列PKKKRKV的NLS组成。EP可包含含有选自NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK和RKCLQAGMNLEARKTKK的氨基酸序列的NLS。EP可由包含选自NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK和RKCLQAGMNLEARKTKK的氨基酸序列的NLS组成

所有环外序列还可含有N-末端乙酰基基团。因此，例如，EP可具有以下结构：Ac-PKKKRKV。

细胞穿透肽(CPP)

细胞穿透肽(CPP)可包含6至20个氨基酸残基。细胞穿透肽可以是环状细胞穿透肽(cCPP)。cCPP能够穿透细胞膜。环外肽(EP)可与cCPP缀合，并且所得构建体可称为内体逃逸载体(EEV)。cCPP可引导货物(例如，治疗性部分(TM)，诸如寡核苷酸、肽或小分子)穿透细胞膜。cCPP可将货物递送至细胞的胞质溶胶。cCPP可将货物递送至靶(例如，前mRNA)所在的细胞位置。为了将cCPP与货物(例如，肽、寡核苷酸或小分子)缀合，可替换cCPP上的至少一个键或孤对电子。

cCPP中氨基酸残基的总数在6至20个氨基酸残基的范围内，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基，包括其间的所有范围和子范围。cCPP可包含6至13个氨基酸残基。本文公开的cCPP可包含6至10个氨基酸。以举例的方式，包含6-10个氨基酸残基的cCPP可具有根据式I-A至I-E中任一种的结构：

其中AA₁、AA₂、AA₃、AA₄、AA₅、AA₆、AA₇、AA₈、AA₉和AA₁₀是氨基酸残基。

cCPP可包含6至8个氨基酸。cCPP可包含8个氨基酸。

cCPP中的每个氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指一种有机化合物，它是天然氨基酸的同属种，因为它具有与天然氨基酸类似的结构，从而模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸可以是经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，其不是20种常见天然存在的氨基酸或稀有天然氨基酸硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸中的一种。非天然氨基酸也可以是天然氨基酸的D-异构体。合适的氨基酸的示例包括但不限于丙氨酸、别亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、萘基丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、它们的衍生物或它们的组合。这些和其他氨基酸连同它们在本文中使用的缩写列于表1中。

表1.氨基酸缩写

*单字母缩写：当在本文中以大写字母示出时，其表示L-氨基酸形式，当在本文中以小写字母示出时，其表示D-氨基酸形式。

cCPP可包含4至20个氨基酸，其中：(i)至少一个氨基酸具有包含胍基或其质子化形式的侧链；(ii)至少一个氨基酸不具有侧链或具有包含 或其质子化形式的侧链；并且(iii)至少两个氨基酸独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链。

至少两个氨基酸可不具有侧链或具有包含 或其质子化形式的侧链。如本文所用，当不存在侧链时，氨基酸在连接胺和羧酸的碳原子上具有两个氢原子(例如，-CH₂-)。

不具有侧链的氨基酸可以是甘氨酸或β-丙氨酸。

cCPP可包含形成cCPP的6至20个氨基酸残基，其中：(i)至少一个氨基酸可以是甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基；(ii)至少一个氨基酸可具有包含芳基或杂芳基基团的侧链；并且(iii)至少一个氨基酸具有包含胍基、 或其质子化形式的侧链。

cCPP可包含形成cCPP的6至20个氨基酸残基，其中：(i)至少两个氨基酸可独立地是甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基；(ii)至少一个氨基酸可具有包含芳基或杂芳基基团的侧链；并且(iii)至少一个氨基酸具有包含胍基、 或其质子化形式的侧链。

cCPP可包含形成cCPP的6至20个氨基酸残基，其中：(i)至少三个氨基酸可独立地是甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基；(ii)至少一个氨基酸可具有包含芳族或杂芳族基团的侧链；并且(iii)至少一个氨基酸可具有包含胍基、 或其质子化形式的侧链。

甘氨酸和相关的氨基酸残基

cCPP可包含(i)1、2、3、4、5或6个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)2个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)4个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)5个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)6个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3、4或5个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3或4个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。

cCPP可包含(i)1、2、3、4、5或6个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)2个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)4个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)5个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)6个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3、4或5个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3或4个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)2或3个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)1或2个甘氨酸残基。

cCPP可包含(i)3、4、5或6个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)4个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)5个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)6个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3、4或5个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。cCPP可包含(i)3或4个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸残基或它们的组合。

cCPP可包含至少三个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3、4、5或6个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)4个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)5个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)6个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3、4或5个甘氨酸残基。cCPP可包含(i)3或4个甘氨酸残基

在实施方案中，cCPP中的甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基都不是邻接的。两个或三个甘氨酸、β-丙氨酸、或4-氨基丁酸残基可以是邻接的。两个甘氨酸、β-丙氨酸或4-氨基丁酸残基可以是邻接的。

在实施方案中，cCPP中没有一个甘氨酸残基是邻接的。cCPP中的每个甘氨酸残基可被不能是甘氨酸的氨基酸残基分开。两个或三个甘氨酸残基可以是邻接的。两个甘氨酸残基可以是邻接的。

具有芳族或杂芳族基团的氨基酸侧链

cCPP可包含(ii)2、3、4、5或6个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)3个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)4个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)5个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)6个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2、3或4个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2或3个独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基。

cCPP可包含(ii)2、3、4、5或6个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)3个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)4个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)5个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)6个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2、3或4个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(ii)2或3个独立地具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。

芳族基团可以是6至14元芳基。芳基可以是苯基、萘基或蒽基，它们各自任选地被取代。芳基可以是苯基或萘基，它们各自任选地被取代。杂芳族基团可以是具有1、2或3个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基或异喹啉基。

具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是双(高萘基丙氨酸)、高萘基丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、双(高苯丙氨酸)、高苯丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、3-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸、3-(2-喹啉基)-丙氨酸、O-苄基丝氨酸、3-(4-(苄氧基)苯基)-丙氨酸、S-(4-甲基苄基)半胱氨酸、N-(萘-2-基)谷氨酰胺、3-(1,1’-联苯-4-基)-丙氨酸、3-(3-苯并噻吩基)-丙氨酸或酪氨酸，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸可各自独立地选自：

/>

其中N-末端的H和/或C-末端的H被肽键替换。

具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是苯丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸、高萘基丙氨酸、双(高苯丙氨酸)、双-(高萘基丙氨酸)、色氨酸或酪氨酸的残基，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-(9-蒽基)-丙氨酸的残基。具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是苯丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基甘氨酸、高苯丙氨酸或高萘基丙氨酸的残基，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是苯丙氨酸、萘基丙氨酸、高苯丙氨酸、高萘基丙氨酸、双(高萘基丙氨酸)或双(高萘基丙氨酸)的残基，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可各自独立地是苯丙氨酸或萘基丙氨酸的残基，它们各自任选地被一个或多个取代基取代。至少一个具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可以是苯丙氨酸的残基。至少两个具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可以是苯丙氨酸的残基。每个具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基可以是苯丙氨酸的残基。

在实施方案中，具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸没有一个是邻接的。两个具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸可以是邻接的。两个邻接的氨基酸可有相反的立体化学。两个邻接的氨基酸可具有相同的立体化学。三个具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸可以是邻接的。三个邻接的氨基酸可具有相同的立体化学。三个邻接的氨基酸可具有交替的立体化学。

包含芳族或杂芳族基团的氨基酸残基可以是L-氨基酸。包含芳族或杂芳族基团的氨基酸残基可以是D-氨基酸。包含芳族或杂芳族基团的氨基酸残基可以是D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。

任选的取代基可以是任何不显著降低(例如超过50％)cCPP的胞质递送效率的原子或基团，例如与不具有该取代基的其他相同序列相比。任选的取代基可以是疏水取代基或亲水取代基。任选的取代基可以是疏水取代基。取代基可增加疏水氨基酸的溶剂可及表面积(如本文所定义)。取代基可以是卤素、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、酰基、烷基氨基甲酰基、烷基羧酰胺基、烷氧羰基、烷硫基或芳硫基。取代基可以是卤素。

尽管不希望受理论束缚，但据信相对于具有较低疏水性值的氨基酸，具有较高疏水性值的芳族或杂芳族基团的氨基酸(即具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸)可改善cCPP的胞质递送效率。每个疏水氨基酸可独立地具有大于甘氨酸的疏水性值。每个疏水氨基酸可独立地是疏水性值大于丙氨酸的疏水氨基酸。每个疏水氨基酸可独立地具有大于或等于苯丙氨酸的疏水性值。疏水性可使用本领域已知的疏水性标度来测量。表2列出了由Eisenberg和Weiss(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1984；81(1):140–144)、Engleman等人(Ann.Rev.of Biophys.Biophys.Chem..1986；1986(15):321–53)、Kyte和Doolittle(J.Mol.Biol.1982；157(1):105–132)、Hoop和Woods(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1981；78(6):3824–3828)以及Janin(Nature.1979；277(5696):491–492)报道的各种氨基酸的疏水性值，其各自的全部内容以引用方式并入本文。疏水性可使用Engleman等人报道的疏水性标度来测量。

表2.氨基酸疏水性

可选择芳族或杂芳族基团的大小以改善cCPP的胞质递送效率。尽管不希望受理论束缚，但据信与具有较小疏水氨基酸的其他相同序列相比，氨基酸侧链上的较大芳族或杂芳族基团可改善胞质递送效率。疏水氨基酸的大小可根据疏水氨基酸的分子量、疏水氨基酸的位阻效应、侧链的溶剂可及表面积(SASA)或它们的组合来测量。疏水氨基酸的大小可根据疏水氨基酸的分子量来测量，并且较大的疏水氨基酸具有分子量为至少约90g/mol、或至少约130g/mol、或至少约141g/mol的侧链。氨基酸的大小可根据疏水侧链的SASA来测量。疏水氨基酸可具有SASA大于或等于丙氨酸、或大于或等于甘氨酸的侧链。较大的疏水氨基酸可具有SASA大于丙氨酸或大于甘氨酸的侧链。疏水氨基酸可具有SASA大于或等于约哌啶-2-羧酸、大于或等于约色氨酸、大于或等于约苯丙氨酸、或大于或等于约萘基丙氨酸的芳族或杂芳族基团。第一疏水氨基酸(AA_H1)可具有SASA为至少约至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>或至少约/>的侧链。第二疏水氨基酸(AA_H2)可具有SASA为至少约/>至少约/>至少约/>至少约至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>或至少约/>的侧链。AA_H1和AA_H2的侧链可具有至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>大于约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>大于约/>至少约/>至少约/>至少约/>至少约/>或至少约/>的组合SASA。AA_H2可以是疏水氨基酸残基，其侧链的SASA小于或等于AA_H1的疏水侧链的SASA。以举例的方式而非限制，与具有Phe-Arg基序的其他方面相同的cCPP相比，具有Nal-Arg基序的cCPP可表现出改善的胞质递送效率；与具有Nal-Phe-Arg基序的其他方面相同的cCPP相比，具有Phe-Nal-Arg基序的cCPP可表现出改善的胞质递送效率；并且与具有nal-Phe-Arg基序的其他方面相同的cCPP相比，phe-Nal-Arg基序可表现出改善的胞质递送效率。

如本文所用，“疏水表面积”或“SASA”是指氨基酸侧链的可被溶剂可及的表面积(报告为平方埃；)。SASA可使用由Shrake&Rupley(JMol Biol.79(2):351–71)开发的“滚球”算法来计算，其全文以引用方式并入本文用于所有目的。这种算法使用特定半径的溶剂“球体”来探测分子表面。球体的典型值是/>其近似于水分子的半径。

某些侧链的SASA值示于下表3中。本文所述的SASA值基于下表3中列出的理论值，如Tien等人(PLOS ONE 8(11):e80635.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080635)所报道的，其全文以引用方式并入本文用于所有目的。

表3.氨基酸SASA值

具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基

如本文所用，胍是指以下结构：

如本文所用，质子化形式的胍是指以下结构：

胍置换基团是指氨基酸侧链上的官能团，其在生理pH或高于生理pH时将带正电荷，或者可再现胍鎓基团的氢键给予和接受活性。

胍置换基团促进细胞渗透和治疗剂的递送，同时降低与胍基或其质子化形式相关的毒性。cCPP可包含至少一个具有包含胍或胍鎓置换基团的侧链的氨基酸。cCPP可包含至少两个具有包含胍或胍鎓置换基团的侧链的氨基酸。cCPP可包含至少三个具有包含胍或胍鎓置换基团的侧链的氨基酸

胍或胍鎓基团可以是胍或胍鎓的等排体。胍或胍鎓置换基团的碱性可低于胍。

如本文所用，胍置换基团是指/>或其质子化形式。

本公开涉及包含4至20个氨基酸残基的cCPP，其中：(i)至少一个氨基酸具有包含胍基或其质子化形式的侧链；(ii)至少一个氨基酸残基不具有侧链或具有包含 或其质子化形式的侧链；并且(iii)至少两个氨基酸残基独立地具有包含芳族或杂芳族基团的侧链。

至少两个氨基酸残基可不具有侧链或具有包含 或其质子化形式的侧链。如本文所用，当不存在侧链时，氨基酸残基在连接胺和羧酸的碳原子上具有两个氢原子(例如，-CH₂-)。

cCPP可包含至少一个具有包含以下部分之一的侧链的氨基酸：

或其质子化形式。

cCPP可包含至少两个氨基酸，每个氨基酸独立地具有以下部分之一：

或其质子化形式。至少两个氨基酸可具有包含选自以下的相同部分的侧链： 或其质子化形式。至少一个氨基酸可具有包含/>或其质子化形式的侧链。至少两个氨基酸可具有包含/>或其质子化形式的侧链。一个、两个、三个或四个氨基酸可具有包含/>或其质子化形式的侧链。一个氨基酸可具有包含或其质子化形式的侧链。两个氨基酸可具有包含/>或其质子化形式的侧链。/> 或其质子化形式可附接到氨基酸侧链的末端。/>可附接到氨基酸侧链的末端。

cCPP可包含(iii)2、3、4、5或6个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)2个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)3个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)4个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)5个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)6个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)2、3、4或5个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)2、3或4个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)2或3个独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)至少一个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)两个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。cCPP可包含(iii)三个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基。

氨基酸残基可独立地具有包含不邻接的胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链。两个氨基酸残基可独立地具有包含可以是邻接的胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链。三个氨基酸残基可独立地具有包含可以是邻接的胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链。四个氨基酸残基可独立地具有包含可以是邻接的胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链。邻接的氨基酸残基可具有相同的立体化学。邻接的氨基酸可具有交替的立体化学。

独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可以是L-氨基酸。独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可以是D-氨基酸。独立地具有包含胍基、胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可以是L-氨基酸或D-氨基酸的混合物。

每个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可独立地是精氨酸、高精氨酸、2-氨基-3-丙酸、2-氨基-4-胍基丁酸或其质子化形式的残基。每个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸残基可独立地是精氨酸残基或其质子化形式。

每个具有包含胍置换基团或其质子化形式的侧链的氨基酸可独立地是

或其质子化形式。

不受理论的束缚，假设胍置换基团相对于精氨酸具有降低的碱度，并且在一些情况下在生理pH下不带电荷(例如，-N(H)C(O))，并且能够维持与质膜上的磷脂的二齿氢键相互作用，这被认为促进有效的膜结合和随后的内化。正电荷的去除也被认为降低了cCPP的毒性。

本领域技术人员将理解，上述非天然芳族疏水氨基酸的N-末端/或C-末端在掺入本文公开的肽中后形成酰胺键。

cCPP可包含具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的第一氨基酸和具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的第二氨基酸，其中第一甘氨酸的N-末端与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的第一氨基酸形成肽键，并且第一甘氨酸的C-末端与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的第二氨基酸形成肽键。尽管按照惯例，术语“第一氨基酸”通常是指肽序列的N-末端氨基酸，但如本文所用，“第一氨基酸”用于将所指氨基酸与cCPP中的另一氨基酸(例如，“第二个氨基酸”)区分开，使得术语“第一氨基酸”可以是或可指位于肽序列的N-末端的氨基酸。

cCPP可包含：第二甘氨酸的N-末端与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸形成肽键，并且第二甘氨酸的C-末端与具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸形成肽键。

cCPP可包含具有包含胍基或其质子化形式的侧链的第一氨基酸，和具有包含胍基或其质子化形式的侧链的第二氨基酸，其中第三甘氨酸的N-末端与具有包含胍基或其质子化形式的侧链的第一氨基酸形成肽键，并且第三甘氨酸的C-末端与具有包含胍基或其质子化形式的侧链的第二氨基酸形成肽键。

cCPP可包含天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或高谷氨酰胺的残基。cCPP可包含天冬酰胺的残基。cCPP可包含谷氨酰胺的残基。

cCPP可包含酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-(9-蒽基)-丙氨酸的残基。

尽管不希望受理论束缚，但据信cCPP中氨基酸的手性可影响胞质摄取效率。cCPP可包含至少一个D氨基酸。cCPP可包含一至十五个D氨基酸。cCPP可包含一至十个D氨基酸。cCPP可包含1、2、3或4个D氨基酸。cCPP可包含具有交替的D和L手性的2、3、4、5、6、7或8个邻接的氨基酸。cCPP可包含具有相同手性的三个邻接的氨基酸。cCPP可包含具有相同手性的两个邻接的氨基酸。至少两个氨基酸可具有相反的手性。具有相反手性的至少两个氨基酸可彼此相邻。至少三个氨基酸可具有相对于彼此交替的立体化学。相对于彼此具有交替手性的至少三个氨基酸可彼此相邻。至少四个氨基酸具有相对于彼此交替的立体化学。相对于彼此具有交替手性的至少四个氨基酸可彼此相邻。至少两个氨基酸可具有相同的手性。具有相同手性的至少两个氨基酸可彼此相邻。至少两个氨基酸具有相同的手性并且至少两个氨基酸具有相反的手性。具有相反手性的至少两个氨基酸可与具有相同手性的至少两个氨基酸相邻。因此，cCPP中的相邻氨基酸可具有以下序列中的任一种：D-L；L-D；D-L-L-D；L-D-D-L；L-D-L-L-D；D-L-D-D-L；D-L-L-D-L；或L-D-D-L-D。形成cCPP的氨基酸残基都可以是L-氨基酸。形成cCPP的氨基酸残基都可以是D-氨基酸。

至少两个氨基酸可具有不同的手性。具有不同手性的至少两个氨基酸可彼此相邻。至少三个氨基酸相对于相邻氨基酸可具有不同的手性。至少四个氨基酸相对于相邻氨基酸可具有不同的手性。至少两个氨基酸具有相同的手性并且至少两个氨基酸具有不同的手性。形成cCPP的一个或多个氨基酸残基可以是非手性的。cCPP可包含3、4或5个氨基酸的基序，其中具有相同手性的两个氨基酸可被非手性氨基酸分开。cCPP可包含下列序列：D-X-D；D-X-D-X；D-X-D-X-D；L-X-L；L-X-L-X；或L-X-L-X-L，其中X是非手性氨基酸。非手性氨基酸可以是甘氨酸。

具有包含以下的侧链的氨基酸：

或其质子化形式，可与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸相邻。具有包含以下的侧链的氨基酸：/> 或其质子化形式，可与至少一个具有包含胍或其质子化形式的侧链的氨基酸相邻。具有包含胍或其质子化形式的侧链的氨基酸可与具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的氨基酸相邻。两个具有包含以下的侧链的氨基酸：/> 或其质子化形式，可彼此相邻。两个具有包含胍或其质子化形式的侧链的氨基酸彼此相邻。cCPP可包含至少两个具有可包含芳族或杂芳族基团的侧链的邻接氨基酸，和至少两个具有包含以下的侧链的不相邻氨基酸：/> 或其质子化形式。cCPP可包含至少两个具有包含芳族或杂芳族基团的侧链的邻接氨基酸和至少两个具有包含/>或其质子化形式的侧链的不相邻氨基酸。相邻氨基酸可具有相同的手性。相邻氨基酸可具有相反的手性。氨基酸的其他组合可具有D和L氨基酸的任何排列，例如，在前述段落中描述的任何序列。

至少两个具有包含以下的侧链的氨基酸：

或其质子化形式，与至少两个具有包含胍基或其质子化形式的侧链的氨基酸交替。

cCPP可具有式(A)的结构：

或其质子化形式，其中：

R₁、R₂和R₃各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₁、R₂和R₃中的至少一者是氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₄、R₅、R₆、R₇独立地是H或氨基酸侧链；

R₄、R₅、R₆、R₇中的至少一者是3-胍基-2-氨基丙酸、4-胍基-2-氨基丁酸、精氨酸、高精氨酸、N-甲基精氨酸、N,N-二甲基精氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、赖氨酸、N-甲基赖氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、N-乙基赖氨酸、N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸、瓜氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸、3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链；

AA_SC是氨基酸侧链；并且

q是1、2、3或4；

其中式(A)的环肽不是FfΦRrRrQ。

cCPP可具有式(I)的结构：

或其质子化形式，其中：

R₁、R₂和R₃可各自独立地是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基；

R₁、R₂和R₃中的至少一者是氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₄和R₇独立地是H或氨基酸侧链；

AA_SC是氨基酸侧链；

q是1、2、3或4；并且

每个m独立地是整数0、1、2或3。

R₁、R₂和R₃可各自独立地是H、-亚烷基-芳基或-亚烷基-杂芳基。R₁、R₂和R₃可各自独立地是H、-C_1-3亚烷基-芳基或-C_1-3亚烷基-杂芳基。R₁、R₂和R₃可各自独立地是H或-亚烷基-芳基。R₁、R₂和R₃可各自独立地是H或-C_1-3亚烷基-芳基。C_1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R₁、R₂和R₃可各自独立地是H、-C_1-3亚烷基-Ph或-C_1-3亚烷基-萘基。R₁、R₂和R₃可各自独立地是H、-CH₂Ph或-CH₂萘基。R₁、R₂和R₃可各自独立地是H或-CH₂Ph。

R₁、R₂和R₃可各自独立地是酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。

R₁可以是酪氨酸的侧链。R₁可以是苯丙氨酸的侧链。R₁可以是1-萘基丙氨酸的侧链。R₁可以是2-萘基丙氨酸的侧链。R₁可以是色氨酸的侧链。R₁可以是3-苯并噻吩基丙氨酸的侧链。R₁可以是4-苯基苯丙氨酸的侧链。R₁可以是3,4-二氟苯丙氨酸的侧链。R₁可以是4-三氟甲基苯丙氨酸的侧链。R₁可以是2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸的侧链。R₁可以是高苯丙氨酸的侧链。R₁可以是β-高苯丙氨酸的侧链。R₁可以是4-叔丁基-苯丙氨酸的侧链。R₁可以是4-吡啶基丙氨酸的侧链。R₁可以是3-吡啶基丙氨酸的侧链。R₁可以是4-甲基苯丙氨酸的侧链。R₁可以是4-氟苯丙氨酸的侧链。R₁可以是4-氯苯丙氨酸的侧链。R₁可以是3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。

R₂可以是酪氨酸的侧链。R₂可以是苯丙氨酸的侧链。R₂可以是1-萘基丙氨酸的侧链。R₁可以是2-萘基丙氨酸的侧链。R₂可以是色氨酸的侧链。R₂可以是3-苯并噻吩基丙氨酸的侧链。R₂可以是4-苯基苯丙氨酸的侧链。R₂可以是3,4-二氟苯丙氨酸的侧链。R₂可以是4-三氟甲基苯丙氨酸的侧链。R₂可以是2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸的侧链。R₂可以是高苯丙氨酸的侧链。R₂可以是β-高苯丙氨酸的侧链。R₂可以是4-叔丁基-苯丙氨酸的侧链。R₂可以是4-吡啶基丙氨酸的侧链。R₂可以是3-吡啶基丙氨酸的侧链。R₂可以是4-甲基苯丙氨酸的侧链。R₂可以是4-氟苯丙氨酸的侧链。R₂可以是4-氯苯丙氨酸的侧链。R₂可以是3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。

R₃可以是酪氨酸的侧链。R₃可以是苯丙氨酸的侧链。R₃可以是1-萘基丙氨酸的侧链。R₃可以是2-萘基丙氨酸的侧链。R₃可以是色氨酸的侧链。R₃可以是3-苯并噻吩基丙氨酸的侧链。R₃可以是4-苯基苯丙氨酸的侧链。R₃可以是3,4-二氟苯丙氨酸的侧链。R₃可以是4-三氟甲基苯丙氨酸的侧链。R₃可以是2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸的侧链。R₃可以是高苯丙氨酸的侧链。R₃可以是β-高苯丙氨酸的侧链。R₃可以是4-叔丁基-苯丙氨酸的侧链。R₃可以是4-吡啶基丙氨酸的侧链。R₃可以是3-吡啶基丙氨酸的侧链。R₃可以是4-甲基苯丙氨酸的侧链。R₃可以是4-氟苯丙氨酸的侧链。R₃可以是4-氯苯丙氨酸的侧链。R₃可以是3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。

R₄可以是H、-亚烷基-芳基、-亚烷基-杂芳基。R₄可以是H、-C_1-3亚烷基-芳基或-C_1-3亚烷基-杂芳基。R₄可以是H或-亚烷基-芳基。R₄可以是H或-C_1-3亚烷基-芳基。C_1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R₄可以是H、-C_1-3亚烷基-Ph或-C_1-3亚烷基-萘基。R₄可以是H或表1或表3中氨基酸的侧链。R₄可以是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。R₄可以是H、-CH₂Ph或-CH₂萘基。R₄可以是H或-CH₂Ph。

R₅可以是H、-亚烷基-芳基、-亚烷基-杂芳基。R₅可以是H、-C_1-3亚烷基-芳基或-C_1-3亚烷基-杂芳基。R₅可以是H或-亚烷基-芳基。R₅可以是H或-C_1-3亚烷基-芳基。C_1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R₅可以是H、-C_1-3亚烷基-Ph或-C_1-3亚烷基-萘基。R₅可以是H或表1或表3中氨基酸的侧链。R₄可以是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。R₅可以是H、-CH₂Ph或-CH₂萘基。R₄可以是H或-CH₂Ph。

R₆可以是H、-亚烷基-芳基、-亚烷基-杂芳基。R₆可以是H、-C_1-3亚烷基-芳基或-C_1-3亚烷基-杂芳基。R₆可以是H或-亚烷基-芳基。R₆可以是H或-C_1-3亚烷基-芳基。C_1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R₆可以是H、-C_1-3亚烷基-Ph或-C_1-3亚烷基-萘基。R₆可以是H或表1或表3中氨基酸的侧链。R₆可以是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。R₆可以是H、-CH₂Ph或-CH₂萘基。R₆可以是H或-CH₂Ph。

R₇可以是H、-亚烷基-芳基、-亚烷基-杂芳基。R₇可以是H、-C_1-3亚烷基-芳基或-C_1-3亚烷基-杂芳基。R₇可以是H或-亚烷基-芳基。R₇可以是H或-C_1-3亚烷基-芳基。C_1-3亚烷基可以是亚甲基。芳基可以是6至14元芳基。杂芳基可以是具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的6至14元杂芳基。芳基可选自苯基、萘基或蒽基。芳基可以是苯基或萘基。芳基可以是苯基。杂芳基可以是吡啶基、喹啉基和异喹啉基。R₇可以是H、-C_1-3亚烷基-Ph或-C_1-3亚烷基-萘基。R₇可以是H或表1或表3中氨基酸的侧链。R₇可以是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基。R₇可以是H、-CH₂Ph或-CH₂萘基。R₇可以是H或-CH₂Ph。

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的一者、两者或三者可以是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的一者可以是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的两者可以是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的三者可以是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中不超过四者可以是-CH₂Ph。

R₁、R₂、R₃和R₄中的一者、两者或三者是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃和R₄中的一者是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃和R₄中的两者是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃和R₄中的三者是-CH₂Ph。R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一者是-CH₂Ph。

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的一者、两者或三者可以是H。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的一者可以是H。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的两者是H。R₁、R₂、R₃、R₅、R₆和R₇中的三者可以是H。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是H。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇中不超过三者可以是-CH₂Ph。

R₁、R₂、R₃和R₄中的一者、两者或三者是H。R₁、R₂、R₃和R₄中的一者是H。R₁、R₂、R₃和R₄中的两者是H。R₁、R₂、R₃和R₄中的三者是H。R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一者是H。

R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是3-胍基-2-氨基丙酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是4-胍基-2-氨基丁酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是高精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是N-甲基精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是N,N-二甲基精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是2,3-二氨基丙酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是2,4-二氨基丁酸、赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是N-甲基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是N,N-二甲基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是N-乙基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是瓜氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少一者可以是3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链。

R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是3-胍基-2-氨基丙酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是4-胍基-2-氨基丁酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是高精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是N-甲基精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是N,N-二甲基精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是2,3-二氨基丙酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是2,4-二氨基丁酸、赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是N-甲基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是N,N-二甲基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是N-乙基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是瓜氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少两者可以是3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链。

R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是3-胍基-2-氨基丙酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是4-胍基-2-氨基丁酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是高精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是N-甲基精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是N,N-二甲基精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是2,3-二氨基丙酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是2,4-二氨基丁酸、赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是N-甲基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是N,N-二甲基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是N-乙基赖氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是瓜氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸的侧链。R₄、R₅、R₆和R₇中的至少三者可以是3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链。

AA_SC可以是天冬酰胺、谷氨酰胺或高谷氨酰胺残基的侧链。AA_SC可以是谷氨酰胺残基的侧链。cCPP还可包含与AA_SC(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺或高谷氨酰胺的残基)缀合的接头。因此，cCPP还可包含与天冬酰胺、谷氨酰胺或高谷氨酰胺残基缀合的接头。cCPP还可包含与谷氨酰胺残基缀合的接头。

q可以是1、2或3。q可以是1或2。q可以是1。q可以是2。q可以是3。q可以是4。

m可以是1-3。m可以是1或2。m可以是0，m可以是1。m可以是2。m可以是3。

式(A)的cCPP可具有式(I)的结构：

或其质子化形式，其中AA_SC、R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、m和q如本文所定义

式(A)的cCPP可具有式(I-a)或式(I-b)的结构：

或其质子化形式，其中AA_SC、R₁、R₂、R₃、R₄和m如本文所定义。

式(A)的cCPP可具有式(I-1)、(I-2)、(I-3)或(I-4)的结构：

/>

或其质子化形式，其中AA_SC和m如本文所定义。

式(A)的cCPP可具有式(I-5)或(I-6)的结构：

或其质子化形式，其中AA_SC如本文所定义。

式(A)的cCPP可具有式(I-1)的结构：或其质子化形式，其中AA_SC和m如本文所定义。

式(A)的cCPP可具有式(I-2)的结构：或其质子化形式，

其中AA_SC和m如本文所定义。

式(A)的cCPP可具有式(I-3)的结构：

或其质子化形式，

其中AA_SC和m如本文所定义。

式(A)的cCPP可具有式(I-4)的结构：

或其质子化形式，

其中AA_SC和m如本文所定义。

式(A)的cCPP可具有式(I-5)的结构：

或其质子化形式，

其中AA_SC和m如本文所定义。

式(A)的cCPP可具有式(I-6)的结构：

或其质子化形式，其中AA_SC和m如本文所定义。

cCPP可包含下列序列之一：FGFGRGR；GfFGrGr、FfΦGRGR；FfFGRGR；或FfΦGrGr。cCPP可具有以下序列之一：FGFΦ；GfFGrGrQ、FfΦGRGRQ；FfFGRGRQ；或FfΦGrGrQ。

本公开还涉及具有式(II)的结构的cCPP：

/>

其中：

AA_SC是氨基酸侧链；

R^1a、R^1b和R^1c各自独立地是6至14元芳基或6至14元杂芳基；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d独立地是氨基酸侧链；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少一者是 或其质子化形式；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少一者是胍或其质子化形式；

每个n”独立地是整数0、1、2、3、4或5；

每个n'独立地是0、1、2或3的整数；并且

如果n'是0，则R^2a、R^2b、R^2b或R^2d不存在。

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少两者可以是 或其质子化形式。R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的两者或三者可以是/> 或其质子化形式。R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的一者可以是/> 或其质子化形式。R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少一者可以是/>或其质子化形式，并且R^2a、R^2b、R^2c和R^2d的其余部分可以是胍或其质子化形式。R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少两者可以是/>或其质子化形式，并且R^2a、R^2b、R^2c和R^2d的其余部分可以是胍或其质子化形式。/>

所有R^2a、R^2b、R^2c和R^2d可以是 或其质子化形式。R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少一者可以是/>或其质子化形式，并且R^2a、R^2b、R^2c和R^2d的其余部分可以是胍或其质子化形式。R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少两者可以是/>或其质子化形式，并且R^2a、R^2b、R^2c和R^2d的其余部分是胍或其质子化形式。

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的每一者可独立地是2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、鸟氨酸、赖氨酸、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、高赖氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、别苏氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、2-氨基丁酸、天冬氨酸、谷氨酸或高谷氨酸的侧链。

AA_SC可以是其中t可以是0至5的整数。AA_SC可以是其中t可以是0至5的整数。t可以是1至5。t是2或3。t可以是2。t可以是3。

R^1a、R^1b和R^1c可各自独立地是6至14元芳基。R^1a、R^1b和R^1c可各自独立地是具有一个或多个选自N、O或S的杂原子的6至14元杂芳基。R^1a、R^1b和R^1c可各自独立地选自苯基、萘基、蒽基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基。R^1a、R^1b和R^1c可各自独立地选自苯基、萘基或蒽基。R^1a、R^1b和R^1c可各自独立地是苯基或萘基。R^1a、R^1b和R^1c可各自独立地选自吡啶基、喹啉基或异喹啉基。

每个n'可独立地是1或2。每个n'可以是1。每个n'可以是2。至少一个n'可以是0。至少一个n'可以是1。至少一个n'可以是2。至少一个n'可以是3。至少一个n'可以是4。至少一个n'可以是5。

每个n”可独立地是1至3的整数。每个n”可独立地是2或3。每个n”可以是2。每个n”可以是3。至少一个n”可以是0。至少一个n”可以是1。至少一个n”可以是2。至少一个n”可以是3。

每个n”可独立地是1或2，并且每个n’可独立地是2或3。每个n”可以是1并且每个n'可独立地是2或3。每个n”可以是1并且每个n'可以是2。每个n”是1并且每个n'是3。

式(II)的cCPP可具有式(II-1)的结构：

其中R^1a、R^1b、R^1c、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、AA_SC、n'和n”如本文所定义。

式(II)的cCPP可具有式(IIa)的结构：

其中R^1a、R^1b、R^1c、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、AA_SC-和n’如本文所定义。

式(II)的cCPP可具有式(IIb)的结构：

其中R^2a、R^2b、AA_SC-和n'如本文所定义。

cCPP可具有式(IIb)的结构：

或其质子化形式，

其中：

AA_SC和n’如本文所定义。

式(IIa)的cCPP具有以下结构之一：

其中AA_SC和n如本文所定义。

式(IIa)的cCPP具有以下结构之一：

其中AA_SC和n如本文所定义

式(IIa)的cCPP具有以下结构之一：/>

其中AA_SC和n如本文所定义。

式(II)的cCPP可具有以下结构：

式(II)的cCPP可具有以下结构：

cCPP可具有式(III)的结构：

其中：

AA_SC是氨基酸侧链；

R^1a、R^1b和R^1c各自独立地是6至14元芳基或6至14元杂芳基；

R^2a和R^2c各自独立地是H、 或其质子化形式；

R^2b和R^2d各自独立地是胍或其质子化形式；

每个n”独立地是1至3的整数；

每个n'独立地是1至5的整数；并且

每个p'独立地是0至5的整数。

式(III)的cCPP可具有式(III-1)的结构：

其中：

AA_SC、R^1a、R^1b、R^1c、R^2a、R^2c、R^2b、R^2d、n'、n”和p'如本文所定义。

式(III)的cCPP可具有式(IIIa)的结构：

其中：

AA_SC、R^2a、R^2c、R^2b、R^2d、n'、n”和p'如本文所定义。

在式(III)、(III-1)和(IIIa)中，R^a和R^c可以是H。R^a和R^c可以是H并且R^b和R^d可各自独立地是胍或其质子化形式。R^a可以是H。R^b可以是H。p’可以是0。R^a和R^c可以是H并且每个p'可以是0。

在式(III)、(III-1)和(IIIa)中，R^a和R^c可以是H，R^b和R^d可各自独立地是胍或其质子化形式，n”可以是2或3，并且每个p’可以是0。

p'可以是0。p'可以是1。p'可以是2。p'可以是3。p'可以是4。p'可以是5。

cCPP可具有以下结构：

式(A)的cCPP可选自：

CPP序列
	(FfΦRrRrQ)
(FfΦCit-r-Cit-rQ)
	(FfΦGrGrQ)
(FfFGRGRQ)
	(FGFGRGRQ)
(GfFGrGrQ)
	(FGFGRRRQ)或
(FGFRRRRQ)

式(A)的cCPP可选自：

AA_SC可与接头缀合。

接头

本公开的cCPP可与接头缀合。接头可将货物连接至cCPP。接头可附接到cCPP的氨基酸的侧链，并且货物可附接在接头上的合适位置处。

接头可以是任何合适的部分，其可将cCPP与一个或多个附加部分(例如环外肽(EP)和/或货物)缀合。在与cCPP和一个或多个附加部分缀合之前，接头具有两个或更多个官能团，它们各自能够独立地与cCPP和一个或多个附加部分形成共价键。如果货物是寡核苷酸，接头可共价结合到货物的5'端或货物的3'端。接头可共价结合到货物的5’端。接头可共价结合到货物的3’端。如果货物是肽，接头可共价结合到货物的N-末端或C-末端。接头可共价结合到寡核苷酸或肽货物的主链。接头可以是将本文所述的cCPP与货物诸如寡核苷酸、肽或小分子缀合的任何合适的部分。

接头可包括烃接头。

接头可包含切割位点。切割位点可以是二硫化物或胱天蛋白酶切割位点(例如，Val-Cit-PABC)。

接头可包含：(i)一个或多个D或L氨基酸，它们各自任选地被取代；(ii)任选取代的亚烷基；(iii)任选取代的亚烯基；(iv)任选取代的亚炔基；(v)任选取代的碳环基；(vi)任选取代的杂环基；(vii)一个或多个-(R^1-J-R²)z”-亚基，其中R¹和R²在每种情况下各自独立地选自亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基和杂环基，每个J独立地是C、NR³、-NR³C(O)-、S和O，其中R³独立地选自H、烷基、烯基、炔基、碳环基和杂环基，它们各自任选地被取代，并且z”是1至50的整数；(viii)-(R^1-J)z”-或-(J-R¹)z”-，其中R¹各自在每种情况下独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，每个J独立地是C、NR³、-NR³C(O)-、S或O，其中R³是H、烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代，并且z”是1至50的整数；或(ix)接头可包括(i)至(x)中的一者或多者。

接头可包含一个或多个D或L氨基酸和/或-(R^1-J-R²)z”-，其中R¹和R²在每种情况下各自独立地是亚烷基，每个J独立地是C、NR³、-NR³C(O)-、S和O，其中R⁴独立地选自H和烷基，并且z”是1至50的整数；或它们的组合。

接头可包含-(OCH₂CH₂)_z’-(例如，作为间隔区)，其中z'是1至23的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23。“-(OCH₂CH₂)z’”也可称为聚乙二醇(PEG)。

接头可包含一个或多个氨基酸。接头可包含肽。接头可包含-(OCH₂CH₂)_z’-和肽，其中z'是1至23的整数。肽可包含2至10个氨基酸。接头还可包含能够通过点击化学反应的官能团(FG)。FG可以是叠氮化物或炔，并且当货物与接头缀合时形成三唑。

接头可包含(i)β丙氨酸残基和赖氨酸残基；(ii)-(J-R¹)z”；或(iii)它们的组合。每个R¹可独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，每个J独立地是C、NR³、-NR³C(O)-、S或O，其中R³是H、烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代，并且z”可以是1至50的整数。每个R¹可以是亚烷基并且每个J可以是O。

接头可包含(i)β-丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合的残基；和(ii)-(R^1-J)z”-或-(J-R¹)z”。每个R¹可独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，每个J独立地是C、NR³、-NR³C(O)-、S或O，其中R³是H、烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代，并且z”可以是1至50的整数。每个R¹可以是亚烷基并且每个J可以是O。接头可包含甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合。

接头可以是三价接头。接头可具有以下结构： 其中A₁、B₁和C₁可独立地是烃接头(例如，NRH-(CH₂)_n-COOH)、PEG接头(例如，NRH-(CH₂O)_n-COOH，其中R是H、甲基或乙基)或一个或多个氨基酸残基，并且Z独立地是保护基团。接头还可掺入切割位点，包括二硫化物[NH₂-(CH₂O)_n-S-S-(CH₂O)_n-COOH]或胱天蛋白酶切割位点(Val-Cit-PABC)。

烃可以是甘氨酸或β-丙氨酸的残基。

接头可以是二价的并且将cCPP连接到货物。接头可以是二价的并且将cCPP连接到环外肽(EP)。

接头可以是三价的并且将cCPP连接到货物和EP。

接头可以是二价或三价C₁-C₅₀亚烷基，其中1-25个亚甲基基团任选地且独立地被-N(H)-、-N(C₁-C₄烷基)-、-N(环烷基)-、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂N(C₁-C₄烷基)-、-S(O)₂N(环烷基)-、-N(H)C(O)-、-N(C₁-C₄烷基)C(O)-、-N(环烷基)C(O)-、-C(O)N(H)-、-C(O)N(C₁-C₄烷基)、-C(O)N(环烷基)、芳基、杂环基、杂芳基、环烷基或环烯基替换。接头可以是二价或三价C₁-C₅₀亚烷基，其中1-25个亚甲基基团任选地且独立地被-N(H)-、-O-、-C(O)N(H)-或它们的组合替换。

接头可具有以下结构：

其中：每个AA独立地是氨基酸残基；*是与AA_SC的附接点，并且AA_SC是cCPP的氨基酸残基的侧链；x是1-10的整数；y是1-5的整数；并且z是1-10的整数。x可以是1-5的整数。x可以是1-3的整数。x可以是1。y可以是2-4的整数。y可以是4。z可以是1-5的整数。z可以是1-3的整数。z可以是1。每个AA可独立地选自甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸和6-氨基己酸。

cCPP可通过接头(“L”)附接到货物。接头可通过结合基团(“M”)与货物缀合。

接头可具有以下结构：

其中：x是1-10的整数；y是1-5的整数；z是1-10的整数；每个AA独立地是氨基酸残基；*是与AA_SC的附接点，并且AA_SC是cCPP的氨基酸残基的侧链；并且M是本文所定义的结合基团。

接头可具有以下结构：

其中：x’是1-23的整数；y是1-5的整数；z'是1-23的整数；*是与AA_SC的附接点，并且AA_SC是cCPP的氨基酸残基的侧链；并且M是本文所定义的结合基团。

接头可具有以下结构：

其中：x’是1-23的整数；y是1-5的整数；z'是1-23的整数；*是与AA_SC的附接点，并且AA_SC是cCPP的氨基酸残基的侧链；并且M是本文所定义的结合基团。

接头可具有以下结构：

其中：x’是1-23的整数；y是1-5的整数；并且z'是1-23的整数；*是与AA_SC的附接点，并且AA_SC是cCPP的氨基酸残基的侧链。

x可以是1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，包括其间的所有范围和子范围。

x'可以是1-23的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23，包括其间的所有范围和子范围。x'可以是5-15的整数。x'可以是9-13的整数。x'可以是1-5的整数。x'可以是1。

y可以是1-5的整数，例如1、2、3、4或5，包括其间的所有范围和子范围。y可以是2-5的整数。y可以是3-5的整数。y可以是3或4。y可以是4或5。y可以是3。y可以是4。y可以是5。

z可以是1-10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，包括其间的所有范围和子范围。

z'可以是1-23的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23，包括其间的所有范围和子范围。z'可以是5-15的整数。z'可以是9-13的整数。z'可以是11。

如上所讨论，接头或M(其中M是接头的一部分)可共价结合到货物上的任何合适的位置。接头或M(其中M是接头的一部分)可共价结合到寡核苷酸货物的3'端或寡核苷酸货物的5'端。接头或M(其中M是接头的一部分)可共价结合到肽货物的N-末端或C-末端。接头或M(其中M是接头的一部分)可共价结合到寡核苷酸或肽货物的主链。

接头可结合到cCPP上的天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸的侧链，或者谷氨酰胺或天冬酰胺的修饰侧链(例如，具有氨基基团的还原侧链)。接头可结合到cCPP上的赖氨酸的侧链。

接头可结合到肽货物上的天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸的侧链，或者谷氨酰胺或天冬酰胺的修饰侧链(例如，具有氨基的还原侧链)。接头可结合到肽货物上的赖氨酸的侧链。

接头可具有以下结构：

其中

M是将L与货物例如寡核苷酸缀合的基团；

AA_s是cCPP上的氨基酸的侧链或末端；

每个AA_x独立地是氨基酸残基；

o是0-10的整数；并且

p是0至5的整数。

接头可具有以下结构：

其中

M是将L与货物例如寡核苷酸缀合的基团；

AA_s是cCPP上的氨基酸的侧链或末端；

每个AA_x独立地是氨基酸残基；

o是0-10的整数；并且

p是0至5的整数。

M可包括亚烷基、亚烯基、亚炔基、碳环基或杂环基，它们各自任选地被取代。M可选自：

其中R是烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基。

M可选自：

/>

其中：R¹⁰是亚烷基、环烷基或其中a是0至10。

M可以是R¹⁰可以是/>并且a是0至10。M可以是/>

M可以是异双官能交联剂，例如其公开于Williams等人Curr.Protoc Nucleic Acid Chem.2010,42,4.41.1-4.41.20中，全文以引用方式并入本文。

M可以是-C(O)-。

AA_s可以是cCPP上的氨基酸的侧链或末端。AA_s的非限制性示例包括天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸，或谷氨酰胺或天冬酰胺的修饰侧链(例如，具有氨基基团的还原侧链)。AA_s可以是如本文所定义的AA_SC。

每个AA_x独立地是天然或非天然氨基酸。一个或多个AA_x可以是天然氨基酸。一个或多个AA_x可以是非天然氨基酸。一个或多个AA_x可以是β-氨基酸。β-氨基酸可以是β-丙氨酸。

o可以是0至10的整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。o可以是0、1、2或3。o可以是0。o可以是1。o可以是2。o可以是3。

p可以是0至5，例如0、1、2、3、4或5。p可以是0。p可以是1。p可以是2。p可以是3。p可以是4。p可以是5。

接头可具有以下结构：

其中M、AA_s、每个-(R^1-J-R²)z”-、o和z”如本文所定义；r可以是0或1。

r可以是0。r可以是1。

接头可具有以下结构：

其中M、AA_s、o、p、q、r和z”各自可如本文所定义。

z”可以是1至50的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50，包括其间的所有范围和值。z”可以是5-20的整数。z”可以是10-15的整数。

接头可具有以下结构：

其中：

M、AA_s和o如本文所定义。

合适接头的其他非限制性示例包括：

/>

其中M和AA_s如本文所定义。

本文提供了包含cCPP和与前mRNA序列中的靶标互补的AC的化合物，该化合物还包含L，其中接头通过结合基团(M)与AC缀合，其中M是

本文提供了包含cCPP和货物的化合物，该货物包含与前mRNA序列中的靶标互补的反义化合物(AC)，例如反义寡核苷酸，其中该化合物还包含L，其中接头通过结合基团(M)与AC缀合，其中M选自：

其中：R¹是亚烷基、环烷基或/>其中t’是0至10，其中每个R独立地是烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，其中R¹是/>并且t'是2。

接头可具有以下结构：

其中AA_s如本文所定义，并且m'是0-10。

接头可具有下式：

/>

接头可具有下式：其中“碱基”对应于货物二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的3’端的核碱基。

接头可具有下式：

其中“碱基”对应于货物二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的3’端的核碱基。

接头可具有下式：

其中“碱基”对应于货物二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的3’端的核碱基。

接头可具有下式：其中“碱基”对应于货物二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物的3’端的核碱基。

接头可具有下式：

接头c可共价结合到货物上的任何合适的位置。接头可共价结合到货物的3'端或寡核苷酸货物的5'端。接头可共价结合到货物的主链。

接头可结合到cCPP上的天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸的侧链，或者谷氨酰胺或天冬酰胺的修饰侧链(例如，具有氨基基团的还原侧链)。接头可结合到cCPP上的赖氨酸的侧链。

cCPP-接头缀合物

cCPP可与本文所定义的接头缀合。接头可与如本文所定义的cCPP的AA_SC缀合。

接头可包含-(OCH₂CH₂)_z’-亚基(例如作为间隔区)，其中z'是1至23的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23。“-(OCH₂CH₂)_z’”也称为PEG。cCPP-接头缀合物可具有选自表4的结构：

环(FfФ-4gp-r-4gp-rQ)-PEG4-K-NH2
	环(FfФ-Cit-r-Cit-rQ)-PEG4-K-NH2
环(FfФ-Pia-r-Pia-rQ)-PEG4-K-NH2
	环(FfФ-Dml-r-Dml-rQ)-PEG4-K-NH2
环(FfФ-Cit-r-Cit-rQ)-PEG12-OH
	环(fФR-Cit-R-Cit-Q)-PEG12-OH

接头可包含-(OCH₂CH₂)_z’-亚基和肽亚基，其中z'是1至23的整数。肽亚基可包含2至10个氨基酸。cCPP-接头缀合物可具有选自表5的结构：

Ac-PKKKRKV-Lys(环[FfФ-R-r-Cit-rQ])-PEG12-K(N3)-NH2
	Ac-PKKKRKV-Lys(环[FfФ-Cit-r-R-rQ])-PEG12-K(N3)-NH2
Ac-PKKKRKV-K(环(FfФR-cit-R-cit-Q))-PEG12-K(N3)-NH2
	Ac-PKKKRKV-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-rQ])-B-k(N3)-NH2
Ac-PKKKRKV-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-rQ])-PEG2-k(N3)-NH2
	Ac-PKKKRKV-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-rQ])-PEG4-k(N3)-NH2
Ac-PKKKRKV-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-rQ])-PEG12-k(N3)-NH2
	Ac-pkkkrkv-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-rQ])-PEG12-k(N3)-NH2
Ac-rrv-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-rQ])-PEG12-OH
	Ac-PKKKRKV-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-r-Q])-PEG12-k(N3)-NH2
Ac-PKKK-Cit-KV-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-r-Q])-PEG12-k(N3)-NH2
	Ac-PKKKRKV-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-r-Q]-PEG12-K(N3)-NH2

cCPP-接头缀合物可具有图1所示的结构(例如，化合物1a、化合物1b、化合物2a或化合物3a)或表4中列出的序列。

cCPP-接头缀合物可具有如表5所列的序列。

cCPP-接头缀合物可以是Ac-PKKKRKV-K(环[FfΦGrGrQ])-PEG12-K(N₃)-NH₂。提供了包含环状细胞穿透肽(cCPP)、接头和环外肽(EP)的EEV。EEV可具有式(B)的结构：

或其质子化形式，

其中：

R₁、R₂和R₃各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₄和R₇独立地是H或氨基酸侧链；

EP是如本文所定义的环外肽；

每个m独立地是0-3的整数；

n是0-2的整数；

x'是1-20的整数；

y是1-5的整数；

q是1-4；并且

z'是1-23的整数。

R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、EP、m、q、y、x'、z'如本文所述。

n可以是0。n可以是1。n可以是2。

EEV可具有式(B-a)或(B-b)的结构：

或其质子化形式，其中EP、R¹、R²、R³、R⁴、m和z'如以上在式(B)中所定义。

EEV可具有式(B-c)的结构：

或其质子化形式，其中EP、R¹、R²、R³、R⁴和m如以上在式(B)中所定义；AA是如本文所定义的氨基酸；M如本文所定义；n是0-2的整数；x是1-10的整数；y是1-5的整数；z是1-10的整数。

EEV可具有式(B-1)、(B-2)、(B-3)或(B-4)的结构：

/>

/>

或其质子化形式，其中EP如上文在式(B)中所定义。

EEV可具有式(B)并且可具有以下结构：Ac-PKKKRKVAEEA-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH或Ac-PK-KKR-KV-AEEA-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH。

EEV可包含下式的cCPP：

EEV可具有下式：Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FfFGRGRQ)-miniPEG2-K(N3)。

EEV可以是：

EEV可以是

EEV可以是Ac-P-K(Tfa)-K(Tfa)-K(Tfa)-R-K(Tfa)-V-miniPEG-K(环(Ff-Nal-GrGrQ)-PEG12-OH。

EEV可以是

EEV可以是Ac-P-K-K-K-R-K-V-miniPEG-K(环(Ff-Nal-GrGrQ)-PEG12-OH。

EEV可以是

EEV可以是

EEV可以是

EEV可以是

EEV可以是

EEV可以是

EEV可以是：

EEV可以是

EEV可以是

EEV可以是

EEV可以是

EEV可选自

Ac-rr-miniPEG2-Dap[环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ)]-PEG12-OH

Ac-frr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rfr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbfbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rrr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbrbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbhbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbhbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbrbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-frr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rfr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbfbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rrr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbrbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbhbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbhbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbrbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-KKKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KGKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKGK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KGK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KBK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KBKBK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KR-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KBR-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PGKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKGKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKGRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKGKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRGV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKG-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKKRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac--KKRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2和

Ac-KRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2。

EEV可选自

Ac-PKKKRKV-Lys(环[FfΦ-G-r-G-rQ])-PEG12-K(N3)-NH₂

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRGRQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KR-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKGKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKG-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKKRK-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FFΦGRGRQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[βhF-fΦGrGrQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2和

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FfΦSrSrQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2

EEV可选自

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(GfF-GrGrQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFKRKRQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFRGRGQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRGRGRQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRrRG))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRRRQ))-PEG12-OH和

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFRRRRQ))-PEG12-OH

EEV可选自

Ac-K-K-K-R-K-G-miniPEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-K-R-K-miniPEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-R-K-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-R-K-K-K-PEG₄-K(环[F(3FGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-K-K-R-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-R-K-K-K-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH和

Ac-K-K-K-R-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

EEV可选自

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₂-K(N₃)-NH₂

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₂-K(N₃)-NH₂和

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH。

货物可以是蛋白质并且EEV可以选自：

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH和

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

其中b是β-丙氨酸，并且环外序列可以是D或L立体化学。

货物

细胞穿透肽(CPP)，诸如环状细胞穿透肽(例如，cCPP)，可与货物缀合。货物可以是治疗性部分。货物可与接头的末端羰基基团缀合。环肽的至少一个原子可被货物替换或者至少一个孤对可形成的与货物键。货物可通过接头与cCPP缀合。货物可通过接头与AA_SC缀合。cCPP的至少一个原子可被治疗性部分替换或者cCPP的至少一个孤对形成与治疗性部分的键。cCPP的氨基酸侧链上的羟基基团可被与货物的键替换。cCPP的谷氨酰胺侧链上的羟基基团可被与货物的键替换。货物可通过接头与cCPP缀合。货物可通过接头与AA_SC缀合。

货物可包含一个或多个可检测部分、一个或多个治疗性部分、一个或多个靶向部分或它们的任何组合。货物可以是肽、寡核苷酸或小分子。货物可以是肽序列或非肽基治疗剂。货物可以是抗体或其抗原结合片段，包括但不限于scFv或纳米抗体。

货物可包含一种或多种附加氨基酸(例如，K、UK、TRV)；接头(例如，双功能接头LC-SMCC)；辅酶A；磷酸香豆基氨基丙酸(pCAP)；8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(miniPEG)；L-2,3-二氨基丙酸(Dap或J)；L-β-萘基丙氨酸；L-哌可酸(Pip)；肌氨酸；均苯三酸；7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)；异硫氰酸荧光素(FITC)；L-2-萘基丙氨酸；正亮氨酸；2-氨基丁酸；罗丹明B(Rho)；地塞米松(DEX)；或它们的组合。

货物可包括表6中列出的那些中的任一种、或它们的衍生物或组合。

表6.示例性货物部分

SEQ ID NO	缩写	序列*
			1	R5	RRRRR
2	A5	AAAAA
			3	F4	FFFF
4	PCP	DE(pCAP)LI
			5	A7	AAAAAAA
6		RARAR
			7		DADAD
8		DΩUD
			9		UTRV
10		D-pThr-Pip-Nal

*pCAP，磷酸香豆基氨基丙酸；Ω，正亮氨酸；U，2-氨基丁酸；D-pThr是D-磷酸苏氨酸，Pip是L-哌啶-2-羧酸酯。

可检测部分

化合物可包含可检测部分。可检测部分可在CPP的氨基基团、羧酸根基团或任何氨基酸的侧链处(例如，在cCPP中的氨基基团、羧酸根基团或任何氨基酸的侧链处)附接到细胞穿透肽(CPP)。可检测部分可在cCPP中任何氨基酸的侧链处附接到环状细胞穿透肽(cCPP)。货物可包含可检测部分。货物可包含治疗剂和可检测部分。可检测部分可包括任何可检测标记。合适的可检测标记的示例包括但不限于UV-Vis标记、近红外标记、发光基团、磷光基团、磁自旋共振标记、光敏剂、光可切割部分、螯合中心、重原子、放射性同位素、同位素可检测自旋共振标记、顺磁性部分、发色团或它们的任何组合。标记可在不添加其他试剂的情况下是可检测的。

可检测部分可以是生物相容的可检测部分，使得化合物可适用于多种生物应用。如本文所用，“生物相容的”和“生物学上相容的”通常是指连同其任何代谢物或降解产物一起通常对细胞和组织无毒并且当细胞和组织在它们的存在下孵育(例如，培养)时不对细胞和组织造成任何显著不良作用的化合物。

可检测部分可含有发光体，诸如荧光标记或近红外标记。合适的发光体的示例包括但不限于金属卟啉；苯并卟啉；氮杂苯并卟啉；萘卟啉；酞菁；多环芳族烃，诸如二亚胺、芘；偶氮染料；呫吨染料；二吡咯亚甲基硼、氮杂二吡咯亚甲基硼、花青染料、金属配体络合物诸如联吡啶、联吡啶类、菲咯啉、香豆素以及钌和铱的乙酰丙酮化物；吖啶、噁嗪衍生物，诸如二苯并噁嗪；氮杂轮烯、方酸；8-羟基喹啉、聚甲炔、发光纳米粒子，诸如量子点、纳米晶体；喹诺酮；铽络合物；无机磷光体；离子载体，诸如冠醚附属或衍生的染料；或它们的组合。合适的发光体的具体示例包括但不限于八乙基卟啉Pd(II)；八乙基卟啉Pt(II)；四苯基卟啉Pd(II)；四苯基卟啉Pt(II)；内消旋-四苯基卟啉四苯并卟吩Pd(II)；内消旋-四苯基甲基苯并卟啉Pt(II)；Pd(II)八乙基卟啉酮；Pt(II)八乙基卟啉酮；内消旋-四(五氟苯基)卟啉Pd(II)；内消旋-四(五氟苯基)卟啉Pt(II)；三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)Ru(II)(Ru(dpp)₃)；三(1,10-菲咯啉)Ru(II)(Ru(phen)₃)，三(2,2’-联吡啶)氯化钌(II)六水合物(Ru(bpy)₃)；赤藓红B；荧光素；异硫氰酸荧光素(FITC)；曙红；((N-甲基-苯并咪唑-2-基)-7-(二乙氨基)-香豆素)铱(III)；

苯并噻唑)((苯并噻唑-2-基)-7-(二乙氨基)-香豆素))-2-(乙酰丙酮化物)；Lumogen染料；Macroflex荧光红；Macrolex荧光黄；得克萨斯红；罗丹明B；罗丹明6G；硫罗丹明；间甲酚；百里酚蓝；二甲苯酚蓝；甲酚红；氯酚蓝；溴甲酚绿；溴甲酚红；溴百里酚蓝；Cy2；Cy3；Cy5；Cy5.5；Cy7；4-硝基苯酚；茜素；酚酞；邻甲酚酞；氯酚红；钙镁试剂；溴二甲苯酚；酚红；中性红；硝嗪；3,4,5,6-四溴酚酞；刚果红；荧光素；曙红；2',7'-二氯荧光素；5(6)-羧基荧光素；羧基萘并荧光素；8-羟基芘-136-三磺酸；半萘并罗丹荧(semi-naphthorhodafluor)；半萘并荧光素；三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II)；(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)钌(II)四苯基硼；八乙基卟啉铂(II)；二烷基碳菁；双十八烷基环氧碳菁；芴基甲氧基碳酰氯；7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)；绿色荧光蛋白(GFP)；以及它们的衍生物或组合。

可检测部分可包括罗丹明B(Rho)、异硫氰酸荧光素(FITC)、7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)、绿色荧光蛋白(GFP)或它们的衍生物或组合。

可检测部分可在细胞穿透肽(CPP)的任何氨基基团、羧酸根基团或氨基酸的侧链处(例如，在cCPP中的氨基基团、羧酸根基团或任何氨基酸的侧链处)附接到细胞穿透肽(CPP)。

治疗性部分

所公开的化合物可包含治疗性部分。货物可包含治疗性部分。可检测部分可与治疗性部分连接，或者可检测部分也可用作治疗性部分。治疗性部分是指当施用于受试者时将减少疾病或障碍的一种或多种症状的基团。治疗性部分可包括肽、蛋白质(例如，酶、抗体或其片段)、小分子或寡核苷酸。

治疗性部分可包括多种药物，包括拮抗剂(例如酶抑制剂)和激动剂(例如导致期望的基因产物表达增加的转录因子(尽管如本领域技术人员所理解的，也可使用拮抗转录因子))，均包括在内。另外，治疗性部分包括能够对体内健康和/或不健康细胞产生直接毒性和/或能够诱导毒性的那些药剂。此外，治疗性部分能够诱导和/或引发免疫系统抵抗潜在的病原体。

治疗性部分可例如包括抗癌剂、抗病毒剂、抗微生物剂、抗炎剂、免疫抑制剂、麻醉剂或它们的任何组合。

治疗性部分可包括抗癌剂。抗癌剂的示例包括13-顺式视黄酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-氟尿嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、Accutane、放线菌素-D、Adriamycin、Adrucil、Agrylin、Ala-Cort、阿地白介素、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利维A酸(Alitretinoin)、Alkaban-AQ、Alkeran、全反式视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺、甲氨蝶呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷(Anagrelide)、Anandron、阿那曲唑、阿糖胞苷(Arabinosylcytosine)、Aranesp、Aredia、Arimidex、Aromascin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、Avastin、BCG、BCNU、贝伐珠单抗、贝沙罗汀(Bexarotene)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、BiCNU、Blenoxane、博来霉素、硼替佐米、白消安、Busulfex、C225、亚叶酸钙、Campath、Camptosar、Camptothecin-11、卡培他滨、Carac、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀片、Casodex、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂、嗜橙菌因子(Citrovorum Factor)、克拉屈滨、可的松、Cosmegen、CPT-11、环磷酰胺、Cytadren、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U、Cytoxan、达卡巴嗪、Dactinomycin、阿法达贝泊汀(Darbepoetin alfa)、道诺霉素(Daunomycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、DaunoXome、Decadron、Delta-Cortef、Deltasone、地尼白介素(Denileukin diftitox)、DepoCyt、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞美松磷酸钠、Dexasone、右雷佐生(Dexrazoxane)、DHAD、DIC、Diodex、多烯紫杉醇(Docetaxel)、Doxil、多柔比星(Doxorubicin)、多柔比星脂质体、Droxia、DTIC、DTIC-Dome、Duralone、Efudex、Eligard、Ellence、Eloxatin、Elspar、Emcyt、表柔比星(Epirubicin)、阿法依泊汀(Epoetin alfa)、Erbitux、欧文氏菌L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)、雌莫司汀(Estramustine)、Ethyol、Etopophos、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Eulexin、Evista、依西美坦、Fareston、Faslodex、Femara、非格司亭、氟尿苷、氟达拉、氟达拉滨、Fluoroplex、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、氟他胺(Flutamide)、亚叶酸、FUDR、氟维司群(Fulvestrant)、G-CSF、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗奥佐米星、Gemzar、Gleevec、Lupron、Lupron Depot、Matulane、Maxidex、氮芥(Mechlorethamine)、盐酸氮芥、Medralone、Medrol、Megace、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、Mesna、Mesnex、甲胺蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲基强的松龙、Mylocel、來曲唑、Neosar、Neulasta、Neumega、Neupogen、Nilandron、尼鲁米特(Nilutamide)、氮芥、Novaldex、Novantrone、奥曲肽(Octreotide)、醋酸奥曲肽、Oncospar、Oncovin、Ontak、Onxal、Oprevelkin、Orapred、Orasone、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、Panretin、Paraplatin、Pediapred、PEG干扰素、培加帕酶、培非格司亭、PEG-INTRON、PEG-L-天冬酰胺酶、苯丙氨酸氮芥、Platinol、Platinol-AQ、泼尼松龙、泼尼松、Prelone、丙卡巴肼、PROCRIT、Proleukin、含卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20、Purinethol、雷洛昔芬、Rheumatrex、Rituxan、利妥昔单抗、Roveron-A(干扰素α-2a)、Rubex、盐酸红比霉素、Sandostatin、Sandostatin LAR、Sargramostim、Solu-Cortef、Solu-Medrol、STI-571、链脲佐菌素(Streptozocin)、他莫昔芬、Targretin、Taxol、Taxotere、Temodar、替莫唑胺、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、Thalomid、TheraCys、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤Tabloid、硫代磷酸酰胺、Thioplex、Thiotepa、TICE、Toposar、Topotecan、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维甲酸、Trexall、Trisenox、TSPA、VCR、Velban、Velcade、VePesid、Vesanoid、Viadur、长春碱、硫酸长春碱、Vincasar Pfs、长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VP-16、Vumon、Xeloda、Zanosar、Zevalin、Zinecard、Zoladex、唑来膦酸、Zometa、Gliadel wafer、Glivec、GM-CSF、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、Halotestin、赫赛汀、Hexadrol、Hexalen、六甲蜜胺、HMM、Hycamtin、Hydrea、醋酸氢化可的松(Hydrocort Acetate)、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢可酮、羟基脲、替伊莫单抗(Ibritumomab)、替伊莫单抗泰泽坦、Idamycin、伊达比星(Idarubicin)、Ifex、IFN-alpha、异环磷酰胺、IL2、IL-11、甲磺酸伊馬替尼、咪唑甲酰胺、干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、白介素2、白介素11、内含子A(干扰素α-2b)、Leucovorin、Leukeran、Leukine、亮丙瑞林、Leurocristine、Leustatin、脂质体Ara-C、Liquid Pred、洛莫司汀(Lomustine)、L-PAM、L-Sarcolysin、Meticorten、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、M-Prednisol、MTC、MTX、Mustargen、Mustine、Mutamycin、Myleran、Iressa、Irinotecan、异维甲酸(Isotretinoin)、Kidrolase、Lanacort、L-天冬酰胺酶和LCR。治疗性部分还可包括生物药物，诸如例如抗体。

治疗性部分可包括抗病毒剂，诸如更昔洛韦、叠氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)等。

治疗性部分可包括抗细菌剂，诸如醋氨苯砜(acedapsone)；磺胺苯砜钠(acetosulfone sodium)；阿拉米辛(alamecin)；阿来西定(alexidine)；氯脒青霉(amdinocillin)；氯脒青霉素双酯(amdinocillin pivoxil)；阿米环素(amicycline)；阿米沙星(amifloxacin)；甲磺酸阿米沙星；阿米卡星(amikacin)；硫酸阿米卡星；氨基水杨酸；氨基水杨酸钠；阿莫西林；安福霉素(amphomycin)；氨苄西林(ampicillin)；氨苄西林钠；阿帕西林钠(apalcillin sodium)；安普霉素(apramycin)；天冬菌素(aspartocin)；硫酸阿司米星(astromicin sulfate)；卑霉素(avilamycin)；阿伏霉素(avoparcin)；阿奇霉素(azithromycin)；阿洛西林(azlocillin)；阿洛西林钠；盐酸巴氨西林；杆菌肽(bacitracin)；亚甲基双水杨酸杆菌肽；杆菌肽锌；巴波霉素(bambermycins)；苯沙酸钙(benzoylpas calcium)；红霉素(berythromycin)；硫酸倍他霉素(betamicin sulfate)；比阿培南(biapenem)；比尼霉素(biniramycin)；盐酸苯柳胺酯(biphenaminehydrochloride)；硫酸镁双巯氧吡啶(bispyrithione magsulfex)；布替卡星(butikacin)；硫酸布替罗星(butirosin sulfate)；硫酸卷曲霉素(capreomycin sulfate)；卡巴多司(carbadox)；羧苄西林二钠(carbenicillin disodium)；羧苄西林茚满钠(carbenicillinindanyl sodium)；羧苄西林钠苯酯(carbenicillin phenyl sodium)；羧苄西林钾(carbenicillin potassium)；卡芦莫南钠(carumonam sodium)；头孢克洛(cefaclor)；头孢羟氨苄(cefadroxil)；头孢孟多(cefamandole)；头孢孟多酯钠(cefamandole nafate)；头孢孟多钠(cefamandole sodium)；头孢帕罗(cefaparole)；头孢曲嗪(cefatrizine)；头孢氟唑钠(cefazaflur sodium)；头孢唑啉(cefazolin)；头孢唑林钠；头孢拉宗(cefbuperazone)；头孢地尼(cefdinir)；头孢吡肟(cefepime)；盐酸头孢吡肟；头孢替考(cefetecol)；头孢克肟(cefixime)；盐酸头孢甲肟(cefmenoxime hydrochloride)；头孢美唑(cefmetazole)；头孢美唑钠；头孢尼西单钠(cefonicid monosodium)；头孢尼西钠；头孢哌酮钠(cefoperazone sodium)；头孢雷特(ceforanide)；头孢噻肟钠(cefotaximesodium)；头孢替坦(cefotetan)；头孢替坦二钠；盐酸头孢替安(cefotiamhydrochloride)；头孢西丁(cefoxitin)；头孢西丁钠；头孢咪唑(cefpimizole)；头孢咪唑钠；头孢匹胺(cefpiramide)；头孢匹胺钠；硫酸头孢匹罗；头孢泊肟酯(cefpodoximeproxetil)；头孢丙烯(cefprozil)；头孢沙定(cefroxadine)；头孢磺啶钠(cefsulodinsodium)；头孢他啶(ceftazidime)；头孢布坦(ceftibuten)；头孢唑肟钠(ceftizoximesodium)；头孢曲松钠(ceftriaxone sodium)；头孢呋辛(cefuroxime)；头孢呋辛酯(cefuroxime axetil)；头孢呋辛匹替酯(cefuroxime pivoxetil)；头孢呋辛钠(cefuroxime sodium)；头孢乙腈钠(cephacetrile sodium)；头孢氨苄(cephalexin)；盐酸头孢氨苄；头孢来星(cephaloglycin)；头孢噻啶(cephaloridine)；头孢噻吩钠(cephalothin sodium)；头孢匹林钠(cephapirin sodium)；头孢拉定(cephradine)；盐酸西托环素(cetocycline hydrochloride)；乙酰氯霉素(cetophenicol)；氯霉素(chloramphenicol)；棕榈酸氯霉素；氯霉素泛酸复合物(chloramphenicol pantothenatecomplex)；琥珀酸钠氯霉素(chloramphenicol sodium succinate)；氨基苯磷酸氯己定(chlorhexidine phosphanilate)；氯二甲苯酚(chloroxylenol)；金霉素硫酸氢盐(chlortetracycline bisulfate)；盐酸金霉素；西诺沙星(cinoxacin)；环丙沙星(ciprofloxacin)；盐酸环丙沙星；西罗霉素(cirolemycin)；克拉霉素(clarithromycin)；盐酸克林沙星(clinafloxacin hydrochloride)；克林霉素(clindamycin)；盐酸克林霉素；盐酸克林霉素棕榈酸酯；磷酸克林霉素；氯法齐明(clofazimine)；苄星邻氯青霉素(cloxacillin benzathine)；氯唑西林钠(cloxacillin sodium)；氯羟喹啉(cloxyquin)；粘菌素甲烷磺酸钠(colistimethate sodium)；硫酸粘菌素(colistin sulfate)；库马霉素(coumermycin)；库马霉素钠；环己西林(cyclacillin)；环丝氨酸(cycloserine)；达福普汀(dalfopristin)；氨苯砜(dapsone)；达托霉素(daptomycin)；地美环素(demeclocycline)；盐酸地美环素；去甲环素(demecycline)；地奴真菌素(denofungin)；二氨藜芦唳(diaveridine)；双氯西林(dicloxacillin)；双氯西林钠；硫酸双氢链霉素(dihydrostreptomycin sulfate)；双硫氧吡啶(dipyrithione)；地红霉素(dirithromycin)；强力霉素(doxycycline)；强力霉素钙；强力霉素磷酸复合物(doxycycline fosfatex)；盐酸强力霉素；屈克沙星钠(droxacin sodium)；依诺沙星(enoxacin)；依匹西林(epicillin)；盐酸差向四环素(epitetracycline hydrochloride)；红霉素；醋硬脂红霉素；依托红霉素；琥乙红霉素；葡庚糖酸红霉素；乳糖醛酸红霉素；丙酸红霉素；硬脂酸红霉素；盐酸乙胺丁醇；乙硫异烟胺；氟罗沙星(fleroxacin)；氟氯西林(floxacillin)；氟氘丙氨酸(fludalanine)；氟甲喹(flumequine)；磷霉素(fosfomycin)；磷霉素氨丁三醇(fosfomycin tromethamine)；呋莫西林(fumoxicillin)；呋唑氯铵(furazolium chloride)；酒石酸呋唑铵(furazolium tartrate)；夫西地酸钠(fusidatesodium)；夫西地酸；硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)；格洛莫南(gloximonam)；短杆菌肽(gramicidin)；卤普罗近(haloprogin)；海他西林(hetacillin)；海他西林钾；海克西丁(hexedine)；以巴沙星(ibafloxacin)；亚胺培南(imipenem)；异康唑(isoconazole)；异帕米星(isepamicin)；异烟肼(isoniazid)；交沙霉素(josamycin)；硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate)；吉他霉素(kitasamycin)；左呋喃它酮(levofuraltadone)；左普皮西林钾(levopropylcillin potassium)；来红霉素(lexithromycin)；林可霉素(lincomycin)；盐酸林可霉素；洛美沙星(lomefloxacin)；盐酸洛美沙星；甲磺酸洛美沙星；氯碳头孢(loracarbef)；磺胺米隆(mafenide)；甲氯环素(meclocycline)；磺基水杨酸甲氯环素；巨霉素磷酸二氢钾(megalomicin potassium phosphate)；美喹多司(mequidox)；美罗培南(meropenem)；美他环素(methacycline)；盐酸美他环素；乌洛托品(methenamine)；马尿酸乌洛托品；扁桃酸乌洛托品；甲氧西林钠(methicillin 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sodium)；吡苄西林钠(pirbenicillin sodium)；吡地西林钠(piridicillin sodium)；盐酸吡利霉素(pirlimycin hydrochloride)；盐酸匹氨青霉素(pivampicillin hydrochloride)；双羟萘酸匹氨青霉素(pivampicillin pamoate)；苯丙酸匹氨青霉素(pivampicillin probenate)；硫酸多粘菌素B(polymyxin B sulfate)；泊非霉素(porfiromycin)；普匹卡星(propikacin)；吡嗪酰胺(pyrazinamide)；吡硫翁锌(pyrithione zinc)；醋酸喹地卡明(quindecamine acetate)；奎奴普丁(quinupristin)；消旋甲砜霉素(racephenicol)；雷莫拉丁(ramoplanin)；雷尼霉素(ranimycin)；瑞洛霉素(relomycin)；瑞普米星(repromicin)；利福布汀(rifabutin)；利福美坦(rifametane)；利福克昔(rifamexil)；利福米特(rifamide)；利福平(rifampin)；利福喷汀(rifapentine)；利福昔明(rifaximin)；罗利环素(rolitetracycline)；硝酸罗利环素(rolitetracyclinenitrate)；罗沙米星(rosaramicin)；丁酸罗沙米星(rosaramicin butyrate)；丙酸罗沙米星(rosaramicin propionate)；罗沙米星磷酸钠(rosaramicin sodium phosphate)；硬脂酸罗沙米星(rosaramicin stearate)；罗索沙星(rosoxacin)；洛克沙胂(roxarsone)；罗红霉素(roxithromycin)；山环素(sancycline)；山费培南钠(sanfetrinem sodium)；沙莫西林(sarmoxicillin)；沙匹西林(sarpicillin)；司可芬净(scopafungin)；西索米星(sisomicin)；硫酸西索米星；司帕沙星(sparfloxacin)；盐酸大观霉素(spectinomycinhydrochloride)；螺旋霉素(spiramycin)；盐酸司他霉素(stallimycin hydrochloride)；司替霉素(steffimycin)；硫酸链霉素；链异烟肼(streptonicozid)；磺胺苯(sulfabenz)；磺胺苯酰(sulfabenzamide)；磺胺醋酰(sulfacetamide)；磺胺醋酰钠；磺胺西汀(sulfacytine)；磺胺嘧啶(sulfadiazine)；磺胺嘧啶钠；磺胺多辛(sulfadoxine)；磺胺林(sulfalene)；磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)；磺胺对甲氧嘧啶(sulfameter)；磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine)；磺胺甲二唑(sulfamethizole)；磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)；磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)；磺胺二甲唑(sulfamoxole)；氨基苯磺酸锌(sulfanilate zinc)；磺胺硝苯(sulfanitran)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；磺胺异噻唑(sulfasomizole)；磺胺噻唑(sulfathiazole)；磺胺吡唑(sulfazamet)；磺胺异噁唑(sulfisoxazole)；乙酸磺胺异噁唑(sulfisoxazole acetyl)；磺胺异噁唑二乙醇胺(sulfisboxazolediolamine)；磺粘菌素(sulfomyxin)；硫培南(sulopenem)；舒他西林(sultamricillin)；森西林钠(suncillin sodium)；盐酸酞氨西林(talampicillinhydrochloride)；替考拉宁(teicoplanin)；盐酸替马沙星(temafloxacinhydrochloride)；替莫西林(temocillin)；四环素(tetracycline)；盐酸四环素；磷酸四环素复合物；四氧普林(tetroxoprim)；甲砜霉素(thiamphenicol)；苯硫青霉素钾(thiphencillin potassium)；替卡西林甲苯基钠(ticarcillin cresyl sodium)；替卡西林二钠(ticarcillin disodium)；替卡西林单钠(ticarcillin monosodium)；替克拉酮(ticlatone)；氯化乔多(tiodonium chloride)；妥布霉素(tobramycin)；硫酸妥布霉素(tobramycin sulfate)；托氟沙星(tosufloxacin)；甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)；硫酸甲氧苄氨嘧啶；三重磺胺嘧啶(trisulfapyrimidines)；醋竹桃霉素(troleandomycin)；硫酸丙大观霉素(trospectomycin sulfate)；短杆菌素(tyrothricin)；万古霉素(vancomycin)；盐酸万古霉素；维吉霉素(virginiamycin)；或佐尔博霉素(zorbamycin)。

治疗性部分可包括抗炎剂。

治疗性部分可包括地塞米松(Dex)。

治疗性部分可包括治疗性蛋白质。例如，一些人具有某些酶的缺陷(例如，溶酶体贮积症)。可通过将酶/蛋白质与本文公开的环状细胞穿透肽(cCPP)连接而将此类酶/蛋白质递送至人细胞。已用蛋白质(例如，GFP、PTP1B、肌动蛋白、钙调蛋白、肌钙蛋白C)测试了所公开的cCPP，并且显示出起作用。

治疗性部分可以是抗感染剂。术语“抗感染剂”是指能够杀死、抑制或减缓感染原生长的药剂。术语“感染原”是指病原微生物，诸如细菌、病毒、真菌以及细胞内或细胞外寄生虫。抗感染剂可用于治疗感染性疾病，因为感染性疾病是由感染原引起的。

感染原可以是革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌可以是选自埃希氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、普罗威登斯菌属、肠杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、嗜血杆菌属、耶尔森氏菌属、奈瑟氏菌属、欧文氏菌属、红假单胞菌属和伯克霍尔德氏菌属的属。感染原可以是革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌可以是选自乳杆菌属、固氮根瘤菌属、链球菌属、片球菌属、发光杆菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、葡萄球菌属、梭菌属、丁酸弧菌属、鞘氨醇单胞菌属、红球菌属和链霉菌属的属。感染原可以是分枝杆菌属的抗酸细菌，诸如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌和麻风分枝杆菌。感染原可以是诺卡氏菌属的。感染原可选自下列种类中的任一种：星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌和豚鼠诺卡氏菌。

感染原可以是真菌。真菌可来自毛霉(Mucor)属。真菌可来自隐球菌(Crytococcus)属。真菌可来自假丝酵母(Candida)属。真菌可选自总状毛霉(Mucorracemosus)、白色念珠菌(Candida albicans)、新型隐球菌(Crytococcus neoformans)或烟曲霉(Aspergillus fumingatus)中的任一种。

感染原可以是原生动物。原生动物可以是疟原虫属(Plasmodium)(例如，恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)或三日疟原虫(P.malariae))。原生动物引起疟疾。

示例性的生物体包括芽孢杆菌、巴尔通体、博德特氏菌、疏螺旋体、布鲁氏菌、弯曲杆菌、衣原体、嗜衣原体、梭菌、棒状杆菌、肠球菌、埃希氏菌、弗朗西斯氏菌、嗜血杆菌、螺杆菌、军团菌、钩端螺旋体、李斯特氏菌、分枝杆菌、支原体、奈瑟氏菌、假单胞菌、立克次氏体、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、密螺旋体、脲原体、弧菌和耶尔森氏菌。

感染原可以是寄生虫。寄生虫可以是隐孢子虫属。寄生虫可以是内寄生虫。内寄生虫可以是心丝虫、绦虫或扁形虫。寄生虫可以是表寄生虫。寄生虫引起选自棘阿米巴虫病(acanthamoebiasis)、巴贝虫病(babesiosis)、小袋纤毛虫病(balantidiasis)、芽囊原虫病(blastocystosis)、球虫病(coccidiosis)、阿米巴虫病(amoebiasis)、贾第鞭毛虫病(giardiasis)、等孢球虫病(isosporiasis)、囊孢子虫病(cystosporiasis)、利什曼原虫病(leishmaniasis)、原发性阿米巴脑膜脑炎、疟疾、鼻孢子虫病(rhinosporidiosis)、弓形虫病(toxoplasmosis)、毛滴虫病(trichomoniasis)、锥虫病(trypanomiasis)、恰加斯病(Chagas disease)或疮痂病(scabies)的疾病。

感染原可以是病毒。病毒的非限制性示例包括突发急性呼吸道冠状病毒2(SARS-CoV-2)、突发急性呼吸道冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸道病毒(MERS)、流感、丙型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹、带状疱疹和拉沙病毒。

抗感染剂可以是抗病毒剂。抗病毒剂的非限制性示例包括核苷或核苷酸逆转录酶抑制剂，诸如齐多夫定(AZT)、去羟肌苷(ddl)、扎西他滨(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、恩曲他滨、阿巴卡韦琥珀酸酯、艾夫他滨、阿德福韦二吡呋酯、洛布卡韦(BMS-180194)、洛德腺苷(lodenosine)(FddA)和替诺福韦，包括替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦二吡呋酯富马酸盐；非核苷逆转录酶抑制剂，诸如奈韦拉平、地拉韦啶、依法韦仑、依曲韦林和利匹韦林；蛋白酶抑制剂，诸如利托那韦、替拉那韦(tipranavir)、沙奎那韦、奈非那韦、茚地那韦(indinavir)、安普那韦(amprenavir)、夫沙那韦(fosamprenavir)、阿扎那韦(atazanavir)、洛匹那韦(lopinavir)、地瑞那韦(darunavir)(TMC-114)、拉西那韦(lasinavir)和布卡那韦(brecanavir)(VX-385)；细胞进入抑制剂，诸如CCR5拮抗剂(例如马拉维罗(maraviroc)、维克维罗(vicriviroc)、INCB9471和TAK-652)和CXCR4拮抗剂(AMD-11070)；融合抑制剂，诸如恩夫韦肽(enfuvirtide)；整合酶抑制剂，诸如雷特格韦、BMS-707035和埃替格韦；Tat抑制剂，诸如二脱氢皮质抑素A(dCA)；成熟抑制剂，诸如berivimat；免疫调节剂，诸如左旋咪唑；以及其他抗病毒剂，诸如羟基脲、利巴韦林、白介素2(IL-2)、白细胞介素12(IL-12)、片沙弗(pensafuside)、帕拉米韦、扎那米韦、磷酸奥司他韦、巴洛沙韦玛波西酯，

抗感染剂可以是抗生素。抗生素的非限制性示例包括氨基糖苷类，诸如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、链霉素和妥布霉素；碳头孢烯类(cabecephems)，诸如氯碳头孢；碳青霉烯类，诸如厄他培南、亚胺培南/西司他丁和美罗培南；头孢菌素类，诸如头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢氨苄、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松和头孢吡肟；大环内酯类，诸如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素和醋竹桃霉素；单环内酰胺；青霉素类，诸如阿莫西林、氨苄西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林和替卡西林；多肽类，诸如杆菌肽、粘菌素和多粘菌素B；喹诺酮类，诸如环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和曲伐沙星；磺胺类，诸如磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑；四环素类，诸如地美环素、多西环素、米诺环素、土霉素和四环素；和万古霉素。抗感染剂可以是甾体抗炎剂。甾体抗炎剂的非限制性示例包括氟轻松、曲安西龙、曲安奈德、倍他米松、二丙酸倍他米松、二氟可龙、氟替卡松、可的松、氢化可的松、莫米松、甲泼尼龙、二丙酸倍氯米松、氯倍他索、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、布地奈德和地塞米松。抗感染剂可以是非甾体抗炎剂。非甾体抗炎剂的非限制性示例包括塞来昔布、尼美舒利、罗非昔布、甲氯灭酸、甲氯芬那酸钠、氟尼辛、氟洛芬、氟比洛芬、舒林酸、美洛昔康、吡罗昔康、依托度酸、非诺洛芬、芬布洛芬、酮洛芬、舒洛芬、双氯芬酸、溴芬酸钠、保泰松、沙利度胺和吲哚美辛。

抗感染剂可以是抗真菌剂。抗真菌剂的非限制性示例包括两性霉素B、卡泊芬净(caspofungin)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、阿莫洛芬(amrolfine)、布替萘芬(butenafine)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬(terbinafine)、新康唑(elubiol)、益康唑(econazole)、econaxole、伊曲康唑(itraconazole)、异康唑(isoconazole)、咪唑、咪康唑(miconazole)、氟康唑(sulconazole)、克霉唑(clotrimazole)、恩康唑(enilconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、噻康唑(tioconazole)、特康唑(terconazole)、布康唑(butoconazole)、噻苯咪唑(thiabendazole)、伏立康唑(voriconazole)、沙康唑(saperconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、芬替康唑(fenticonazole)、泊沙康唑(posaconazole)、联苯苄唑(bifonazole)、氟曲吗唑(flutrimazole)、制霉菌素(nystatin)、匹马菌素(pimaricin)、那他霉素(natamycin)、托萘酯(tolnaftate)、磺胺米隆(mafenide)、氨苯砜(dapsone)、actofunicone、灰黄霉素(griseofulvin)、碘化钾、龙胆紫(Gentian Violet)、环匹罗司(ciclopirox)、环匹罗司乙醇胺(ciclopirox olamine)、氯丙炔碘(haloprogin)、十一烯酸酯、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine)、十一烯酸、十一烯酸烷醇酰胺和石炭酸-品红(Carbol-Fuchsin)。

治疗性部分可以是止痛剂或疼痛缓解剂。止痛剂或疼痛缓解剂的非限制性示例包括阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、普鲁卡因、利多卡因、丁卡因、地布卡因(dibucaine)、苯佐卡因(benzocaine)、对丁基氨基苯甲酸2-(二乙基氨基)乙酯HCI、甲哌卡因(mepivacaine)、哌罗卡因(piperocaine)和达克罗宁(dyclonine)

治疗性部分可以是抗体或抗原结合片段。抗体和抗原结合片段可源自任何合适的来源，包括人、小鼠、骆驼科动物(例如，骆驼、羊驼、美洲驼)、大鼠、有蹄类动物或非人灵长类动物(例如，猴、恒河猴)。

还应当理解，本文所述的包含抗感染剂和其他治疗性部分的货物包括其可能的盐，其中药学上可接受的盐当然对于治疗应用是特别相关的。盐包括酸加成盐和碱式盐。酸加成盐的示例是盐酸盐、富马酸盐、草酸盐等。碱式盐的示例是其中(剩余的)抗衡离子可选自碱金属诸如钠和钾、碱土金属诸如钙盐、钾盐和铵离子(⁺N(R')₄，其中R'独立地表示任选取代的C_1-6-烷基、任选取代的C_2-6-烯基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基)的盐。

治疗性部分可以是寡核苷酸。寡核苷酸可以是反义化合物(AC)。寡核苷酸可包括例如但不限于反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、免疫刺激核酸、antagomir、antimir、微小RNA模拟物、supermir、Ul衔接子、CRISPR机制和适体。术语“反义寡核苷酸”或简称“反义”意在包括与靶向多核苷酸序列互补的寡核苷酸。用于治疗Duchenne型肌营养不良的反义寡核苷酸的非限制性示例可见于美国公开号2019/0365918、美国公开号US2020/0040336、美国专利号9499818和美国专利号9447417中找到，其各自全文以引用方式并入本文用于所有目的。

治疗性部分可用于治疗以下疾病中的任一种：神经肌肉障碍、庞贝病、β-地中海貧血、Kobe型抗肌萎缩蛋白病、Duchenne型肌营养不良、Becker型肌营养不良、糖尿病、阿尔茨海默氏病、癌症、囊性纤维化、Merosin缺陷性先天性肌营养不良1A型(MDC1A)、近端脊髓性肌萎缩症(SMA)、亨廷顿病、亨廷顿病样2(HDL2)、肌强直性营养不良、脊髓小脑性共济失调、脊髓和延髓性肌萎缩症(SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、脆性X综合征、脆性X精神发育迟滞1(FMR1)、脆性X精神发育迟滞2(FMR2)、脆性XE精神发育迟滞(FRAXE)、弗里德赖希氏共济失调(FRDA)、脆性X-相关震颤/共济失调综合征(FXTAS)、肌阵挛性癫痫、眼咽肌营养不良(OPMD)、综合征或非综合征X-连锁精神发育迟滞、肌强直性营养不良、肌强直性营养不良1型、肌强直性营养不良2型、癫痫、德拉韦综合征或阿尔茨海默氏病。治疗性部分可用于治疗选自神经胶质瘤、急性髓样白血病、甲状腺癌、肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、尿路上皮癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌或黑色素瘤的癌症。治疗性部分可用于治疗眼部疾病。眼部疾病的非限制性示例包括屈光不正、黄斑变性、白内障、糖尿病性视网膜病、青光眼、弱视或斜视。

治疗性部分可包括靶向部分。靶向部分可包含例如可靶向一个或多个酶结构域的氨基酸序列。靶向部分可包括针对可在疾病中起作用的酶的抑制剂，该疾病诸如癌症、囊性纤维化、糖尿病、肥胖症或它们的组合。靶向部分靶向以下基因中的一种或多种：FMR1、AFF2、FXN、DMPK、SCA8、PPP2R2B、ATN1、DRPLA、HTT、AR、ATXN1、ATXN2、ATXN3、CACNA1A、ATXN7、TBP、ATP7B、HTT、SCN1A、BRCA1、LAMA2、CD33、VEGF、ABCA4、CEP290、RHO、USH2A、OPA1、CNGB3、PRPF31、GYS1或RPGR。治疗性部分可以是美国公开号2019/0365918中描述的反义化合物(AC)，其全文以引用方式并入本文。例如，靶向部分可包含表7中列出的序列中的任一种。

表7.示例性靶向部分

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*Fpa，∑：L-4-氟苯丙氨酸；Pip，Θ：L-高脯氨酸；Nle，Ω：L-正亮氨酸；Phg，Ψ：L-苯基甘氨酸；F₂Pmp，Λ：L-4-(膦酰二氟甲基)苯丙氨酸；Dap：L-2,3-二氨基丙酸；Nal，Φ'：L-β-萘基丙氨酸；Pp，θ：L-哌可酸；Sar，Ξ：肌氨酸；Tm，均苯三酸。

靶向部分和细胞穿透肽可重叠。也就是说，形成细胞穿透肽的残基也可以是形成靶向部分的序列的一部分，反之亦然。

治疗性部分可在细胞穿透肽的氨基基团、羧酸根基团或任何氨基酸的侧链处(例如，在cCPP的氨基基团、羧酸根基团或任何氨基酸的侧链处)附接到细胞穿透肽。治疗性部分可附接到可检测部分。

治疗性部分可包含靶向部分，其可充当针对Ras(例如，K-Ras)、PTP1B、Pin1、Grb2SH2、CAL PDZ等或它们的组合的抑制剂。

Ras是一种在人类中由RAS基因编码的蛋白质。正常Ras蛋白在正常组织信号传导中发挥重要功能，并且Ras基因的突变与许多癌症的发展有关。Ras可充当分子开/关开关，一旦它被打开，Ras就募集并激活生长因子和其他受体信号传播所必需的蛋白质。Ras的突变形式已与多种癌症有关，包括肺癌、结肠癌、胰腺癌和多种白血病。

蛋白-酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是PTP超家族的原型成员，并且在真核细胞信号传导期间起许多作用。PTP1B是胰岛素信号传导途径的负调节剂，并且被认为是有希望的潜在治疗靶标，特别是用于治疗II型糖尿病。PIP1B也与乳腺癌的发展有关。

Pin1是一种与蛋白质亚类结合的酶并且在调节蛋白质功能中起到后磷酸化控制的作用。Pin1活性可调节脯氨酸定向激酶信号传导的结果，并因此可调节细胞增殖和细胞存活。Pin1的失调可在多种疾病中发挥作用。Pin1的上调可能与某些癌症有关，而Pin1的下调可能与阿尔茨海默病有关。Pin1的抑制剂可能对癌症和免疫障碍具有治疗意义。

Grb2是参与信号转导和细胞通讯的衔接蛋白。Grb2蛋白含有一个SH2结构域，其可结合酪氨酸磷酸化序列。Grb2被广泛表达并且是多种细胞功能所必需的。Grb2功能的抑制可损害发育过程并可阻断各种细胞类型的转化和增殖。

最近报道了囊性纤维化膜电导调节因子(CFTR)(在囊性纤维化(CF)患者中突变的氯离子通道蛋白)的活性被CFTR-相关配体(CAL)通过其PDZ结构域(CAL-PDZ)负调节(Wolde,M等人J.Biol.Chem.2007,282,8099)。CFTR/CAL-PDZ相互作用的抑制显示出改善ΔPhe508-CFTR(CFTR突变的最常见形式)的活性(Cheng,SH等人Cell 1990,63,827；Kerem,BS等人Science 1989,245,1073)，方式是通过减少其蛋白酶体介导的降解(Cushing,PR等人Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9907)。因此，本文公开了通过施用有效量的本文公开的化合物或组合物来治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗性部分，该治疗性部分可包含靶向部分，该靶向部分可充当针对CAL PDZ的抑制剂。此外，本文公开的一种或多种组合物可与校正CFTR功能的分子一起施用。

治疗性部分可在氨基基团或羧酸根基团处，或在环肽的任何氨基酸的侧链处(例如，在环肽的氨基酸的侧链上的氨基或羧酸根基团处)附接到环肽。在一些示例中，治疗性部分可附接到可检测部分。

本文还公开了包含本文所述的化合物的组合物。

本文还公开了所公开化合物的药学上可接受的盐和前药。药学上可接受的盐包括根据化合物上发现的特定取代基用酸或碱制备的所公开的化合物的盐。在其中本文公开的化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定的无毒酸或碱盐的条件下，以盐的形式施用化合物可以是适当的。药学上可接受的碱加成盐的示例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐或镁盐。生理上可接受的酸加成盐的示例包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、碳酸、硫酸和有机酸如乙酸、丙酸、苯甲酸、琥珀酸、富马酸、扁桃酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、丙二酸、抗坏血酸、α-酮戊二酸、α-糖磷酸、马来酸、甲苯磺酸、甲磺酸等。因此，本文公开了盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-糖磷酸盐、马来酸盐、甲苯磺酸盐和甲磺酸盐。化合物的药学上可接受的盐可使用本领域熟知的标准方法获得，例如，通过使足够碱性的化合物诸如胺与提供生理上可接受的阴离子的合适的酸反应。还可制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。

治疗性部分可包括治疗性多肽、寡核苷酸或小分子。治疗性多肽可包括肽抑制剂。治疗性多肽可包括特异性结合感兴趣的靶标的结合试剂。结合试剂可包括特异性结合感兴趣的靶标的抗体或其抗原结合片段。抗原结合片段可包括Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、微抗体、双抗体、纳米抗体、单结构域抗体(dAb)、单链可变片段(scFv)或多特异性抗体。

寡核苷酸可包括反义化合物(AC)。AC可包括与编码感兴趣的蛋白质靶标的靶核苷酸序列互补的核苷酸序列。

治疗性部分(TM)可与cCPP的氨基酸的化学反应性侧链缀合。cCPP上任何能够形成共价键或者可被如此修饰的氨基酸侧链都可用于将TM连接到cCPP。cCPP上的氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。化学反应性侧链可包括胺基团、羧酸、酰胺、羟基基团、巯基基团、胍基、酚基团、硫醚基团、咪唑基团或吲哚基团。与TM缀合的cCPP的氨基酸可包括赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸或它们的类似物。用于缀合TM的cCPP上的氨基酸可以是鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸或它们的类似物。氨基酸可以是赖氨酸或其类似物。氨基酸可以是谷氨酸或其类似物。氨基酸可以是天冬氨酸或其类似物。侧链可被与TM或接头的键取代。

TM可包括治疗性多肽，并且cCPP可与治疗性多肽的氨基酸的化学反应性侧链缀合。TM上任何能够形成共价键或可被如此修饰的氨基酸侧链都可用于将cCPP连接到TM。TM上的氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸。化学反应性侧链可包括胺基团、羧酸、酰胺、羟基基团、巯基基团、胍基、酚基团、硫醚基团、咪唑基团或吲哚基团。与cCPP缀合的TM的氨基酸可包括赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸或它们的类似物。用于缀合cCPP的TM上的氨基酸可以是鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸或它们的类似物。氨基酸可以是赖氨酸或其类似物。氨基酸可以是谷氨酸或其类似物。氨基酸可以是天冬氨酸或其类似物。TM的侧链可被与cCPP的键或接头取代。

TM可以是反义化合物(AC)，其包括寡核苷酸，其中寡核苷酸的5'或3'端与cCPP的氨基酸的化学反应性侧链缀合。AC可通过AC的5'或3'端上的部分与cCPP化学缀合。cCPP的化学反应性侧链可包括胺基团、羧酸、酰胺、羟基基团、巯基基团、胍基、酚基团、硫醚基团、咪唑基团或吲哚基团。与AC缀合的cCPP的氨基酸可包括赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或色氨酸。与AC缀合的cCPP的氨基酸可包括赖氨酸或半胱氨酸。

寡核苷酸

该化合物可包括与作为治疗性部分的反义化合物(AC)缀合的环状细胞穿透肽(cCPP)。AC可包括反义寡核苷酸、siRNA、微小RNA、antagomir、适体、核酶、免疫刺激性寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、supermir、miRNA模拟物、miRNA抑制剂或它们的组合。

反义寡核苷酸

治疗性部分可包括反义寡核苷酸。术语“反义寡核苷酸”或简称“反义”是指与靶向多核苷酸序列互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸可包括与所选序列(例如靶基因mRNA)互补的单链DNA或RNA。

反义寡核苷酸可经由反义寡核苷酸与靶核酸的杂交来调节蛋白质转录、翻译、表达和功能的一个或多个方面。反义寡核苷酸与其靶序列的杂交可抑制靶蛋白的表达。反义寡核苷酸与其靶序列的杂交可抑制一种或多种靶蛋白同种型的表达。反义寡核苷酸与其靶序列的杂交可上调靶蛋白的表达。反义寡核苷酸与其靶序列的杂交可下调靶蛋白的表达。

反义化合物可通过与互补mRNA结合来抑制基因表达。与靶mRNA的结合可通过阻止互补mRNA链的翻译(通过与其结合)或通过导致靶mRNA的降解而导致基因表达的抑制。反义DNA可用于靶向特异性互补(编码或非编码)RNA。如果发生结合，该DNA/RNA杂交体可被RNA酶H降解。反义寡核苷酸可包含约10至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、或约20至约25个核苷酸。该术语还包括可能不与期望靶基因完全互补的反义寡核苷酸。因此，本文公开的化合物可用于这样的情况，其中发现反义序列具有非靶特异性活性，或其中需要含有一个或多个与靶序列错配的反义序列。

反义寡核苷酸已被证明是蛋白质合成的有效和靶向抑制剂，并且因此可用于通过靶向基因特异性抑制蛋白质合成。反义寡核苷酸抑制蛋白质合成的功效已被充分确定。

产生反义寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且可以容易地适用于产生靶向任何感兴趣的多核苷酸序列的反义寡核苷酸。对给定靶序列特异性的反义寡核苷酸序列的选择基于对所选靶序列的分析和二级结构、Tm、结合能和相对稳定性的确定。反义寡核苷酸可基于它们相对不能形成将减少或抑制与宿主细胞中的靶mRNA的特异性结合的二聚体、发夹或其他二级结构来选择。mRNA的靶区域包括在AUG翻译起始密码子处或附近的那些区域和基本上与mRNA的5'区域互补的那些序列。这些二级结构分析和靶位点选择考虑可例如使用第4版的OLIGO引物分析软件(Molecular Biology Insights)和/或BLASTN 2.0.5算法软件来进行(Altschul等人,Nucleic Acids Res.1997,25(17):3389-402)。

RNA干扰核酸

治疗性部分可以是RNA干扰(RNAi)分子或小干扰RNA分子。使用RNAi或siRNA分子的RNA干扰方法可用于破坏感兴趣的基因或多核苷酸的表达。

小干扰RNA(siRNA)是通常约16至约30个核苷酸长的RNA双链体，其可与称为RNAi诱导的沉默复合物(RISC)的细胞质多蛋白复合物结合。负载有siRNA的RISC介导同源mRNA转录物的降解，因此siRNA可被设计成以高特异性敲低蛋白质表达。与其他反义技术不同，siRNA通过经非编码RNA进化以控制基因表达的天然机理发挥作用。多种RNAi试剂，包括靶向临床相关靶标的siRNA，目前正处于药物开发中，如例如de Fougerolles,A.等人,NatureReviews 6:443-453(2007)中所述。

虽然最先描述的RNAi分子是包括RNA有义链和RNA反义链的RNA:RNA杂交体，但现已证明DNA有义链:RNA反义杂交体、RNA有义链:DNA反义杂交体和DNA:DNA杂交体能够介导RNAi(Lamberton,J.S.和Christian,A.T.,(2003)Molecular Biotechnology 24:111-119)。可使用包括这些不同类型的双链分子中的任一种的RNAi分子。此外，应当理解，RNAi分子可以多种形式被使用和引入细胞。RNAi分子可包括能够在细胞中诱导RNAi反应的任何和所有分子，包括但不限于包括两条分开的链即有义链和反义链的双链寡核苷酸，例如小干扰RNA(siRNA)；包括通过非核苷酸接头连接在一起的两条分开的链的双链寡核苷酸；包括形成双链区的互补序列的发夹环的寡核苷酸，例如shRNAi分子，以及表达一种或多种多核苷酸的表达载体，该一种或多种多核苷酸能够单独或与另一种多核苷酸组合形成双链多核苷酸。

如本文所用，“单链siRNA化合物”是由单个分子组成的siRNA化合物。它可包括由链内配对形成的双链体区，例如，它可以是或包括发夹或盘柄结构。单链siRNA化合物对于靶分子可以是反义的。

单链siRNA化合物可以足够长以使其能够进入RISC并参与RISC介导的靶mRNA的切割。单链siRNA化合物的长度是至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40或至多约50个核苷酸。单链siRNA的长度小于约200、约100或约60个核苷酸。

发夹siRNA化合物可具有等于或至少约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个核苷酸对的双链体区。双链体区的长度可等于或小于约200、约100或约50个核苷酸对。双链体区的长度范围是约15至约30、约17至约23、约19至约23和约19至约21个核苷酸对。发夹可具有单链突出端或末端未配对区。突出端的长度可以是约2至约3个核苷酸。突出端可在发夹的有义侧或在发夹的反义侧。

如本文所用，“双链siRNA化合物”是包括多于一条并且在一些情况下两条链的siRNA化合物，其中链间杂交可形成双链体结构的区域。

双链siRNA化合物的反义链的长度可等于或至少约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约25、约30、约40或约60个核苷酸。其长度可等于或小于约200、约100或约50个核苷酸。长度范围可以是约17至约25、约19至约23、和约19至约21个核苷酸。如本文所用，术语“反义链”意指与靶分子(例如靶RNA)充分互补的siRNA化合物的链。

双链siRNA化合物的有义链的长度可等于或至少约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约25、约30、约40或约60个核苷酸。其长度可等于或小于约200、约100或约50个核苷酸。长度范围可以是约17至约25、约19至约23、和约19至约21个核苷酸。

双链siRNA化合物的双链部分的长度可等于或至少约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约30、约40或约60个核苷酸对，其长度可等于或小于约200、约100或约50个核苷酸对。长度范围可以是约15至约30、约17至约23、约19至约23和约19至约21个核苷酸对。

siRNA化合物可足够大以使其能够被内源分子(例如，被Dicer)切割，以产生较小的siRNA化合物，例如siRNA剂。

可选择有义链和反义链，使得双链siRNA化合物在分子的一端或两端包含单链或未配对区。因此，双链siRNA化合物可含有配对的有义链和反义链以含有突出端，例如一个或两个5'或3'突出端，或1至3个核苷酸的3'突出端。突出端可以是一条链比另一条链长的结果，或者是相同长度的两条链交错的结果。一些实施方案将具有至少一个3'突出端。在实施方案中，siRNA分子的两端将具有3'突出端。突出端可以是2个核苷酸。

双链体区的长度可以是约15至约30、或约18、约19、约20、约21、约22或约23个核苷酸长度，例如，在以上讨论的ssiRNA(具有粘性突出端的siRNA)化合物范围内。ssiRNA化合物可在长度和结构上类似于来自长dsiRNA的天然Dicer加工产物。还包括其中ssiRNA化合物的两条链连接(例如共价连接)的实施方案。包括发夹或提供双链区的其他单链结构和3'突出端。

本文所述的siRNA化合物(包括双链siRNA化合物和单链siRNA化合物)可介导靶RNA(例如mRNA，例如编码蛋白质的基因的转录物)的沉默。为方便起见，此类mRNA在本文中也称为待沉默的mRNA。此类基因也被称为靶基因。通常，待沉默的RNA是内源基因。

如本文所用，短语“介导RNAi”是指以序列特异性方式沉默靶RNA的能力。尽管不希望受理论束缚，但据信沉默使用RNAi机制或方法和引导RNA，例如约21至约23个核苷酸的ssiRNA化合物。

与靶RNA(例如靶mRNA)“充分互补”的siRNA化合物可沉默由靶mRNA编码的蛋白质的产生。与编码感兴趣的蛋白质的RNA“充分互补”的siRNA化合物可沉默由mRNA编码的感兴趣的蛋白质的产生。siRNA化合物可与靶RNA“精确互补”，例如靶RNA和siRNA化合物退火，例如在精确互补区域中形成仅由沃森-克里克碱基对组成的杂交体。“充分互补”的靶RNA可包括与靶RNA精确互补的内部区域(例如，至少约10个核苷酸)。在实施方案中，siRNA化合物特异性区分单核苷酸差异。在这种情况下，如果在单核苷酸差异的区域(例如，在7个核苷酸内)发现精确互补，则siRNA化合物仅介导RNAi。

微小RNA

治疗性部分可以是微小RNA分子。微小RNA(miRNA)是一类高度保守的小RNA分子，其从植物和动物基因组中的DNA转录，但不翻译成蛋白质。经加工的miRNA是单链17-25个核苷酸(nt)的RNA分子，其被整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中并且已被鉴定为发育、细胞增殖、凋亡和分化的关键调节因子。据信它们通过与特定mRNA的‘he 3'-非翻译区结合而在基因表达的调节中发挥作用。RISC通过翻译抑制、转录切割或两者介导基因表达的下调。RISC还与多种真核生物细胞核中的转录沉默有关。

Antagomir

治疗性部分可以是antagomir。Antagomir是RNA样寡核苷酸，其具有针对RNA酶保护和药理学特性(诸如增强的组织和细胞摄取)的各种修饰。它们与正常RNA的不同之处在于例如糖、硫代磷酸酯主链和例如3'-端的胆固醇部分的完全2'-0-甲基化。Antagomir可用于通过形成包括antagomir和内源miRNA的双链体来有效地沉默内源miRNA，从而防止miRNA诱导的基因沉默。antagomir-介导的miRNA沉默的一个示例是miR-122的沉默，描述于Krutzfeldt等人,Nature,2005,438:685-689中，其全文以引用方式明确并入本文。Antagomir RNA可使用标准固相寡核苷酸合成方案合成。参见美国专利申请序列号11/502,158和11/657,341(其各自的公开内容以引用方式并入本文)。

antagomir可包括配体缀合的单体亚基和用于寡核苷酸合成的单体。单体描述于2004年8月10日提交的美国申请号10/916,185中。antagomir可具有ZXY结构，诸如在2004年3月8日提交的PCT申请号PCT/US2004/07070中所述。antagomir可与两亲性部分复合。与寡核苷酸剂一起使用的两亲性部分描述于2004年3月8日提交的PCT申请号PCT/US2004/07070中。

适体

治疗性部分可以是适体。适体是以高亲和力和特异性与感兴趣的特定分子结合的核酸或肽分子(Tuerk和Gold,Science 249:505(1990)；Ellington和Szostak,Nature 346:818(1990))。已成功生产了结合从大蛋白质到小有机分子的许多不同实体的DNA或RNA适体。参见Eaton,Curr.Opin.Chem.Biol.1:10-16(1997)，Famulok,Curr.Opin.Struct.Biol.9:324-9(1999)，以及Hermann和Patel,Science 287:820-5(2000)。适体可以是基于RNA或DNA的，并且可包括核开关。核开关是可直接结合小靶分子的mRNA分子的一部分，并且其与靶的结合影响基因的活性。因此，含有核开关的mRNA直接参与调节其自身的活性，这取决于其靶分子的存在与否。通常，通过重复几轮的体外选择或等效的SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)来工程化适体以结合多种分子靶标，诸如小分子、蛋白质、核酸，以及甚至细胞、组织和生物体。适体可通过任何已知方法制备，包括合成、重组和纯化方法，并且可单独使用或与对相同靶标特异性的其他适体组合使用。此外，术语“适体”还包括含有共有序列的“二级适体”，该共有序列源自将两种或更多种已知适体与给定靶标进行比较。适体可以是“细胞内适体”，或“intramer”，其特异性识别细胞内靶标。参见Famulok等人,Chem Biol.2001年10月,8(10):931-939；Yoon和Rossi,Adv Drug DelivRev.2018年9月,134:22-35，各自以引用方式并入本文。

核酶

治疗性部分可以是核酶。核酶是具有特定催化结构域的RNA分子复合物，其具有核酸内切酶活性(Kim和Cech,Proc Natl Acad Sci U S A.1987年12月；84(24):8788-92；Forster和Symons,Cell.1987年4月24日；49(2):211-20)。例如，大量核酶以高度特异性加速磷酸酯转移反应，通常仅切割寡核苷酸底物中的几种磷酸酯中的一种(Cech等人,Cell.1981年12月；27(3Pt2):487-96；Michel和Westhof,J Mol Biol.1990年12月5日；216(3):585-610；Reinhold-Hurek和Shub,Nature.1992年5月14日；357(6374):173-6)。这种特异性归因于需要底物在化学反应前经由特异性碱基配对相互作用与核酶的内部引导序列(“IGS”)结合。

目前已知至少六种基本种类的天然存在的酶促RNA。在生理条件下，每一种都可反式催化RNA磷酸二酯键的水解(并因此可切割其他RNA分子)，通常，酶促核酸通过首先与靶RNA结合来起作用。此类结合通过酶促核酸的靶结合部分发生，该靶结合部分保持紧密接近于用于切割靶RNA的分子的酶促部分。因此，酶促核酸首先识别、然后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦结合到正确的位点，就起到酶促作用以切割靶RNA。此类靶RNA的策略性切割将破坏其指导编码蛋白合成的能力。在酶促核酸已结合并切割其RNA靶标后，其从该RNA中释放以寻找另一个靶标并且可重复地结合并切割新的靶标。

例如，酶促核酸分子可在锤头、发夹、δ型肝炎病毒、I组内含子或RNaseP RNA(与RNA引导序列结合)或脉孢菌属VS RNA基序中形成。锤头基序的具体示例由Rossi等人Nucleic Acids Res.1992年9月11月；20(17):4559-65描述。发夹基序的示例由以下文献描述：Hampel等人(欧洲专利申请公开号EP 0360257)；Hampel和Tritz,Biochemistry 1989年6月13日；28(12):4929-33；Hampel等人,Nucleic Acids Res.1990年1月25日；18(2):299-304和美国专利5631359。肝炎病毒基序的示例由Perrotta和Been,Biochemistry.1992年12月1日；31(47):11843-52描述；RNaseP基序的示例由Guerrier-Takada等人,Cell.1983年12月；35(3Pt 2):849-57描述；脉孢菌属VS RNA核酶基序由Collins(Saville和Collins,Cell.1990年5月18日；61(4):685-96；Saville和Collins,Proc Natl Acad Sci U SA.1991年10月1日；88(19):8826-30；Collins和Olive,Biochemistry.1993年3月23日；32(ll):2795-9)描述；并且I族内含子的示例描述于美国专利4,987,071中。酶促核苷酸分子可具有与一个或多个靶基因DNA或RNA区域互补的特异性底物结合位点，并且它们在该底物结合位点内或周围具有赋予该分子RNA切割活性的核苷酸序列。因此，核酶构建体不需要限于本文提到的特定基序。

产生靶向多核苷酸序列的核酶的方法是本领域已知的。核酶可如国际专利申请公开号WO 93/23569和国际专利申请公开号WO 94/02595中所述进行设计，各自特别地以引入方式本文，并且如其中所述合成用于体外和体内测试。

核酶活性可通过改变核酶结合臂的长度或化学合成具有以下修饰的核酶来增加：防止其被血清核糖核酸酶降解的修饰(参见例如国际专利申请公开号WO 92/07065；国际专利申请公开号WO 93/15187；国际专利申请公开号WO 91/03162；欧洲专利申请公开号92110298.4；美国专利5334711；和国际专利申请公开号WO 94/13688，其描述了可对酶促RNA分子的糖部分进行的各种化学修饰)，增强其在细胞中的功效以及去除茎∏碱基以缩短RNA合成时间并降低化学需求的修饰。

免疫刺激性寡核苷酸

治疗性部分可以是免疫刺激性寡核苷酸。当施用于患者(可以是哺乳动物或其他患者)时，免疫刺激性寡核苷酸(ISS；单链或双链)能够诱导免疫应答。ISS包括例如导致发夹二级结构的某些回文结构(参见Yamamoto S.等人(1992)J.Immunol.148:4072-4076)，或CpG基序，以及其他已知的ISS特征(诸如多G结构域，参见WO 96/11266)。

免疫应答可以是先天性或适应性免疫应答。免疫系统分为更先天的免疫系统和脊椎动物的获得性适应性免疫系统，后者进一步分为体液细胞组分。免疫应答可以是粘膜的。

当不需要免疫刺激性核酸特异性结合靶多核苷酸并降低其表达以激发免疫应答时，认为免疫刺激性核酸是非序列特异性的。因此，某些免疫刺激性核酸可包括对应于天然存在的基因或mRNA的区域的序列，但它们仍可被认为是非序列特异性免疫刺激性核酸。

免疫刺激性核酸或寡核苷酸可包括至少一个CpG二核苷酸。寡核苷酸或CpG二核苷酸可以是非甲基化的或甲基化的。免疫刺激性核酸可包括至少一种具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。核酸可包括单个CpG二核苷酸，其中所述CpG二核苷酸中的胞嘧啶是甲基化的。核苷酸可包括序列5'TAACGTTGAGGG’CAT 3'。核酸可包括至少两个CpG二核苷酸，其中CpG二核苷酸中的至少一个胞嘧啶是甲基化的。存在于序列中的CpG二核苷酸中的每个胞嘧啶可被甲基化。核酸可包括多个CpG二核苷酸，其中所述CpG二核苷酸中的至少一者包括甲基化的胞嘧啶。

适用于组合物和方法的寡核苷酸(ODN)的其他特定核酸序列描述于Raney等人,Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,298:1185-1192(2001)中。组合物和方法中使用的ODN可具有磷酸二酯(“PO”)主链或硫代磷酸酯(“PS”)主链，和/或CpG基序中的至少一个甲基化胞嘧啶残基。

诱饵寡核苷酸

治疗性部分可以是诱饵寡核苷酸。因为转录因子识别它们相对短的结合序列，甚至在周围基因组DNA不存在的情况下，携带特定转录因子的共有结合序列的短寡核苷酸可用作操纵活细胞中基因表达的工具。该策略涉及此类“诱饵寡核苷酸”的细胞内递送，其然后被靶因子识别并结合。诱饵占据转录因子的DNA结合位点使得转录因子随后不能与靶基因的启动子区域结合。诱饵可用作治疗剂，以抑制由转录因子激活的基因的表达，或上调被转录因子的结合抑制的基因。利用诱饵寡核苷酸的示例可见于Mann等人,J.Clin.Invest,2000,106:1071-1075中，其全文以引用方式明确并入本文。

Supermir

治疗性部分可以是supermir。supermir是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或两者或其修饰物的单链、双链或部分双链寡聚体或多聚体，其具有与miRNA基本上相同的核苷酸序列并且相对于其靶标而言是反义的，该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)连接组成的寡核苷酸，并且其含有至少一个功能类似的非天然存在的部分。此类经修饰或经取代的寡核苷酸具有期望的特性，诸如例如增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性。supermir可不包括有义链。supermir可不以显著程度自杂交。supermir可具有二级结构，但其在生理条件下基本上是单链的。基本上为单链的supermir是单链的，其程度为小于约50％(例如，小于约40％、约30％、约20％、约10％或约5％)的supermir与其自身双链体化。supermir可包括发夹片段，例如序列，例如在3'端可自杂交并形成双链体区，例如至少约1、约2、约3或约4或小于约8、约7、约6或约5个核苷酸或约5个核苷酸的双链体区。双链体区可通过接头连接，例如核苷酸接头，例如约3、约4、约5或约6个dT，例如经修饰的dT。supermir可与例如长度为约5、约6、约7、约8、约9或约10个核苷酸的较短寡核苷酸(例如在supermir的3'和5'端之一或两者处或者在一端和非末端或中间)双链体化。

miRNA模拟物

治疗性部分可以是miRNA模拟物。miRNA模拟物代表一类可用于模拟一种或多种miRNA的基因沉默能力的分子。因此，术语“微小RNA模拟物”是指能够进入RNAi途径并调节基因表达的合成非编码RNA(即，miRNA不是通过从内源miRNA的来源纯化获得的)。miRNA模拟物可被设计为成熟分子(例如单链)或模拟前体(例如初级或前miRNA)。miRNA模拟物可包括核酸(经修饰或经修饰的核酸)，包括寡核苷酸，其包括但不限于RNA、经修饰的RNA、DNA、经修饰的DNA、锁定核酸、或2'-0,4'-C-乙烯桥联核酸(ENA)、或上述的任何组合(包括DNA-RNA杂交体)。此外，miRNA模拟物可包括能够影响递送、细胞内区室化、稳定性、特异性、功能性、链使用和/或效力的缀合物。在一个设计中，miRNA模拟物是双链分子(例如，具有长度在约16与约31个核苷酸之间的双链体区)并且含有与给定miRNA的成熟链具有同一性的一个或多个序列。修饰可包括在分子的一条或两条链上的2’修饰(包括2’-0甲基修饰和2'F修饰)和增强核酸稳定性和/或特异性的核苷酸间修饰(例如硫代磷酸酯修饰)。此外，miRNA模拟物可包含突出端。突出端可在任一条链的3'或5'端包含约1至约6个核苷酸，并且可被修饰以增强稳定性或功能性。miRNA模拟物可包含约16至约31个核苷酸的双链体区和以下化学修饰模式中的一者或多者：有义链含有核苷酸1和2的2'-0-甲基修饰(从有义寡核苷酸的5'端计数)，以及所有Cs和Us；反义链修饰可包括所有Cs和Us的2'F修饰、寡核苷酸5'端的磷酸化、以及与2个核苷酸3'突出端相关的稳定化核苷酸间连接。

miRNA抑制剂

治疗性部分可以是miRNA抑制剂。术语“antimir”、“微小RNA抑制剂”、“miR抑制剂”或“miRNA抑制剂”是同义的，并且是指干扰特定miRNA能力的寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸。通常，抑制剂本质上是核酸或经修饰的核酸，包括寡核苷酸，其包括RNA、经修饰的RNA、DNA、经修饰的DNA、锁定核酸(LNA)或上述的任何组合。

修饰包括能够影响递送、稳定性、特异性、细胞内区室化或效力的2'修饰(包括2'-0烷基修饰和2'F修饰)和核苷酸间修饰(例如硫代磷酸酯修饰)。此外，miRNA抑制剂可包括能够影响递送、细胞内区室化、稳定性和/或效力的缀合物。抑制剂可采用多种构型，包括单链、双链(RNA/RNA或RNA/DNA双链体)和发夹设计，通常，微小RNA抑制剂包括与待靶向的miRNA的成熟链(或多条链)互补或部分互补的一个或多个序列或序列的部分，此外，miRNA抑制剂还可包括位于成熟miRNA的反向互补序列的5'和3'处的附加序列。附加序列可以是成熟miRNA所来源的初级miRNA中与成熟miRNA相邻的序列的反向互补序列，或者附加序列可以是任意序列(具有A、G、C或U的混合物)。附加序列中的一者或两者可以是能够形成发夹的任意序列。作为miRNA的反向互补的序列可在5'侧和3'侧侧接发夹结构。当是双链时，微小RNA抑制剂可包括相反链上的核苷酸之间的错配。此外，可将微小RNA抑制剂连接到缀合部分以促进抑制剂摄入细胞中。例如，微小RNA抑制剂可与5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-3羟基戊基氨基甲酸胆固醇酯连接，这允许微小RNA抑制剂被动摄入细胞内。微小RNA抑制剂，包括发夹miRNA抑制剂，详细描述于Vermeulen等人,“Double-Stranded RegionsAre Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function,”RNA13:723-730(2007)以及WO2007/095387和WO 2008/036825中，其各自全文以引用方式并入本文。本领域普通技术人员可从数据库中选择期望miRNA的序列并设计可用于本文公开的方法的抑制剂。

反义化合物(AC)

治疗性部分包括能够改变靶基因的翻译或表达的一个或多个方面的反义化合物(AC)。反义技术背后的原理是，与靶核酸杂交的反义化合物通过许多反义机理中的一种来调节基因表达活性，诸如翻译。反义技术是用于改变一种或多种特定基因产物表达的有效手段，并且因此可证明在许多治疗、诊断和研究应用中是有用的。

本文所述的化合物可含有一个或多个不对称中心，并且因此产生对映体、非对映体和其他立体异构构型，这些构型可根据绝对立体化学定义为(R)或(S)、α或β、或(D)或(L)。本文提供的反义化合物包括所有这些可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。

反义化合物杂交位点

反义机理依赖于反义化合物与靶核酸的杂交。

AC可与长度为约5至约50个核酸的序列杂交，该长度也可称为AC的长度。AC的长度可以是约5至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、约25至约30、约30至约35、约35至约40、约40至约45或约45至约50个核酸。AC的长度可以是约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49或约50个核酸。AC的长度可以是约10个核酸。AC的长度可以是约15个核酸。AC的长度可以是约20个核酸。AC的长度可以是约25个核酸。AC的长度可以是约30个核酸。

AC可与靶核酸序列小于约100％互补。如本文所用，术语“互补百分比”是指与寡聚化合物或核酸的对应核碱基具有核碱基互补性的AC的核碱基数量除以AC的总长度(核碱基数量)。本领域技术人员认识到，在不消除反义化合物活性的情况下，包含错配是可能的。AC可含有多达约20％的核苷酸，其破坏AC与靶核酸的碱基配对。AC可含有不超过约15％、不超过约10％、不超过5％的错配或无错配。AC可与靶核酸至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％互补。通过将互补核碱基的数量除以寡核苷酸的核碱基总数来计算寡核苷酸的互补性百分比。寡核苷酸区域的互补性百分比通过将该区域中互补核碱基的数量除以核碱基区域的总数来计算。

与未修饰的化合物相比，掺入核苷酸亲和力修饰可允许更大数量的错配。类似地，某些寡核苷酸序列可比其他寡核苷酸序列更耐受错配。本领域普通技术人员能够确定寡核苷酸之间或寡核苷酸与靶核酸之间的适当数量的错配，诸如通过确定解链温度(Tm)。Tm或ΔTm可通过本领域普通技术人员熟悉的技术来计算。例如，Freier等人(Nucleic AcidsResearch,1997,25,22:4429-4443)描述的技术允许本领域普通技术人员评价核苷酸修饰提高RNA:DNA双链体解链温度的能力。

反义机理

根据本公开的AC可调节蛋白质转录、翻译和表达的一个或多个方面。

AC可通过空间阻断来调节转录、翻译或蛋白质表达。以下综述文章描述了空间阻断的机理及其应用，并且其全文以引用方式并入本文：Roberts等人Nature Reviews DrugDiscovery(2020)19:673-694。

反义机理通过反义化合物与靶核酸的杂交起作用。AC可与其靶序列杂交并下调靶蛋白的表达。AC可与其靶序列杂交以下调一种或多种靶蛋白异构体的表达。AC可与其靶序列杂交以上调靶蛋白的表达。AC可与其靶序列杂交以增加一种或多种靶蛋白异构体的表达。

AC的功效可通过评价由其施用所影响的反义活性来评估。如本文所用，术语“反义活性”是指可归因于反义化合物与其靶核酸杂交的任何可检测和/或可测量的活性。此类检测和/或测量可以是直接或间接的。在实施方案中，反义活性通过检测和/或测量靶蛋白的量来评估。反义活性可通过检测和/或测量靶核酸的量来评估。

反义化合物设计

根据本公开的AC的设计将取决于所靶向的序列。将AC靶向特定的靶核酸分子可以是多步骤过程。该过程通常从靶核酸的鉴定开始，该靶核酸的表达将被调节。如本文所用，术语“靶核酸”和“编码靶基因的核酸”包括编码所选择的靶基因的DNA、从此类DNA转录的RNA(包括前mRNA和mRNA)以及从此类RNA衍生的cDNA。

本领域技术人员将能够设计、合成和筛选不同核碱基序列的反义化合物，以鉴定产生反义活性的序列。例如，可设计抑制靶蛋白表达的反义化合物。用于设计、合成和筛选针对预选靶核酸的反义活性的反义化合物的方法可见于例如由Stanley T.Crooke编辑的“Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications”,CRC Press,Boca Raton,Florida，其全文以引用方式并入用于所有目的。

提供了包含约8至约30个连接核苷的反义化合物。反义化合物可包含经修饰的核苷、经修饰的核苷间连接和/或缀合基团。

反义化合物可以是“三环-DNA(tc-DNA)”，其是指一类受约束的DNA类似物，其中每个核苷酸通过引入环丙烷环而被修饰以限制主链的构象柔性并且增强扭转角γ的主链几何形状。含同碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶的tc-DNA与互补的RNA形成非常稳定的A-T碱基对。

核苷

反义化合物可包含连接核苷。一些或所有的核苷可以是经修饰的核苷。一个或多个核苷可包含经修饰的核碱基。一个或多个核苷可包含经修饰的糖。经化学修饰的核苷通常用于掺入反义化合物中以增强一种或多种特性，诸如核酸酶抗性、药代动力学或对靶RNA的亲和力。核苷的非限制性示例提供于Khvorova等人Nature Biotechnology(2017)35:238-248中，其全文以引用方式并入本文。

通常，核碱基是含有能够与另一核酸的碱基氢键合的一个或多个原子或原子团的任何基团。除了“未修饰的”或“天然的”核碱基诸如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)外，本领域技术人员已知的许多经修饰的核碱基或核碱基模拟物也适用于本文所述的化合物。术语经修饰的核碱基和核碱基模拟物可重叠，但通常经修饰的核碱基是指在结构上与亲本核碱基相当类似的核碱基，诸如例如7-脱氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶或G-钳，而核碱基模拟物将包括更复杂的结构，诸如例如三环吩噁嗪核碱基模拟物。用于制备上述经修饰的核碱基的方法是本领域技术人员熟知的。

AC可包括一个或多个具有经修饰的糖部分的核苷。天然核苷的呋喃糖基糖环可以多种方式被修饰，包括但不限于添加取代基、桥接两个非偕环原子以形成双环核酸(BNA)以及用原子或基团诸如-S-、-N(R)-或-C(R1)(R2)取代4'-位的环氧。经修饰的糖部分是众所周知的，并且可用于改变(通常是增加)反义化合物对其靶标的亲和力和/或增加核酸酶抗性。经修饰的糖的代表性列表包括但不限于非双环取代的糖，尤其是具有2'-F、2'-OCH3或2'-O(CH2)2-OCH3取代基的非双环2'-取代的糖；和4’-硫代修饰的糖。糖也可用糖模拟基团等替换。用于制备经修饰的糖的方法是本领域技术人员熟知的。一些教导制备此类经修饰的糖的代表性专利和出版物包括但不限于美国专利：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920；和6,600,032；以及WO 2005/121371.

核苷可包括双环修饰的糖(BNA)，包括LNA(4'-(CH2)-O-2'桥)、2'-硫代-LNA(4'-(CH2)-S-2'桥)、2'-氨基-LNA(4'-(CH2)-NR-2'桥)、ENA(4'-(CH2)2-O-2'桥)、4'-(CH2)3-2'桥接的BNA、4'-(CH2CH(CH3))-2'桥接的BNA"cEt(4'-(CH(CH3)-O-2'桥)和cMOE BNA(4'-(CH(CH2OCH3)-O-2'桥)。在专利文献以及科学文献中已制备并公开了某些此类BNA(参见例如Srivastava等人J.Am.Chem.Soc.2007,ACS Advanced online publication,10.1021/ja071106y，Albaek等人J.Org.Chem.,2006,71,7731 -7740，Fluiter等人Chembiochem2005,6,1104-1109，Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；WO 94/14226；WO2005/021570；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039，WO 2007/090071；公开BNA的已发布美国专利和已公布申请的示例包括例如美国专利号7053207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；和6,525,191；以及美国授权前公开号2004-0171570；2004-0219565；2004-0014959；2003-0207841；2004-0143114；和20030082807。

本文还提供了“锁定核酸”(LNA)，其中核糖基糖环的2'-羟基连接到糖环的4'碳原子，从而形成2'-C,4'-C-氧亚甲基连接以形成双环糖部分(综述于Elayadi等人,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol.,2001,8 1-7；和Orum等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；还参见美国专利：6,268,490和6,670,461)。该连接可以是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，为此术语LNA用于双环部分；在该位置上为亚乙基的情况下，使用术语ENA^TM(Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；ENA^TM：Morita等人,Bioorganic Medicinal Chemistry,2003,11,2211-2226)。LNA和其他双环糖类似物显示出与互补DNA和RNA的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、对3'-外切核苷酸降解的稳定性和良好的溶解性。含有LNA的有效且无毒的反义寡核苷酸已有描述(Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638)。

也已研究的LNA异构体是α-L-LNA，其已显示对3'-外切核酸酶具有优异的稳定性。将α-L-LNA掺入显示有效反义活性的反义gapmer和嵌合体中(Frieden等人,Nucleic AcidsResearch,2003,21,6365-6372)。

LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备以及它们的寡聚化和核酸识别特性已有描述(Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。LNA及其制备也描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。

还制备了LNA的类似物，硫代磷酸-LNA和2'-硫代-LNA(Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。含有寡脱氧核糖核苷酸双链体作为核酸聚合酶底物的锁定核苷类似物的制备也已有描述(Wengel等人，WO 99/14226)。此外，一种新的构象受限的高亲和力寡核苷酸类似物2'-氨基-LNA的合成已在本领域中描述(Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，已制备了2’-氨基-LNA和2'-甲基氨基-LNA，并且先前已报道了它们与互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。

核苷间连接

本文描述了核苷间连接基团，其将核苷或另外经修饰的单体单元连接在一起，从而形成反义化合物。核苷间连接基团的两个主要类别通过磷原子的存在或不存在来定义。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。代表性的不含磷的核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫代氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)；和N,N'-二甲肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。具有非磷核苷间连接基团的反义化合物称为寡核苷。与天然磷酸二酯连接相比，经修饰的核苷间连接可用于改变(通常增加)反义化合物的核酸酶抗性。具有手性原子的核苷间连接可被制备成外消旋的、手性的或作为混合物。代表性的手性核苷间连接包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。含磷和不含磷的连接的制备方法是本领域技术人员熟知的。

磷酸基团可连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸时，磷酸基团将相邻核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。在寡核苷酸内，磷酸基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常连接或主链是3'至5'磷酸二酯连接。

缀合基团

可通过一个或多个缀合基团的共价附接来修饰货物。通常，缀合基团修饰货物的一种或多种特性，包括但不限于药效学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。缀合基团在化学领域中是常规使用的，并且直接地或经由任选的连接部分或连接基团连接到亲本化合物。缀合基团包括但不限于嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。缀合基团可包括聚乙二醇(PEG)。PEG可与货物或cCPP缀合。货物可包括肽、寡核苷酸或小分子。

缀合基团可包括脂质部分，诸如胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)；胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765)；硫胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.,1992,20,533)；脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.,1991,10,111；Kabanov等人,FEBSLett.,1990,259,327；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75,49)；磷脂，例如二十六烷基外消旋甘油或三乙基铵-1,2-二-O-十六烷基外消旋甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969)；金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651)；棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)；或十八胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923)。

连接基团或双官能连接部分诸如本领域已知的那些适用于本文提供的化合物。连接基团可用于将化学官能团、缀合基团、报道基团和其他基团连接到亲本化合物(诸如例如AC)的选择性位点。通常，双官能连接部分包括具有两个官能团的烃基部分。选择官能团中的一者与感兴趣的亲本分子或化合物结合，并且选择另一者与基本上任何选择的基团诸如化学官能团或缀合基团结合。可使用本文所述的任何接头。接头可包括重复单元诸如乙二醇或氨基酸单元的链结构或低聚物。在双官能连接部分中常规使用的官能团的示例包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电体和用于与亲电基团反应的亲核体。双官能连接部分可包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和度(例如双键或三键)等。双官能连接部分的一些非限制性示例包括8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其他连接基团包括但不限于取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C₂-C₁₀烯基或取代或未取代的C₂-C₁₀炔基，其中取代基基团的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。

AC的长度可以是约5至约50个核苷酸。AC的长度可以是约5至约10个核苷酸。AC的长度可以是约10至约15个核苷酸。AC的长度可以是约15至约20个核苷酸。AC的长度可以是约20至约25个核苷酸。AC的长度可以是约25至约30个核苷酸。AC的长度可以是约30至约35个核苷酸。AC的长度可以是约35至约40个核苷酸。AC的长度可以是约40至约45个核苷酸。AC的长度可以是约45至约50个核苷酸。

成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)基因编辑机制

这些化合物可包括与CRISPR基因编辑机制缀合的一种或多种cCPP(或cCPP)。如本文所用，“CRISPR基因编辑机制”是指可用于编辑基因组的蛋白质、核酸或它们的组合。基因编辑机制的非限制性示例包括gRNA、核酸酶、核酸酶抑制剂以及它们的组合和复合物。以下专利文献描述了CRISPR基因编辑机制：美国专利号8,697,359、美国专利号8,771,945、美国专利号8,795,965、美国专利号8,865,406、美国专利号8,871,445、美国专利号8,889,356、美国专利号8,895,308、美国专利号8,906,616、美国专利号8,932,814、美国专利号8,945,839、美国专利号8,993,233、美国专利号8,999,641、美国专利申请号14/704,551和美国专利申请号13/842,859。上述专利文献各自全文以引用方式并入。

接头可将cCPP与CRISPR基因编辑机制缀合。可利用本公开中描述的或本领域技术人员已知的任何接头。

gRNA

该化合物可包括与gRNA缀合的cCPP。gRNA靶向原核或真核细胞中的基因组基因座。

gRNA可以是单分子引导RNA(sgRNA)。sgRNA包括间隔序列和支架序列。间隔序列是用于将核酸酶(例如，Cas9核酸酶)靶向至感兴趣的特定核苷酸区域(例如，待切割的基因组DNA序列)的短核酸序列。间隔区的长度可以是约17-24个碱基对，诸如长度约20个碱基对。间隔区的长度可以是约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个碱基对。间隔区的长度可以是至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个碱基对。间隔区的长度可以是约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个碱基对。间隔序列可具有在约40％至约80％之间的GC含量。

间隔区可靶向紧邻5'原间隔区相邻基序(PAM)之前的位点。可基于期望的核酸酶选择PAM序列。例如，PAM序列可以是下表中所示的PAM序列中的任何一种，其中N是指任何核酸，R是指A或G，Y是指C或T，W是指A或T，并且V是指A或C或G。

表8

PAM序列(5'至3')	核酸酶	分离自
			NGG	SpCas9	酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
NGRRT或NGRRN	SaCas9	金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
			NNNNGATT	NmeCas9	脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
NNNNRYAC	CjCas9	空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
			NNAGAAW	StCas9	嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)
TTTV	LbCpf1	毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)
			TTTV	AsCpf1	氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)

间隔区可靶向哺乳动物基因诸如人基因的序列。间隔区可靶向突变基因。间隔区可靶向编码序列。

支架序列是sgRNA内负责核酸酶(例如，Cas9)结合的序列。支架序列不包括间隔/靶向序列。在实施方案中，支架的长度可以是约1至约10、约10至约20、约20至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约60、约60至约70、约70至约80、约80至约90、约90至约100、约100至约110、约110至约120或约120至约130个核苷酸。支架的长度可以是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60，约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100、约101、约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约110、约111、约112、约113、约114、约115、约116、约117、约118、约119、约120、约121、约122、约123、约124、或约125个核苷酸。支架的长度可以是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120或至少125个核苷酸。

gRNA可以是双分子引导RNA，例如crRNA和tracrRNA。gRNA还可包括聚A尾部。

化合物包括与包含gRNA的核酸缀合的cCPP。核酸可包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个gRNA。gRNA可识别相同的靶标。gRNA可识别不同的靶标。包含gRNA的核酸包含编码启动子的序列，其中启动子驱动gRNA的表达。

核酸酶

这些化合物可包括与核酸酶缀合的环状细胞穿透肽(cCPP)。核酸酶可以是II型、V-A型、V-B型、VC型、V-U型或VI-B型核酸酶。核酸酶可以是转录、类激活因子效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或锌指核酸酶。核酸酶可以是Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Tnp-B样、Cas13a(C2c2)、Cas13b或Cas14核酸酶。核酸酶可以是Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。

核酸酶可以是Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Tnp-B样、Cas13a(C2c2)、Cas13b或Cas14核酸酶的修饰形式或变体。核酸酶可以是TAL核酸酶、大范围核酸酶或锌指核酸酶的修饰形式或变体。“修饰的”或“变体”核酸酶是例如截短的、与另一种蛋白质(诸如另一种核酸酶)融合的、催化失活的等核酸酶。核酸酶可与天然存在的Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Tnp-B样、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas14核酸酶或TALEN、大范围核酸酶或锌指核酸酶具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性。核酸酶可以是源自化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶(SpCas9)。核酸酶可与源自化脓性链球菌的Cas9核酸酶(SpCas9)具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。核酸酶可以是源自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的Cas9(SaCas9)。核酸酶可与源自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。Cpf1可以是来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus)(物种BV3L6，UniProt登记号U2UMQ6)的Cpf1酶。核酸酶可与来自氨基酸球菌属(物种BV3L6，UniProt登录号U2UMQ6)的Cpf1酶具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。

Cpf1可以是来自毛螺菌科(Lachnospiraceae)的Cpf1酶(物种ND2006，UniProt登录号A0A182DWE3)。核酸酶可与来自毛螺菌科的Cpf1酶具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。可对编码核酸酶的序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。可对编码核酸酶的序列进行密码子优化以在人细胞或小鼠细胞中表达。

该化合物可包括与核酸酶缀合的cCPP。核酸酶可以是可溶性蛋白质。

该化合物可包括与编码核酸酶的核酸缀合的cCPP。编码核酸酶的核酸可包括编码启动子的序列，其中启动子驱动核酸酶的表达。

gRNA和核酸酶组合

该化合物可包括与gRNA和核酸酶缀合的一个或多个cCPP。一个或多个cCPP可与编码gRNA和/或核酸酶的核酸缀合。编码核酸酶和gRNA的核酸可包括编码启动子的序列，其中启动子驱动核酸酶和gRNA的表达。编码核酸酶和gRNA的核酸可包括两个启动子，其中第一启动子控制核酸酶的表达，并且第二启动子控制gRNA的表达。编码gRNA和核酸酶的核酸可编码约1至约20个gRNA，或约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18或约19以及至多约20个gRNA。gRNA可识别不同的靶标。gRNA可识别相同的靶标。

这些化合物可包括与包含gRNA和核酸酶的核糖核蛋白(RNP)缀合的环状细胞穿透肽(或cCPP)。

可将组合物递送至细胞，该组合物包含：(a)与gRNA缀合的cCPP和(b)核酸酶。可将组合物递送至细胞，该组合物包含：(a)与核酸酶缀合的cCPP和(b)gRNA。

可将组合物递送至细胞，该组合物包含：(a)与gRNA缀合的第一cCPP和(b)与核酸酶缀合的第二cCPP。第一cCPP和第二cCPP可相同。第一cCPP和第二cCPP可不同。

感兴趣的遗传元件

该化合物可包括与感兴趣的遗传元件缀合的环状细胞穿透肽(cCPP)。感兴趣的遗传元件可替换被核酸酶切割的基因组DNA序列。感兴趣的遗传元件的非限制性示例包括基因、单核苷酸多态性、启动子或终止子。

核酸酶抑制剂

该化合物可包括与核酸酶抑制剂(例如Cas9抑制剂)缀合的环状细胞穿透肽(cCPP)。基因编辑的限制是潜在的脱靶编辑。核酸酶抑制剂的递送可限制脱靶编辑。核酸酶抑制剂可以是多肽、多核苷酸或小分子。核酸酶抑制剂描述于美国公开号2020/087354、国际公开号2018/085288、美国公开号2018/0382741、国际公开号2019/089761、国际公开号2020/068304、国际公开号2020/041384和国际公开号2019/076651中，其各自全文以引用方式并入本文。

治疗性多肽

抗体

治疗性部分可包括抗体或抗原结合片段。抗体和抗原结合片段可源自任何合适的来源，包括人、小鼠、骆驼科动物(例如，骆驼、羊驼、美洲驼)、大鼠、有蹄类动物或非人灵长类动物(例如，猴、恒河猴)。

术语“抗体”是指能够通过位于免疫球蛋白(Ig)分子的可变区中的至少一个表位识别位点结合特定靶标(诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质或多肽)的Ig分子。如本文所用，该术语包括完整的多克隆或单克隆抗体及其抗原结合片段。天然免疫球蛋白分子通常包括两条重链多肽和两条轻链多肽。重链多肽中的每一者借助于重链多肽和轻链多肽之间的链间二硫键与轻链多肽缔合以形成两个异二聚体蛋白质或多肽(即，由两条异源多肽链组成的蛋白质)。然后，这两个异二聚体蛋白质借助于重链多肽之间的附加链间二硫键缔合以形成免疫球蛋白蛋白质或多肽。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指含有免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个互补决定区(CDR)的多肽片段，其结合感兴趣抗原的至少一个表位。抗原结合片段可包含来自特异性结合靶分子的抗体的可变重链(VH)序列的1、2或3个CDR。抗原结合片段可包含来自特异性结合靶分子的抗体的可变轻链(VL)序列的1、2或3个CDR。抗原结合片段可包含来自特异性结合靶分子的抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列的1、2、3、4、5或全部6个CDR。抗原结合片段包括包含全长抗体的一部分(通常为其抗原结合区或可变区)的蛋白质，诸如Fab、F(ab’)2、Fab'、Fv片段、微抗体、双抗体、单结构域抗体(dAb)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体，以及可包含所需特异性的抗原结合位点或片段的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。

术语“F(ab)”是指由木瓜蛋白酶对IgG分子的蛋白水解切割产生的两个蛋白质片段。每个F(ab)可包含VH链和VL链的共价异二聚体，并且包括完整的抗原结合位点。每个F(ab)可以是单价抗原结合片段。术语“Fab’”是指衍生自F(ab’)2的片段，并且可含有Fc的小部分。每个Fab'片段可以是单价抗原结合片段。

术语“F(ab’)2”是指由胃蛋白酶的蛋白水解切割生成的IgG的蛋白质片段。每个F(ab’)2片段可包含两个F(ab’)片段并且因此可以是二价抗原结合片段。

“Fv片段”指非共价的VH::VL异二聚体，其包括保留天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点，但缺乏Fab内所含的CH1和CL结构域。Inbar等人(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69:2659-2662；Hochman等人(1976)Biochem 15:2706-2710；和Ehrlich等人(1980)Biochem19:4091-4096。

双特异性抗体(BsAb)是能够同时结合两种分开且独特的抗原(或同一抗原的不同表位)的抗体。治疗性部分可包括能够同时结合两种不同感兴趣的靶标的双特异性抗体。BsAb可重定向细胞毒性免疫效应细胞，以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和由效应细胞介导的其他细胞毒性机理来增强对肿瘤细胞的杀伤。

重组抗体工程已允许产生包含亲本单克隆抗体(mab)的可变重(VH)和轻(VL)结构域的重组双特异性抗体片段。非限制性示例包括scFv(单链可变片段)、BsDb(双特异性双抗体)、scBsDb(单链双特异性双抗体)、scBsTaFv(单链双特异性串联可变结构域)、DNL-(Fab)3(对接-锁定三价Fab)、sdAb(单结构域抗体)和BssdAb(双特异性单结构域抗体)。

具有Fc区的BsAb可用于执行Fc介导的效应子功能，诸如ADCC和CDC。它们具有正常IgG的半衰期。另一方面，没有Fc区的BsAb(双特异性片段)仅依赖于它们的抗原结合能力来实现治疗活性。由于它们的较小尺寸，这些片段具有更好的实体瘤穿透率。BsAb片段不需要糖基化，并且它们可在细菌细胞中产生。BsAb的大小、化合价、灵活性和半衰期适合应用。

使用重组DNA技术，双特异性IgG抗体可从在同一细胞系中表达的两条不同的重链和轻链组装。不同链的随机组装导致非功能性分子和不期望的HC同型二聚体的形成。为了解决这个问题，可将第二结合部分(例如，单链可变片段)融合到H或L链的N或C末端，从而产生对于每个抗原含有两个结合位点的四价BsAb。解决LC-HC错配和HC同二聚化的其他方法如下。

杵-臼BsAb IgG。通过将不同的突变引入两个CH3结构域来迫使H链异二聚化，从而产生不对称抗体。具体地，在一个HC中产生“杵”突变并且在另一个HC中产生“臼”突变，以促进异二聚化。

Ig-scFv融合体。将新的抗原结合部分直接添加至全长IgG产生具有四价的融合蛋白。示例包括IgG C-末端scFv融合体和IgG N-末端scFv融合体。

双抗体-Fc融合体。这涉及用双特异性双抗体(scFv的衍生物)替换IgG的Fab片段。

双重可变结构域IgG(DVD-IgG)。经由接头序列将具有一种特异性的IgG的VL和VH结构域分别与具有不同特异性的IgG的VL和VH的N-末端融合以形成DVD-IgG。

术语“双抗体”是指双特异性抗体，其中VH和VL结构域使用接头在单个多肽链中表达，该接头太短以至于不允许在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-48(1993)和Poljak等人,Structure 2:1121-23(1994))。双抗体可被设计成结合两种不同的抗原，并且是双特异性抗原结合构建体。

术语“纳米抗体”或“单结构域抗体”是指包含重链抗体的一个可变结构域(VH)的单个单体可变抗体结构域的抗原结合片段。它们具有优于传统单克隆抗体(mAb)的几个优点，包括更小的大小(15kD)、在还原性胞内环境中的稳定性、以及在细菌系统中易于产生(Schumacher等人,(2018)Nanobodies:Chemical Functionalization Strategies andIntracellular Applications.Angew.Chem.Int.Ed.57,2314；Siontorou,(2013)Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy.InternationalJournal of Nanomedicine,8,4215-27)。这些特征使得纳米抗体可修改以进行遗传和化学修饰(Schumacher等人,(2018)Nanobodies:Chemical Functionalization Strategiesand Intracellular Applications.Angew.Chem.Int.Ed.57,2314)，从而促进它们作为研究工具和治疗剂的应用(Bannas等人,(2017)Nanobodies and nanobody-based humanheavy chain antibodies as antitumor therapeutics.Frontiers in Immunology,8,1603)。在过去的十年中，纳米抗体已被用于蛋白质固定(Rothbauer等人,(2008)AVersatile Nanotrap for Biochemical and Functional Studies with FluorescentFusion Proteins.Mol.Cell.Proteomics,7,282-289)、成像(Traenkle等人,(2015)Monitoring Interactions and Dynamics of Endogenous Beta-catenin WithIntracellular Nanobodies in Living Cells.Mol.Cell.Proteomics,14,707-723)、蛋白质-蛋白质相互作用的检测(Herce等人,(2013)Visualization and targeted disruptionof protein interactions in living cells.Nat.Commun,4,2660；Massa等人,(2014)Site-Specific Labeling of Cysteine-Tagged Camelid Single-Domain Antibody-Fragments for Use in Molecular Imaging.Bioconjugate Chem,25,979-988)、以及作为大分子抑制剂(Truttmann等人,(2015)HypE-specific Nanobodies as Tools toModulate HypE-mediated Target AMPylation.J.Biol.Chem.290,9087–9100)。

治疗性部分可以是与感兴趣的靶标结合的抗原结合片段。与感兴趣的靶标结合的抗原结合片段可包括来自特异性结合感兴趣的靶标的抗体的可变重链(VH)序列的1、2或3个CDR。与感兴趣的靶标结合的抗原结合片段可包括来自特异性结合感兴趣的靶标的抗体的可变轻链(VL)序列的1、2或3个CDR。与感兴趣的靶标结合的抗原结合片段可包括来自特异性结合感兴趣的靶标的抗体的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)序列的1、2、3、4、5或全部6个CDR。与靶标结合的抗原结合片段可以是全长抗体的一部分，诸如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv片段、微抗体、双抗体、单结构域抗体(dAb)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体、或包括抗原结合位点或所需特异性片段的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。

治疗性部分可包括双特异性抗体。双特异性抗体(BsAb)是能够同时结合两种分开且独特的抗原(或同一抗原的不同表位)的抗体。

治疗性部分可包括“双抗体”。

治疗性部分可包括纳米抗体或单结构域抗体(其在本文中也可称为sdAb或VHH)。

治疗性部分可包括“微抗体”。微抗体(Mb)包括与抗原结合片段融合或连接的CH3结构域(例如，与scFv、结构域抗体等融合或连接的CH3结构域)。术语“Mb”可表示CH3单结构域。CH3结构域可表示微抗体。(S.Hu等人,Cancer Res.,56,3055-3061,1996)。参见例如Ward,E.S.等人,Nature 341,544-546(1989)；Bird等人,Science,242,423-426,1988；Huston等人,PNAS USA,85,5879-5883,1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,1993；Y.Reiter等人,Nature Biotech,14,1239-1245,1996；S.Hu等人,Cancer Res.,56,3055-3061,1996。

治疗性部分可包括“单体”。术语“单体”是指使用纤连蛋白III型结构域(FN3)作为分子支架构建的合成结合蛋白。

治疗性部分可以是抗体模拟物。抗体模拟物是像抗体一样可特异性结合抗原但在结构上不与抗体相关的化合物。它们通常是分子量为约3kD至20kD(与分子量为约150kDa的抗体相比)的人工肽或蛋白质。抗体模拟物的示例包括亲和体分子(在蛋白A的结构域的支架上构建，参见Nygren(2008年6月).FEBS J.275(11):2668–76)、Affiln(在γ-B结晶或泛素的支架上构建，参见Ebersbach H等人(2007年9月).J.Mol.Biol.372(1):172–85)、Affimer(在胱抑素支架上构建，参见Johnson A等人,(2012年8月7日).Anal.Chem.84(15):6553–60)、Affitin(在来自嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)支架的Sac7d上构建，参见Krehenbrink M等人,(2008年11月).J.Mol.Biol.383(5):1058–68)、α体(在三螺旋盘绕线圈支架上构建，参见Desmet,J等人,(2014年2月5日).Nature Communications.5:5237)、Anticalins(在脂质运载蛋白的支架上构建，参见Skerra A(2008年6月).FEBS J.275(11):2677–83)、亲和多聚体(Avimer)(在各种膜受体的支架上构建，参见Silverman J等人(2005年12月).Nat.Biotechnol.23(12):1556–61)、DARPin(在锚蛋白重复基序的支架上构建，参见Stumpp等人,(2008年8月).Drug Discov.Today.13(15–16):695–701)、Fynomers(在Fyn的SH3结构域的支架上构建，参见Grabulovski等人,(2007).J Biol Chem.282(5):3196–3204)、Kunitz结构域肽(在各种蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域的支架上构建，参见Nixon人,(2006年3月).Curr Opin Drug Discov Dev.9(2):261–8)和单抗体(在纤连蛋白的III型结构域的支架上构建，参见Koide等人(2007).Methods Mol.Biol.352:95–109)。

治疗性部分可包括“设计的锚蛋白重复”或“DARPin”。DARPin衍生自天然锚蛋白，其由至少三个重复基序蛋白组成，通常由四个或五个重复组成。

治疗性部分可包括“双可变结构域-IgG”或“DVD-IgG”。通过将具有一种特异性的IgG的VL和VH结构域分别经由接头序列与具有不同特异性的IgG的VL和VH的N末端融合，从两种亲本单克隆抗体生成DVD-IgG。

治疗性部分可包括F(ab)片段。

治疗性部分可包括F(ab’)2片段。

治疗性部分可包括Fv片段。

抗原结合片段可包括“单链可变片段”或“scFv”。scFv是指与十至约25个氨基酸的短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16):5879-5883。接头可连接VH的N-末端与VL的C-末端，或反之亦然。已描述了许多方法来辨别用于将来自抗体V区的天然聚集但化学分离的轻链和重链多肽链转化为scFv分子的化学结构，该分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本上类似的三维结构。参见，例如，授予Huston等人的美国专利号5,091,513和5,132,405；以及授予Ladner等人的美国专利号4,946,778。

抗原结合构建体可包含两个或更多个抗原结合部分。抗原结合构建体可结合两种分开且独特的抗原或同一抗原的不同表位。杵-臼BsAb IgG。通过将不同的突变引入两个CH3结构域来迫使H链异二聚化，从而产生不对称抗体。具体地，在一个HC中产生“杵”突变并且在另一个HC中产生“臼”突变，以促进异二聚化。

肽抑制剂

治疗性部分可包括肽。该肽可作为激动剂，从而增加靶蛋白的活性。该肽可作为拮抗剂，从而降低靶蛋白的活性。该肽可被配置为抑制蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)在许多生物化学过程中是重要的，包括核苷酸的转录和翻译蛋白质的各种翻译后修饰。PPI可通过生物物理技术诸如X射线晶体学、NMR光谱法、表面等离子体共振(SPR)、生物层干涉测量法(BLI)、等温滴定量热法(ITC)、放射性配体结合、分光光度测定和荧光光谱法进行实验确定。抑制蛋白质-蛋白质相互作用的肽可称为肽抑制剂。

治疗性部分可包括肽抑制剂。肽抑制剂可包含约5至约100个氨基酸，约5至约50个氨基酸；约15至约30个氨基酸；或约20至约40个氨基酸。肽抑制剂可包含一种或多种化学修饰，例如以减少蛋白水解降解和/或改善体内半衰期。肽抑制剂可包含一个或多个合成氨基酸和/或主链修饰。肽抑制剂可具有α-螺旋结构。

肽抑制剂可靶向感兴趣的同二聚体或异二聚体靶蛋白的二聚化结构域。

小分子

治疗性部分可包括小分子。治疗性部分可包括小分子激酶抑制剂。治疗性部分可包括抑制磷酸化感兴趣的靶标的激酶的小分子。感兴趣的靶标的磷酸化的抑制可阻断感兴趣的靶标的核易位。治疗性部分可包括MyD88的小分子抑制剂。

组合物

提供了包含本文所述化合物的组合物。

提供了所公开的化合物的药学上可接受的盐和/或前药。药学上可接受的盐包括根据化合物上发现的特定取代基用酸或碱制备的所公开的化合物的盐。在其中本文公开的化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定的无毒酸或碱盐的条件下，以盐的形式施用化合物可以是适当的。药学上可接受的碱加成盐的示例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐或镁盐。生理上可接受的酸加成盐的示例包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、碳酸、硫酸和有机酸如乙酸、丙酸、苯甲酸、琥珀酸、富马酸、扁桃酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、丙二酸、抗坏血酸、α-酮戊二酸、α-糖磷酸、马来酸、甲苯磺酸、甲磺酸等。因此，本文公开了盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-糖磷酸盐、马来酸盐、甲苯磺酸盐和甲磺酸盐。化合物的药学上可接受的盐可使用本领域熟知的标准方法获得，例如，通过使足够碱性的化合物诸如胺与提供生理上可接受的阴离子的合适的酸反应。还可制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。

寡核苷酸治疗剂和靶分子的机理

许多类型的寡核苷酸能够调节细胞中的基因转录、翻译和/或蛋白质功能。此类寡核苷酸的非限制性示例包括例如小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒、免疫刺激核酸、反义、antagomir、antimir、微小RNA模拟物、supermir、Ul衔接子和适体。附加的示例包括DNA靶向的形成三链体的寡核苷酸、链侵入寡核苷酸和CRISPR/Cas的合成引导链，这些核酸经由多种机理发挥作用。参见Smith和Zain,Annu Rev PharmacolToxicol.2019,59:605-630，以引用方式并入本文。

剪接转换反义寡核苷酸是短的、合成的、反义的、经修饰的核酸，其与前mRNA碱基配对，并通过阻断剪接机制的组分与前mRNA之间发生的RNA-RNA碱基配对或蛋白质-RNA结合相互作用来破坏转录物的正常剪接库。前mRNA的剪接是绝大多数蛋白质编码基因的正确表达所必需的，并且因此，靶向该过程提供了操纵从基因产生蛋白质的手段。剪接调节在由导致正常剪接破坏的突变引起的疾病的情况下或当干扰基因转录物的正常剪接过程可以是治疗性的时特别有价值。此类反义寡核苷酸提供了以治疗方式靶向和改变剪接的有效和特异性方式。参见Havens和Hastings,Nucleic Acids Res.2016年8月19日；44(14):6549-6563，以引用方式并入本文。

在siRNA或miRNA的情况下，这些核酸可通过称为RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平。在将siRNA或miRNA引入细胞质后，这些双链RNA构建体可与称为RISC的蛋白质结合。siRNA或miRNA的有义链从RISC复合物中被置换，从而在RISC内提供模板，该模板可识别并结合具有与结合的siRNA或miRNA的序列互补的序列的mRNA。结合互补mRNA后，RISC复合物切割mRNA并释放切割的链。RNAi可通过靶向特异性破坏编码蛋白质合成的对应mRNA来提供特定蛋白质的下调。

RNAi的治疗应用非常广泛，因为siRNA和miRNA构建体可用针对靶蛋白的任何核苷酸序列来合成。迄今为止，siRNA构建体已显示出在体外和体内模型以及临床研究中特异性下调靶蛋白的能力。

反义寡核苷酸和核酶也能抑制mRNA翻译成蛋白质。在反义构建体的情况下，这些单链脱氧核酸具有与靶蛋白mRNA互补的序列，并且可通过沃森-克里克碱基配对与mRNA结合。这种结合阻止靶mRNA的翻译和/或触发mRNA转录物的RNA酶H降解，因此，反义寡核苷酸对于作用的特异性(即，下调特定疾病相关蛋白)具有巨大的潜力。迄今为止，这些化合物已在几种体外和体内模型中显示出前景，包括炎性疾病、癌症和HIV的模型(综述于Agrawal,Trends in Biotech.14:376-387(1996))。反义也可通过与染色体DNA特异性杂交来影响细胞活性。

免疫刺激核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。在脱氧核糖核酸的情况下，某些序列或基序已显示在哺乳动物中诱发免疫刺激。这些序列或基序包括CpG基序、富含嘧啶的序列和回文序列。据信脱氧核糖核酸中的CpG基序被内体受体toll样受体9(TLR-9)特异性识别，其然后触发先天和获得性免疫刺激途径。还报道了某些免疫刺激核糖核酸序列。据信，这些RNA序列通过结合toll样受体6和7(TLR-6和TLR-7)触发免疫激活。此外，据报道双链RNA也是免疫刺激性的，并被认为通过与TLR-3结合而激活。

反义寡核苷酸(ASO)调节基因转录、翻译和/或蛋白质功能的机理和靶标的非限制性示例示于表9A和表9B中。

表9A.ASO调节和靶分子的机理

表9B.ASO调节和靶分子的机理

成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和相关的Cas蛋白构成CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas是一种基因编辑机理。RNA引导的(例如，gRNA)Cas9核酸内切酶以序列依赖性方式特异性靶向并切割DNA。Cas9核酸内切酶可被本公开的任何核酸酶取代。gRNA将核酸酶(例如，Cas9核酸酶)靶向感兴趣的特定核苷酸区域(例如，待切割的基因组DNA序列)并切割基因组DNA。然后可用感兴趣的遗传元件替换基因组DNA。

调节组织分布和/或保留的方法

本文提供了用于调节治疗剂在受试者体内的组织分布和/或保留的化合物和方法。调节治疗剂的组织分布的化合物可包括环状细胞穿透肽(cCCP)和环外肽(EP)。用于调节组织分布的方法可包括向受试者施用包含环状细胞穿透肽(cCPP)和环外肽(EP)的化合物。可通过测量化合物在体内不同组织中的量、表达、功能或活性来评估化合物的组织分布或保留的调节。组织可以是同一生物系统的不同组织，诸如不同类型的肌肉组织或中枢神经系统内的不同组织。组织可以是肌肉组织，并且与至少一种其他类型的肌肉组织(例如，骨骼肌，包括但不限于横隔膜、胫骨前肌和三头肌、或平滑肌)相比，在心肌组织中存在化合物的分布或保留的调节。组织可以是CNS组织，并且与至少一种其他类型的CNS组织相比，在至少一种CNS组织中存在化合物的分布或保留的调节。

本文所述的EP中的任一种适于包含在该方法中使用的化合物中。EP可以是PKKKRKV。EP可以是KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV和PKKKRKG。EP可选自KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV和PKKKRKG。

EP可包含PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH，其中B是β-丙氨酸。EP中的氨基酸可具有D或L立体化学。EP可以是PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH，其中B是β-丙氨酸。EP中的氨基酸可具有D或L立体化学。

EP可包含本领域中鉴定为核定位序列(NLS)的氨基酸序列。EP可由本领域中鉴定为核定位序列(NLS)的氨基酸序列组成。EP可包含含有氨基酸序列PKKKRKV的NLS。EP可由包含氨基酸序列PKKKRKV的NLS组成。EP可包含含有选自NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK和RKCLQAGMNLEARKTKK的氨基酸序列的NLS。EP可由包含选自NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK和RKCLQAGMNLEARKTKK的氨基酸序列的NLS组成。

与第二组织相比，在至少一种组织中化合物的量、表达、功能或活性可增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％。

与第二组织相比，在至少一种组织中化合物的量、表达、功能或活性可降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％。

化合物的量或表达可通过本领域已知的方法在不同组织类型中评估，包括但不限于实施例中所述的方法。可通过标准方法制备组织。化合物在不同组织中的量或表达可通过本领域公认的技术来测量，例如通过LC-MS/MS、Western印迹分析或ELISA。化合物在不同组织中的功能或活性可通过为评估相关功能或活性而建立的技术来测量，诸如使用RT-PCR来评估基于寡核苷酸的治疗性部分的活性。例如，对于用作治疗性部分(TM)以诱导感兴趣的靶mRNA中外显子跳跃的反义化合物(AC)，可使用RT-PCR来定量不同组织中外显子跳跃的水平。

可用包含环状细胞穿透肽(cCPP)和环外肽(EP)的化合物来调节治疗剂在中枢神经系统(CNS)组织中的组织分布和/或保留。化合物可鞘内施用于受试者，并且化合物可调节治疗剂在中枢神经系统(CNS)组织中的组织分布和/或保留。CNS组织的非限制性示例包括小脑、皮质、海马、嗅球、脊髓、背根神经节(DRG)和脑脊髓液(CSF)。包含cCPP和EP的化合物可鞘内施用，并且与另一种CNS组织相比，在至少一种CNS组织中治疗剂的表达水平、活性或功能可更高。包含cCPP和EP的化合物可鞘内施用，并且与另一种CNS组织相比，在至少一种CNS组织中治疗剂的表达水平、活性或功能可更低。治疗剂可包括靶向CD33的治疗剂(例如，靶向CD33的反义化合物)，其中化合物鞘内施用。包含cCPP和EP的化合物可以至少1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg或50mg/kg的剂量鞘内施用。

调节治疗剂在受试者的中枢神经系统(CNS)中的组织分布或保留的方法可包括：向受试者鞘内施用化合物，该化合物包含：

(a)环状细胞穿透肽(cCPP)；

(b)包含治疗剂的治疗性部分(TM)；以及

(c)包含至少一个带正电荷的氨基酸残基的环外肽(EP)，其中与受试者的CNS的第二组织相比，在受试者的CNS的至少一个组织中治疗剂的量、表达、功能或活性被调节至少10％。

与受试者的CNS的第二组织相比，在受试者的CNS的至少一个组织中治疗剂的量、表达、功能或活性可被调节至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％。

本文所述的用于CNS相关疾病或障碍的治疗剂中的任一种适于包含在该方法中使用的化合物中。治疗剂可包括靶向CD33的治疗剂，诸如本文所述的靶向CD33的反义化合物中的任一种。

本文所述的CPP中的任一种适于包含在该方法中使用的化合物中。CPP可以是环状CPP(cCPP)。

该化合物可用于治疗患有中枢神经系统疾病或障碍、或神经炎性疾病或障碍的受试者。在实施方案中，受试者患有阿尔茨海默病或帕金森病。

可调节治疗剂在不同类型肌肉组织中的组织分布和/或保留。肌肉组织的非限制性示例包括隔膜、心(心脏)肌肉、胫骨前肌、三头肌、其他骨骼肌和平滑肌。可施用包含cCPP、EP和治疗剂的化合物，并且与另一种肌肉组织相比，在至少一种肌肉组织中治疗剂的表达水平、活性或功能可更高。可施用包含cCPP、EP和治疗剂的化合物，并且与另一种肌肉组织相比，在至少一种肌肉组织中治疗剂的表达水平、活性或功能可更低。治疗剂可以是靶向抗肌萎缩蛋白的治疗剂(例如，靶向DMD的反义化合物)。化合物可以至少1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg或50mg/kg的剂量施用。

一种调节治疗剂在受试者的肌肉系统中的组织分布或保留的方法包括：向受试者施用化合物，该化合物包含：

(a)环状细胞穿透肽(cCPP)；

(b)包含治疗剂的治疗性部分(TM)；以及

(c)包含至少一个带正电荷的氨基酸残基的环外肽(EP)，其中与受试者的肌肉系统的第二组织相比，在受试者的肌肉系统的至少一个组织中治疗剂的量、表达、机能或活性被调节至少10％。

与受试者的肌肉系统的第二组织相比，在受试者的肌肉系统的至少一个组织中治疗剂的量、表达、机能或活性可被调节至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％。

本文所述的用于肌肉系统相关疾病或障碍的治疗剂中的任一种适于包含在该方法中使用的化合物中。治疗剂可以是靶向DMD的治疗剂，诸如靶向DMD的反义化合物。

本文所述的CPP中的任一种适于包含在该方法中使用的化合物中。在实施方案中，CPP是环状CPP(cCPP)。

在实施方案中，受试者患有神经肌肉障碍或肌骨骼障碍。在实施方案中，受试者患有Duchenne型肌营养不良。

与异常剪接和示例性靶基因相关的疾病

人基因组包含超过40,000个基因，其中大约一半对应于蛋白质编码基因。然而，由于单个氨基酸多态性、翻译后修饰和重要的选择性剪接，预计人蛋白质种类的数量要高几个数量级。通常发生在细胞核中的RNA剪接是通过去除非编码区(内含子)并将剩余的编码区(外显子)连接在一起而将前体信使RNA(前mRNA)转化为成熟信使RNA(mRNA)的过程。然后，可将所得mRNA从细胞核输出并翻译成蛋白质。选择性剪接或差异剪接是基因表达期间的调节过程，其产生编码多种蛋白质的单个基因。在该过程中，基因的特定外显子可被包括在由该基因产生的最终的、加工的mRNA内或从其中排除。虽然选择性剪接是真核生物中的正常现象，并且促成由基因组编码的蛋白质的生物多样性，但剪接中的异常变异严重涉及疾病。大部分人类遗传疾病由剪接变体引起；异常剪接变体促成癌症的发展；并且剪接因子基因在不同类型的癌症中经常突变。

在人基因突变数据库(HGMD)中报道的约80,000个突变中约10％影响剪接位点。在HGMD中，在+1供体剪接位点处发生3390个致病突变。这些突变影响901个基因中的2754个外显子。由于编码肌肉结构蛋白的基因的异常大的尺寸和多外显子结构，神经肌肉障碍(NMD)的流行率甚至更高，进一步突出了NMD中这些突变的重要性。

先前，已尝试经由同源定向修复(HDR)途径来校正点突变，例如剪接位点突变，这在有丝分裂后组织诸如骨骼肌中极其低效，妨碍了其在NMD中的治疗效用。此外，将校正的编码区再引入基因组的标准基因治疗方法受到编码例如肌肉结构蛋白的基因的大尺寸的阻碍。此外，许多现有疗法依赖于将治疗性化合物低效引入疾病细胞中，使得体内治疗不切实际并且经历更高的毒性。

本公开的靶基因可以是包含一个或多个内含子和一个或多个外显子的任何真核基因。靶基因可以是哺乳动物基因。哺乳动物可以是人、小鼠、牛、大鼠、猪、马、鸡、羊等。靶基因可以是人基因。

靶基因可以是包含导致异常剪接的突变的基因。靶基因可以是包含一个或多个突变的基因。靶基因可以是包含一个或多个突变使得靶基因的转录和翻译不产生功能性蛋白质的基因。靶基因可以是包含一个或多个突变的基因，使得靶基因的转录和翻译导致比野生型靶蛋白活性更低或功能更低的靶蛋白。

靶基因可以是遗传障碍的潜在基因。靶基因可在中枢神经系统中具有异常的基因表达。靶基因可以是参与神经肌肉障碍(NMD)的发病机制的基因。靶基因可以是参与肌骨骼障碍(NMD)的发病机制的基因。神经肌肉疾病可以是庞贝病，并且靶基因可以是GYS1。

反义化合物可用于靶向包含导致遗传病潜在的异常剪接的突变的基因，以便重定向剪接以产生期望的剪接产物(Kole,Acta Biochimica Polonica,1997,44,231-238)。

CRISPR基因编辑机制可用于靶向异常基因以去除或调节基因转录和翻译。

该疾病可包括β-地中海贫血(Dominski和Kole,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90,8673-8677；Sierakowska等人,Nucleosides&Nucleotides,1997,16,1173-1182；Sierakowska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,12840-44；Lacerra等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,9591-9596)。

该疾病可包括Kobe型抗肌萎缩蛋白病(Takeshima等人,J.Clin.Invest.,1995,95,515-520)。

该疾病可包括Duchenne型肌营养不良(Dunckley等人Nucleosides&Nucleotides,1997,16,1665-1668；Dunckley等人Human Mol.Genetics,1998,5,1083-90)。靶基因可以是编码抗肌萎缩蛋白的DMD基因。该蛋白由与肌动蛋白微丝结合的N-末端结构域、中央杆结构域和与抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物结合的C-末端富含半胱氨酸的结构域组成(Hoffman等人1987；Koenig等人1988；Yoshida和Ozawa 1990)。DMD基因中中断阅读框的突变导致抗肌萎缩蛋白功能完全丧失，这导致严重的Duchenne型肌营养不良(DMD)[MIM 310200])。另一方面，较温和的Becker型肌营养不良(BMD[MIM 300376])是同一基因中非移码突的结果，并导致内部缺失但部分功能性的抗肌萎缩蛋白保留其N-末端和C-末端(Koenig等人1989；DiBlasi等人1996)。超过三分之二的DMD和BMD患者具有>1个外显子的缺失(den Dun-nen等人1989)。值得注意的是，已描述了表现出极轻度BMD并且缺少高达67％的中央杆结构域的患者(England等人1990；Winnard等人1993；Mirabella等人1998)。这表明，尽管有大的缺失，但可生成部分功能性抗肌萎缩蛋白，条件是缺失使得转录物符合读框。这些观察导致了使用AC改变剪接的想法，从而恢复开放阅读框并将严重的DMD表型转变为较温和的BMD表型。几项研究已显示在源自mdx小鼠模型的细胞中治疗性AC诱导的单外显子跳跃(Dunckley等人1998；Wilton等人1999；Mann等人2001,2002；Lu等人2003)和各种DMD患者(Takeshima等人2001；van Deutekom等人2001；Aartsma-Rus等人2002,2003；De Angelis等人2002)。AC可用于跳跃选自DMD的外显子2、8、11、17、19、23、29、40、41、42、43、44、45、46、48、49、50、51、52、53、55和59的一个或多个外显子。参见Arartsma-Rus等人2002，以引用方式并入本文。AC可用于跳跃选自DMD外显子8、11、43、44、45、50、51、53和55的一个或多个外显子。在所有患有DMD的患者中，约75％将从这些外显子的跳跃中获益。跳跃框外缺失侧翼的外显子或含有无义突变的框内外显子可恢复阅读框并诱导处理细胞中BMD样抗肌萎缩蛋白的合成。(vanDeutekom等人2001；Aartsma-Rus等人2003)。与其在靶DMD前mRNA内的靶序列杂交的AC可诱导一个或多个外显子的跳跃。AC可诱导包含抗肌萎缩蛋白活性片段的再剪接靶蛋白的表达。外显子52的AC的非限制性示例描述于美国公开号2019/0365918中，其全文以引用方式并入用于所有目的。化合物可包含靶向DMD基因的EP、cCPP和货物。

与货物部分缀合的环状细胞穿透肽(cCPP)

环状细胞穿透肽(cCPP)可与货物部分缀合。

货物部分可通过接头与cCPP缀合。货物部分包含治疗性部分。治疗性部分可包括寡核苷酸、肽或小分子。寡核苷酸可包括反义寡核苷酸。货物部分可在末端羰基处与接头缀合以提供以下结构：

其中：

EP是环外肽，并且M、AA_SC、货物、x'、y和z'如上文所定义，*是与AA_SC的附接点。x’可以是1。y可以是4。z'可以是11。-(OCH₂CH-₂)_x’-和/或-(OCH₂CH-₂)_z’-可独立地被一个或多个氨基酸替换，包括例如甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合。

内体逃逸载体(EEV)可包含环状细胞穿透肽(cCPP)、环外肽(EP)和接头，并且可与货物缀合以形成包含式(C)的结构的EEV-缀合物：

或其质子化形式，其中：

R₁、R₂和R₃可各自独立地是H或具有包含芳族基团的侧链的氨基酸残基；

R₄是H或氨基酸侧链；

EP是如本文所定义的环外肽；

货物是如本文所定义的部分；

每个m独立地是0-3的整数；

n是0-2的整数；

x'是2-20的整数；

y是1-5的整数；

q是1-4的整数；并且

z'是2-20的整数。

R₁、R₂、R₃，R₄、EP、货物、m、n、x'、y、q和z'如本文所定义。

EEV可与货物缀合，并且EEV-缀合物可包含式(C-a)或(C-b)的结构：

/>

或其质子化形式，其中EP、m和z如上文在式(C)中所定义。

EEV可与货物缀合，并且EEV-缀合物可包含式(C-c)的结构：

或其质子化形式，其中EP、R¹、R²、R³、R⁴和m如上文在式(III)中所定义；AA可以是如本文所定义的氨基酸；n可以是0-2的整数；x可以是1-10的整数；y可以是1-5的整数；z可以是1-10的整数。

EEV可与寡核苷酸货物缀合，并且EEV-寡核苷酸缀合物可包含式(C-1)、(C-2)、(C-3)或(C-4)的结构：

/>

/>

EEV可与寡核苷酸货物缀合，并且EEV-缀合物可包含以下结构：

胞质递送效率

对环状细胞穿透肽(cCPP)的修饰可提高胞质递送效率。通过将具有经修饰的序列的cCPP的胞质递送效率与对照序列进行比较，可测量改善的胞质摄取效率。调控序列不包括修饰序列中的特定置换氨基酸残基(包括但不限于精氨酸、苯丙氨酸和/或甘氨酸)，但在其他方面是相同的。

如本文所用，胞质递送效率是指cCPP穿过细胞膜并进入细胞的胞质溶胶的能力。cCPP的胞质递送效率不一定依赖于受体或细胞类型。胞质递送效率可指绝对胞质递送效率或相对胞质递送效率。

绝对胞质递送效率是生长培养基中cCPP(或cCPP-货物缀合物)的胞质浓度与cCPP(或cCPP-货物缀合物)的浓度的比率。相对胞质溶胶递送效率是指与对照cCPP在胞质溶胶中的浓度相比cCPP在胞质溶胶中的浓度。定量可通过荧光标记cCPP(例如，用FITC染料)并使用本领域熟知的技术测量荧光强度来实现。

通过比较(i)被细胞类型(例如，HeLa细胞)内化的本发明cCPP的量与(ii)被相同细胞类型内化的对照cCPP的量来确定相对胞质递送效率。为了测量相对胞质递送效率，可将细胞类型在cCPP的存在下孵育指定的时间段(例如，30分钟、1小时、2小时等)，之后使用本领域已知的方法例如荧光显微术定量被细胞内化的cCPP的量。单独地，将相同浓度的对照cCPP在该细胞类型的存在下孵育相同的时间段，并且对被细胞内化的对照cCPP的量进行定量。

相对胞质递送效率可通过测量具有经修饰的序列的cCPP对胞内靶标的IC₅₀并将具有经修饰的序列的cCPP对对照序列的IC₅₀(如本文所述)进行比较来确定。

与环(FfФRrRrQ)相比，cCPP的相对胞质传递效率可在约50％至约450％的范围内，例如约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％、约500％、约510％、约520％、约530％、约540％、约550％、约560％、约570％、约580％、或约590％，包括其间的所有范围和值。与包含环(FfФRrRrQ)的环肽相比，cCPP的相对胞质递送效率可提高大于约600％。

绝对胞质递送效力为约40％至约100％，例如约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，包括其间的所有值和子范围。

与其他相同的序列相比，本公开的cCPP可将胞质递送效率提高约1.1倍至约30倍，例如，约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约10、约10.5、约11.0、约11.5、约12.0、约12.5、约13.0、约13.5、约14.0、约14.5、约15.0、约15.5、约16.0、约16.5、约17.0、约17.5、约18.0、约18.5、约19.0、约19.5、约20、约20.5、约21.0、约21.5、约22.0、约22.5、约23.0、约23.5、约24.0、约24.5、约25.0、约25.5、约26.0、约26.5、约27.0、约27.5、约28.0、约28.5、约29.0、或约29.5倍，包括其间的所有值和子范围。

制备方法

本文所述的化合物可以有机合成领域技术人员已知的多种方式或本领域技术人员所理解的其变化形式制备。本文所述的化合物可由容易获得的起始材料制备。最佳反应条件可随所用的特定反应物或溶剂而变化，但此类条件可由本领域技术人员确定。

本文所述化合物的变化形式包括如针对每种化合物所述的各种成分的添加、减去或移动。类似地，当分子中存在一个或多个手性中心时，分子的手性可改变。另外，化合物合成可涉及各种化学基团的保护和脱保护。保护和脱保护的使用以及适当的保护基团的选择可由本领域技术人员确定。保护基团的化学性质可见于例如Wuts和Greene,ProtectiveGroups in Organic Synthesis,第4版,Wiley&Sons,2006，其全文以引用方式并入本文。

用于制备所公开的化合物和组合物的起始材料和试剂可购自商业供应商诸如Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,WI)、Acros Organics(Morris Plains,NJ)、FisherScientific(Pittsburgh,PA)、Sigma(St.Louis,MO)、Pfizer(New York,NY)、GlaxoSmithKline(Raleigh,NC)、Merck(Whitehouse Station,NJ)、Johnson&Johnson(NewBrunswick,NJ)、Aventis(Bridgewater,NJ)、AstraZeneca(Wilmington,DE)、Novartis(Basel,Switzerland)、Wyeth(Madison,NJ)、Bristol-Myers-Squibb(New York,NY)、Roche(Basel,Switzerland)、Lilly(Indianapolis,IN)、Abbott(Abbott Park,IL)、ScheringPlough(Kenilworth,NJ)、或Boehringer Ingelheim(Ingelheim,Germany)，或者通过本领域技术人员已知的方法按照参考文献中所述的程序制备，该参考文献诸如Fieser andFieser’s Reagents for Organic Synthesis,第1-17卷(John Wiley and Sons,1991)；Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds,第1-5卷和补充版(Elsevier SciencePublishers,1989)；Organic Reactions,第1-40卷(John Wiley and Sons,1991)；March’sAdvanced Organic Chemistry,(John Wiley and Sons,第4版)；以及Larock’sComprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.,1989)。其他材料，诸如本文公开的药物载剂可从商业来源获得。

制备本文所述化合物的反应可在溶剂中进行，该溶剂可由有机合成领域的技术人员选择。在进行反应的条件(即，温度和压力)下，溶剂可基本上不与起始材料(反应物)、中间体或产物反应。反应可在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。产物或中间体形成可根据本领域已知的任何合适的方法进行监测。例如，产物形成可通过光谱手段诸如核磁共振光谱法(例如，¹H或¹³C)、红外光谱法、分光光度测定(例如，、UV-可见光)或质谱法，或通过色谱法诸如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法来监测。

所公开的化合物可通过固相肽合成来制备，其中氨基酸α-N-末端被酸或碱保护基团保护。此类保护基团应具有对肽连接形成条件稳定的特性，同时可容易地去除而不破坏生长的肽链或使其中所含的任何手性中心外消旋化。合适的保护基团是9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、联苯基异丙氧羰基、叔戊氧羰基、异冰片基氧羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧羰基、邻硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基团对于所公开化合物的合成是特别优选的。对于侧链氨基基团如赖氨酸和精氨酸，其他优选的侧链保护基团是2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷氧基羰基；对于酪氨酸是苄基、邻溴苄氧基-羰基、2,6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；对于丝氨酸是叔丁基、苄基和四氢吡喃基；对于组氨酸是三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2,4-二硝基苯基；对于色氨酸是甲酰基；对于天冬氨酸和谷氨酸是苄基和叔丁基，并且对于半胱氨酸是三苯基甲基(三苯甲基)。

在固相肽合成方法中，将α-C-末端氨基酸附接到合适的固体支持物或树脂上。可用于上述合成的合适固体支持物是对逐步缩合-脱保护反应的试剂和反应条件呈惰性以及不溶于所用介质的那些材料。用于合成α-C-末端羧基肽的固体支持物是可购自AppliedBiosystems(Foster City,Calif.)的4-羟甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)或4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰胺基乙基树脂。α-C-末端氨基酸通过N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，在有或没有4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)或双(2-氧代-3-噁唑烷基)氯化膦(BOPCl)的情况下，在10℃至50℃的温度下在溶剂诸如二氯甲烷或DMF中介导偶联约1至约24小时而偶联到树脂上。当固体支持物是4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，在如上所述与α-C-末端氨基酸偶联之前，用仲胺(优选地哌啶)切割Fmoc基团。一种用于与脱保护的4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂偶联的方法是在DMF中的O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。可在自动多肽合成仪中进行连续的受保护氨基酸的偶联。在一个示例中，用Fmoc保护生长肽链的氨基酸中的α-N-末端。从生长肽的α-N-末端侧去除Fmoc保护基团是通过用仲胺(优选地哌啶)处理完成的。然后以约3倍摩尔过量引入每个受保护的氨基酸，并且优选地在DMF中进行偶联。偶联剂可以是O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。在固相合成结束时，将多肽从树脂上去除并脱保护，连续地或在单一操作中进行。通过用包含茴香硫醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的切割试剂处理树脂结合的多肽，可在单一操作中完成多肽的去除和脱保护。在多肽的α-C-末端是烷基酰胺的情况下，通过用烷基胺氨解来切割树脂。另选地，可通过酯交换(例如，用甲醇)、接着氨解或通过直接转酰胺基来去除肽。受保护的肽可在此时纯化或直接用于下一步骤。侧链保护基团的去除可使用上述切割混合物来完成。完全脱保护的肽可通过使用任何或所有以下类型的一系列色谱步骤来纯化：在弱碱性树脂(乙酸盐形式)上的离子交换；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如，Amberlite XAD)上的疏水吸附色谱法；硅胶吸附色谱法；羧甲基纤维素上的离子交换色谱法；分配色谱法(例如，在Sephadex G-25、LH-20上)或逆流分布；高效液相色谱法(HPLC)，特别是在辛基-十八烷基甲硅烷基-二氧化硅键合相柱填料上的反相HPLC。

使用方法

本文还提供了本文所述的化合物或组合物的使用方法。本文还提供了用于治疗有需要的受试者的疾病或病状的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何化合物或组合物。组合物的化合物可用于治疗可用本文公开的治疗性部分进行治疗的任何疾病或病症。

本文还提供了治疗受试者的癌症的方法。该方法包括向受试者施用有效量的一种或多种本文所述的化合物或组合物或其药学上可接受的盐。本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐可用于在人(例如，儿童和老年群体)和动物(例如，兽医应用)中治疗癌症。所公开的方法可任选地包括鉴定需要或可能需要治疗癌症的患者。可通过本文所述的化合物和组合物治疗的癌类型的示例包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖器癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌。进一步示例包括肛门、胆管、骨、骨髓、肠(包括结肠和直肠)、眼、胆囊、肾、口、喉、食道、胃、睾丸、宫颈、间皮瘤、神经内分泌、阴茎、皮肤、脊髓、甲状腺、阴道、外阴、子宫、肝、肌肉、血细胞(包括淋巴细胞和其他免疫系统细胞)的癌症和/或肿瘤。可通过本文所述的化合物和组合物治疗的癌症的进一步示例包括癌、卡波西肉瘤、黑色素瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、胰腺癌、肺癌、白血病(急性成淋巴细胞、急性髓样、慢性淋巴细胞、慢性髓样和其他)和淋巴瘤(霍奇金和非霍奇)以及多发性骨髓瘤。

本文所述的治疗或预防癌症的方法还可包括用一种或多种附加药剂(例如，抗癌剂或电离辐射)进行治疗。如本文所述的一种或多种附加药剂以及化合物和组合物或其药学上可接受的盐可以任何顺序施用，包括同时施用，以及间隔多达数天的时间间隔顺序施用。该方法还可包括多于单次施用如本文所述的一种或多种附加药剂和/或化合物和组合物或其药学上可接受的盐。如本文所述的一种或多种附加药剂以及化合物和组合物或其药学上可接受的盐的施用可通过相同或不同的途径。当用一种或多种附加药剂治疗时，如本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐可组合成包含一种或多种附加药剂的药物组合物。

例如，如本文所述的化合物或组合物或其药学上可接受的盐可与附加抗癌剂组合成药物组合物，该附加抗癌剂诸如13-顺式视黄酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-氟尿嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、Accutane、放线菌素-D、Adriamycin、Adrucil、Agrylin、Ala-Cort、阿地白介素、阿仑单抗、阿利维A酸、Alkaban-AQ、Alkeran、全反式视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺、甲氨蝶呤、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、Anandron、阿那曲唑、阿糖胞苷、Aranesp、Aredia、Arimidex、Aromascin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、Avastin、BCG、BCNU、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、BiCNU、Blenoxane、博来霉素、硼替佐米、白消安、Busulfex、C225、亚叶酸钙、Campath、Camptosar、Camptothecin-11、卡培他滨、Carac、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀片、Casodex、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、嗜橙菌因子、克拉屈滨、可的松、Cosmegen、CPT-11、环磷酰胺、Cytadren、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U、Cytoxan、达卡巴嗪、Dactinomycin、阿法达贝泊汀、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、DaunoXome、Decadron、Delta-Cortef、Deltasone、地尼白介素、DepoCyt、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞美松磷酸钠、Dexasone、右雷佐生、DHAD、DIC、Diodex、多烯紫杉醇、Doxil、多柔比星、多柔比星脂质体、Droxia、DTIC、DTIC-Dome、Duralone、Efudex、Eligard、Ellence、Eloxatin、Elspar、Emcyt、表柔比星、阿法依泊汀、Erbitux、欧文氏菌L-天冬酰胺酶、雌莫司汀、Ethyol、Etopophos、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Eulexin、Evista、依西美坦、Fareston、Faslodex、Femara、非格司亭、氟尿苷、氟达拉、氟达拉滨、Fluoroplex、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮、氟他胺、亚叶酸、FUDR、氟维司群、G-CSF、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗奥佐米星、Gemzar、Gleevec、Lupron、Lupron Depot、Matulane、Maxidex、氮芥、盐酸氮芥、Medralone、Medrol、Megace、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、Mesna、Mesnex、甲胺蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲基强的松龙、Mylocel、來曲唑、Neosar、Neulasta、Neumega、Neupogen、Nilandron、尼鲁米特、氮芥、Novaldex、Novantrone、奥曲肽、醋酸奥曲肽、Oncospar、Oncovin、Ontak、Onxal、Oprevelkin、Orapred、Orasone、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、Panretin、Paraplatin、Pediapred、PEG干扰素、培加帕酶、培非格司亭、PEG-INTRON、PEG-L-天冬酰胺酶、苯丙氨酸氮芥、Platinol、Platinol-AQ、泼尼松龙、泼尼松、Prelone、丙卡巴肼、PROCRIT、Proleukin、含卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20、Purinethol、雷洛昔芬、Rheumatrex、Rituxan、利妥昔单抗、Roveron-A(干扰素α-2a)、Rubex、盐酸红比霉素、Sandostatin、SandostatinLAR、Sargramostim、Solu-Cortef、Solu-Medrol、STI-571、链脲佐菌素、他莫昔芬、Targretin、Taxol、Taxotere、Temodar、替莫唑胺、替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、Thalomid、TheraCys、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤Tabloid、硫代磷酸酰胺、Thioplex、Thiotepa、TICE、Toposar、Topotecan、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维甲酸、Trexall、Trisenox、TSPA、VCR、Velban、Velcade、VePesid、Vesanoid、Viadur、长春碱、硫酸长春碱、Vincasar Pfs、长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VP-16、Vumon、Xeloda、Zanosar、Zevalin、Zinecard、Zoladex、唑来膦酸、Zometa、Gliadel wafer、Glivec、GM-CSF、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、Halotestin、赫赛汀、Hexadrol、Hexalen、六甲蜜胺、HMM、Hycamtin、Hydrea、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢可酮、羟基脲、替伊莫单抗、替伊莫单抗泰泽坦、Idamycin、伊达比星、Ifex、IFN-alpha、异环磷酰胺、IL 2、IL-11、甲磺酸伊馬替尼、咪唑甲酰胺、干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、白介素2、白介素11、内含子A(干扰素α-2b)、Leucovorin、Leukeran、Leukine、亮丙瑞林、Leurocristine、Leustatin、脂质体Ara-C、Liquid Pred、洛莫司汀、L-PAM、L-Sarcolysin、Meticorten、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、M-Prednisol、MTC、MTX、Mustargen、Mustine、Mutamycin、Myleran、Iressa、Irinotecan、异维甲酸、Kidrolase、Lanacort、L-天冬酰胺酶和LCR。附加抗癌剂还可包括生物药物，诸如抗体。

许多肿瘤和癌症具有存在于肿瘤或癌细胞中的病毒基因组。例如，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)与许多哺乳动物恶性肿瘤相关。本文公开的化合物还可单独使用或与抗癌剂或抗病毒剂诸如更昔洛韦、叠氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)等组合使用，以治疗被可引起细胞转化的病毒感染的患者和/或治疗患有与细胞中病毒基因组的存在相关的肿瘤或癌的患者。本文公开的化合物还可与基于病毒的肿瘤疾病治疗组合使用。

本文还描述了杀死受试者中的肿瘤细胞的方法。该方法包括使肿瘤细胞与有效量的如本文所述的化合物或组合物接触，并且任选地包括用有效量的电离辐射辐照肿瘤细胞的步骤。另外，本文提供了肿瘤放射疗法的方法。该方法包括使肿瘤细胞与有效量的如本文所述的化合物或组合物接触，并用有效量的电离辐射辐照肿瘤。如本文所用，术语电离辐射是指包含具有足够能量或可经由核相互作用产生足够能量以产生电离的粒子或光子的辐射。电离辐射的一个示例是x辐射。电离辐射的有效量是指当与本文所述的化合物组合施用时产生细胞损伤或死亡增加的电离辐射的剂量。电离辐射可根据本领域已知的方法递送，包括施用放射性标记的抗体和放射性同位素。

本文所述的方法和化合物可用于预防性和治疗性治疗。如本文所用，术语治疗(treating)或治疗(treatment)包括预防；延迟发作；发作后体征或症状恶化的减轻、根除或延迟；以及预防复发。对于预防用途，将治疗有效量的如本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐在癌症的发作前(例如，在明显的癌体征前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状后)或在确定发展后施用于受试者。预防性施用可在感染症状显现之前发生数天至数年。预防性施用可用于例如呈现癌前病变的受试者、诊断为患有早期恶性肿瘤的受试者以及对特定癌症易感的亚组(例如，家族、种族和/或职业)的化学预防性治疗。治疗性治疗涉及在诊断出癌症之后向受试者施用治疗有效量的如本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐。

在治疗受试者中的癌症或肿瘤的治疗方法的一些示例中，施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗性部分，该治疗性部分可包含靶向部分，该靶向部分可充当针对Ras(例如，K-Ras)、PTP1B、Pin1、Grb2 SH2或它们的组合的抑制剂。

所公开的主题还涉及用于治疗患有代谢障碍或病症的受试者的方法。可将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用于患有代谢障碍且需要其治疗的受试者。在一些示例中，代谢障碍可包括II型糖尿病。在治疗受试者中的代谢障碍的治疗方法的一些示例中，施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗性部分，该治疗性部分可包含靶向部分，该靶向部分可充当针对PTP1B的抑制剂。在该方法的一个具体示例中，受试者是肥胖的，并且该方法可包括通过施用如本文所公开的组合物来治疗受试者的肥胖。

所公开的主题还涉及用于治疗患有免疫障碍或病症的受试者的方法。将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用于患有免疫障碍且需要其治疗的受试者。在治疗受试者的免疫障碍的治疗方法的一些示例中，施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗性部分，该治疗性部分可包含靶向部分，该靶向部分可充当针对Pin1的抑制剂。

所公开的主题还涉及用于治疗患有炎性障碍或病症的受试者的方法。可将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用于患有炎性障碍且需要其治疗的受试者。

所公开的主题还涉及用于治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。可将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用于患有囊性纤维化且需要其治疗的受试者。在治疗受试者中的囊性纤维化的方法的一些示例中，施用于受试者的化合物或组合物可包含治疗性部分，该治疗性部分可包含靶向部分，该靶向部分可充当针对CAL PDZ的抑制剂。

本文公开的化合物可用于检测或诊断受试者的疾病或病症。例如，cCPP可包含可与靶标(例如肿瘤)相互作用的靶向部分和/或可检测部分。

组合物、制剂和施用方法

所公开的化合物和含有它们的组合物的体内应用可通过本领域技术人员目前或预期已知的任何合适的方法和技术来实现。例如，所公开的化合物可被配制成生理学上或药学上可接受的形式，并通过本领域已知的任何合适的途径施用，包括例如口服、鼻、直肠、局部和肠胃外施用途径。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内施用，诸如通过注射。所公开的化合物或组合物的施用可以是单次施用，或以连续或不同的间隔施用，如本领域技术人员可容易地确定的。

本文公开的化合物和包含它们的组合物也可利用脂质体技术、缓释胶囊、可植入泵和可生物降解容器来施用。这些递送方法可有利地在延长的时间段内提供均匀的剂量。化合物还可以其盐衍生物形式或结晶形式施用。

本文公开的化合物可根据用于制备药学上可接受的组合物的已知方法配制。在本领域技术人员熟知且容易获得的许多来源中详细描述了制剂。例如，Remington’sPharmaceutical Science,E.W.Martin(1995)描述了可与所公开的方法结合使用的制剂。通常，本文公开的化合物可被配制成使得有效量的化合物与合适的载剂组合，以便促进化合物的有效施用。所用的组合物还可以是各种形式。这些剂型包括例如固体、半固体和液体剂型，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬浮液、栓剂、可注射和可输注溶液、以及喷雾剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。组合物还优选地包含本领域技术人员已知的常规药学上可接受的载剂和稀释剂。与化合物一起使用的载剂或稀释剂的示例包括乙醇、二甲亚砜、甘油、氧化铝、淀粉、盐水和等效载剂和稀释剂。为了提供用于期望的治疗性治疗的此类剂量的施用，基于包含载剂或稀释剂的总组合物的重量，本文公开的组合物可有利地包含总共约0.1重量％至100重量％之间的主题化合物中的一种或多种。

适于施用的制剂包括例如无菌注射水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中，并且可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前仅需要无菌液体载剂(例如注射用水)的条件。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应当理解，除了以上特别提及的成分外，本文公开的组合物还可包含本领域中关于所讨论的制剂类型的其他常规剂。

本文公开的化合物和包含它们的组合物可通过与细胞直接接触或经由载剂手段递送至细胞。用于将化合物和组合物递送至细胞的载剂手段是本领域已知的，并且包括例如将组合物包封在脂质体部分中。用于将本文公开的化合物和组合物递送至细胞的另一手段可包括将化合物附着到靶向递送至靶细胞的蛋白质或核酸。美国专利号6,960,648和美国申请公开号20030032594和20020120100公开了可与另一种组合物偶联并允许该组合物跨生物膜易位的氨基酸序列。美国申请公开号20020035243也描述了用于跨细胞膜转运生物部分以用于细胞内递送的组合物。也可将化合物掺入聚合物中，该聚合物的示例包括用于颅内肿瘤的聚(D-L丙交酯-共-乙交酯)聚合物；摩尔比为20:80的聚[双(对羧基苯氧基)丙烷:癸二酸](如GLIADEL中所用)；软骨素；甲壳质；和壳聚糖。

对于肿瘤障碍的治疗，本文公开的化合物可以与其他抗肿瘤或抗癌物质和/或与放射和/或光动力疗法和/或与手术治疗组合施用于需要治疗的患者以去除肿瘤。这些其他物质或治疗可与本文公开的化合物同时或在不同时间给予。例如，本文公开的化合物可与有丝分裂抑制剂诸如紫杉醇或长春花碱、烷化剂诸如环磷酰胺或异环磷酰胺、抗代谢物诸如5-氟尿嘧啶或羟基脲、DNA嵌入剂诸如阿霉素或博来霉素、拓扑异构酶抑制剂诸如依托泊苷或喜树碱、抗血管生成剂诸如血管抑素、抗雌激素诸如他莫昔芬和/或其他抗癌药物或抗体诸如分别例如GLEEVEC(Novartis Pharmaceuticals Corporation)和HERCEPTIN(Genentech,Inc.)或免疫治疗剂诸如伊匹单抗和硼替佐米组合使用。

在某些示例中，本文公开的化合物和组合物可在一个或多个解剖部位局部施用，例如不希望的细胞生长的部位(诸如肿瘤部位或良性皮肤生长，例如注射或局部应用于肿瘤或皮肤生长)，任选地与药学上可接受的载剂诸如惰性稀释剂组合。本文公开的化合物和组合物可全身施用，诸如静脉内或口服施用，任选地与药学上可接受的载剂诸如惰性稀释剂或用于口服递送的可同化的食用载剂组合。它们可被包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，可被压制成片剂，或可直接与患者饮食的食物混合。对于口服治疗施用，活性化合物可与一种或多种赋形剂组合，并以可摄入片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片、气溶胶喷雾等形式使用。

所公开的组合物是生物可利用的并且可口服递送。口服组合物可以是片剂、锭剂、丸剂、胶囊等，并且还可包含以下：粘结剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可添加甜味剂诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜，或调味剂诸如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可含有液体载剂，诸如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可作为包衣存在或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂诸如樱桃或橙调味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应当是药学上可接受的并且在所采用的量下基本上无毒。此外，可将活性化合物掺入持续释放制剂和装置中。

本文公开的化合物和组合物，包括其药学上可接受的盐或前药，可通过输注或注射静脉内、肌内或腹膜内施用。活性剂或其盐的溶液可在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇、三醋精以及它们的混合物中和在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。

适于注射或输注的药物剂型可包括包含活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，其适于临时制备任选地包封在脂质体中的无菌可注射或可输注溶液或分散体。最终剂型应当是无菌的、流体的并且在制造和储存条件下是稳定的。液体载剂或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯以及它们的合适混合物。适当的流动性可例如通过形成脂质体、在分散体的情况下通过维持所需的粒度或通过使用表面活性剂来维持。任选地，可通过各种其他抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。通过包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现可注射组合物的延长吸收。

通过将所需量的本文公开的化合物和/或药剂与上文列举的各种其他成分掺入适当溶剂中，根据需要，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上存在于先前无菌过滤的溶液中的任何附加的期望成分的粉末。

对于局部施用，本文公开的化合物和药剂可作为液体或固体形式应用。然而，通常期望将它们作为与皮肤病学可接受的载剂组合的组合物局部施用于皮肤，该载剂可以是固体或液体。本文公开的化合物和药剂以及组合物可局部施用于受试者的皮肤以减小恶性或良性生长物的大小(并且可包括完全去除)，或治疗感染部位。本文公开的化合物和药剂可直接应用于生长或感染部位。优选地，化合物和药剂以诸如软膏、霜剂、洗剂、溶液剂、酊剂等制剂应用于生长或感染部位。

有用的固体载剂包括精细分散的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载剂包括水、醇或二醇或水-醇/二醇混合物，其中化合物可以有效水平溶解或分散，任选地借助于无毒表面活性剂。可添加佐剂诸如香料和附加的抗微生物剂以优化给定用途的特性。所得液体组合物可从吸收垫应用，用于浸渍绷带和其他敷料，或使用例如泵型或气溶胶喷雾器喷雾到受影响区域上。

增稠剂诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料也可与液体载剂一起使用以形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，用于直接应用于使用者的皮肤。

本文公开的化合物和药剂以及药物组合物的有用剂量可通过比较它们在动物模型中的体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的。

组合物施用的剂量范围是大到足以产生影响症状或障碍的期望效果的剂量范围。剂量不应大到引起不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，并且可由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，剂量可由个别医师调整。剂量可变化，并且可每天一次或多次剂量施用，持续一天或几天。

还公开了包含本文公开的化合物与药学上可接受的载剂组合的药物组合物。包含一定量化合物的适于口服、局部或肠胃外施用的药物组合物构成优选的方面。施用于患者(特别是人)的剂量应当足以在合理的时间范围内在患者中实现治疗反应，而没有致死毒性，并且优选地引起不超过可接受水平的副作用或发病率。本领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包括受试者的状况(健康)、受试者的体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率、治疗比率以及病理状况的严重程度和阶段。

还公开了在一个或多个容器中包含本文公开的化合物的试剂盒。所公开的试剂盒可任选地包括药学上可接受的载剂和/或稀释剂。试剂盒可包括如本文所述的一种或多种其他组分、助剂或佐剂。试剂盒包括一种或多种抗癌剂，诸如本文所述的那些药剂。试剂盒可包括描述如何施用试剂盒的化合物或组合物的说明书或包装材料。试剂盒的容器可以是任何合适的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并且可以是任何合适的尺寸、形状或构型。本文公开的化合物和/或药剂可作为固体(诸如片剂、丸剂或粉末形式)提供在试剂盒中。本文公开的化合物和/或药剂可作为液体或溶液提供在试剂盒中。试剂盒可包括含有液体或溶液形式的本文公开的化合物和/或药剂的安瓿或注射器。

某些定义

如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种组合物”包括两种或更多种此类组合物的混合物，提及“一种药剂”包括两种或更多种此类药剂的混合物，提及“该组分”包括两种或更多种此类组分的混合物，等等。

术语“约”当紧接在数值之前时意指范围(例如，该值的加或减10％)。例如，“约50”可意指45至55，“约25,000”可意指22,500至27,500等。除非本公开的上下文另外指出，或者与此类解释不一致。例如，在诸如“约49、约50、约55、…”的数值列表中，“约50”意指延伸至小于前后值之间一半间隔的范围，例如，大于49.5至小于52.5。此外，短语“小于约”值或“大于约”值应当根据本文提供的术语“约”的定义来理解。类似地，术语“约”当在一系列数值或数值范围(例如，“约10、20、30”或“约10-30”)之前时分别指该系列中的所有数值或该范围的端点。

如本文所用，术语“环状细胞穿透肽”或“cCPP”是指促进将货物(例如治疗性部分)递送到细胞中的肽。

如本文所用，术语“内体逃逸载体”(EEV)是指通过化学连接(即，共价键或非共价相互作用)与接头和/或环外肽(EP)缀合的cCPP。EEV可以是式(B)的EEV。

如本文所用，术语“EEV-缀合物”是指通过化学连接(即，共价键或非共价相互作用)与货物缀合的本文定义的内体逃逸载体。货物可以是可通过EEV递送到细胞中的治疗性部分(例如，寡核苷酸、肽或小分子)。EEV-缀合物可以是式(C)的EEV-缀合物。

如本文所用，术语“环外肽”(EP)和“调节肽”(MP)可互换使用，是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基，其可与本文公开的环状细胞穿透肽(cCPP)缀合。当与本文公开的环肽缀合时，EP可改变化合物的组织分布和/或保留。典型地，EP包含至少一个带正电荷的氨基酸残基，例如至少一个赖氨酸残基和/或至少一个精氨酸残基。本文描述了EP的非限制性示例。EP可以是在本领域中被鉴定为“核定位序列”(NLS)的肽。核定位序列的非限制性示例包括SV40病毒大T抗原的核定位序列，其最小功能单元是七个氨基酸序列PKKKRKV、具有序列NLSKRPAAIKKAGQAKKKK的双分型核质蛋白NLS、具有氨基酸序列PAAKRVKLD或RQRRNELKRSF的c-myc核定位序列、来自输入蛋白-α的IBB域的序列RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV、肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP和PPKKARED、人p53的序列PQPKKKPL、小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP、流感病毒NS1的序列DRLRR和PKQKKRK、肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL和小鼠Mxl蛋白的序列REKKKFLKRR、人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK和类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK。国际公开号2001/038547描述了NLS的附加示例并且全文以引用方式并入本文。

如本文所用，“接头”或“L”是指将一个或多个部分(例如，环外肽(EP)和货物，例如寡核苷酸、肽或小分子)与环状细胞穿透肽(cCPP)共价结合的部分。接头可包含天然或非天然氨基酸或多肽。接头可以是含有两个或更多个适于将cCPP结合到货物部分从而形成本文公开的化合物的适当官能团的合成化合物。接头可包含聚乙二醇(PEG)部分。接头可包含一个或多个氨基酸。cCPP可经由接头与货物共价结合。

如本文所用，术语“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷酸或核苷的寡聚化合物。寡核苷酸的一个或多个核苷酸可被修饰。寡核苷酸可包括核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。寡核苷酸可由天然和/或经修饰的核碱基、糖和共价核苷间连接组成，并且可进一步包括非核酸缀合物。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指包含通过一个氨基酸的羧基基团与另一个氨基酸的α氨基基团连接的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。两个或更多个氨基酸残基可通过一个氨基酸的羧基基团与α氨基基团连接。多肽的两个或更多个氨基酸可通过肽键接合。多肽可包括肽主链修饰，其中两个或更多个氨基酸通过除肽键以外的键共价连接。多肽可包括一种或多种非天然氨基酸、氨基酸类似物或能够整合到多肽中的其他合成分子。术语多肽包括天然存在的和人工存在的氨基酸。术语多肽包括例如包含约2至约100个氨基酸残基的肽以及包含超过约100个氨基酸残基或超过约1000个氨基酸残基的蛋白质，包括但不限于治疗性蛋白质，诸如抗体、酶、受体、可溶性蛋白质等。

术语“治疗性多肽”指具有治疗、预防或其他生物活性的多肽。治疗性多肽可以任何合适的方式产生。例如，治疗性多肽可从天然存在的环境中分离或纯化，可化学合成，可重组产生，或它们的组合。

术语“小分子”是指具有药理学活性且分子量小于约2000道尔顿、或小于约1000道尔顿、或小于约500道尔顿的有机化合物。小分子治疗剂通常通过化学合成来制造。

如本文所用，术语“邻接”是指通过共价键连接的两个氨基酸。例如，在代表性环状细胞穿透肽(cCPP)诸如AA₁/AA₂、AA₂/AA₃、AA₃/AA₄和AA₅/AA₁的情况下举例说明了邻接氨基酸对。

如本文所用，化学物质的残基是指存在于特定产物中的化学物质的衍生物。为了形成产物，该物质的至少一个原子被与另一部分的键取代，使得产物含有该化学物质的衍生物或残基。例如，本文所述的环状细胞穿透肽(cCPP)具有通过形成一个或多个肽键而掺入其中的氨基酸(例如，精氨酸)。掺入cCPP中的氨基酸可称为残基，或简单地称为氨基酸。因此，精氨酸或精氨酸残基是指/>

术语“其质子化形式”是指氨基酸的质子化形式。例如，精氨酸侧链上的胍基可被质子化以形成胍鎓基团。质子化形式的精氨酸的结构是

如本文所用，术语“手性”是指具有多于一种在原子的三维空间排列上不同的立体异构体的分子，其中一种立体异构体是另一种立体异构体的不可重叠的镜像。除了甘氨酸外，氨基酸具有与羧基基团相邻的手性碳原子。术语“对映体”是指手性的立体异构体。手性分子可以是具有“D”和“L”对映体的氨基酸残基。没有手性中心的分子，诸如甘氨酸，可被称为“非手性的”。。

如本文所用，术语“疏水的”是指不溶于水或在水中溶解度极小的部分。通常，中性部分和/或非极性部分，或者主要是中性和/或非极性的部分是疏水的。疏水性可通过本文以下公开的方法之一来测量。

如本文所用，“芳族”是指具有4n+2π电子的不饱和环分子，其中n是任何整数。术语“非芳族”是指不属于芳族定义的任何不饱和环分子。

“烷基”、“烷基链”或“烷基基团”是指具有一至四十个碳原子且通过单键与分子的其余部分连接的完全饱和的直链或支链烃链基团。包括包含1至40个碳原子的任何数量的烷基。包含至多40个碳原子的烷基是C₁-C₄₀烷基，包含至多10个碳原子的烷基是C₁-C₁₀烷基，包含至多6个碳原子的烷基是C₁-C₆烷基，并且包含至多5个碳原子的烷基是C₁-C₅烷基。C₁-C₅烷基包括C₅烷基、C₄烷基、C₃烷基、C₂烷基和C₁烷基(即，甲基)。C₁-C₆烷基包括上文对于C₁-C₅烷基所述的所有部分，但也包括C₆烷基。C₁-C₁₀烷基包括上文对于C₁-C₅烷基和C₁-C₆烷基所述的所有部分，但也包括C₇、C₈、C₉和C₁₀烷基。类似地，C₁-C₁₂烷基包括所有前述部分，但也包括C₁₁和C₁₂烷基。C₁-C₁₂烷基的非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、仲丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基基团可任选地被取代。

“亚烷基”、“亚烷基链”或“亚烷基基团”是指具有一至四十个碳原子的完全饱和的直链或支链二价烃链基团。C₂-C₄₀亚烷基的非限制性示例包括亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烷基链可任选地被取代。

“烯基”、“烯基链”或“烯基基团”是指具有二至四十个碳原子并具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃链基团。每个烯基基团通过单键与分子的其余部分附接。包括包含2至40个碳原子的任何数量的烯基基团。包含至多40个碳原子的烯基是C₂-C₄₀烯基，包含至多10个碳原子的烯基是C₂-C₁₀烯基，包含至多6个碳原子的烯基是C₂-C₆烯基，并且包含至多5个碳原子的烯基是C₂-C₅烯基。C₂-C₅烯基包括C₅烯基、C₄烯基、C₃烯基和C₂烯基。C₂-C₆烯基包括上文关于C₂-C₅烯基所述的所有部分，但也包括C₆烯基。C₂-C₁₀烯基包括上文对于C₂-C₅烯基和C₂-C₆烯基所述的所有部分，但也包括C₇、C₈、C₉和C₁₀烯基。类似地，C₂-C₁₂烯基包括所有前述部分，但也包括C₁₁和C₁₂烯基。C₂-C₁₂烯基的非限制性示例包括乙烯基(ethenyl/vinyl))、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-己烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基、9-癸烯基、1-十一烯基、2-十一烯基、3-十一烯基、4-十一烯基、5-十一烯基、6-十一烯基、7-十一烯基、8-十一烯基、9-十一烯基、10-十一烯基、1-十二烯基、2-十二烯基、3-十二烯基、4-十二烯基、5-十二烯基、6-十二烯基、7-十二烯基、8-十二烯基、9-十二烯基、10-十二烯基和11-十二烯基。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基基团可任选地被取代。

“亚烯基”、“亚烯基链”或“亚烯基基团”是指具有二至四十个碳原子并且具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链二价烃链基团。C₂-C₄₀亚烯基的非限制性示例包括乙烯、丙烯、丁烯等。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烯基链可以是任选的。

“烷氧基”或“烷氧基基团”是指基团-OR，其中R是如本文所定义的烷基、烯基、炔基、环烷基或杂环基。除非在说明书中另有具体说明，否则烷氧基基团可任选地被取代。

“酰基”或“酰基基团”是指基团-C(O)R，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、碳环基或杂环基，如本文所定义。除非在说明书中另有具体说明，否则酰基可任选地被取代。

“烷基氨基甲酰基”或“烷基氨基甲酰基基团”是指基团-O-C(O)-NR_aR_b，其中R_a和R_b相同或不同并且独立地是如本文所定义的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基，或R_aR_b可合一起形成如本文所定义的环烷基基团或杂环基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基氨基甲酰基基团可任选地被取代。

“烷基羧酰胺基”或“烷基羧酰胺基基团”是指基团-C(O)-NR_aR_b，其中R_a和R_b相同或不同并且独立地是如本文所定义的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、环炔基或杂环基基团，或R_aR_b可合一起形成如本文所定义的环烷基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基羧酰胺基基团可任选地被取代。

“芳基”是指包含氢、6至18个碳原子和至少一个芳环的烃环体系基团。为了本发明的目的，芳基基团可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可包括稠环或桥环体系。芳基包括但不限于衍生自醋蒽烯(aceanthrylene)、苊烯(acenaphthylene)、醋菲烯(acephenanthrylene)、蒽、薁(azulene)、苯、屈(chrysene)、荧蒽(fluoranthene)、芴、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、非那烯(phenalene)、菲、七曜烯(pleiadene)、芘和苯并菲的芳基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则术语“芳基”意指包括任选取代的芳基基团。

“杂芳基”是指包含氢原子、一至十三个碳原子、一至六个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳环的5至20元环体系基团。为了本发明的目的，杂芳基基团可以是单环、双环、三环或四环环体系，其可包括稠环或桥环体系；并且杂芳基基团中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。示例包括但不限于氮杂环庚烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯基、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氧杂环己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、异喹啉基、中氮茚基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、2-氧代氮杂环庚烯基、噁唑基、环氧乙烷基、1-氧吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基、1-氧化哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和苯硫基(即噻吩基)。除非在说明书中另有具体说明，否则杂芳基基团可任选地被取代。

本文所用的术语“取代的”意指其中至少一个原子被非氢原子替换的任何上述基团(即，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、酰基、烷基氨基甲酰基、烷基羧酰胺基、烷氧羰基、烷硫基或芳硫基)，该非氢原子诸如但不限于：卤素原子，诸如F、Cl、Br和I；基团诸如羟基基团、烷氧基基团和酯基团等中的氧原子；基团诸如硫醇基团、硫代烷基基团、砜基团、磺酰基基团和亚砜基团中的硫原子；基团诸如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺中的氮原子；基团诸如三烷基甲硅烷基基团、二烷基芳基甲硅烷基基团、烷基二芳基甲硅烷基基团和三芳基甲硅烷基基团中的硅原子；以及各种其他基团中的其他杂原子。“取代的”还意指其中一个或多个原子被与杂原子(诸如氧代、羰基、羧基和酯基团中的氧)的高阶键(例如双键或三键)替换的任何上述基团；以及基团诸如亚胺、肟、腙和腈中的氮。例如，“取代的”包括其中一个或多个原子被-NR_gR_h、-NR_gC(＝O)R_h、-NR_gC(＝O)NR_gR_h、-NR_gC(＝O)OR_h、-NR_gSO₂R_h、-OC(＝O)NR_gR_h、-OR_g、-SR_g、-SOR_g、-SO₂R_g、-OSO₂R_g、-SO₂OR_g、＝NSO₂R_g和-SO₂NR_gR_h替换的任何上述基团。“取代的”还意指其中一个或多个氢原子被-C(＝O)R_g、-C(＝O)OR_g、-C(＝O)NR_gR_h、-CH₂SO₂R_g、-CH₂SO₂NR_gR_h替换的任何上述基团。在上文中，R_g和R_h相同或不同，并且独立地是氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基。“取代的”还意指其中一个或多个原子被氨基、氰基、羟基、亚氨基、硝基、氧代、硫代、卤代、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烯基、环炔基、环烷基烷基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基替换的任何上述基团。“取代的”还可意指侧链上的一个或多个原子被烷基、烯基、炔基、酰基、烷基羧酰胺基、烷氧羰基、碳环基、杂环基、芳基或杂芳基替换的氨基酸。此外，前述取代基中的每一者还可任选地被上述取代基中的一者或多者取代。

如本文所用，“受试者”是指个体。因此，“受试者”可包括驯养动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟。“受试者”还可包括哺乳动物，诸如灵长类动物或人。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生(例如，医师)的治疗下的受试者。

术语“抑制”是指活性、反应、病症、疾病或其他生物参数的降低。这可包括但不限于活性、反应、病症或疾病的完全消除。这还可包括，例如，与天然或对照水平相比，活性、反应、病症或疾病减少10％。因此，减少可以是与天然或对照水平相比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何量的减少。

“减少”或该词的其他形式，诸如“减少(reducing)”或“减少(reduction)”，意指事件或特征(例如，肿瘤生长)的降低。应当理解，这通常与一些标准或预期值有关，换句话讲，它是相对的，但并不总是需要参考标准或相对值。例如，“减少肿瘤生长”意指相对于标准或对照(例如，未治疗的肿瘤)减少肿瘤的生长速率。

术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或障碍而对患者进行的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或障碍的治疗，并且还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或障碍的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即旨在缓解症状而非治愈疾病、病理状况或障碍的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理状况或障碍的特定疗法的治疗。

术语“治疗有效”是指所用组合物的量足以改善疾病或障碍的一种或多种病因或症状。此类改善仅需要减少或改变，而不必消除。

术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“载剂”意指化合物、组合物、物质或结构，当与化合物或组合物组合时，其有助于或促进化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或用于其预期用途或目的的任何其他特征。例如，可选择载剂以使活性成分的任何降解最小化并使受试者中的任何不良副作用最小化。

如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及用于在临近使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒介物的示例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯诸如油酸乙酯。适当的流动性可例如通过使用包衣材料诸如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持。这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可期望包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可注射制剂可例如通过经细菌截留过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，该无菌固体组合物可在临近使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载剂可包括糖诸如乳糖。

表10

实施例

实施例1.含有精氨酸衍生物及其缀合物的cCPP的设计和合成

材料和一般方法。用于肽合成的试剂和Rink酰胺树脂(100-200目，0.54mmol/g)购自商业供应商。通过分析型HPLC评估肽的纯度，并通过ESI质谱分析确认其身份。

cCPP设计。精氨酸已被认为是细胞穿透肽造成全身器官毒性的重要因素。精氨酸残基由于侧链上的胍鎓官能团而被质子化，并在生理pH下具有正电荷。这种正电荷促进与血浆和内溶酶体膜两者的相互作用，这使得内吞作用和内体逃逸以将货物形态递送到细胞质中。将在生理pH下可带正电荷的另选残基掺入环状支架中并如表11和图1所列进行制备。胍鎓官能团还能够与质膜上的磷脂形成二齿氢键相互作用，并且应当理解，这对于有效的膜缔合和随后的内化是必需的。由于增加的正电荷数量导致增加的全身毒性，因此提出能够形成二齿氢键相互作用而没有正电荷的精氨酸替换物将保持活性，同时降低毒性，如表11和图1中所列。

表11.包含另选残基的环肽。

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Agp＝L-2-氨基-3-胍基丙酸，Agb＝L-2-4-胍基丁酸，hR＝L-高精氨酸，4gp＝4-胍基-L-苯丙氨酸，Cit＝瓜氨酸，Pia＝3-(4-哌啶基)-L-丙氨酸，Dml＝N-二甲基-L-赖氨酸，B＝β-丙氨酸。小写字母表示D-氨基酸。

寡核苷酸设计。反义化合物(AC)被设计成跳跃小鼠抗肌萎缩蛋白前mRNA中的外显子23，从而导致形成抗肌萎缩蛋白的内部截短形式，以评估利用组合物来解决Duchenne型肌营养不良(DMD)的mdx小鼠模型中的疾病状态的可行性。AC是仅由二氨基磷酸酯吗啉代碱基组成的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)，其中缀合的一个序列是5’-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3’。

细胞穿透肽。包含序列乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-PEG₂-Lys(环[Phe-D-Phe-2-Nal-Cit-D-Arg-Cit-D-Arg-γ-Glu)-PEG₁₂-Lys(N₃)-NH₂的细胞穿透肽(“化合物1b”)被配制为TFA盐。

合成。使用标准Fmoc化学合成肽。

1.将DMF添加到含有Rink酰胺MBHA树脂(0.3mmol，0.87g，小于：0.35mmol/g)的容器中并溶胀2小时。

2.排干，然后用DMF洗涤30秒，共3次。

3.添加20％哌啶/DMF并混合30分钟。

4.排干，然后用DMF洗涤30秒，共5次。

5.添加Fmoc-氨基酸溶液并混合30秒，然后添加偶联试剂，同时N₂鼓泡30分钟。

6.对下一个氨基酸偶联重复步骤2至5。

7.偶联后，将树脂用MeOH洗涤3次并在减压下干燥。

表12

将20％哌啶的DMF溶液用于Fmoc脱保护30分钟。将Dde通过3％NH₂NH₂/DMF去除两次，每次30分钟。通过Pd(PPh₃)₄和PhSiH₃去除烯丙基。通过茚三酮测试监测偶联反应，并用DMF洗涤树脂5次。

肽切割和纯化：

1.在室温下将切割缓冲液(95％TFA/2.5％TIS/2.5％H₂O)添加到含有侧链保护肽的烧瓶中并搅拌2.0小时。

2.用冷异丙醚沉淀肽并离心(3000rpm下3分钟)。

3.异丙醚再洗涤两次。

4.在真空下干燥粗肽2小时。

5.通过制备型HPLC(A：0.075％TFA的H₂O溶液，B：ACN)纯化粗肽，得到终产物(145.6mg，97.4％纯度，15.1％产率)。通过分析型UPLC/MS确认纯度和身份。

cCPP-PMO缀合物的制备。经由应变促进的炔-叠氮化物环加成将肽-PMO制备为3'缀合物。简而言之，将肽-叠氮化物在无核酸酶水(1mM)中的溶液添加到PMO-3'-环辛炔或环辛炔-5'-PMO固体中。将混合物涡旋以溶解肽-PMO缀合物，离心以沉降溶液，并且在室温下孵育8-12小时以完成，如通过LCMS(Q-TOF)确认的。为了纯化，将粗混合物用DMSO稀释，上样到C18反相柱(150mm*21.2mm)上，流速为20mL/min，并通过使用含0.05％TFA的水和乙腈作为溶剂的适当梯度进行纯化。合并期望的级分，用1N NaOH将溶液的pH调节至5-6，并将溶液冻干，得到白色粉末。对于体外和体内制剂，将缀合物在适当量的无菌PBS或无菌盐水中重构至期望浓度(2-10mg/mL)。所有材料储存在-80℃直至使用。

实施例2.使用氯烷烃渗透测定确定细胞渗透活性。

测定设计。产生稳定表达HaloTag-ActA融合蛋白(“HEK293-HaloTag”)的HEK293细胞，这确保融合蛋白在暴露于细胞溶胶时定位于线粒体膜的外部。HaloTag蛋白迅速与短的含氯烷烃的化合物共价反应，从而占据活性位点并阻止进一步反应。氯烷烃渗透测定在脉冲追踪测定中利用这种反应性，其中首先用感兴趣的cCPP-氯烷烃处理细胞，随后与细胞可渗透荧光染料四甲基罗丹明-氯烷烃(“TMR-ct”)一起孵育。如果cCPP已进入胞质溶胶，它们将与HaloTag反应并阻止其与TMR-ct反应。因此，化合物的相对细胞穿透效率可通过它们在清除期后减少细胞TMR荧光的能力来确定，其中该值表示为IC₅₀。

细胞穿透肽。将具有表13(下文)中所示序列的细胞穿透肽在赖氨酸残基上用序列N¹-(2-(2-((5-氯己基)氧基)乙氧基)乙基-N⁴-(2-(2-(2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)琥珀酰胺(在表13中称为“氯烷烃”)的氯烷烃标签官能化，纯化，并制备为在DMSO中的储备溶液，其中浓度由A₂₈₀或重量(如适用)确定。

细胞穿透效率的确定。将待评价的化合物制备为在DMSO中的储备溶液，并在添加到HEK293-HaloTag细胞之前在PBS中稀释为从30μM至0.5nM的系列稀释液。将细胞与给定浓度的化合物在FBS的存在下于37℃孵育24小时。孵育后，将细胞用PBS充分洗涤，并向细胞中添加含有5μMTMR-ct的新鲜无血清培养基并孵育30分钟。孵育后，将细胞洗涤并在新鲜培养基中孵育以洗出任何未反应的TMR-ct。然后使用高含量成像对细胞进行成像并定量细胞荧光。将值归一化为媒介物处理的细胞，并使用GraphPad PRISM v.8中的4参数对数拟合计算IC₅₀。

结果。来自HaloTag实验的数据支持包含中性残基的多种精氨酸衍生物(参见图1)，诸如瓜氨酸，对于在哺乳动物细胞中实现cCPP的细胞穿透和胞质递送而言，等同于或优于精氨酸(表13)。

表13.包含精氨酸替换物的环肽的细胞穿透效率。

ID	序列	HaloTag IC50(μM)
			EEV12	环(FfФRrRrQ)-PEG4-K(氯烷烃)-NH2	0.792
化合物A	环(FfФ-Agp-r-Agp-rQ)-PEG4-K(氯烷烃)-NH2	0.626
			化合物B	环(FfФ-Agb-r-Agb-rQ)-PEG4-K(氯烷烃)-NH2	0.695
化合物C	环(FfФ-hR-r-hR-rQ)-PEG4-K(氯烷烃)-NH2	0.786
			化合物D	环(FfФ-4gp-r-4gp-rQ)-PEG4-K(氯烷烃)-NH2	0.695
化合物1a	环(FfФ-Cit-r-Cit-rQ)-PEG4-K(氯烷烃)-NH2	0.849
			化合物2a	环(FfФ-Pia-r-Pia-rQ)-PEG4-K(氯烷烃)-NH2	0.881
化合物3a	环(FfФ-Dml-r-Dml-rQ)-PEG4-K(氯烷烃)-NH2	0.932

实施例3.精氨酸衍生物cCPP的体外细胞毒性和膜溶解活性。

细胞系。使用人成纤维细胞(“WI38”)、人原代肾近端小管上皮细胞(“RPTEC”)、人脐静脉内皮细胞(“HUVEC”)和人外周血单核细胞(“PBMC”)的混合物。

细胞活力。如前所述合成化合物并制备为在DMSO中的储备溶液。将化合物在无菌盐水中连续稀释至期望浓度，并添加到在含有10％FBS的完全生长培养基中铺板的WI38、RPTEC、HUVEC或PBMC中，并在37℃下孵育24小时。24小时后，使用CellTiter-Glo 2.0(WI38)或CyQuant Green(RPTEC、HUVEC、PBMC)按照制造商的方案评估细胞活力。针对活力给出的值是相对于媒介物处理的对照作为100％活力给出的。

LDH释放。评估cCPP破坏质膜并引起LDH释放的能力。将WI38、RPTEC和HUVEC细胞维持在补充有10％FBS的完全生长培养基中，并且用从DMSO储备溶液在PBS中以指定浓度连续稀释的化合物在37℃、5％CO₂下处理1小时。1小时后，将来自每孔的50μL细胞培养基转移到透明96孔板中，并与50μL的LDH反应混合物组合，并在室温下孵育30分钟。30分钟后。将该反应用50μL终止溶液淬灭，并测量490nm处的吸光度并使用680nm处的吸光度校正背景。所给出的值是相对于代表100％LDH活性的用1％Triton-X100裂解的细胞。

结果。用化合物1b(Ac-PKKKRKV-PEG₂-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-r-Q]-PEG₁₂-K(N₃)-NH₂)处理导致WI38、HUVEC和hPBMC中细胞活力的非显著损失，包括没有可检测的LDH释放，表明在化合物处理后没有可测量的膜损伤。用精氨酸类似物瓜氨酸替换精氨酸残基降低了对RPTEC的毒性(化合物1b对EEV12)，甚至在由于环外残基而携带更多总正电荷的分子的情况下也是如此。结果示于图3-图8中。

实施例4.含有精氨酸衍生物的cCPP的体内耐受性和功效。

小鼠。雄性C57BL/6小鼠用于耐受性实验。功效研究使用C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(MDX)小鼠，其含有C至T突变，导致在X染色体上的抗肌萎缩蛋白基因(Dmd)的外显子23内2983位的终止密码子。表达该突变等位基因的小鼠产生最小的抗肌萎缩蛋白mRNA产物和抗肌萎缩蛋白，并且因此是Duchenne氏肌营养不良(“DMD”)的模型。

研究设计。cCPP和cCPP-AC缀合物如实施例2中所述使用表6中列出的序列进行制备和表征，并且具有图3所示的结构。对于在C57BL/6小鼠中的耐受性研究，使用没有缀合的cCPP。对于在mdx小鼠中的功效研究，cCPP-AC缀合物包括来自表6的序列和具有序列5’-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3’的AC。所得的缀合物包含EEV12和AC(“EEV-MDX-PMO-1”)或化合物1b(Ac-PKKKRKV-PEG2-Lys(环[FfФ-Cit-r-Cit-r-Q]-PEG₁₂-K(N₃)-NH₂和AC(“EEV1-PMO-MDX-2”)。对于耐受性研究，将化合物配制在无菌盐水pH7.2中，并基于动物的体重以5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg的剂量经由IV注射施用于C57BL/6小鼠。注射后15分钟收集血清，并在液氮中速冻并储存在-80℃用于进一步分析。对于功效研究，将缀合物配制在无菌盐水pH7.2中，并基于动物的体重以15mg/kg、30mg/kg和40mg/kg的剂量经由IV注射施用于mdx小鼠。注射后7天，处死动物并收获指定组织，在液氮中速冻并储存在-80℃用于将来的处理。

组胺水平的定量。施用化合物后血清组胺水平的增加可指示全身性过敏反应或其可阻碍成功的化合物开发，因为它们表现为有害的临床观察。将在C57BL/6小鼠中IV化合物施用后15分钟获得的血清样品中的组胺使用异硫氰酸苯酯(PITC)在PITC:乙醇:吡啶的0.1:1:10混合物中在室温下衍生化10分钟，生成苯基硫代氨基甲酰基(PTC)组胺。将样品干燥并在0.1％甲酸的乙腈溶液中重构，然后色谱分离并使用ESI-MS使用247.1-154.1m/z的MRM跃迁进行检测。使用内部PTC-组胺对照进行定量，并且值表示为ng/mL血清组胺。

通过RT-PCR检测剪接校正。PMO的递送可改变剪接，并在外显子23跳跃后产生截短的抗肌萎缩蛋白mRNA。通过RT-PCR测量剪接校正过程的检测，其中首先将从组织提取的RNA逆转录成cDNA，并通过巢式PCR使用两个引物组进一步分析：用于第一轮PCR的正向引物5’-CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG-3'和反向引物5’-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3'(外部引物组)以及用于第二轮PCR的正向引物5’-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3'和反向引物5’-CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3'(内部引物组)。没有剪接校正的组织的RT-PCR读出产生901bp基因片段，并且在剪接校正之后出现新的689bp基因片段。使用以下等式计算通过RT-PCR检测的剪接校正的程度(百分比)：％校正＝(689bp片段条带的强度)/(901bp片段条带的强度+689bp片段条带的强度)。

通过Western印迹检测抗肌萎缩蛋白表达。将裂解缓冲液(9％SDS、4％甘油、5mMTris和5％β-巯基乙醇，以及HALT蛋白酶抑制剂)添加到来自小鼠心脏、横腹肌、四头肌或横膈膜的切碎的小鼠组织中。将金属珠与Qiagen Tissuelyser联合使用以将组织机械匀浆。通过离心澄清裂解物，并将上清液使用3％-8％Tris乙酸盐凝胶进行SDS-PAGE，随后转移至硝化纤维膜并进行western印迹，随后使用LICOR系统进行荧光成像，或使用66-440kDa毛细管基质进行Jess Simple Western系统分析。使用来自Abcam的抗-抗肌萎缩蛋白抗体(Ab52777或Ab154168)检测抗肌萎缩蛋白；使用来自R&D Systems(MAB8279)或Abcam(ab68167)的抗α-辅肌动蛋白抗体检测α-辅肌动蛋白。使用LICOR软件定量传统的western印迹条带。拟合Jess Simple Western峰，并使用Simple Western软件计算峰下面积。每次运行包括使用由来自各自组织的不同量的mdx小鼠裂解物稀释的野生型小鼠裂解物的标准曲线。将每个样品中检测到的抗肌萎缩蛋白归一化至作为上样对照的α-辅肌动蛋白，并且对标准曲线进行线性回归，其用于确定每个样品中抗肌萎缩蛋白的量，作为野生型抗肌萎缩蛋白水平的百分比。

结果。如图9所示，用精氨酸类似物替换精氨酸残基能够显著降低IV施用后的血清组胺水平。用5mg/kg化合物1b处理后的组胺释放比5mg/kg EEV12低约3倍，尽管化合物1b具有7个总正电荷，但在cCPP基序内的精氨酸残基少2个。观察到与5mg/kg EEV12相当的组胺释放需要20mg/kg化合物1b的剂量。由于用非带正电荷的瓜氨酸残基替换精氨酸残基，化合物1b具有显著增强的耐受性。这种耐受性实现更高的剂量而没有不良反应。精氨酸残基的掺入还保留或增强了mdx小鼠中的体内功效，如通过RT-PCR确定的。相对于30mg/kg EEV-MDX-PMO-1，在所有所评价的组织中，包括如图10A-E中所描绘的横腹肌、心脏、横膈膜、胫骨前肌和四头肌，用40mg/kg EEV-MDX-PMO-2处理(基于PMO浓度)导致显著增强的外显子23跳跃。mdx小鼠中的外显子跳跃效率进一步转化为跨越横腹肌、心脏、横膈膜、胫骨前肌和四头肌的稳健抗肌萎缩蛋白产物，如通过Western印迹确定的和如图11中描绘的。这些发现证明，用保留精氨酸独特的氢键能力但不带正电荷的另选残基替换精氨酸能够使cCPP细胞可渗透并且能够成功地将货物形态体内递送至胞质溶胶和细胞核。

实施例5：含有甘氨酸的cCPP的体内功效。

如上所述，功效研究使用C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(MDX)小鼠，其含有C至T突变，导致在X染色体上的抗肌萎缩蛋白基因(Dmd)的外显子23内2983位的终止密码子。表达该突变等位基因的小鼠产生最小的抗肌萎缩蛋白mRNA产物和抗肌萎缩蛋白，并且因此是Duchenne氏肌营养不良(“DMD”)的模型。

研究设计。为了在mdx小鼠中进行功效研究，cCPP和cCPP-AC缀合物如实施例2中所述进行制备并表征，具有图2和图12所示的结构。AC具有序列5’-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3’。化合物4b具有序列Ac-PKKKRKV-Lys(FfΦ-G-r-G-rQ)-PEG₁₂-K(N₃)-NH₂。-所得缀合物为EEV-MDX-PMO-3。

将缀合物配制在无菌盐水pH7.2中，并基于动物的体重以40mg/kg的剂量经由IV注射施用于mdx小鼠。注射后3天，处死动物并收获指定组织，在液氮中速冻并储存在-80℃用于将来的处理。

通过RT-PCR检测剪接校正。PMO的递送可改变剪接，并在外显子23跳跃后产生截短的抗肌萎缩蛋白mRNA。通过RT-PCR测量剪接校正过程的检测，其中首先将从组织提取的RNA逆转录成cDNA，并通过巢式PCR使用两个引物组进一步分析：用于第一轮PCR的正向引物5’-CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG-3'和反向引物5’-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3'(外部引物组)以及用于第二轮PCR的正向引物5’-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3'和反向引物5’-CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3'(内部引物组)。没有剪接校正的组织的RT-PCR读出产生901bp基因片段，并且在剪接校正之后出现新的689bp基因片段。使用以下等式计算通过RT-PCR检测的剪接校正的程度(百分比)：％校正＝(689bp片段条带的强度)/(901bp片段条带的强度+689bp片段条带的强度)。

通过Western印迹检测抗肌萎缩蛋白表达。将裂解缓冲液(9％SDS、4％甘油、5mMTris和5％β-巯基乙醇，以及HALT蛋白酶抑制剂)添加到来自小鼠心脏、横腹肌、四头肌或横膈膜的切碎的小鼠组织中。将金属珠与Qiagen Tissuelyser联合使用以将组织机械匀浆。通过离心澄清裂解物，并将上清液使用3％-8％Tris乙酸盐凝胶进行SDS-PAGE，随后转移至硝化纤维膜并进行western印迹，随后使用LICOR系统进行荧光成像，或使用66-440kDa毛细管基质进行Jess Simple Western系统分析。使用来自Abcam的抗-抗肌萎缩蛋白抗体(Ab52777或Ab154168)检测抗肌萎缩蛋白，使用来自Cell Signaling Technology的HSP90抗体(4877)检测HSP90。使用LICOR软件定量传统的western印迹条带。拟合Jess SimpleWestern峰，并使用Simple Western软件计算峰下面积。每次运行包括使用由来自各自组织的不同量的mdx小鼠裂解物稀释的野生型小鼠裂解物的标准曲线。将每个样品中检测到的抗肌萎缩蛋白归一化至作为上样对照的HSP90。

结果。用甘氨酸替换精氨酸残基保留或增强了mdx小鼠中的体内功效，如通过RT-PCR确定的。在静脉内注射40mpk的EEV-MDX-PMO-2和40mpk的EEV-MDX-PMO-3后3天在mdx小鼠中外显子23跳跃的PCR琼脂糖凝胶图像示于图13中。与40mg/kg EEV-MDX-PMO-2(基于PMO浓度)相比，在所有所评价的组织中，包括如图14A-C中描绘的四头肌、横膈膜和心脏，用40mg/kg EEV-MDX-PMO-3(基于PMO浓度)处理导致如通过外显子23跳跃测量的类似水平的功效。mdx小鼠中的外显子跳跃效率进一步转化为跨越这些组织的稳健抗肌萎缩蛋白产物，如通过Western印迹确定的和如图15A-D中描绘的。这些发现证明，用甘氨酸残基替换精氨酸能够使cCPP细胞可渗透并且能够成功地将货物形态体内递送至胞质溶胶和细胞核。

实施例6：与寡核苷酸缀合的细胞穿透肽在hDMD和CD1小鼠模型以及非人灵长类动 物(NHP)中用于DMD外显子44的剪接校正的用途

目的：本研究采用hDMD和CD1小鼠模型以及NHP模型来研究包含反义化合物和细胞穿透肽的化合物的作用。每种化合物含有环外序列PKKKRKV。

所评价的化合物：本研究中评价的化合物示于表14中

表14.本研究中评价的化合物

下面提供了EEV-PMO-DMD44-1、2和3的结构。EEV-PMO-DMD44-1、2和3根据图18A(EEV-PMO-DMD44-1)、图18B(EEV-PMO-DMD44-2)和图18C(EEV-PMO-DMD44-3)的方案来合成。

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化合物合成和纯化：根据以下程序合成化合物。使TFA-赖氨酸保护的cCPP与表14的AC反应，随后脱保护以提供cCPP-AC缀合物。简而言之，通过使cCPP与HATU(2.0当量)和DIPEA(2.0当量)在DMSO(10mM，1.8mL)中反应来将其预激活。在室温下10分钟后，将预激活的溶液与AC在DMSO中的溶液(10mM，1.8mL)组合并充分混合。将反应在室温下孵育2小时。通过LCMS(Q-TOF)监测反应，使用BEH C18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)，缓冲液A：水(0.1％FA)，缓冲液B：乙腈(0.1％FA)，流速：0.4mL/min，从2％缓冲液B开始并在3.4分钟内逐渐增加至98％。完成后，通过用0.2M KCl(水溶液)pH12(36mL)稀释反应混合物来引发TFA-保护的赖氨酸的原位脱保护。使用上述分析方法，通过LCMS(Q-TOF)监测反应。将粗混合物直接上样到C18反相柱(Oligo clarity柱，150mm*21.2mm)上。然后使用含0.1％FA和乙腈的水作为溶剂并以20mL/min的流速，在60min内使用5％-20％的梯度纯化粗产物。合并含有期望产物的级分，并使用0.5M NaOH将溶液的pH调节至7。将溶液冷冻并冻干，得到白色粉末。通过在1M NaCl水溶液中重构cCPP-AC缀合物并通过3-kD MW-截止微管重复洗涤(以3500rpm离心20-40min)，用氯化物交换甲酸盐。该过程用1M NaCl进行三次，并用盐水(0.9％NaCl，无菌，无内毒素)进行三次。评估最后滤液的电导率以确认适当的盐浓度。将溶液进一步用盐水稀释至期望的制剂浓度，并在生物安全柜中无菌过滤。过滤后重新测量每种制剂的浓度。

获得EEV-PMO-DMD44-1，产率为74％。通过液相色谱-质谱四极飞行时间质谱(QTOF-LCMS)评估每种制剂的纯度和身份。EEV-PMO-DMD44-1通过RP-FA确定为99％纯，并且通过CEX确定为78％纯。C₄₁₁H₆₆₁N₁₇₃O₁₃₀P₂₄的MW计算值为10849.26。通过QTOF-LCMS鉴定的MW为10850.95。进一步测定制剂的内毒素量、残留游离肽、FA含量和pH。

获得EEV-PMO-DMD44-2，产率为70％。通过QTOF-LCMS评估每种制剂的纯度和身份。EEV-PMO-DMD44-2通过RP-FA确定为99％纯，并且通过CEX确定为78％纯。C₄₁₁H₆₆₁N₁₇₃O₁₃₀P₂₄的MW计算值为10849.26。通过QTOF-LCMS鉴定的MW为10850.88。

获得EEV-PMO-DMD44-3，产率为68％。通过QTOF-LCMS评估每种制剂的纯度和身份。EEV-PMO-DMD44-3通过RP-FA确定为86.3％纯(杂质为未反应的AC)。C₄₂₂H₆₆₉N₁₇₃O₁₃₀P₂₄的MW计算值为10989.45。通过QTOF-LCMS鉴定的MW为10990.07。

方法：

hDMD小鼠模型：hDMD小鼠购自Jackson Lab(STOCK Tg(DMD)72Thoen/J；保藏号：018900)并在室内繁殖。在Transnetyx处对半合子小鼠进行进一步基因分型。所有组通过静脉内(iv)注射以5mL/kg/只动物给药，并在注射后5天后处死。通过CO₂窒息对所有动物实施安乐死，随后经由心脏穿刺进行终末血液收集。将最大可获得体积的全血收集到肝素锂管中并处理成血浆。通过Testing Facility(IDEXX)分析一部分血浆的临床化学特性，并将其余部分在标称-70℃冷冻储存。收集组织(三头肌、TA、横膈膜、心脏、肾、肝、脑)，并在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃下用于进一步评价外显子跳跃和药物浓度测量。将动物进行年龄匹配并根据表15分配到八(8)个处理组中。组1-1(3只同型hDMD小鼠，6周龄)、组1-2(3只同型hDMD小鼠，6周龄)、组1-3(1只雄性，1只雌性，半型hDMD，11周龄)、组1-4(1只雄性，1只雌性，半型DMD，11周龄)分别接受10、20、40和80毫克/千克体重(mpk)的EEV-PMO-DMD44-1。组2-1(3只同型hDMD小鼠，6周龄)、组2-2(3只同型hDMD小鼠，6周)、组2-3(1只雄性，1只雌性，半型hDMD，11周)、组2-4(1只雄性，1只雌性，半型DMD，11周)分别接受10、20、40和80mpk的EEV-PMO-DMD44-2。所有动物存活直至其预定的安乐死时间。按照方案收集组织。通过LC-MS定量各种组织样品中AC和cCPP-AC的量。通过RT-PCR分析不同组织中的外显子跳跃并定量外显子44校正。

表15：hDMD实验的实验设计

CD1小鼠模型：使用7周龄的CD1雄性小鼠评价EEV-PMO-DMD44-1和EEV-PMO-DMD44-2的耐受性。它们从Charles River Lab订购，并且在接受后在注射前使它们适应5天。将动物进行年龄匹配并根据表16分配到九(9)个处理组中：组1(3只小鼠，盐水)；组2-1(3只小鼠)、组2-2(2只小鼠)、组2-3(2只小鼠)、组2-4(2只小鼠)、组2-5(3只小鼠)、组2-6(3只小鼠)分别接受80、100、120、160、200和300mpk的EEV-PMO-DMD44-1。组3-1(3只小鼠)、组3-2(2只小鼠)、组3-3(2只小鼠)、组3-4(2只小鼠)、组3-5(3只小鼠)、组3-6(3只小鼠)分别接受80、100、120、160、200和300mpk的EEV-PMO-DMD44-2。

表16：CD1小鼠中的耐受性研究的实验设计

NHP模型：根据表17以10mL/kg的剂量体积按照每种化合物(EEV-PMO-DMD44-1和EEV-PMO-DMD44-2)一只雌性动物施用60分钟IV输注。将每种测试制品在盐水中以4mg/mL配制。在表18所示的时间采集血液和尿液用于进一步PK分析。注射后2天对二头肌进行活组织检查。在注射后第7天处死动物，取骨骼肌(四头肌、横膈膜、二头肌、三角肌、胫骨前肌(TiA)、平滑肌(食道、主动脉、结肠)和心肌(心室、心房)，粉碎，并储存在-80℃用于评价外显子跳跃和组织中的生物分布。

表17NHP研究的实验设计

表18：NHP研究时间点

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生物分析样品分析：将组织解冻、称重并用掺有1x蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher Scientific，参考号1860932)的RIPA缓冲液匀浆(w/v，1/5)。将匀浆物在4℃下以5000rpm离心5分钟。将上清液用H₂O、乙腈和MeOH的混合物沉淀，并在4℃下以15000rpm离心15分钟。将上清液转移到注射板上，使用与Triple Quad Sciex 4500仪器集成的Shimadzu UPLC进行LC-MS/MS分析。LC-MS/MS测定的动态范围为25ng/g组织至50,000ng/g组织。LC-MS/MS方法的细节在此处和表19中概述。简而言之，使用以下操作UPLC：Waters Acquity UPLC BEH C4，300A，1.7um，2.1x150mm；缓冲液A：H₂O，0.2％FA；缓冲液B：95％乙腈的H₂O溶液，0.2％FA；流速(0.3mL/min)和50℃的柱温。10分钟运行开始于2％缓冲液B，并且逐渐增加至35％持续3.5分钟，随后90％持续1分钟，在90％梯度下停留2.5分钟并且最后在2％梯度下运行2分钟。根据表19用以下建立7.5分钟持续时间的MRM方法：正极性；涡轮喷雾离子源；帘幕气体：25；碰撞气体：6；离子喷雾电压：5500；温度：500；离子源气体1：60；离子源气体2：60。表21的下划线行用于定量完整的和对应的代谢物(AC-PEG12)。

表19：LC-MS/MS测定

通过RT-PCR进行外显子跳跃分析：hDMD小鼠和NHP表达全长人抗肌萎缩蛋白mRNA。AC的递送可改变剪接，并在外显子44跳跃后产生缩短的抗肌萎缩蛋白mRNA。使用1mL RLT裂解缓冲液(Qiagen，目录号79216)将组织匀浆。通过RT-PCR测量剪接校正过程的检测，其中首先将从组织提取的RNA逆转录成cDNA，并使用以下引物组通过一步RT-PCR进一步分析：正向引物5'-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3'和反向引物5'-GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3'。没有剪接校正的组织的RT-PCR读出产生641bp基因片段，并且在剪接校正之后出现新的493bp基因片段。进行对应于跳跃和未跳跃转录物的条带的相对强度的定量，以评估AC诱导的外显子-44跳跃功效。使用以下等式计算通过RT-PCR检测的剪接校正的程度(百分比)：％校正＝(493bp片段条带的强度)/(493bp片段条带的强度+641bp片段条带的强度)。

结果：EEV-PMO-DMD44-1、2和3在患者肌管中的功效：评估了各自靶向人抗肌萎缩蛋白(DMD)外显子44的EEV-PMO-DMD44-1、2和3在DMD患者来源的肌细胞中的DMD外显子44跳跃。简而言之，在补充有2％马血清和1％鸡胚提取物的PromoCell骨骼肌细胞生长培养基中，用1μM、3μM和10μM的EEV-PMO-DMD44-1、2和3处理具有外显子45缺失(DMDΔ45)的患者来源的成肌细胞24小时。24小时后，用DMEM/2％马血清替换含化合物的生长培养基并孵育5天以促进成肌细胞融合和分化成肌管。洗涤细胞并收获用于RNA提取以评估外显子44跳跃，或在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中用于蛋白质提取和抗肌萎缩蛋白恢复的简单Western分析。结果示于图19中。将抗肌萎缩蛋白水平归一化至HSP90，并相对于未处理的健康样品表示。数据表示为平均值±SD，n＝3-4。未处理的DMDΔ45患者来源的细胞在基线时表达约10％自发DMD外显子44跳跃和约4％抗肌萎缩蛋白。所有三种化合物以剂量依赖性方式导致稳健的外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白恢复。

图20A-B示出了经由IV注射施用EEV-PMO-DMD44-1(图201A)和EEV-PMO-DMD44-2(图20B)的hDMD小鼠中的外显子跳跃。没有观察到严重的副作用。小鼠在注射后、注射后24小时和处死日期之前都是正常的。在IV注射后5天评价测量肝和肾毒性(碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白、血尿素氮(BUN)、肌酸酐、钙、磷、氯、钾、钠、BUN/肌酸酐、镁)以及溶血和脂血指数的临床化学。通过临床化学评价，在EEV-PMO-DMD44-1和EEV-PMO-DMD44-2处理的小鼠中没有检测到显著的毒性。在10、20、40和80mpk IV剂量后5天，评估了各种肌群中的组织浓度和外显子跳跃。对于每种剂量的EEV-PMO-DMD44-1，在心脏/三头肌/TiA/横膈膜组织中分别实现了以下外显子跳跃：10mpk(0％、6％、12％、6％)；20mpk(0％、22％、36％、33％)；40mpk(20％、94％、99％、82％)；80mpk(79％、97％、99％、98％)。对于每种剂量的EEV-PMO-DMD44-2，在心脏/三头肌/TiA/横膈膜组织中分别实现了以下外显子跳跃：10mpk(0％、17％、22％、14％)；20mpk(2％、44％、58％、35％)；40mpk(17％、92％、95％、83％)；80mpk(79％、98％、99％、99％)。在携带全尺寸人DMD基因的转基因鼠模型中，在心肌和骨骼肌中观察到EEV-PMO-DMD44-1和EEV-PMO-DMD44-2两者的强剂量依赖性累积和有效外显子跳跃。在较低剂量10mpk和20mpk下，EEV-PMO-DMD44-2药物暴露和功效略高于EEV-PMO-DMD44-1。然而，该作用在40mpk剂量下开始减弱，其中两种化合物在所有骨骼肌中均导致相同高水平的外显子跳跃(高于80％)。EEV-PMO-DMD44-1的对应组织浓度在100-300ng/g组织范围内，而对于EEV-PMO-DMD44-2，该范围移至略高的数值，为300-500ng/g组织浓度。有趣的是，EEV-PMO-DMD44-1和EEV-PMO-DMD44-2两者在心脏中的最小有效剂量是用40mpk实现的，分别对应于每克组织浓度170ng和350ng。

图20A和图20B示出了经由IV注射用EEV-PMO-DMD44-1(图20A)和EEV-PMO-DMD44-2(图20B)处理的hDMD小鼠的心脏、三头肌、胫骨前肌和横膈膜组织中的外显子跳跃和药物浓度。

EEV-PMO-DMD44-1在以80、100、160、200和300mpk剂量施用于CD1小鼠的所有剂量中是非常良好耐受的。仅观察到短暂的症状，其在注射后1小时完全消退。在注射后1天和7天没有观察到生物标志物异常。EEV-PMO-DMD44-2是较不耐受的。在EEV-PMO-DMD44-2的最高剂量300mpk下，三只小鼠中的一只在注射后1-3小时内死亡。在EEV-PMO-DMD44-2的较低剂量200mpk下，三只小鼠中的一只具有严重的症状(对刺激无反应、耳朵向后拉、呼吸缓慢、难以恢复正常)。这些症状逐渐恶化，并且它们与肌肉抽搐结合。对于160mpk和80mpk的较低剂量没有观察到症状。令人惊讶地，在100mpk下，三只小鼠中的一只在注射后2小时显示出延迟的症状；但它们在注射后1天和7天完全正常。

为了进一步证明cCPP-AC缀合物的外显子跳跃的功效，利用NHP。具体地，对具有完整肌肉组织的食蟹猴以40mg/kg的剂量施用EEV-PMO-DMD44-1或EEV-PMO-DMD44-2的60分钟IV输注，它们是良好耐受的。更具体地，动物在治疗开始45分钟时经历恶心，这在治疗后约3小时显著消退，并且动物更警觉，不再弯腰驼背并食用提供的产品。在给药后约20小时，动物变得(机灵、警觉且反应灵敏，使得该动物在表型上是“正常的”)(BAR)，并且在笼中没有留下饼干，并观察到食用产品。

在注射后2天和7天没有观察到临床化学组的异常。按照标准方案分析不同组织中的外显子44跳跃百分比。图21A-图21B描绘了EEV-PMO-DMD44-1的外显子跳跃(图21A)和药物暴露(图21B)。图21C-图21D描绘了EEV-PMO-DMD44-2的外显子跳跃(图21C)和药物暴露(图21D)。两种化合物在注射后7天在通过IV给予40mpk的不同肌群中均表现出优异的外显子跳跃水平。从功效的观点来看，EEV-PMO-DMD44-1在TiA、膈膜中表现得更好，并且在心室和心房中表现得不那么显著。在所有骨骼肌中，实现了超过78％的外显子跳跃，最大98.4％在横膈膜中。在心脏组织中，40mpk下的EEV-PMO-DMD44-1在心室和心房中分别产生31.9％和23.4％。在平滑肌中，食管显示57.1％的最高功效。EEV-PMO-DMD44-1和EEV-PMO-DMD44-2两者以药理学相关浓度分布于各种组织中。在一些情况下，例如在心脏组织中的心室和心房以及更显著地在食管和结肠中，相同的组织浓度不转变成相同的功能递送。这可能表明不同组织中的内体逃逸水平可能不同。然而，在骨骼肌中，约200ng/克组织浓度与超过80％的稳健外显子跳跃相关，而在心脏组织中，800-1000ng/克组织浓度与心房和心室中粗略组合的50％外显子跳跃相关。仅单一剂量40mpk的cCPP-AC缀合物的50％外显子跳跃是非常鼓舞人心的，因为心脏组织对于递送而言是更具挑战性的组织，并且是对于神经肌肉障碍(诸如DMD)的治疗而言至关重要的组织。

将EEV-PMO-DMD44-1添加到DMD患者来源的肌细胞中，并施用于表达全长人抗肌萎缩蛋白基因的hDMD转基因小鼠，以测试人序列特异性PMO的DMD转录校正。在10、20、40和80mg/kg IV剂量后5天评估小鼠中各种肌肉组中的外显子跳跃和组织浓度。图23A示出了在用EEV-PMO-DMD44-1处理的DMD患者来源的肌细胞中稳健的剂量依赖性外显子跳跃和抗肌萎缩蛋白的恢复。与未处理的患者来源的细胞和健康细胞相比，在用EEV-PMO-DMD44-1处理的DMD患者来源的肌细胞中观察到剂量依赖性外显子44跳跃和抗肌萎缩蛋白恢复(分别高达100％和43.7％)。然后在人源化小鼠模型中研究EEV-PMO-DMD44-1以评估在组织中的摄取和外显子跳跃潜力。

图23B示出了在以10mg/kg至80mg/kg范围内的各种水平施用递增IV剂量的EEV-PMO-DMD44-1后携带全长人DMD基因的整合拷贝的转基因小鼠的心肌和骨骼肌中的剂量依赖性组织暴露和外显子跳跃。给药五天后分别评估外显子跳跃和组织暴露。观察到在翻译相关剂量下高达80％的组织暴露和高达100％的外显子跳跃的剂量依赖性水平。

图24A-图24C描绘了携带全长人DMD基因的转基因小鼠的心脏(图24A)、胫骨前肌(图24B)和横膈膜(图24C)中EEV-PMO-DMD44-1的组织浓度和外显子跳跃百分比。

图25示出在NHP中观察到EEV-PMO-DMD44-1的延长的循环半衰期。在NHP的血浆中观察到长达50小时的EEV-PMO-DMD44-1的延长的循环半衰期(图24A)。这种药代动力学分布提示了预期的组织暴露、靶结合和药效学作用的机会。

图26示出单一30mg/kg IV剂量的EEV-PMO-DMD44-1导致在NHP的骨骼肌和心脏两者中有意义水平的外显子跳跃，这提供了翻译潜力的置信度。在以30mg/kg IV输注1小时后7天，在分离自EEV-PMO-DMD44-1处理的NHP的不同肌群中观察到稳健的外显子44跳跃。

这些结果代表一组稳健的翻译数据。外显子跳跃转化为在心脏和骨骼肌中有希望的抗肌萎缩蛋白产生。抗肌萎缩蛋白产生足以导致功能改善。抗肌萎缩蛋白产生在单次注射后持续4+周。

实施例7：与寡核苷酸缀合的细胞穿透肽用于靶向来自DM1的成肌细胞中的CTG重 复的用途

所评价的化合物：本研究中评价的化合物示于表21中。

表21在该研究中评价的化合物

细胞培养。来自DM1(ASA308DM1)和未受影响个体(KM1421；AB1190)的永生化成肌细胞根据法国法规从法国的麻省理工学院获得。DM1患者成肌细胞在DMPK的3'UTR中具有2600个CTG重复。将成肌细胞在骨骼肌细胞生长培养基(PomoCell)、2％马血清(Gibco)、1％鸡胚提取物(USB)和0.5mg/mL青霉素/链霉素(Gibco)的生长培养基中培养。对于肌原性分化，将汇合培养物转换为补充有2％马血清的DMEM分化培养基并培养4天(DM1)。

方法。对于DM1，评估两种处理条件，并且每种条件一式三份进行。在第一种条件下，将成肌细胞以75％-80％汇合度铺板，将表14中的化合物在生长培养基中连续稀释，并将细胞分别与每种化合物一起浸泡24小时，以允许自由摄取化合物。去除含有化合物的培养基，用1X DPBS(Gibco)洗涤成肌细胞，并在收获前分化四天。对于平行进行的第二种条件，在处理前三天使成肌细胞分化。将化合物在分化培养基中连续稀释，并在24小时后收获肌管用于分析。

RNA分离和PCR。用Qiagen RNeasy Mini试剂盒根据制造商的说明书分离总RNA。对于外显子内含物，将100ng RNA逆转录并用于PCR(OneStep RT-PCR试剂盒，Qiagen)。通过LabChip(PerkinElmer)用HT DNA高灵敏度测定试剂盒分析样品。

图22A-图22F展示了Mbnl1(对于外显子5内含物；图22A)、Bin1(对于外显子11内含物；图22B)、IR(对于外显子11内含物；图22C)、DMD(对于外显子78内含物；图22D)、LDB3(对于外显子11内含物；图22E)和Sos1(对于外显子25内含物；图22F)的RNA剪接测量。数据一般性地证明使用本文所述的化合物至少部分恢复。

实施例8.电荷减少的环状细胞穿透肽在MDX小鼠模型中对DMD外显子23的剪接校正的功效

下表22的化合物包括化合物的附加非限制性示例。如前述实施例所述制备化合物。

表22

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cCPP化学结构的非限制性示例如下所示：

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在实施例4中描述的MDX模型中测试化合物。在第1天用20mg/kg的单次静脉内剂量处理小鼠。在注射后第5天，处死动物，并且收获特定组织并快速冷冻。提取RNA，并如前所述通过RT-PCR定量横膈膜(图39A)、心脏(图39B)、胫骨前肌(图39C)和三头肌(图39D)中的外显子跳跃。结果表明，与所检查的三种类型的肌肉组织相比，用EEV-PMO-MDX-4、5、6和7处理导致心脏组织中更低水平的外显子跳跃。另外，在注射后第5天，通过Wester印迹分析定量横膈膜(图40A)、心脏(图40B)和胫骨前肌(图40C)中的抗肌萎缩蛋白水平。结果表明，与横隔膜组织相比，用含NLS的化合物(EEV-PMO-MDX-8、EEV-PMO-MDX-5)处理也导致心脏组织和胫骨前肌组织中更低水平的抗肌萎缩蛋白表达。

表23：在该研究中评价的化合物

实施例9.经由外显子跳跃敲低GYS1表达

图31A示出了使用外显子跳跃敲低GYS1表达的示意图。EEV-PMO用于诱导外显子6的外显子跳跃。所用的EEV是Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-K(N₃)-NH₂或Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₂-K(N₃)-NH₂。跳跃外显子6使阅读框移位并引起阅读过早终止密码子。然后经由无义介导的衰变机制降解GYS1 mRNA，从而阻止完整GYS1蛋白的表达。

表24：在该研究中评价的化合物

当与GAA单敲除小鼠相比时，GYS1/GAA双敲除小鼠表现出心脏和骨骼肌中糖原量的显著减少、溶酶体肿胀和自噬积聚的显著降低。这些细胞级变化导致心脏肥大校正、葡萄糖代谢正常化和肌萎缩校正。尽管不存在GAA，GYS1的消除在糖原代谢中仍可能发挥重要作用。

实验

对GAA敲除小鼠(GAA^-/-)注射单次IV剂量的13.5mg/kg的EEV-PMO-GYS1-1、27mg/kg的EEV-PMO-GYS1-1、27mg/kg的PMO或阴性对照(媒介物)。注射后一周测量GYS1 mRNA和蛋白质水平。在13.5mg/kg EEV-PMO-GYS1-2的IV剂量后一周、两周、四周和八周，也测定了GYS1的水平。

结果

图32A-图32D示出了在EEV-PMO-GYS1-1和EEV-PMO-GYS1-2组两者而不是仅PMO组中的横膈膜和心肌中GYS1表达的显著敲低。这种药效学结果是值得注意的，因为这是以非常低的剂量施用的单剂量实验，并且表明GYS1是可寻址的靶标。

图33A-图33D示出降低的GYS1蛋白水平在注射后在心脏、横膈膜、四头肌和三头肌中维持长达八周。

实施例10.经由外显子跳跃敲低IRF5表达

图31B示出了使用外显子跳跃敲低IRF5表达的示意图。EEV-PMO用于诱导外显子4的外显子跳跃。跳跃外显子4使阅读框移位并引起阅读过早终止密码子。然后经由无义介导的衰变机制降解IRF5 mRNA，从而阻止完整IRF5蛋白的表达。

表25：在该研究中评价的化合物

实验

对于体内研究，在第0天和第3天用两个剂量的EEV-PMO-IRF5-1处理野生型小鼠。在第7天收集样品用于qPCR以测量mRNA水平。对于体外研究，如下处理小鼠巨噬细胞：用EEV-PMO-IRF5-1处理，或用2μMEEV-PMO-IRF5-1、2、3或4预处理4小时，随后用R848(一种咪唑并喹啉化合物，其是toll样受体(TLR)7/8的特异性激活剂)刺激过夜。处理后24小时，收获细胞并通过Western印迹进行评价。

对于EEV-PMO-IRF5-1、2、3、4的每一种，PMO是以下序列5’-AGA ACG TAA TCA TCAGTG GGT TGG C-3’的278。

EEV-PMO-IRF5-1、2、3和4的EEV示于图37A-E中。

结果

图34A-图34C示出了肝(A)、小肠(B)和胫骨前肌(C)中IRF5水平的显著敲低。在所有组织中，敲低是剂量依赖性的。

图35显示当与EEV-PMO-IRF5-1相比时，EEV-PMO-IRF5-2、EEV-PMO-IRF5-3和EEV-PMO-IRF5-4在相对效力方面具有显著改善，如通过IRF5蛋白表达测量的。

图36显示在30μM、10μM和3μM的剂量下，用EEV-PMO-IRF5-1处理的小鼠巨噬细胞具有IRF5蛋白水平的统计学显著降低。

实施例11：体外筛选靶向IRF-5的PMO的EEV

RAW 264.7单核细胞/巨噬细胞用于评价示于图37A-E中的各种EEV-PMO构建体处理后的IRF-5表达和外显子跳跃。

简而言之，将150K个细胞/孔接种在24孔板的0.5ml DMEM中。4小时后，向细胞中添加EEV-PMO-IRF5-1、2、3、4化合物，得到500μL的总体积。然后将细胞孵育24小时。在用EEV-PMO-IRF5-1、2、3、4化合物孵育后，用新鲜培养基洗涤细胞，然后孵育过夜。在第二次孵育后，收获RNA并使用检测IRF-5基因中外显子5跳跃的引物进行RT-PCR。

IRF5表达水平相对于β-微管蛋白确定。

在IRF-5表达研究中，将细胞用EEV-PMO-IRF5-1、2、3、4化合物预处理，随后用R848刺激过夜。R484是Toll样受体激动剂，并引起IRF-5表达的诱导。总处理时间为24小时。

图38-图39示出了本实施例的筛选研究的结果。

图38和图40示出了用各种浓度的各种化合物处理后的IRF-5表达水平。R848显著增加RAW264.7细胞中的IRF5蛋白表达。当与用R848刺激的细胞相比时，所有测试浓度的所有EEV-PMO-IRF5-1、2、3、4处理的样品显示IRF-5蛋白表达的显著降低。当与用R848刺激的细胞中的IRF-5水平相比时，EEV-PMO-IRF5-2、3、4比EEV-PMO-IRF5-1平均更有效5倍，在低至2μM的浓度下IRF-5蛋白减少约80％。

图39示出了用各种浓度的各种化合物处理后外显子跳跃的水平。化合物EEV-PMO-IRF5-2、3和4在5μM时表现出比EEV-PMO-IRF5-1更高的外显子跳跃。在EEV-PMO-IRF5-2、3和4之间没有观察到外显子跳跃的显著差异。经由外显子跳跃敲低IRF5表达

实施例12：EEV-PMO-DM1-3的7天单剂量范围发现研究

在本研究中评价的化合物是EEV-PMO-DM1-3，其序列可在实施例7表21中找到。

在单剂量范围研究后1周使用9周龄的HSA-LR小鼠和对照FVB小鼠。将HSA-LR小鼠分成5组。一组静脉内施用盐水，而另一组施用EEV-PMO-DM1-3(15、30、60或90mpk的EEV-PMO-DM1-3)。7天后收获组织。RT-PCR用于确定特定基因(Atp2a1、Clcn1、Nfix、MBNL1)的选择性剪接。LC-质谱用于确定四头肌、胃、TA、三头肌、横膈膜、心脏、肾、肝、脑、血浆中的药物水平。RNA-seq用于确定经处理的疾病模型、未处理的疾病模型和野生型之间的转录水平变化。荧光成像用于确定在用EEV-寡聚化合物处理后RNA团簇的减少。在用EEV-PMO-DM1-3处理后7天记录肌强直减少。使用Q-PCR确定处理后肌动蛋白-HSA的mRNA水平的降低。

图41A-D示出了在用EEV-PMO-DM1-3注射HSA-LR小鼠后1周四头肌中MBNL1下游基因的剂量依赖性校正；图41A：Atp2a1，图41B：Nfix，图41C：Clcn1，图41D：Mbnl1。

图42A-D示出了在用EEV-PMO-DM1-3注射HSA-LR小鼠后1周腓肠肌中MBNL1下游基因的剂量依赖性校正；图42A：Atp2a1，图42B：Nfix，图42C：Clcn1，图42D：Mbnl1。

图43A-D示出了在用EEV-PMO-DM1-3注射HSA-LR小鼠后1周胫骨前肌中MBNL1下游基因的剂量依赖性校正；图43A：Atp2a1，图43B：Nfix，图43C：Clcn1，图43D：Mbnl1)。

图44A-D示出了在用EEV-PMO-DM1-3注射HSA-LR小鼠后1周前三头肌中MBNL1下游基因的剂量依赖性校正；图44A：Atp2a1，图44B：Nfix，图44C：Clcn1，图44D：Mbnl1)。

图45A-D提供了图41A-D、图42A-D、图43A-D和图44A-D中所示数据的叠加。

图46A-D示出施用EEV-PMO-DM1-3导致HSA-LR小鼠的骨骼肌中约50％-70％HSAmRNA敲低：图46A：四头肌；图46B：腓肠肌；图46C：三头肌；图46D：胫骨前肌。相对于HSALR媒介物处理组(n＝3)，通过单向ANOVA计算统计学显著性。剂量基于PMO。

图47A-F是示出在施用EEV-PMO-DM1-3的小鼠中各种肌肉组织中药物水平的剂量依赖性反应的图。图47A：四头肌；图47B：三头肌；图47C：心脏；图47D：腓肠肌；图47E：胫骨前肌；以及图47F：横膈膜。

图48示出了体内检测到的主要代谢物PMO-DM1。

图49A-C描绘了在以15mpk、30mpk、60mpk和90mpk施用后脑(图49A)、肝(图49B)和肾(图49C)中的EEV-PMO-DM1-3暴露。

图50示出了EEV-PMO处理1周后减少HSA-LR小鼠TA肌肉中的CUG团簇。

图51是示出EEV-PMO处理1周后减少HSA-LR小鼠TA肌肉中的CUG团簇的图。

图52示出了在用15mpk、30mpk、60mpk和90mpk的EEV-PMO-DM1-3处理后7天HSA-LR小鼠中的剂量依赖性肌强直减少。

肌强直在用EEV-PMO-DM1-3处理后1周可能改善。用90mg/kg单一剂量的EEV-PMO-DM1-3处理的HSA-LR小鼠在诱导后没有表现出明显的后肢肌强直迹象。

实施例13：使用EEV-PMO-DM1-3的长达8周的80mpk持续时间作用

在本研究中评价的化合物是EEV-PMO-DM1-3，其序列可在实施例7表21中找到。

对7周龄HSALR小鼠静脉内施用80mpk的EEV-PMO-DM1-3，并在1周至8周后收获组织。RT-PCR用于确定特定基因(Atp2a1、Clcn1、Nfix、MBNL1)的选择性剪接。LC-质谱用于确定四头肌、胃、TA、三头肌、横膈膜、心脏、肾、肝、脑、血浆中的药物水平。RNA-seq用于确定经处理的疾病模型、未处理的疾病模型和野生型之间的转录水平变化。荧光成像用于确定在用EEV-寡聚化合物处理后RNA团簇的减少。在用EEV-寡聚化合物处理后7天记录肌强直减少。使用Q-PCR确定处理后肌动蛋白-HSA的mRNA水平的降低。

图53A-C示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠中的Atp2a1外显子22内含物的作用持续时间。胫骨前肌(图53A)；三头肌(图53B)；和四头肌(图53C)

图54A-C示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠中Nfix外显子7内含物的作用持续时间。胫骨前肌(图54A)；三头肌(图54B)；和四头肌(图54C)。

图55A-C示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠中Mbnl1外显子5内含物的作用持续时间。胫骨前肌(图55A)；三头肌(图55B)；和四头肌(图55C)。

图56A-C示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠的腓肠肌中外显子22内含物的作用持续时间。Atp2a1(图56A)；Nfix(图56B)；和Mbnl1(图56C)。

图57示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)在HSA-LR小鼠的腓肠肌、三头肌、胫骨前肌和四头肌中的作用持续时间。

图58A-D示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)在HSA-LR小鼠的肌肉组织中的作用持续时间。图58A：四头肌，图58B：腓肠肌，图58C：三头肌；图58D：胫骨前肌。

图59A-D示出了80mpk EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物)对HSA-LR小鼠中Clcn1外显子7a内含物的作用持续时间。图59A：胫骨前肌；图59B：三头肌；图59C：四头肌；图59D：腓肠肌。

图60A-D示出EEV-PMO-DM1-3在注射后1周和4周显示HSA mRNA敲低趋势。图60A：胫骨前肌；图60B：三头肌；图60C：四头肌；图60D：腓肠肌。

图61A-D示出了肌肉组织中80mpk EEV-PMO-DM1-3在1周至4周后药物水平的降低。图61A：胫骨前肌；图61B：腓肠肌；图61C：三头肌；图61D：腓肠肌。EEV-PMO-DM1-3(60mpk寡聚物，80mpk全药物)在处理1周后完全校正腓肠肌、三头肌、胫骨前肌和四头肌中的错误剪接。

图62A-B示出了在肝和肾中用80mpk剂量的EEV-PMO-DM1-3在1周至4周后观察到药物水平的降低。

进行类似的实验以评价EEV-PMO-DM1-3更长持续时间和更高剂量的静脉内施用。对8周龄HSALR小鼠静脉内施用40、60、80或120mpk的EEV-PMO-DM1-3，并在4至12周后收获组织。RT-PCR用于确定特定基因(Atp2a1、Clcn1、Nfix、MBNL1)的选择性剪接。LC-质谱用于确定四头肌、胃、TA、三头肌、横膈膜、心脏、肾、肝、脑、血浆中的药物水平。RNA-seq用于确定经处理的疾病模型、未处理的疾病模型和野生型之间的转录水平变化。荧光成像用于确定在用EEV-PMO-DM1-3处理后RNA团簇的减少。在用EEV-PMO-DM1-3处理后7天记录肌强直减少。使用Q-PCR确定处理后肌动蛋白-HSA的mRNA水平的降低。观察到类似的数据趋势(数据未示出)

实施例14：用EEV-PMO-DM1-3处理患者来源的DM1细胞

在本研究中评价的化合物是EEV-PMO-DM1-3，其序列可在实施例7表21中找到。

在分化的整个4天中，用30微摩尔的EEV-寡聚物处理患者成肌细胞。通过一步RT-PCR评估剪接校正。HCR-FISH和螯合的MBNL1蛋白检测测定用于检测RNA团簇。结果：EEV-PMO-DM1-3促进显著的生物标志物剪接校正和DM1患者来源的肌细胞中核团簇的减少。

患者成肌细胞在DMPK 3'UTR内具有2600个CTG重复。在分化的整个4天中，自由摄取30μM EEV-PMO-DM1-3。通过一步RT-PCR和Labchip分析评估剪接校正。绘制平均值±SD；n＝4HCR-FISH测定用于原位CUG团簇检测。

图63A-C示出EEV-PMO-DM1-3促进DM1患者来源的肌细胞中显著的生物标志物剪接校正。

图64A-C示出EEV-PMO-DM1-3减少DM1患者来源的肌细胞中的核团簇。

实施例15：EEV-PMO-DM1-3在肾细胞中的细胞毒性筛选

在本研究中评价的化合物是PMO-DM1或EEV-PMO-DM1-3，其序列可在实施例7表21中找到。

将人原代肾近端小管上皮细胞(RPTEC)暴露于不同浓度(在盐水中1:2连续稀释，最终稀释因子为4x，从约6微摩尔至约800微摩尔)的PMO-DM1和EEV-PMO-DM1-3中24小时，并筛选活力。蜂毒肽以16.6uM用作阳性对照。

图65A-B显示PMO-DM1或其缀合的EEV-PMO-DM1-3没有显示任何毒性，即使分别在817uM或797uM的最高浓度下也是如此。

编号实施方案

实施方案1涉及一种式(A)的环肽：

或其质子化形式或盐，

其中：

R₁、R₂和R₃各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₁、R₂和R₃中的至少一者是氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₄、R₅、R₆、R₇独立地是H或氨基酸侧链；

R₄、R₅、R₆、R₇中的至少一者是3-胍基-2-氨基丙酸、4-胍基-2-氨基丁酸、精氨酸、高精氨酸、N-甲基精氨酸、N,N-二甲基精氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、赖氨酸、N-甲基赖氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、N-乙基赖氨酸、N,N,N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸、瓜氨酸、N,N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸、3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链；

AA_SC是氨基酸侧链；并且

q是1、2、3或4；

其中所述式(A)的所述环肽不是FfΦRrRrE。

实施方案2涉及根据实施方案1所述的环肽，其中所述环肽具有式(I)：

或其质子化形式或盐，

其中每个m独立地是0-3的整数。

实施方案3涉及根据实施方案1或2所述的环肽，其中R₁、R₂和R₃独立地是H或包含芳基基团的侧链。

实施方案4涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述包含芳基基团的侧链是酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸或3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。

实施方案5涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述包含芳基基团的侧链是苯丙氨酸的侧链。

实施方案6涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中R₁、R₂和R₃中的两者是苯丙氨酸的侧链。

实施方案7涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中R₁、R₂、R₃和R₄中的两者是H。

实施方案8涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-1)，

或其质子化形式或盐。

实施方案9涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-2)：

或其质子化形式或盐。

实施方案10涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-3)：

或其质子化形式或盐。

实施方案11涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-4)：

或其质子化形式或盐。

实施方案12涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-5)：

或其质子化形式或盐。

实施方案13涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-6)：

或其质子化形式或盐。

实施方案14涉及一种式(II)的环肽：

其中：

AA_SC是氨基酸侧链；

R^1a、R^1b和R^1c各自独立地是6至14元芳基或6至14元杂芳基；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d独立地是氨基酸侧链；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少一者是 或其质子化形式或盐；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少一者是胍或其质子化形式或盐；

每个n”独立地是0至5的整数；

每个n'独立地是0至3的整数；并且

如果n'是0，则R^2a、R^2b、R^2b或R^2d不存在。

实施方案15涉及根据实施方案14所述的环肽，其中所述环肽具有式(II-1)：

实施方案16涉及根据实施方案14或15所述的环肽，其中R^1a、R^1b和R^1c各自独立地选自苯基、萘基和蒽基。

实施方案17涉及根据实施方案14或15所述的环肽，其中所述环肽具有式(IIa)：

实施方案18涉及根据实施方案14-17中任一项所述的环肽，其中R^2a、R^2b、R^2c或R^2d中的至少一者是并且其余的R^2a、R^2b、R^2c或R^2d是胍或其质子化形式或盐。

实施方案19涉及根据实施方案14-18中任一项所述的环肽，其中R^2a、R^2b、R^2c或R^2d中的至少两者是并且其余的R^2a、R^2b、R^2c或R^2d是胍或其质子化形式或盐。

实施方案20涉及根据实施方案14-19中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(IIb)：

实施方案21涉及根据实施方案14-20中任一项所述的环肽，其中R^2a和R^2c各自是

实施方案22涉及根据实施方案14-21中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(IIc)：

或其质子化形式或盐。

实施方案23涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中AA_SC是天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、高谷氨酸残基或高谷氨酸盐残基的侧链。

实施方案24涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中AA_SC是谷氨酸残基的侧链。

实施方案25涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中AA_SC是：其中t是0至5的整数。

实施方案26涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，所述环肽具有以下结构：

或其质子化形式或盐。

实施方案27涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，所述环肽具有以下结构：

或其质子化形式或盐。

实施方案28涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述AA_SC上的至少一个原子被货物部分替换或至少一个孤对形成与货物部分的键。

实施方案29涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述AA_SC与接头缀合。

实施方案30涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中在所述缀合形式中，所述AA_SC是天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基或高谷氨酰胺残基的侧链。

实施方案31涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中在所述缀合形式中，所述AA_SC是谷氨酰胺残基的侧链。

实施方案32涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中货物部分通过接头与AA_SC缀合。

实施方案33涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述接头包含-(OCH₂CH₂)_z’-亚基，其中z'是1至23的整数。

实施方案34涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述接头包含：

(i)-(OCH₂CH₂)_z-亚基，其中z'是1至23的整数；

(ii)一个或多个氨基酸残基，诸如甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸或它们的组合的残基；或

(iii)(i)和(ii)的组合。

实施方案35涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述接头包含：

(i)-(OCH₂CH₂)_z-亚基，其中z是2至20的整数；

(ii)一个或多个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合的残基；或

(iii)(i)和(ii)的组合。

实施方案36涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述接头包含二价或三价C₁-C₅₀亚烷基，其中1-25个亚甲基基团任选地且独立地被-N(H)-、-N(C₁-C₄烷基)-、-N(环烷基)-、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂N(C₁-C₄烷基)-、-S(O)₂N(环烷基)-、-N(H)C(O)-、-N(C₁-C₄烷基)C(O)-、-N(环烷基)C(O)-、-C(O)N(H)-、-C(O)N(C₁-C₄烷基)、-C(O)N(环烷基)、芳基、杂环基、环烷基或环烯基替换。

实施方案37涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述接头具有以下结构：

其中：

x'是1-23的整数；y是1-5的整数；z'是1-23的整数；*是与所述AA_SC的附接点，并且AA_SC是所述环肽的氨基酸残基的侧链；并且M是结合基团。

实施方案38涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中所述接头具有以下结构：

实施方案39涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中z'是11。

实施方案40涉及根据前述实施方案中任一项所述的环肽，其中x'是1。

实施方案41涉及一种内体逃逸载体(EEV)，所述内体逃逸载体包含根据权利要求29-31和33-40中任一项所述的环肽，以及在接头的氨基末端与所述接头缀合的环外肽。

实施方案42涉及根据实施方案41所述的EEV，其中所述环肽具有式(B)：

或其质子化形式或盐，其中：

R₁、R₂和R₃各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₄和R₇独立地是H或氨基酸侧链；

EP是环外肽；

每个m独立地是0-3的整数；

n是0-2的整数；

x'是1-20的整数；

y是1-5的整数；

q是1-4；并且

z'是1-23的整数。

实施方案43涉及根据实施方案41或42所述的EEV，其中所述环肽具有式(B-1)-(B-4)：

/>

实施方案44涉及根据实施方案41-43中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含2至10个氨基酸残基。

实施方案45涉及根据实施方案41-44中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含4至8个氨基酸残基。

实施方案46涉及根据实施方案41-45中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含1或2个氨基酸残基，所述氨基酸残基包含含有胍基或其质子化形式或盐的侧链。

实施方案47涉及根据实施方案41-46中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含2、3或4个赖氨酸残基。

实施方案48涉及根据实施方案41-47中任一项所述的EEV，其中每个赖氨酸残基的侧链上的所述氨基基团被三氟乙酰基(-COCF₃)、烯丙氧基羰基(Alloc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)或(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基-3)-甲基丁基(ivDde)基团取代。

实施方案49涉及根据实施方案41-48中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸残基。

实施方案50涉及根据实施方案41-49中任一项所述的EEV，其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸。

实施方案51涉及根据实施方案41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：KK、KR、RR、HH、HK、HR、RH、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKH、KHK、HKK、HRR、HRH、HHR、HBH、HHH、HHHH、KHKK、KKHK、KKKH、KHKH、HKHK、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、HBHBH、HBKBH、RRRRR、KKKKK、KKKRK、RKKKK、KRKKK、KKRKK、KKKKR、KBKBK、RKKKKG、KRKKKG、KKRKKG、KKKKRG、RKKKKB、KRKKKB、KKRKKB、KKKKRB、KKKRKV、RRRRRR、HHHHHH、RHRHRH、HRHRHR、KRKRKR、RKRKRK、RBRBRB、KBKBKB、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。

实施方案52涉及根据实施方案41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH，其中B是β-丙氨酸。

实施方案53涉及根据实施方案41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。

实施方案54涉及根据实施方案41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH，其中B是β-丙氨酸。

实施方案55涉及根据实施方案41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含：PKKKRKV。

实施方案56涉及根据实施方案41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：Ac-PKKKRKV。

实施方案57涉及根据实施方案41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK或RKCLQAGMNLEARKTKK。

实施方案58涉及根据实施方案41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK或RKCLQAGMNLEARKTKK。

实施方案59涉及一种化合物，所述化合物包含与货物部分缀合的根据实施方案41-58中任一项所述的EEV，其中所述EEV的末端羧酸基团的-OH被所述货物部分替换。

实施方案60涉及根据实施方案59所述的化合物，其中所述货物部分是小分子、肽、寡核苷酸、蛋白质、抗体或它们的衍生物。

实施方案61涉及根据实施方案59或60所述的化合物，其中所述化合物具有式(C)：

或其质子化形式或盐，

其中：

R₁、R₂和R₃各自独立地是H或包含芳基或杂芳基基团的侧链，其中R₁、R₂和R₃中的至少一者是包含芳基或杂芳基基团的侧链；

R₄和R₇独立地是H或氨基酸侧链；

EP是环外肽；

每个m独立地是0-3的整数；

n是0-2的整数；

x'是1-23的整数；

y是1-5的整数；

q是1-4的整数；并且

z'是1-23的整数。

实施方案62涉及根据实施方案61所述的化合物，其中R₁、R₂和R₃是H或包含芳基基团的侧链。

实施方案63涉及根据实施方案61或62所述的化合物，其中所述包含芳基基团的侧链是苯丙氨酸的侧链。

实施方案64涉及根据实施方案61-63中任一项所述的化合物，其中R₁、R₂和R₃中的两者是苯丙氨酸的侧链。

实施方案65涉及根据实施方案61-64中任一项所述的化合物，其中R₁、R₂、R₃和R₄中的两者是H。

实施方案66涉及根据实施方案61-65中任一项所述的化合物，其中z'是11。

实施方案67涉及根据实施方案61-66中任一项所述的化合物，其中x'是1。

实施方案68涉及根据实施方案61-67中任一项所述的化合物，其中所述EP包含2至10个氨基酸残基。

实施方案69涉及根据实施方案61-68中任一项所述的化合物，其中所述EP包含4至8个氨基酸残基。

实施方案70涉及根据实施方案61-69中任一项所述的化合物，其中所述EP包含1或2个氨基酸残基，所述氨基酸残基包含含有胍基或其质子化形式或盐的侧链。

实施方案71涉及根据实施方案61-70中任一项所述的化合物，其中所述EP包含至少1个赖氨酸残基。

实施方案72涉及根据实施方案61-71中任一项所述的化合物，其中所述EP包含2、3或4个赖氨酸残基。

实施方案73涉及根据实施方案61-72中任一项所述的化合物，其中所述EP包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸。

实施方案74涉及根据实施方案61-73中任一项所述的化合物，其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸残基。

实施方案75涉及根据实施方案61-74中任一项所述的化合物，其中所述EP包含以下序列之一：PKKKRKV、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。

实施方案76涉及根据实施方案62-75中任一项所述的化合物，其中所述EP具有以下结构：Ac-PKKKRKV。

实施方案77涉及根据实施方案61-76中任一项所述的化合物，其中所述EEV与货物部分缀合，所述货物部分包含选自寡核苷酸、肽和小分子的治疗性部分。

实施方案78涉及根据实施方案61-77中任一项所述的化合物，所述化合物具有式(C-1)、(C-2)、(C-3)或(C-4)的结构：

/>

/>

或其质子化形式或盐。

实施方案79涉及一种下式的化合物：

Ac-PKKKRKVAEEAK(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH或Ac-PKKKRKVAEEAK(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH。

实施方案80涉及一种货物、接头和下式的环肽：

实施方案81涉及一种下式的EEV：

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FfFGRGRQ)-miniPEG2-K(N3)。

实施方案82涉及一种下式的EEV：

；Ac-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Lys(环[Phe-D-Phe-Nal-Gly-D-Arg-Gly-D-Arg-Gly-Gln])-PEG12-Lys(叠氮基)-NH₂。

实施方案83涉及一种下式的EEV：

实施方案84涉及一种下式的EEV：Ac-P-K(Tfa)-K(Tfa)-K(Tfa)-R-K(Tfa)-V-miniPEG-K(环(Ff-Nal-GrGrQ)-PEG12-OH。

实施方案85涉及一种下式的EEV：

实施方案86涉及一种下式的EEV：Ac-P-K-K-K-R-K-V-miniPEG-K(环(Ff-Nal-GrGrQ)-PEG12-OH。

实施方案87涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Arg-Lys(Tfa)-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案88涉及一种下式的EEV：

/>

；乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案89涉及一种下式的EEV：

；Ac-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-D-Phe-Nal-Cit-D-Arg-Cit-D-Arg-Gln])-PEG12-Lys(叠氮基)-NH₂。

实施方案90涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-D-Phe-Phe-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln])-AEEA-Lys(叠氮基)-NH₂。

实施方案91涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-D-Phe-Nal-Gly-D-Arg-Gly-D-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案92涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Arg-Lys(Tfa)-Val-AEEA-Lys(环[Gly-D-Phe-Phe-Gly-D-Arg-Gly-D-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案93涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Gly-D-Phe-Phe-Gly-D-Arg-Gly-D-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案94涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Arg-Lys(Tfa)-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Gly-Arg-Arg-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案95涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Gly-Arg-Arg-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案96涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Arg-Lys(Tfa)-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Arg-Arg-Arg-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案97涉及一种下式的EEV：

；乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Arg-Arg-Arg-Arg-Gln])-PEG12-OH。

实施方案98涉及一种EEV，所述EEV选自：

Ac-rr-miniPEG2-Dap[环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ)]-PEG12-OH

Ac-frr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rfr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbfbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rrr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbrbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbhbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbhbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbrbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-frr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rfr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbfbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rrr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbrbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbhbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbhbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbrbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OHAc-KKKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KGKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KKGK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KGK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KBK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KBKBK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KR-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KBR-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-PGKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-PKGKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-PKKGRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-PKKKGKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-PKKKRGV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-PKKKRKG-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KKKRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2Ac-KKRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2和Ac-KRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2。

实施方案99涉及一种EEV，所述EEV选自：

Ac-PKKKRKV-Lys(环[FfΦ-G-r-G-rQ])-PEG12-K(N3)-NH₂

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRGRQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KR-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKGKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKG-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKKRK-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FFΦGRGRQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[βhF_-fΦGrGrQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2和

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FfΦSrSrQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2。

实施方案100涉及一种EEV，所述EEV选自：

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(GfF-GrGrQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFKRKRQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFRGRGQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRGRGRQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRrRQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRRRQ))-PEG12-OH和

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFRRRRQ))-PEG12-OH。

实施方案101涉及一种EEV，所述EEV选自：

Ac-K-K-K-R-K-G-miniPEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-K-R-K-miniPEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-R-K-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-R-K-K-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-K-K-R-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])PEG₁₂-OH

Ac-R-K-K-K-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH和

Ac-K-K-K-R-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH。

实施方案102涉及一种EEV，所述EEV选自：

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₂-K(N₃)-NH₂

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₂-K(N₃)-NH₂和

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH。

实施方案103涉及一种货物和一种EEV，其中所述货物是蛋白质，并且所述EEV选自：

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH。

Claims (103)

1.一种式(A)的环肽：

或其质子化形式，

其中：

R₁、R₂和R₃各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₁、R₂和R₃中的至少一者是氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₄、R₅、R₆、R₇独立地是H或氨基酸侧链；

R₄、R₅、R₆、R₇中的至少一者是3-胍基-2-氨基丙酸、4-胍基-2-氨基丁酸、精氨酸、高精氨酸、N-甲基精氨酸、N，N-二甲基精氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、赖氨酸、N-甲基赖氨酸、N，N-二甲基赖氨酸、N-乙基赖氨酸、N，N，N-三甲基赖氨酸、4-胍基苯丙氨酸、瓜氨酸、N，N-二甲基赖氨酸、β-高精氨酸、3-(1-哌啶基)丙氨酸的侧链；

AA_SC是氨基酸侧链；并且

q是1、2、3或4；

其中所述式(A)的所述环肽不是FfΦRrRrE。

2.根据权利要求1所述的环肽，其中所述环肽具有式(I)：

或其质子化形式，

其中每个m独立地是0-3的整数。

3.根据权利要求1或2所述的环肽，其中R₁、R₂和R₃独立地是H或包含芳基基团的侧链。

4.根据权利要求3所述的环肽，其中所述包含芳基基团的侧链是酪氨酸、苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-苯基苯丙氨酸、3，4-二氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、2，3，4，5，6-五氟苯丙氨酸、高苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、4-叔丁基-苯丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸或3-(9-蒽基)-丙氨酸的侧链。

5.根据权利要求3所述的环肽，其中所述包含芳基基团的侧链是苯丙氨酸的侧链。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的环肽，其中R₁、R₂和R₃中的两者是苯丙氨酸的侧链。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的环肽，其中R₁、R₂、R₃和R₄中的两者是H。

8.根据权利要求1或2所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-1)，

或其质子化形式。

9.根据权利要求1或2所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-2)：或其质子化形式。

10.根据权利要求1或2所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-3)：或其质子化形式。

11.根据权利要求1或2所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-4)：或其质子化形式。

12.根据权利要求1或2所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-5)：或其质子化形式。

13.根据权利要求1或2所述的环肽，其中所述环肽具有式(I-6)：或其质子化形式。

14.一种式(II)的环肽：

其中：

AA_SC是氨基酸侧链；

R^1a、R^1b和R^1c各自独立地是6至14元芳基或6至14元杂芳基；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d独立地是氨基酸侧链；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少一者是 或其质子化形式；

R^2a、R^2b、R^2c和R^2d中的至少一者是胍或其质子化形式；

每个n”独立地是0至5的整数；

每个n'独立地是0至3的整数；并且

如果n'是0，则R^2a、R^2b、R^2b或R^2d不存在。

15.根据权利要求14所述的环肽，其中所述环肽具有式(II-1)：

16.根据权利要求14或15所述的环肽，其中R^1a、R^1b和R^1c各自独立地选自苯基、萘基和蒽基。

17.根据权利要求14或15所述的环肽，其中所述环肽具有式(IIa)：

18.根据权利要求14-17中任一项所述的环肽，其中R^2a、R^2b、R^2c或R^2d中的至少一者是并且其余的R^2a、R^2b、R^2c或R^2d是胍或其质子化形式。

19.根据权利要求14-18中任一项所述的环肽，其中R^2a、R^2b、R^2c或R^2d中的至少两者是并且其余的R^2a、R^2b、R^2c或R^2d是胍或其质子化形式。

20.根据权利要求14-19中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(IIb)：

21.根据权利要求20所述的环肽，其中R^2a和R^2c各自是

22.根据权利要求14-19中任一项所述的环肽，其中所述环肽具有式(IIc)：

或其质子化形式。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的环肽，其中AA_SC是天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、高谷氨酸残基或高谷氨酸盐残基的侧链。

24.根据权利要求1-22中任一项所述的环肽，其中AA_SC是谷氨酸残基的侧链。

25.根据权利要求1-22中任一项所述的环肽，其中AA_SC是： 其中t是0至5的整数。

26.根据权利要求1-22中任一项所述的环肽，所述环肽具有以下结构：

或其质子化形式。

27.根据权利要求1-22中任一项所述的环肽，所述环肽具有以下结构：

或其质子化形式。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的环肽，其中所述AA_SC上的至少一个原子被货物部分替换或至少一个孤对形成与货物部分的键。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的环肽，其中所述AA_SC与接头缀合。

30.根据权利要求29所述的环肽，其中在缀合形式中，所述AA_SC是天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基或高谷氨酰胺残基的侧链。

31.根据权利要求30所述的环肽，其中在所述缀合形式中，所述AA_SC是谷氨酰胺残基的侧链。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的环肽，其中货物部分通过接头与AA_SC缀合。

33.根据权利要求29-31中任一项所述的环肽，其中所述接头包含-(OCH₂CH₂)_z’-亚基，其中z'是1至23的整数。

34.根据权利要求29-31中任一项所述的环肽，其中所述接头包含：

(i)-(OCH₂CH₂)_z-亚基，其中z'是1至23的整数；

(ii)一个或多个氨基酸残基，诸如甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸或6-氨基己酸或它们的组合的残基；或

(iii)(i)和(ii)的组合。

35.根据权利要求29-31中任一项所述的环肽，其中所述接头包含：

(i)-(OCH₂CH₂)_z-亚基，其中z是2至20的整数；

(ii)一个或多个甘氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或它们的组合的残基；或

(iii)(i)和(ii)的组合。

36.根据权利要求29-35中任一项所述的环肽，其中所述接头包含二价或三价C₁-C₅₀亚烷基，其中1-25个亚甲基基团任选地且独立地被-N(H)-、-N(C₁-C₄烷基)-、-N(环烷基)-、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂N(C₁-C₄烷基)-、-S(O)₂N(环烷基)-、-N(H)C(O)-、-N(C₁-C₄烷基)C(O)-、-N(环烷基)C(O)-、-C(O)N(H)-、-C(O)N(C₁-C₄烷基)、-C(O)N(环烷基)、芳基、杂环基、环烷基或环烯基替换。

37.根据权利要求29-31中任一项所述的环肽，其中所述接头具有以下结构：

其中：

x'是1-23的整数；y是1-5的整数；z'是1-23的整数；*是与所述AA_SC的附接点，并且AA_SC是所述环肽的氨基酸残基的侧链；并且M是结合基团。

38.根据权利要求29-31或37中任一项所述的环肽，其中所述接头具有以下结构：

39.根据权利要求37或38所述的环肽，其中z'是11。

40.根据权利要求37-39中任一项所述的环肽，其中x'是1。

41.一种内体逃逸载体(EEV)，所述内体逃逸载体包含根据权利要求29-31和33-40中任一项所述的环肽，以及在接头的氨基末端与所述接头缀合的环外肽。

42.根据权利要求41所述的EEV，其中所述环肽具有式(B)：

或其质子化形式，

其中：

R₁、R₂和R₃各自独立地是H或氨基酸的芳族或杂芳族侧链；

R₄和R₇独立地是H或氨基酸侧链；

EP是环外肽；

每个m独立地是0-3的整数；

n是0-2的整数；

x'是1-20的整数；

y是1-5的整数；

q是1-4；并且

z'是1-23的整数。

43.根据权利要求41或42所述的环肽，其中所述环肽具有式(B-1)-(B-4)：

/>

/>

44.根据权利要求41-43中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含2至10个氨基酸残基。

45.根据权利要求41-44中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含4至8个氨基酸残基。

46.根据权利要求41-45中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含1或2个氨基酸残基，所述氨基酸残基包含含有胍基或其质子化形式的侧链。

47.根据权利要求41-46中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含2、3或4个赖氨酸残基。

48.根据权利要求47所述的EEV，其中每个赖氨酸残基的侧链上的氨基基团被三氟乙酰基(-COCF₃)、烯丙氧基羰基(Alloc)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)或(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基-3)-甲基丁基(ivDde)基团取代。

49.根据权利要求41-48中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸残基。

50.根据权利要求49所述的EEV，其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸。

51.根据权利要求41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：KK、KR、RR、HH、HK、HR、RH、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKH、KHK、HKK、HRR、HRH、HHR、HBH、HHH、HHHH、KHKK、KKHK、KKKH、KHKH、HKHK、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、HBHBH、HBKBH、RRRRR、KKKKK、KKKRK、RKKKK、KRKKK、KKRKK、KKKKR、KBKBK、RKKKKG、KRKKKG、KKRKKG、KKKKRG、RKKKKB、KRKKKB、KKRKKB、KKKKRB、KKKRKV、RRRRRR、HHHHHH、RHRHRH、HRHRHR、KRKRKR、RKRKRK、RBRBRB、KBKBKB、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。

52.根据权利要求41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH，其中B是β-丙氨酸。

53.根据权利要求41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：KK、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PKKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。

54.根据权利要求41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：PKKKRKV、RR、RRR、RHR、RBR、RBRBR、RBHBR或HBRBH，其中B是β-丙氨酸。

55.根据权利要求41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含：

PKKKRKV。

56.根据权利要求41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：Ac-PKKKRKV。

57.根据权利要求41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK或RKCLQAGMNLEARKTKK。

58.根据权利要求41-50中任一项所述的EEV，其中所述环外肽包含以下序列之一：NLSKRPAAIKKAGQAKKKK、PAAKRVKLD、RQRRNELKRSF、RMRKFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELR、KAKKDEQILKRRNV、VSRKRPRP、PPKKARED、PQPKKKPL、SALIKKKKKMAP、DRLRR、PKQKKRK、RKLKKKIKKL、REKKKFLKRR、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK或RKCLQAGMNLEARKTKK。

59.一种化合物，所述化合物包含与货物部分缀合的根据权利要求41-58中任一项所述的EEV，其中所述EEV的末端羧酸基团的-OH被所述货物部分替换。

60.根据权利要求59所述的化合物，其中所述货物部分是小分子、肽、寡核苷酸、蛋白质、抗体或它们的衍生物。

61.根据权利要求59或60所述的化合物，其中所述化合物具有式(C)：

或其质子化形式，

其中：

R₁、R₂和R₃各自独立地是H或包含芳基或杂芳基基团的侧链，其中R₁、R₂和R₃中的至少一者是包含芳基或杂芳基基团的侧链；

R₄和R₇独立地是H或氨基酸侧链；

EP是环外肽；

每个m独立地是0-3的整数；

n是0-2的整数；

x'是1-23的整数；

y是1-5的整数；

q是1-4的整数；并且

z'是1-23的整数。

62.根据权利要求61所述的化合物，其中R₁、R₂和R₃是H或包含芳基基团的侧链。

63.根据权利要求61或62所述的化合物，其中所述包含芳基基团的侧链是苯丙氨酸的侧链。

64.根据权利要求61-63中任一项所述的化合物，其中R₁、R₂和R₃中的两者是苯丙氨酸的侧链。

65.根据权利要求61-64中任一项所述的化合物，其中R₁、R₂、R₃和R₄中的两者是H。

66.根据权利要求61-65中任一项所述的化合物，其中z'是11。

67.根据权利要求61-66中任一项所述的化合物，其中x'是1。

68.根据权利要求61-67中任一项所述的化合物，其中所述EP包含2至10个氨基酸残基。

69.根据权利要求61-68中任一项所述的化合物，其中所述EP包含4至8个氨基酸残基。

70.根据权利要求61-69中任一项所述的化合物，其中所述EP包含1或2个氨基酸残基，所述氨基酸残基包含含有胍基或其质子化形式的侧链。

71.根据权利要求61-70中任一项所述的化合物，其中所述EP包含至少1个赖氨酸残基。

72.根据权利要求61-71中任一项所述的化合物，其中所述EP包含2、3或4个赖氨酸残基。

73.根据权利要求61-72中任一项所述的化合物，其中所述EP包含至少2个具有疏水侧链的氨基酸。

74.根据权利要求73所述的化合物，其中所述具有疏水侧链的氨基酸残基选自缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸残基。

75.根据权利要求61-74中任一项所述的化合物，其中所述EP包含以下序列之一：PKKKRKV、KR、RR、KKK、KGK、KBK、KBR、KRK、KRR、RKK、RRR、KKKK、KKRK、KRKK、KRRK、RKKR、RRRR、KGKK、KKGK、KKKKK、KKKRK、KBKBK、KKKRKV、PGKKRKV、PKGKRKV、PKKGRKV、PKKKGKV、PKKKRGV或PKKKRKG。

76.根据权利要求62-75中任一项所述的化合物，其中所述EP具有以下结构：Ac-PKKKRKV。

77.根据权利要求61-76中任一项所述的化合物，其中所述EEV与货物部分缀合，所述货物部分包含选自寡核苷酸、肽和小分子的治疗性部分。

78.根据权利要求61-77中任一项所述的化合物，所述化合物具有式(C-1)、(C-2)、(C-3)或(C-4)的结构：

/>

或其质子化形式。

79.一种下式的化合物：Ac-PKKKRKV-AEEA-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH或Ac-PKKKRKV-AEEA-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH。

80.一种化合物，所述化合物包含货物、接头和下式的环肽：

81.一种下式的EEV：Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FfFGRGRQ)-miniPEG2-K(N3)-NH₂。

82.一种下式的EEV：

Ac-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Lys(环[Phe-D-Phe-Nal-Gly-D-Arg-Gly-D-Arg-Gly-Gln])-PEG12-Lys(叠氮基)-NH₂。

83.一种下式的EEV：

84.一种下式的EEV：Ac-P-K(Tfa)-K(Tfa)-K(Tfa)-R-K(Tfa)-V-miniPEG-K(环(Ff-Nal-GrGrQ))-PEG12-OH。

85.一种下式的EEV：

86.一种下式的EEV：Ac-P-K-K-K-R-K-V-miniPEG-K(环(Ff-Nal-GrGrQ))-PEG12-OH。

87.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Arg-Lys(Tfa)-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln])-PEG12-OH。

88.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln])-PEG12-OH。

89.一种下式的EEV：

Ac-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-D-Phe-Nal-Cit-D-Arg-Cit-D-Arg-Gln])-PEG12-Lys(叠氮基)-NH₂。

90.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-D-Phe-Phe-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln])-AEEA-Lys(叠氮基)-NH₂。

91.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-D-Phe-Nal-Gly-D-Arg-Gly-D-Arg-Gln])-PEG12-OH。

92.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Arg-Lys(Tfa)-Val-AEEA-Lys(环[Gly-D-Phe-Phe-Gly-D-Arg-Gly-D-Arg-Gln])-PEG12-OH。

93.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Gly-D-Phe-Phe-Gly-D-Arg-Gly-D-Arg-Gln])-PEG12-OH。

94.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Arg-Lys(Tfa)-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Gly-Arg-Arg-Arg-Gln])-PEG12-OH。

95.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Gly-Arg-Arg-Arg-Gln])-PEG12-OH。

96.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Lys(Tfa)-Arg-Lys(Tfa)-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Arg-Arg-Arg-Arg-Gln])-PEG12-OH。

97.一种下式的EEV：

乙酰基-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-AEEA-Lys(环[Phe-Gly-Phe-Arg-Arg-Arg-Arg-Gln])-PEG12-OH。

98.一种EEV，所述EEV选自：

Ac-rr-miniPEG2-Dap[环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ)]-PEG12-OH

Ac-frr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rfr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbfbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rrr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbrbr-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbhbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rbhbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-hbrbh-PEG2-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-PEG12-OH

Ac-rr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-frr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rfr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbfbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rrr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbrbr-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbhbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-rbhbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-hbrbh-Dap(环(FfΦ-Cit-r-Cit-rQ))-b-OH

Ac-KKKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KGKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKGK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KGK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KBK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KBKBK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KR-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KBR-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PGKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKGKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKGRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKGKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRGV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKG-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKKRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH2和

Ac-KRK-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))-miniPEG2-K(N3)-NH₂。

99.一种EEV，所述EEV选自：

Ac-PKKKRKV-Lys(环{FfΦ-G-f-G-rQ])-PEG12-K(N3)-NH₂

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(Ff-Nal-GrGrQ))miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-minPEG2-Lys(环(FGFGRGRQ))-minPEG2-K(N3)-NH2

Ac-KR-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKGKV-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-N2

Ac-PKKKRKG-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-KKKRK-PEG2-K(环[FGFGRGRQ])-PEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FFφGRGRQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2

Ac-PKKKRKV-minPEG2-Lys(环[βhF-fΦGrGrQ])-miniPEG2-K(N3)-NH2和

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环[FfφSrSrQ])-miniPEG2-K(N3)-H2。

100.一种EEV，所述EEV选自：

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(GfF-GrGrQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFKRKRQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFRGRGQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRGRGRQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFGRrRQ))-PEG12-OH

Ac-PKKKRKV-minPEG2-Lys(环(FGFGRRRQ))-PEG12-OH和

Ac-PKKKRKV-miniPEG2-Lys(环(FGFRRRRQ))-PEG12-OH。

101.一种EEV，所述EEV选自：

Ac-K-K-K-R-K-G-minPEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-K-R-K-mniPEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-R-K-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-R-K-K-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-K-K-K-K-R-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-R-K-K-K-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH和

Ac-K-K-K-R-K-PEG₄-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH。

102.一种EEV，所述EEV选自：

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₂-K(N₃)-NH₂

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₂-K(N₃)-NH₂和

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH。

103.一种货物和一种EEV，其中所述货物是蛋白质，并且所述EEV选自：

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-PKKKRKV-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rrr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH Ac-rhr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rhr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH Ac-rbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbrbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-rbhbr-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[Ff-Nal-GrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[Ff-Nal-Cit-r-Cit-rQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FfF-GRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFGRGRQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[GfFGrGrQ])-PEG₁₂-OH

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFGRRRQ])-PEG₁₂-OH和

Ac-hbrbh-PEG₂-K(环[FGFRRRRQ])-PEG₁₂-OH。