CN117560997A - 用于生产酪蛋白的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于生产酪蛋白组合物的新方法(通过加热组合物来提高组合物中的酪蛋白比率)及其用途，特别是用于生产乳酪替代品。

Description

用于生产酪蛋白的方法及其用途

技术领域

本发明属于食品工业，并且涉及用于生产酪蛋白组合物的新方法及其用途，特别是用于生产乳酪替代品(尤其是素食乳酪)的用途。

背景技术

使用奶作为富含蛋白、糖和脂质的营养物质，在传统社会中几乎已变得普遍。此外，将奶转化为各种衍生品是人类农用工业最古老的示例之一。在全球范围内精心制作出种类繁多的乳酪，在某些国家成为一种文化基准，不仅如此，而且还被用作许多菜肴的配料，作为国际标准的许多示例，乳酪用在披萨、汉堡中或作为意大利面的添加剂。如今，乳酪市场每年生产2000万吨产品，价值约1400亿美元。

然而，乳制品与在健康以及环境和道德考虑方面的多个问题或担忧相关。这些担忧突出表明需要乳制品替代品以缓解这些不同的问题。健康问题包括乳糖不耐症、过敏(Mousan和Kamat(2016)Cow's Milk Protein Allergy.Clin Pediatr(Phila)，第55(11)卷，第1054-63页；Manuyakorn和Tanpowpong(2018)Cow milk protein allergy and othercommon food allergies and intolerances.Paediatr Int Child Health，第39(1)卷，第32-40页)和其他，例如饱和脂肪酸含量高，已知其对健康具有潜在的负面影响(Micha和Mozaffarian(2010)Saturated fat and cardiometabolic risk factors,coronaryheart disease,stroke,and diabetes:A fresh look at the evidence.Lipids，第45卷，第893-905页；Jakobsen等人(2009)Major types of dietary fat and risk of coronaryheart disease:A pooled analysis of 11cohort studies.Am.J.Clin.Nutr；第89卷，第1425-1432页；Nettleton等人(2017)Saturated fat consumption and risk of coronaryheart disease and ischemic stroke:A science update.Ann Nutr Metab，第70卷，第26-33页)。乳糖不耐症是由于缺乏乳糖酶(在胃和小肠中降解乳糖的酶)，导致乳糖在结肠中积聚并被细菌消化(Ugidos-Rodríguez等人(2018)Lactose malabsorption andintolerance:a review.Food Funct，第9(8)卷，第4056-4068页)。这是人类非常常见的特征，是由基因决定的，因此使得需要无乳饮食。在乳制品替代品中，可以调节这种组成，以避免乳糖、饱和脂肪酸、甚至是过敏性蛋白。

此外，在过去几十年中，与动物源的食品产品相关的环境和道德问题加重。用于70亿人口(2050年为110亿)的动物养殖负担越来越重。环境后果很严重。如今，其主要是从人为温室气体(GHG)排放、水消耗、污水污染和土地占用方面进行考虑。

如今，牛饲养被认为是GHG排放的首要来源之一，估计每年产生7.1吉吨的CO2当量，占所有人为温室气体(GHG)排放的14.5％，来源和方法(Rotz(2017)Modelinggreenhouse gas emissions from dairy farms.J Dairy Science，第101卷，第6675–6690页)，但联合国的一项研究估计，在2010年仅全球乳制品行业就引起人为GGHG排放的4％(FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONs,Greenhouse GasEmissions from the Dairy Sector.A Life Cycle Assessment)。

非常大的耗水量也与动物农业有关(Sultana等人(2014)Comparison of wateruse in global milk production for different typical farms.AgriculturalSystems，第129卷，第9-21页；Ercin and Aldaya(2012)The water footprint of soymilk and soy burger and equivalent animal products.Ecological Indicators，第18卷，第392-402页)。此外，农业废水对环境的影响也很大。尽管农作物肥料对地下水的影响不容忽视，但动物农业废水的影响往往是巨大的，而且已在世界许多地方证明是灾难性的(https://www.nrdc.org/issues/livestock-production)。此外，畜牧业占据了全球近80％的农业用地，但产生的卡路里是全球供应量的不到20％，可见动物农业带给土地资源的压力程度非常高。

最后，动物福利已成为越来越重要的问题。肉和乳的生产和加工的扩大已将其转变为集约化的工业流程，这逐渐被认为在道德上是不可接受的。

因此，迫切需要乳制品替代品以缓解上述问题。由于大部分奶被转化为乳酪(在欧洲约38％)，因此这种需求在很大程度上转为对乳酪替代品的需求。

基于植物的替代品是传统乳制品的潜在替代品。然而，这些产品通常源自大豆、杏仁或椰奶，远不能模仿乳制品的味道。此外，它们在组成方面也有根本的不同。

因此，如今需要乳替代品，尤其是乳酪替代品

(i)不含不期望的化合物

(ii)在外观、质地和味道上与原产品相似

(iii)在营养方面等同于或优于原产品。

在表1中描述了牛奶的典型组成，牛奶和其他动物奶的更详细组成(包括列出的不同的脂质、蛋白质、盐、维生素和其他营养物质)可以存在于大量的来源(https://en.wikipedia.org/wiki/Milk#Cow's_milk；Haug等人(2007)Bovine milk in humannutrition–a review,Lipids Health Dis.，第6卷，第25页；Dominguez-Salasa等人(2019)Contributions of Milk Production to Food and Nutrition Security；Encyclopediaof Food Security and Sustainability，第3卷，第278-291页)。

表1：牛奶组成

分子的类型	1升的质量(以克计)
		水	902
乳糖	49
		脂肪	39
酪蛋白	28
		其他蛋白质	5
盐和维生素	9
		总计	1032

脂质和碳水化合物(乳糖除外)可以从植物中回收，钙可以从无机来源、动物来源或植物(例如海草)中回收。在蛋白质的情况下，必须考虑其他来源，因为动物蛋白的氨基酸含量与植物蛋白不同。奶中的蛋白质也可以通过发酵生产，这是非动物源配料的另一种来源。

此外，从奶中分离的蛋白质也被单独用作营养补充剂和其他应用。因此，通过发酵产生的奶蛋白独立于其他奶成分，也可用于制造乳替代品之外的其他应用。

通过发酵生产是基于产生感兴趣的化合物的细菌或真菌在发酵罐中生长，通常随后是回收和纯化感兴趣的化合物。通过发酵制造蛋白质是已在食品工业中使用的一种方法，最早的示例之一是重组凝乳酶(chymosin)，其是在美国食品和药物管理局注册并被允许的第一种人工生产的酶,占据现今凝乳酶(rennet)市场的主要份额(现今在美国超过80％)(Food Biotechnology in the United States:Science,Regulation,and Issues".U.S.Department of State.检索于2006-08-14)。从那时起，多个研究描述了通过发酵在各种微生物中生产奶的组成蛋白或同源物(参见下文)，多次描述了将包括发酵蛋白在内的配料组配以制成奶替代品(US6270827；US5,942,274；WO2018039632；WO2020223700)。

然而，奶的蛋白质的工业生产也需要适当的纯化程序，这些纯化程序不仅以与食品工业的使用相匹配的等级生产高纯度水平的所需蛋白质，而且还可容易地以与开发相匹配的成本在工业水平上扩大。理想地，这样的程序应尽可能地简化，避免使用非食用化学物质并避免在非常大规模地进行的情况下使用高成本的步骤。

四种酪蛋白分子(α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白)占奶蛋白的80％以上并几乎占乳酪蛋白的全部，因为在凝乳后其他奶蛋白(通常称为“乳清蛋白”)如β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白在乳清中被去除。酪蛋白的溶解度在很大程度上取决于pH、温度和盐浓度(Post等人(2012)Effect of temperature and pH on thesolubility of caseins:Environmental influences on the dissociation ofcaseins.J.Dairy Sci.，第95卷：第1603-1616页)，但在奶中，它们不是作为可溶性蛋白存在的，而是组织化成胶束，产生胶状结构。酪蛋白胶束是直径在50至600nm范围内的大致球形颗粒，平均直径为约200nm(Kruif，Supra-aggregates of casein micelles as aprelude to coagulation(1998)J Dairy Sci，第81卷，第3019-3028页；de Kruif等人Casein micelles and their internal structure(2012)Advances in Colloid andInterface Science，第171-172卷，第36-52页)。这种胶状体演变成凝乳是乳酪生产的基础(Gillis JC，Ayerbe A，Le fromage 4ème版，Lavoisier-Technique Et Documentation，2018年四月20日)。可认为的是，κ酪蛋白作为胶束结构的稳定剂具有关键作用。

酪蛋白可以在酸介导或凝乳酶介导的凝固后通过中和从奶中以酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙或酪蛋白酸钾分离出来(Sarode等人(2016)Methods of Manufacture.In:Caballero,B.,Finglas,P.,and Toldrá,F.(eds.)The Encyclopedia of Food andHealth，第1卷，第676-682页，Oxford:Academic Press)。不同的各种酪蛋白(α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白)也可以根据它们不同的物理化学性质从大部分的酪蛋白制备物中进行单独纯化，在低温使用膜过滤(Murphy和Fox(1991)Fractionation ofsodium caseinate by ultrafiltration.Food Chem.第39卷，第27-38页；Ward和Bastian(1996)A method for isolatingβ-casein.J.Dairy Sci.第79卷，第1332-1339页；Huppertz等人(2006).Amethod for the large-scale isolation ofβ-casein.FoodChem.第99卷，第45-50页；Lamothe等人(2007).Short communication:Extraction ofβ-casein from goat milk.J.Dairy Sci.第90卷，第5380-5382页；O’Mahony等人(2007).Purification ofβ-casein from milk.US专利No.0104847A1)或选择性地沉淀(Law和Leaver(2007)Methods of extracting casein fractions from milk and caseinatesand production of novel products.Hanna Research Institute，assignee.WO专利No.03003847；Post等人(2009).β-Casein as a bioactive precursor—Processing forpurification.Aust.J.Dairy Technol.第64卷，第84-88页；Post和Hinrichs(2011)Large-scale isolation of food-gradeβ-casein.Milchwissenschaft，第66卷，第361-364页)。

在通过发酵制造的重组蛋白的情况下，必须开发特定的程序以从生物质和培养液中分离重组蛋白，这样的程序取决于生产用的微生物和重组蛋白的性质。

在蛋白质生产的主力之一大肠杆菌中，重组蛋白通常存在于包涵体中。这些细胞内颗粒基本上由重组蛋白的聚集体组成。从这样的聚集体回收实际上折叠的蛋白质需要繁琐的再折叠过程(Singh等人(2015)Protein recovery frominclusion bodies ofEscherichia coli using mild solubilization process.Microbial Cell Factories，第14卷：第41-51页；Vallejo和Rinas(2004)Strategies for the recovery of activeproteins through refolding of bacterial inclusion body proteins.MicrobialCell Factories，第3卷：第11页)。然而，包涵体是小颗粒(0.2-1.5mm)，其分离方案通常基于高相对离心力离心(Rodríguez-Carmona等人(2010)Isolation of cell-freebacterial inclusion bodies.Microbial Cell Factories，第9卷，第71页)，该步骤不容易在工业规模上实施，对于大批量来说可能会有问题。

对于耐热重组蛋白或肽，使用热裂解可能是一个有吸引力的纯化步骤，因为许多宿主可溶性蛋白在高温会沉淀和/或降解(Takesawa等人(1990)Heat-inducedprecipitation of cell homogenates:an investigation of the recovery ofthermostable proteins.Enzyme Microb.Technol.第12卷，第184-189页；Kirk和Cowan1995Optimising the recovery of recombinant thermostable proteinsexpressed in mesophilic hosts.J.of Biotechnology，第42卷，第177-184页；Sundarrajan等人(2018)Novel properties of recombinant Sso7d-Taq DNA polymerasepurified using aqueous two-phase extraction:Utilities of the enzyme in viraldiagnosis.Biotechnol Rep(Amst)19:e00270；US8603782；WO2011119703)。

Post等人(Journal of Dairy Science，第95卷，第4期，2012，1603-1616)未关注酪蛋白纯化，而是分析了β酪蛋白相对于α酪蛋白的选择性沉淀的存在原因。因此，该文献中提供的信息与分离酪蛋白(尤其是重组酪蛋白)的技术问题无关。

US 4 550 028没有描述重组酪蛋白的用途，也没有描述它们的制备或纯化。可以注意到，该文献(第3栏，第1-22行)提及酪蛋白在酸性pH下随着温度的升高而絮凝，这与本文所实现的技术效果(其中酪蛋白保留在溶液中，而非奶蛋白的其他蛋白质沉淀)不同。

WO 99/54355描述了使用与水混溶的有机溶剂(特别是丙酮、异丙醇、乙醇和甲醇)在约5.0至约10.0的pH和约30℃至约50℃的温度从细胞纯化和回收重组蛋白。该申请指出(第6页，第20-24行)“与水混溶的有机溶剂从细胞悬浮液中提取重组蛋白。与水混溶的有机溶剂被认为可以选择性地将重组蛋白从细胞悬浮液中分离出来并使其进入液相”。尽管目的类似于本申请的目的(重组蛋白的纯化)，但是技术效果是通过与本文公开的方法不同的另一种方法(使用有机溶剂)来获得的。

事实上，对于食品应用来说，重要的是避免使用化学物质如有机溶剂，这些化学物质必须在随后的步骤中去除，而在本文公开的方法是在不含有机溶剂的细菌培养基上(优选在裂解细胞和去除细胞碎片之后)进行的。

WO 2020/223700涉及基于重组酪蛋白的制备物(胶束形式的α酪蛋白和κ酪蛋白，优选不含β酪蛋白，如[0006]所示)的制备。该文献没有描述这些重组蛋白的纯化，也没有描述它们的用途，还可以注意到，实施例涉及由胶束酪蛋白制成的新鲜产品的制造，所述胶束酪蛋白“通常在工业中通过对脱脂奶超滤以分离出酪蛋白胶束并用喷雾干燥技术将酪蛋白胶束粉末化而获得”(如[00210]所示)或在胶束重构后获得(实施例6)。

US 4,519,945涉及通过调节pH和温度来用奶制备凝乳。因此，该文献涉及实现酪蛋白絮凝的条件，而与分离和纯化酪蛋白的目的无关。

发明内容

申请人已经表明酪蛋白在高温变得或保持溶解，而其他蛋白质沉淀和/或降解。特别地，申请人已发现，在大肠杆菌中，在不溶性部分中存在的重组酪蛋白(特别是α酪蛋白和β酪蛋白)通过在高温(高于75℃)加热而溶解，然而相反地，来自宿主的许多可溶性蛋白在这样的温度沉淀和/或降解。利用这种性质，可以消除组合物中全部或部分的非酪蛋白的蛋白质，从而在组合物中富集酪蛋白(即增加酪蛋白的相对量)。因此开发了一种从细菌细胞中分离酪蛋白的方法，该方法是在本文公开的发明的基础。

在本发明的上下文中，“酪蛋白”为任何酪蛋白或酪蛋白的混合物。因此，“酪蛋白”为α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白。在某种程度上，它也可以是指这些蛋白质的任何混合物。可以通常使用术语“酪蛋白(casein)”或“酪蛋白(caseins)”来讨论酪蛋白蛋白质。

在本发明的上下文中，术语“在......之间”包括端值。

在本发明的上下文中，术语“乳酪替代品”意指在营养价值、外观、质地和味道方面具有乳酪基本特征的食品产品。

术语“新鲜乳酪”是指这样的乳酪，其中在无脂肪基础上的水分超过80％(水相对于无脂肪的产品总质量的比率)，并且蛋白质含量介于总重量的2％至15％之间(蛋白质质量相对于总产品质量的比率)。

术语“软质乳酪”或“半软质乳酪”是指这样的乳酪，其中在无脂肪基础上的水分介于62％至80％之间(水相对于无脂肪的产品总质量的比率)，并且蛋白质含量介于总重量的15％至30％之间(蛋白质质量相对于总产品质量的比率)。软质乳酪具有的在无脂肪基础上的水分介于67％至80％之间，半软质乳酪具有的在无脂肪基础上的水分介于62％至67％之间。

在本发明的上下文中，术语“液体预凝乳组合物”或“LpCC”是指在添加凝乳酶和发酵物以及进行凝乳(特别是酪蛋白凝固)之前的包含至少一种酪蛋白和至少一种其他配料的组合物，所述其他配料包含水、钙、脂质、碳水化合物中的至少一种成分。LpCC中的酪蛋白浓度高于奶中的酪蛋白浓度。LpCC中其他配料的浓度也高于奶中其他配料的浓度。这使得当使用如本申请中公开的具有重组酪蛋白的LpCC时可以节约一些水，因为LpCC不表示人造(牛)奶。调节蛋白质、脂质、钙盐和/或碳水化合物各自的浓度，以适合于乳酪替代品的最终期望组成。

在本发明的上下文中，术语“凝乳剂”是指能够触发凝乳的化学或生化组合物。可以通过添加酸溶液、通过添加发酵剂培养物(在碳水化合物的存在下生长而引起pH降低的发酵物(ferments))、通过热处理、通过添加钙螯合剂、通过添加天然或重组凝乳酶、通过添加凝乳酶替代品(例如动物蛋白酶或植物凝乳酶)或通过这些方法的组合，来实现凝乳。凝乳剂可以是通过添加导致凝乳的任何添加剂、化合物、组合物或处理剂，其可单独或与另一种或其他添加剂、化合物、组合物或处理剂组合使用。当制备不含动物的可食用组合物时，优选使用酸化剂(例如酸或发酵剂培养物)，以避免使用凝乳酶，使得凝乳剂不包含任何动物源的元素。当酸化剂包含一种或多种乳酸菌时是有利的，但也可以使用酸性化学物质。

在本发明的上下文中，术语“凝乳”意指这样的组合物，其中酪蛋白在凝乳剂的作用下凝固或沉淀，并且其可以通过沥水(例如，在乳酪包布上)与液相(如果有的话)分离。凝乳还包含其他配料，包括水和脂质(如果存在)，

在本发明的上下文中，术语“发酵物”是指在生产乳酪替代品的方法中添加的包含至少一种微生物株的组合物。乳酸发酵物负责乳酸发酵，显著导致介质的酸化。因此，乳酸发酵物可以用作凝乳剂。

将其他发酵物用于乳酪生产以加工凝乳，从而改变质地、味道、气味和化学组成(尤其是将蛋白质裂解成更小的肽)。这些发酵物可以称为“用于成熟的发酵物(fermentsfor maturation)”、“成熟发酵物(maturation ferments)”或“熟化发酵物(ripeningferments)”，其一般不用于生产新鲜乳酪。这种用于成熟的发酵物可以与凝乳剂一起添加。

在本发明的上下文中，术语“非动物源的”意指这样的化合物或组合物，其不是直接源自动物、不是从培养的动物细胞产生的、或者不是从动物产品(例如奶)中分离的。因此，通过微生物发酵产生的化合物或组合物是“非动物源的”，即使在发酵过程中可能涉及一些动物源的产品，例如细菌蛋白胨。因此，在本发明的上下文中，当在动物中天然产生的蛋白质是在微生物(例如细菌或酵母)细胞或植物细胞中产生时，该蛋白质将被称为非动物源的，即使其序列或结构可以与从动物中分离的蛋白质的序列或结构相同。

在本发明的上下文中，术语“不含动物”意指不源自动物、不源自培养的动物细胞或者不源自动物产品(例如奶)的化合物或组合物，其生产方法不涉及任何动物源的原料或添加剂。

在本发明的上下文中，术语“质地剂(texturing agent)”意指任何胶凝剂，包括乳化剂如卵磷脂，以及水胶体如肉桂胶、田菁胶、罗望子胶、瓜尔胶、葫芦巴胶、阿拉伯胶、琼脂(agar agar或agar-agar)、卡拉胶、黄芪胶、黄原胶、角豆(槐豆)胶、纤维素胶。

在第一方面，本文公开了一种用于生产酪蛋白组合物的方法，其包括：

i)提供含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物

ii)加热组合物以减少(或降低)组合物的可溶性部分中其他蛋白质的量，

iii)回收可溶性部分

从而获得酪蛋白组合物。

特别地，在ii)中，加热增加了可溶性部分中酪蛋白相对于其他蛋白质的比率，从而使组合物富集酪蛋白。

i)的组合物包含可溶性部分和任选的不溶性部分。可溶性部分是指在离心时未成团块的部分。不溶性部分为离心后获得的团块。优选地将离心在约3000g下进行20至30分钟。在工业规模上，可以使用连续流离心或其他方法(例如过滤)来回收可溶性部分。

优选地在不存在有机溶剂的情况下，或在添加有机溶剂的情况下，通过加热来获得期望的技术效果。

当酪蛋白的相对量与蛋白质总量相比增加时，可溶性部分中酪蛋白的比率增加。

这种方法可以用于从含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物中分离或纯化酪蛋白。这种方法也可以用于在蛋白质组合物中富集酪蛋白，即增加酪蛋白在蛋白质组合物的蛋白质部分中的比例。

在本文所述方法的情况中，“酪蛋白组合物”是指含有酪蛋白的组合物。为了使用基于可溶性和不溶性部分分离的纯化步骤，酪蛋白组合物需要包含可溶性部分。然而，随后可以将这种酪蛋白组合物在后续步骤中干燥。在一些实施方案中，酪蛋白占组合物的蛋白质的25％以上。在另一个实施方案中，酪蛋白占组合物的蛋白质的50％以上。在一些实施方案中，酪蛋白占干重的主要部分(50％以上)。这种酪蛋白组合物还可以包含其他化合物，尤其是钙、其他蛋白质、脂质等。通过微生物培养产生的酪蛋白组合物是非动物源的酪蛋白组合物。

还可以列举一种用于在含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物中富集酪蛋白的方法，其包括：

i)提供含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物

ii)加热组合物以减少组合物的可溶性部分中其他蛋白质的量，同时增加或保持可溶性部分中酪蛋白的量，以及

iii)回收可溶性部分

从而在组合物中富集酪蛋白。

其他蛋白质为非酪蛋白的蛋白质。因此，该方法使得可以获得富含酪蛋白的组合物。酪蛋白在组合物中的富集是指在全部蛋白质含量中的酪蛋白比率(或相对量)的增加。将其与加热前的量进行比较。

优选地在不存在有机溶剂的情况下，或在添加有机溶剂的情况下，通过加热来获得期望的技术效果。

鉴于此，其结果是酪蛋白组合物在方法结束时可以仅含有酪蛋白，或者也可以含有其他蛋白质(当加热时其他蛋白质的沉淀和/或降解不完全时)。然而，如上所述，优选的是酪蛋白占在实施方法后获得的组合物中蛋白质的至少50％(重量/重量)。在一个优选的实施方案中，酪蛋白占在实施方法后获得的组合物中蛋白质的至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％。蛋白质的量可以通过本领域已知的任何方法(使用凝胶、蛋白质定量)来测量。

如上所述，在(i)中使用的含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物也可以含有其他成分，例如碳水化合物或脂质。这在含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物通过表达酪蛋白的重组微生物(包括真核细胞)的培养产生时尤为如此。这样的其他成分(全部或部分)将存在于酪蛋白组合物中。

在(i)中使用的这种含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物可以含有悬浮在适当的缓冲液或溶液但更优选水中的微生物，或者在酪蛋白由微生物分泌的情况下，含有从微生物培养物产生的上清液。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有α-S1酪蛋白。在一个实施方案中，α-S1酪蛋白为起始组合物中仅有的酪蛋白。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有α-S2酪蛋白。在一个实施方案中，α-S2酪蛋白为起始组合物中仅有的酪蛋白。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有β酪蛋白。在一个实施方案中，β酪蛋白为起始组合物中仅有的酪蛋白。

在一个具体但非优选的实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有κ酪蛋白。因此，在优选的实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)不含κ酪蛋白。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有α-S1酪蛋白和β酪蛋白的混合物。在一个实施方案中，α-S1酪蛋白和β酪蛋白为起始组合物中仅有的酪蛋白。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有α-S1酪蛋白和α-S2酪蛋白的混合物。在一个实施方案中，α-S1酪蛋白和α-S2酪蛋白为起始组合物中仅有的酪蛋白。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有α-S2酪蛋白和β酪蛋白的混合物。在一个实施方案中，α-S2酪蛋白和β酪蛋白为起始组合物中仅有的酪蛋白。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白和β酪蛋白的混合物。在一个实施方案中，α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白和β酪蛋白为起始组合物中仅有的酪蛋白。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白的混合物。

在一个具体实施方案中，起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)含有选自α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白中的两种至三种酪蛋白组合的混合物。

可以对可溶性部分进行另一个纯化步骤，例如过滤(特别是超滤、纳滤、反渗透)、色谱法、或另一种沉淀(例如酪蛋白的酸性沉淀)，以进一步纯化和/或富集酪蛋白。特别地，在pH＝4并优选地在约90℃进行酸性沉淀。可以进行多个其他纯化步骤。在操作一种或多种上述纯化方法之前或之后，也可以在可溶性部分中添加活性炭。

在一个具体实施方案中，微生物为细菌细胞。在另一个实施方案中，微生物为真菌细胞(包括酵母细胞)。在另一个实施方案中，微生物为真核细胞，特别是植物细胞。实际上优选酪蛋白在非动物生物体中产生。

当酪蛋白是通过转化为表达酪蛋白的微生物(特别是细菌)的培养或发酵来产生时，可以利用酪蛋白的性质(在高温保持可溶性，而其他蛋白质沉淀和/或降解)来实施用于生产酪蛋白组合物的方法，所述方法包括：

i)提供微生物组合物(优选细菌组合物)，其中所述微生物组合物(优选细菌组合物)包含已用至少一种编码酪蛋白的核酸转化的微生物(优选细菌)，并且微生物(优选细菌)已经过培养从而表达和产生了酪蛋白

ii)在诱导酪蛋白在可溶性部分中富集和/或其他蛋白质在可溶性部分中的量减少的温度，加热微生物组合物(优选细菌组合物)

iii)从ii)的经加热的溶液中分离可溶性部分，

iv)任选地进行选自添加活性炭、膜过滤(超滤、纳滤或反渗透)、色谱法或沉淀酪蛋白中的一个后续步骤，该步骤应用至iii)中分离出的可溶性部分，

从而获得酪蛋白组合物。

在ii)中，如果细胞尚未裂解，加热微生物组合物(优选细菌组合物)还应诱导细胞裂解，以产生微生物提取物，其中可溶性部分富集酪蛋白和/或其中可溶性部分中其他蛋白质的量减少。

因此，当微生物组合物包含已经裂解的微生物时，在ii)中加热将使酪蛋白在可溶性部分中富集和/或使可溶性部分中其他蛋白质的量减少，并且当微生物组合物中存在的微生物尚未裂解时，观察到微生物裂解的附加效果。

与加热前微生物已经裂解的微生物组合物的可溶性部分相比，观察到可溶性部分中的酪蛋白富集或其他蛋白质减少。

因此，这种方法允许获得酪蛋白组合物，并且从微生物培养物中分离出富含酪蛋白(或酪蛋白富集)的组合物。富含酪蛋白的组合物是其中酪蛋白为主要蛋白质的组合物。在一个优选的实施方案中，酪蛋白占所述富含酪蛋白的组合物中蛋白质的50％以上。在一个更优选的实施方案中，酪蛋白占所述富含酪蛋白的组合物中蛋白质的80％以上或90％以上或95％以上。

事实上，如实施例所示，在加热时，酪蛋白从不溶性部分(团块)转移至可溶性部分(上清液)。实施例还表明，在热作用下转移至可溶性部分的基本上是酪蛋白。

微生物组合物含有悬浮在适当流体(例如水或下文所述的其他缓冲液)中的微生物细胞。因此，在离心时，可以获得不溶性部分(团块)和可溶性部分(上清液)。然而，优选的是在离心之前实施方法。在该实施方案中，当进行加热时，不溶性部分可以悬浮在可溶性部分内。因此，离心或其他方法(例如过滤)可以用于回收可溶性部分。

在一个实施方案中，微生物组合物(优选细菌组合物)是通过在适当的液体或流体(适当的缓冲液，更优选水，更优选不存在有机溶剂)中培养、洗涤和重新悬浮之后对微生物细胞(优选细菌)进行离心而获得的。缓冲液的pH不是酸性(等于或高于6.5)，优选接近中性(在6.5至7.5之间)，或碱性(优选低于9)。事实上，酪蛋白可以在酸性pH沉淀，并且该过程甚至通过加热而增强，如实施例7所示。还优选的是缓冲液为非离子性的或者具有低离子强度。iii)的可溶性部分可以通过将ii)中经加热的组合物离心或通过本领域已知的其他方法来获得。

在ii)中，在介于约75℃至约100℃之间，特别是在75℃至105℃之间的温度加热以上所公开的方法中i)的组合物。这样的温度使得可以获得以上ii)中所述的技术效果和功能效果(去除其他蛋白质，从而减少它们的量和/或将酪蛋白从不溶性部分转移至可溶性部分)。即使在压力增加的情况下使用水时，也可以在100℃以上的温度起作用。本领域技术人员能够确定合适的温度、压力和pH条件来实施本文公开的方法。

当提及可测量值时，术语“约”意指涵盖从指定值起±4％的变化，因为这样的变化适于实施所公开的方法。

特别地，温度等于或高于80℃，或者等于或高于85℃，等于或高于90℃。特别地，温度介于约85℃至约95℃之间，更具体地为约95℃。在另一个实施方案中，温度介于约90℃至约95℃之间。温度通常等于或低于100℃。在80℃至100℃之间或在85℃至100℃之间的温度是合适的。

加热的持续时间可以由本领域技术人员进行调整。当在约95℃进行加热时，持续时间可以在约5分钟至约2小时之间。优选的是，持续时间为至少10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、1小时，更优选约2小时。可以将持续时间延长(特别是针对较低的温度)或者缩短(特别是针对较高的温度)。

如上所述，具体实施方案包括当起始组合物(含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物)已经从细菌培养物中获得时的情况。在这样的实施方案中，细菌已经用一种或多种编码多于一种酪蛋白的核酸转化。

特别地，在一个实施方案中，细菌已经用一种或多种编码β酪蛋白的核酸转化。

特别地，在一个实施方案中，细菌已经用一种或多种编码α-S1酪蛋白的核酸转化。

特别地，在一个实施方案中，细菌已经用一种或多种编码α-S2酪蛋白的核酸转化。

特别地，在一个实施方案中，细菌已经用一种或多种编码β酪蛋白和α-S1酪蛋白的核酸转化。

特别地，在一个实施方案中，细菌已经用一种或多种核酸转化，所述一种或多种核酸编码β酪蛋白、α-S1酪蛋白和α-S2酪蛋白或它们中两种的的组合。

应注意的是，当生产多种蛋白质时，细菌可以用不同的核酸(每种核酸编码不同的蛋白质)转化或用仅有的核酸(其包含允许产生各种蛋白质的元素)转化。转化微生物和细菌以特别用于生产一种或多种蛋白质的此类方法是本领域已知的。

核酸含有允许产生其编码的酪蛋白的所有元素(例如启动子、增强子、终止子等)。本领域技术人员知晓所有这些元素，并且能够选择最合适的元素。本领域技术人员还可以选择微生物以产生酪蛋白。

特别地，适合表达酪蛋白的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)以及乳球菌属、假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各种物种。

适合表达酪蛋白的真核宿主包括真菌，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。

植物细胞也可以用于在细胞培养物或整个植物中产生蛋白质。

可以添加后续步骤，例如添加活性炭、膜过滤、色谱法或沉淀酪蛋白，从而得到包括以下的方法：

i)提供微生物组合物(优选细菌组合物)，其中所述微生物组合物(优选细菌组合物)包含已用至少一种编码酪蛋白的核酸转化的微生物(优选细菌)，并且微生物(优选细菌)已经过培养从而表达和产生了酪蛋白

ii)在诱导酪蛋白在可溶性部分中富集和/或其他蛋白质在可溶性部分中的量减少的温度，加热微生物组合物(优选细菌组合物)

iii)从ii)的经加热的组合物中分离可溶性部分，

iv)通过添加选自添加活性炭、膜过滤、色谱法或酪蛋白沉淀中的至少一个步骤来进一步加工所述可溶性部分

从而获得酪蛋白组合物。

在该实施方案中，在ii)中的加热还诱导微生物的裂解，从而获得微生物提取物，并且在该提取物中酪蛋白富集和/或其他蛋白质减少。

此外，在包括以下的方法中可以使用独立于细胞裂解的加热过程：

i)提供微生物提取物，其中所述微生物提取物通过微生物培养物的裂解而产生，所述微生物培养物包含已用编码酪蛋白的核酸转化的微生物，所述微生物经过培养从而表达和产生了酪蛋白

ii)在一定温度加热微生物提取物，以在组合物的可溶性部分中富集酪蛋白和/或在可溶性部分中减少其他蛋白质的量

iii)分离加热后的可溶性部分

iv)通过添加选自添加活性炭、膜过滤、色谱法或酪蛋白沉淀中的至少一个步骤来进一步加工所述可溶性部分

从而获得酪蛋白组合物。

可以将在iii)中分离出的可溶性部分进一步加工以提高酪蛋白的纯度。

可以将活性炭添加至可溶性部分并进行搅拌。活性炭可以用于吸附可溶性部分中存在的杂质(特别是有机杂质或氯)，这些杂质在iii)中回收可溶性部分时未被去除。优选伴有活性炭进行搅拌，并且在对可溶性部分进行其他方法(例如下文公开的方法)之前去除活性炭。

色谱法广泛用于纯化方法，尤其包括亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法等。

膜过滤(尤其包括超滤和纳滤)也通常用于蛋白质纯化(Saxena等人(2009)Membrane-based techniques for the separation and purification of proteins:Anoverview.Advances in colloids and Interface Science，第145卷，第1-22页)，膜过滤技术广泛用在乳品业中。有趣的是，它们可以用于将不同的酪蛋白相互分离(参见上文)。

最后，可以利用酪蛋白的特定性质(Post等人(2012)Effect of temperature andpH on the solubility of caseins:Environmental influences on the dissociationof caseins.J.Dairy Sci.第95卷：第1603–1616页)，尤其是它们在酸性条件下沉淀的倾向性来进行进一步的纯化。

在一个优选的实施方案中，通过在酸性条件下沉淀酪蛋白来进一步加工所述可溶性部分。在沉淀之后，可以将酪蛋白重新悬浮，并且使用适当的碱性缓冲液，还可以使它们重新溶解(Post等人(2012)Effect of temperature and pH on the solubility ofcaseins:Environmental influences on the dissociation of caseins.J.Dairy Sci.第95卷：第1603–1616页)。当将酪蛋白从微生物培养物中分离出时，在酸性条件下沉淀是特别有益的，因为其使得可以去除或降解酪蛋白组合物中可能存在的任何核酸。当将酪蛋白用于获得旨在由人类摄入的可食用组合物(例如乳酪替代品)时，微生物的DNA或RNA的存在可能被证明是有害的(至少从监管的角度来看)。

在一个具体实施方案中，将酪蛋白组合物干燥。当从细菌培养物中获得时，这种组合物应在干燥的组合物中含有约15％至30％的酪蛋白(w/w)、和碳水化合物。

优选的是保留一点水，以有利于以后的复水。因此，干燥被理解为减少水的量。在一些实施方案中，水的量为约50％或更少(w/w)。

在具体实施方案中，本发明涉及一种用于生产酪蛋白组合物的方法，其包括：

i)提供细菌组合物，其中所述细菌组合物包含已用至少一种编码酪蛋白的核酸转化的细菌，并且细菌已经过培养从而表达和产生了酪蛋白，

ii)在诱导酪蛋白在可溶性部分中富集和/或其他蛋白质在可溶性部分中的量减少的温度，加热细菌组合物，

iii)从ii)的经加热的细胞组合物中分离可溶性部分，

iv)通过添加选自添加活性炭、膜过滤、色谱法或酪蛋白沉淀中的至少一个步骤来进一步加工所述可溶性部分

从而获得酪蛋白组合物。

当细菌组合物的细菌未裂解时，在ii)中的加热还诱导细胞裂解，从而产生细菌提取物。

在其他实施方案中，本发明涉及一种用于生产酪蛋白组合物的方法，其包括：

i)提供细菌组合物，其中所述细菌组合物包含已用至少一种编码酪蛋白的核酸转化的细菌，并且细菌已经过培养从而表达和产生了酪蛋白，

ii)在诱导酪蛋白在可溶性部分中富集和/或其他蛋白质在可溶性部分中的量减少的温度，加热细菌组合物，

iii)从ii)的经加热的细菌组合物中分离可溶性部分，

iv)通过在酸性条件下沉淀酪蛋白来进一步加工所述可溶性部分

从而获得酪蛋白组合物。

在该实施方案中，当细菌组合物的细菌未裂解时，在ii)中的加热还应诱导细菌裂解，从而产生细菌提取物。

在其他实施方案中，本发明涉及一种用于生产酪蛋白组合物的方法，其包括：

i)提供细菌组合物，其中所述细菌组合物包含已用至少一种编码酪蛋白的核酸转化的细菌，并且细菌已经过培养从而表达和产生了酪蛋白，

ii)在诱导酪蛋白在可溶性部分中富集和/或其他蛋白质在可溶性部分中的量减少的温度，加热细菌组合物，

iii)从ii)的经加热的细菌组合物中分离可溶性部分，

iv)通过在90℃、pH＝4加热而使酪蛋白沉淀来进一步加工所述可溶性部分从而获得酪蛋白组合物。

在一个优选的实施方案中，加热细菌组合物诱导细胞裂解。

因此，在本文公开的方法使得可以获得酪蛋白组合物。通过本文公开的方法易于获得(或获得)的这种酪蛋白组合物是本发明的另一个主题。可以对这种组合物进行表征，如上所限定。

在奶中，酪蛋白是在奶中存在的胶束形式，其中胶束包含组装在相同颗粒中的α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白。在本发明的情况中，酪蛋白可以不组装成胶束形式。然而，如下所示，这并不妨碍以下的能力：通过添加适当的凝乳剂来从酪蛋白组合物获得凝乳。

事实上，如实施例中所形成的，这种酪蛋白组合物可以用于生产乳酪替代品，特别是不含动物的乳酪替代品，即不含任何动物源产品的乳酪替代品(特别是当酪蛋白是从细菌或酵母培养物中分离出时)。

总之，对含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物的简单加热使得可以通过减少可溶性部分中大多数其他蛋白质的量来使组合物富集酪蛋白。加热还使得可以将细菌培养物的不溶性部分中存在的酪蛋白溶解。所获得的酪蛋白虽然不是处于形成胶束的最佳条件，但在凝乳剂的作用下可以适当地凝乳。这样的发现是出乎意料的。

特别地，已表明，在不存在κ酪蛋白的情况下，用细菌产生的重组酪蛋白可以实现凝乳。

已知乳品酪蛋白，尤其是α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白和β酪蛋白为磷酸化的；此外，κ酪蛋白为糖基化的(Walstra等人(2006)Dairy Science and Technology.Taylor andFrancis Group，Boca Ranton，美国；Martin等人，(2003)Non bovine caseinsquantitative variability and molecular diversity.In:Fox PF and Mc SweeneyPLH.Advances in Dairy Chemistry–Proteins，第1卷，Springer，New-York，227-310)。酪蛋白磷酸化在与钙的相互作用中以及在乳品酪蛋白胶束的结构中起着重要作用。在细菌产生的重组酪蛋白中不会存在这种翻译后修饰。

还已知κ酪蛋白在乳品酪蛋白胶束的形成中也起着重要作用。WO2020223700描述了在形成由重组α-S1酪蛋白(去磷酸化)和κ酪蛋白(去糖基化)形成的胶束之后，用这两种酪蛋白制造凝乳(参见该文献的实施例14)。然而，WO2020223700也报道了使用低磷酸化的α-酪蛋白产生较疏松的胶束(参见该文献的实施例11)。因此，以下是出乎意料的：在没有翻译后修饰以及没有κ酪蛋白的情况下可以实现凝乳。

因此，可以将在本文公开的组合物以及通过上文公开的方法获得的或易于获得的组合物用在用于获得凝乳的方法中，所述方法包括

i)提供在本文公开的酪蛋白组合物，

ii)将所述酪蛋白组合物与包含选自水、钙、脂质和碳水化合物中的至少一种成分的至少一种其他配料混合，以获得液体预凝乳组合物(LpCC)

iii)将至少一种凝乳剂添加至液体组合物以获得凝乳。

在一个优选的实施方案中，所述凝乳剂不是凝乳酶，而是酸化剂。在一个优选的实施方案中，所述凝乳剂为乳酸菌或者乳酸、柠檬酸或乙酸。在一个优选的实施方案中，酪蛋白组合物不含任何κ酪蛋白。在一个优选的实施方案中，酪蛋白不含任何翻译后修饰。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有α-S1酪蛋白(作为酪蛋白)。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有α-S2酪蛋白(作为酪蛋白)。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有β酪蛋白(作为酪蛋白)。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有α-S1酪蛋白和β酪蛋白(作为酪蛋白)。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有α-S2酪蛋白和β酪蛋白(作为酪蛋白)。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有α-S1酪蛋白和α-S2酪蛋白(作为酪蛋白)。在一个实施方案中，酪蛋白组合物含有α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白和β酪蛋白。

本发明还涉及一种用于生产可食用组合物的方法，其包括

i)提供在本文公开的酪蛋白组合物，

ii)将所述酪蛋白组合物与包含选自水、钙、脂质和碳水化合物中的至少一种成分的至少一种其他配料混合，以获得液体预凝乳组合物(LpCC)

iii)将至少一种凝乳剂添加至液体组合物以获得凝乳，以及

iv)进一步加工凝乳以获得可食用组合物，

在一个优选的实施方案中，所述凝乳剂不是凝乳酶，而是酸化剂。在一个优选的实施方案中，所述凝乳剂为乳酸菌或者乳酸、柠檬酸或乙酸。

在以上的实施方案中，优选的是在b)或d)中添加胶凝剂。

优选的是在b)中添加的其他配料均为非动物源。在本文公开的用于生产凝乳和可食用组合物的方法中，优选仅使用非动物源的产品，以获得不含动物源元素的可食用组合物。

在优选的实施方案中，在b)中添加的配料包括

i.任选的除酪蛋白以外的蛋白质

ii.脂质

iii.水，以及

iv.碳水化合物；在优选的实施方案中，碳水化合物不包括乳糖，以使可食用组合物更容易被乳糖不耐症的顾客接受。

一般来说，可食用组合物

i.具有的蛋白质含量小于25％，优选地介于2％至25％之间或介于5％至25％之间(w/w)

ii.具有的在无脂肪基础上的水分含量高于62％。

在优选的实施方案中，可食用组合物为乳酪替代品。

在一个优选的实施方案中，酪蛋白组合物含有α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白中的至少一种酪蛋白。在一个更优选的实施方案中，酪蛋白组合物含有α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白中的至少两种酪蛋白。在一个更优选的实施方案中，酪蛋白组合物含有α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白或κ酪蛋白。在一个实施方案中，选自α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白中的至少一种酪蛋白不存在于酪蛋白组合物中。在一个实施方案中，κ酪蛋白不存在于酪蛋白组合物中。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有β酪蛋白。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有β酪蛋白和α-S2酪蛋白。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有β酪蛋白和α-S1酪蛋白。在一个实施方案中，酪蛋白组合物仅含有β酪蛋白、α-S1酪蛋白和α-S2酪蛋白。事实上，发明人已经表明，在不含κ酪蛋白的情况下可以获得凝乳和作为乳酪替代品的可食用组合物，从而使得发明人不用试图重新构建胶束的形成，或者不用检查溶液是否真的存在胶束。

当制备不含动物的可食用组合物时，优选使用酸化剂(例如酸或发酵剂培养物)，以避免使用凝乳酶，使得凝乳剂不包含任何动物源的元素。当酸化剂包含一种或多种乳酸菌时是有利的。

考虑到由于凝乳和陈化而引起的水损失(这可以由本领域技术人员通过改变持续时间和成熟条件来调节)，LpCC的组合物适合于对可食用组合物所期望的最终组合物。

在一个实施方案中，乳酪替代品具有新鲜乳酪的基本特征。新鲜乳酪含有的在无脂肪基础上的水分为80％或更高。在无脂肪基础上的水分的百分比为产品中存在的水的质量除以总质量减去脂肪的质量(＝水的质量/总质量-脂肪的质量))。在新鲜乳酪中，蛋白质含量通常低于15％，可以低至总重量的7％，或甚至更低。

在该实施方案中，可食用组合物优选具有

i.介于2％至15％之间(重量含量)的蛋白质含量

ii.在无脂肪基础上高于80％的水分含量。

更具体地，可食用组合物的蛋白质含量可介于5％至15％之间(重量含量)。

当在b)中获得的LpCC具有以下含量时可以获得这些特征：

i.低于12％(重量含量)的蛋白质含量

ii.在无脂肪基础上高于80％的水分含量。

特别地，在b)中获得的LpCC具有

i.介于5％至10％之间(重量含量)的蛋白质含量

ii.在无脂肪基础上高于80％的水分含量。

在该实施方案中，优选的是将琼脂以占LpCC的0.5％至0.8％(w/w)的量添加至LpCC。

可食用组合物或在用于制造可食用组合物的方法中使用的LpCC的一些其他特征如下所述，并且可以单独或组合地存在：

-可食用组合物的脂质含量介于10％至30％之间(重量含量)

-LpCC的脂质含量介于10％至30％之间(重量含量)

-可食用组合物的钙含量低于2.8％(重量含量)

-LpCC的钙含量介于0.1％至1％之间(重量含量)。

当实施用于获得将作为新鲜乳酪替代品的可食用组合物的方法时，凝乳的加工可以包括以下步骤：

a)将结构化剂与凝乳混合以获得补充的凝乳，其中所述结构化剂选自胶凝剂、质地剂、乳化剂及其混合物，以及

b)将补充的凝乳成型并沥水。

c)下文还公开了其他实施方案。

在该实施方案中，本发明涉及一种用于生产可食用组合物的方法，其包括：

a)提供酪蛋白组合物，所述酪蛋白组合物包含如本文所公开的重组酪蛋白(优选仅如本文所公开的重组酪蛋白，优选仅非动物源的酪蛋白)

b)将所述酪蛋白组合物与包含选自水、钙、脂质和碳水化合物中的至少一种成分的至少一种其他配料混合，以获得液体预凝乳组合物(LpCC)，

c)将至少一种凝乳剂添加至液体预凝乳组合物以获得凝乳

d)进一步加工凝乳以获得可食用组合物，

其中在b)和/或d)中添加胶凝剂。

“仅包含非动物源的酪蛋白”表示不存在动物源的酪蛋白(即包含仅非动物源的酪蛋白)。在优选的实施方案中，如果存在其他元素，它们也是非动物源的。在其他实施方案中，酪蛋白组合物不含酪蛋白(非动物源，优选本文所述的重组酪蛋白)以外的任何其他元素。

在一个实施方案中，在b)中添加胶凝剂。

在另一个实施方案中，在d)中添加胶凝剂。

在另一个实施方案中，在b)和d)中添加胶凝剂。

在该实施方案中，优选的是可食用组合物具有

i.介于2％至15％之间(重量含量)的蛋白质含量

ii.在无脂肪基础上高于80％的水分含量。

因此，该实施方案非常适合于生产新鲜乳酪替代品。

在另一个优选的实施方案中，乳酪替代品具有软质乳酪或半软质乳酪的基本特征。软质乳酪含有在无脂肪基础上在67％至80％之间的水分，并且可以是花外皮(bloomyrind)或洗过的外皮。它们的蛋白质含量通常在总重量的20％范围内。软质乳酪，花外皮具有丰富的奶油质地，乳酪略带弹性。陈化方法取决于其厚度。这种乳酪具有混合的凝固，沥水缓慢，接种了特定的霉菌。软质的洗过的外皮乳酪具有丰富的奶油质地，乳酪略带弹性。在陈化方法中，将乳酪定期翻动，并用啤酒、蜂蜜酒、葡萄酒或烈酒在盐水中刷洗或洗涤。半软质乳酪含有在无脂肪基础上在62％至67％之间的水分。质地可以为柔软的奶油质地。陈化时，可以在盐水中采用红色涂抹(含有或不含有酒精)洗涤乳酪(洗过的外皮)。乳酪也可以进行刷洗和/或形成天然外皮。

特别地，在该实施方案中，可食用组合物具有

i.介于15％至25％之间(重量含量)的蛋白质含量

ii.在无脂肪基础上介于62％至80％之间的水分含量。

这尤其当在b)中获得的LpCC具有以下含量时可以实现：

i.介于10％至18％之间(重量含量)的蛋白质含量

ii.在无脂肪基础上高于62％的水分含量

在该实施方案中，优选的是将琼脂以占LpCC的0.5％至1％(w/w)的量添加至LpCC。

在该实施方案中，有利的是：在c)中添加用于成熟的发酵物[熟化发酵物]，以及d)包括将凝乳进行盐渍和成型。

特别地，步骤d)包括：在允许用于成熟的发酵物发生进展(development)的温度，特别是在14℃，使凝乳进行成熟。成熟的持续时间由本领域技术人员根据对可食用组合物所期望的外观确定。可以是数天或数周。

可食用组合物或在用于制造可食用组合物的方法中使用的LpCC的一些其他特征如下所述，并且可以单独或组合地存在：

-可食用组合物的脂质含量介于10％至30％之间(重量含量)

-LpCC的脂质含量介于10％至30％之间(重量含量)

-可食用组合物的钙含量低于2.8％(重量含量)

-LpCC的钙含量介于0.3％至1.7％之间(重量含量)。

在一个具体实施方案中，本发明涉及一种用于生产可食用组合物的方法，其包括：

a)提供酪蛋白组合物，所述酪蛋白组合物包含如本文所公开的重组酪蛋白(优选仅如本文所公开的重组酪蛋白，优选仅非动物源的酪蛋白)

b)将所述酪蛋白组合物与包含选自水、钙、脂质和碳水化合物中的至少一种成分的至少一种其他配料混合，以获得液体预凝乳组合物(LpCC)，

c)将至少一种凝乳剂添加至液体预凝乳组合物以获得凝乳

d)进一步加工凝乳以获得可食用组合物，

其中在b)中添加胶凝剂，在c)中添加用于成熟的发酵物，并且d)包括将凝乳进行盐渍和成型。

在该实施方案中，优选的是可食用组合物具有

i.介于15％至25％之间(重量含量)的蛋白质含量

ii.在无脂肪基础上介于62％至80％之间的水分含量。

该实施方案非常适合于生产软质乳酪替代品。

此外，本发明还涉及一种方法，其包括：

i)提供细菌组合物，其中所述细菌组合物包含已用至少一种编码酪蛋白的核酸转化的细菌，并且细菌已经过培养从而表达和产生了酪蛋白

ii)在诱导酪蛋白在可溶性部分中富集和/或其他蛋白质在可溶性部分中的量减少的温度，加热细菌

iii)分离加热后的可溶性部分

iv)任选地，通过添加选自添加活性炭、膜过滤、色谱法或酪蛋白沉淀中的至少一个步骤来进一步加工所述可溶性部分，从而获得酪蛋白组合物

v)将所述酪蛋白组合物与包含选自水、钙、脂质和碳水化合物中的至少一种成分的至少一种其他配料混合，以获得液体预凝乳组合物(LpCC)

vi)将至少一种凝乳剂添加至液体组合物以获得凝乳。

当细菌未裂解时，在ii)中的加热应在诱导细胞裂解的温度进行，从而产生细菌提取物。

在一个优选的实施方案中，所述凝乳剂不是凝乳酶，而是酸化剂。在一个优选的实施方案中，所述凝乳剂为乳酸菌或者乳酸、柠檬酸或乙酸。

术语“液体预凝乳组合物”或“LpCC”是指在添加凝乳酶和发酵物以及进行凝乳(特别是酪蛋白凝固)之前的包含至少一种酪蛋白和至少一种其他配料的组合物，所述其他配料包含水、钙、脂质、碳水化合物中的至少一种成分。

“凝乳剂”是指能够触发凝乳的化学或生化组合物。可以通过添加酸溶液、通过添加发酵剂培养物(其在碳水化合物的存在下生长而引起pH降低)、通过添加天然或重组凝乳酶、通过添加凝乳酶替代品(例如动物蛋白酶或植物凝乳酶)或通过这些方法的组合，来实现凝乳。也可以进行热处理，或添加钙螯合剂，以特别是改善或加速凝乳。

凝乳剂可以是通过添加导致凝乳的任何添加剂、化合物、组合物或处理剂，其可单独或与另一种或其他添加剂、化合物、组合物或处理剂组合使用。

全部蛋白质含量(包括酪蛋白和衍生的肽)取决于乳酪类型和生产方法。LpCC中的蛋白质含量将影响最终产品中的蛋白质含量，并且可以被调节以生产针对期望类型的乳酪的替代品。LpCC中的蛋白质含量(重量含量)对应于LpCC中蛋白质的质量除以LpCC的总质量。

在一个优选的实施方案中，LpCC中的蛋白质含量低于12％(重量含量)。在一个更优选的实施方案中，其介于2％至10％之间(重量含量)。在一个更优选的实施方案中，其介于5％至10％之间(重量含量)。这些量对于生产新鲜乳酪的替代品而言是特别有益的。

在另一个优选的实施方案中，LpCC中的蛋白质含量介于10％至25％之间(重量含量)。在一个更优选的实施方案中，其介于10％至18％之间(重量含量)。这些量对于生产软质乳酪或半软质乳酪的替代品而言是特别有益的。

钙和其他盐

牛奶每升含有约1.2g钙(约0.12％，重量含量)。钙存在于乳酪中，有助于其营养品质。钙占乳酪重量的0.1％至1％，通常在新鲜乳酪中存在的钙含量最低(在法国“白乳酪(fromage blanc)”中的重量含量为0.125％)，而通常在坚实的硬质乳酪中存在的钙含量最高(在埃曼塔拉乳酪(Emmental)中为0.97％)。在卡门培尔乳酪(camembert)中，其在0.25％的范围内(重量含量)。在乳酪生产方法中，在奶中保留的钙量取决于方法(Mietton etChablain,Du lait au fromage:les fondamentaux technologiques.在Gillis JC,Ayerbe A,Le fromage第四版,Lavoisier-Technique Et Documentation，2018年4月20日)，相较于用乳酸凝乳剂(16％至17％的钙)，用凝乳酶实现了更好的保留(62％至67％的钙)。此外，为了贴近地重现给定乳酪类别的特性，LpCC中钙的百分比将很重要。然而，可以设想钙含量提高的乳酪。

在一个优选的实施方案中，LpCC中的钙含量介于0.1％至1.7％之间。

一些含钙的食品添加剂，尤其是碳酸钙(E170)是动物源的。然而，也存在矿物或植物(例如，来自石枝藻海藻(lithothamne sea weed))源的钙。在本文公开的方法提供了用非动物源的钙替代奶钙的可能性，从而允许减少动物源的成分。在一个更优选的实施方案中，钙来自非动物源。可以添加其他盐，例如磷酸盐(其为奶的重要成分)等。

脂质

脂质存在于大多数乳酪中，并在感官感觉中发挥作用。然而，为了解决健康问题，在过去几十年中生产了脂肪含量降低(低脂肪)或者甚至不含脂肪的乳酪。在本文公开的方法提供了用非动物源的脂质替代奶脂质的可能性，从而允许减少动物源的成分。在一个更优选的实施方案中，所述脂质为从植物中提取的脂质。

在乳酪中，脂肪含量可以从完全无脂肪的产品的0％到多于30％不等。乳酪中的脂肪含量对应于乳酪中脂质的质量除以乳酪的总质量。

可以在数量和质量方面调节脂肪组分，以模拟现有乳酪的组分。脂质以高含量存在于大多数乳酪中：95％-10％的奶脂质在凝乳过程中保留在凝乳中。然而，脂质含量因奶源(牛、山羊、绵羊)以及奶调配(conditioning)和乳酪生产方法而有很大差异。

其在新鲜乳酪中可能只有7％或甚至更低，而在传统硬质乳酪中高于30％。最近的工业乳酪包括脂质含量非常低的产品以解决对无脂肪产品的需求，或脂质水平非常高的产品(例如，在法国Bongrain制造的布尔索(Boursault)中是总重量的36％)。

在本发明的上下文中，可以任意改变LpCC中的脂肪组分，以获得无脂肪或富含脂肪的产品。LpCC中的脂肪含量(重量含量)对应于LpCC中脂质的质量除以LpCC的总质量。

在一个优选的实施方案中，LpCC中的脂肪组分为0％(重量含量)。在另一个优选的实施方案中，其小于10％(重量含量)。在另一个优选的实施方案中，其介于10％至20％之间(重量含量)。在另一个优选的实施方案中，其介于20％至30％之间(重量含量)。在另一个优选的实施方案中，其介于30％至40％之间(重量含量)。

在奶中，脂质主要包含甘油三酯，即甘油分子与三个脂肪酸通过酯化融合而产生的分子，但这种组分在乳酪加工过程中会发生很大变化，甘油三酯的水解会产生不同量的甘油单酯和甘油二酯，以及游离脂肪酸。可以进一步加工游离脂肪酸，其对最终产品的味道和气味起着非常重要的作用。

脂质可以作为从植物中提取的脂质组合物包含在内。牛奶脂肪中的主要脂肪酸为棕榈酸(31％)、油酸(24％)、肉豆蔻酸(12％)、硬脂酸(11％)、低级饱和酸(11％)、棕榈酸(4％)、亚油酸(3％)、反式不饱和酸(3％)和α-亚油酸(1％)。可以在LpCC中重现这样的组成。然而，也可以对其进行调节，例如以增加不饱和脂肪酸的比例。

乳制品富含饱和脂肪酸：在奶中，饱和棕榈酸、肉豆蔻酸和硬脂酸以及较小分子占脂肪酸的65％。使用例如来自植物的脂质组分的优点之一是可以提供更健康的脂肪来源。事实上，植物脂肪通常含有比动物脂肪更少的饱和脂肪酸和反式脂肪酸。此外，该组分可以增加已知具有健康益处的脂质，例如ω-3脂肪酸，包括例如α-亚麻酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。

在本发明的上下文中，可以使用各种来自植物的脂质来源，例如芥花(canola)或油菜籽、葵花、大豆、可可油、橄榄油、核桃油、榛子油和人造黄油。此类产品已大量商业化。然而，应该使用足够纯度的产品，以避免带有不期望的香味和/或味道。可以使用脱臭的油。脱臭为一种汽提方法，其中在低绝对压力和足够高的温度下，将从经过除气和适当处理的给水中产生的优质蒸汽注入到大豆油中，以使游离脂肪酸(FFA)和有气味的化合物蒸发并携带这些挥发物远离原料。大豆油加工的各种方法在Practical Handbook of SoybeanProcessing and Utilization(1995)(OCS Press.Elsevier Inc)中有描述。

在一个优选的实施方案中，脂质包含芥花油、菜籽油、葵花油、大豆油、可可油、橄榄油、核桃油、榛子油或人造黄油。在一个更优选的实施方案中，脂质包含芥花油、菜籽油、大豆油或可可油。

乳化剂和胶凝剂

乳化剂(emulsifier)或乳化剂(emulsifying agent)为用作乳液稳定剂的化合物或物质，其防止通常不会混合的液体分离。使用乳化剂可有所帮助，以避免在LpCC制备期间和之后形成固相和液相。非常普遍的是卵磷脂。该术语实际上是指在动物和植物中发现的两亲化合物家族，但可以很容易地找到商业大豆或葵花卵磷脂。

在一个优选的实施方案中，添加乳化剂以避免形成液相和固相。在一个更优选的实施方案中，该乳化剂为卵磷脂。可以将乳化剂在步骤b)中进行添加，或在步骤c)中添加凝乳剂之前(或同时)添加到LpCC中(然而，应该在凝乳之前将乳化剂与LpCC混合)。

可替选地或者额外地，可以使用胶凝剂，例如琼脂或瓜尔胶、阿拉伯胶、黄芪胶、黄原胶、角豆(槐豆)胶、纤维素胶、肉桂胶、田菁胶、罗望子胶、葫芦巴胶、卡拉胶。这样的水胶体增加了硬度并增强了保水性。动物源的胶凝剂(例如明胶)应从该组合物中被排除。

在本发明的上下文中，在凝乳之前或凝乳之后(与凝乳混合)添加胶凝剂是尤其有益的。这将有助于为可食用组合物提供质地。可以特别使用槐豆胶。

琼脂(添加到LpCC中的量可占LpCC的0.5％至0.8％(w/w)，或LpCC的0.5％至1％(w/w))是特别有益的。

碳水化合物

在另一个优选的实施方案中，其他配料至少包含钙、脂质和碳水化合物。乳糖是主要的奶碳水化合物。牛奶含有70mg/L的乳糖、20mg/L的半乳糖和微量的其他碳水化合物(包括各种低聚糖)。在陈化乳酪的过程中和陈化的乳酪内，碳水化合物最终完全降解或几乎完全降解。然而，在新鲜乳酪中仍然存在大量的碳水化合物，有强烈乳糖不耐症的人通常应该避开新鲜乳酪。无论如何，对于每种乳酪类型，个体反应将取决于乳糖不耐症的严重程度。

乳糖很重要，因为其是乳酪微生物群落(发酵物)的原料。但是，可以用葡萄糖或其他碳水化合物取代乳糖。碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖或果糖)源自植物，而现今大多数商业乳糖为动物源的。在本文公开的方法提供了用葡萄糖或另一种非动物源的碳水化合物替代奶中乳糖的可能性，从而允许减少动物源的成分，具有明确处理乳糖不耐症的额外优势。

在一个优选的实施方案中，在组合物中不添加乳糖。在一个更优选的实施方案中，在组合物中添加非动物源的碳水化合物。在一个甚至更优选的实施方案中，该碳水化合物为葡萄糖、蔗糖或果糖。

维生素

在一个更优选的实施方案中，其他配料至少包含钙、脂质、碳水化合物和维生素。乳制品通常富含维生素。奶是水溶性维生素B₁₂、B₂、B₈、B₅的良好来源，但对维生素B₃的需求贡献不大。奶也含有脂溶性维生素A，但不是维生素D、E和K的良好来源。然而，在通常富含脂肪的乳酪中，这种脂溶性维生素含量低的情况有所缓解。乳酪替代品在维生素方面可具有与传统乳酪相同的营养价值，甚至可以补充有更高的维生素量。然而，在需要非动物源的替代品(其可通常与纯素饮食或动物产品含量较低的饮食有关)的情况下，维生素B₁₂是要提供的最重要的添加剂，因为其通常主要由源自动物的食物引入。在一个更优选的实施方案中，组合物补充有至少一种维生素。在一个甚至更优选的实施方案中，该维生素为维生素B₁₂。

在一个更优选的实施方案中，其他配料至少包含钙、脂质、碳水化合物和维生素B₁₂。

凝乳剂

虽然可以通过添加酸或简单地通过乳酸发酵来实现奶凝结，但现今大多数乳酪是使用凝乳酶制成的，大多数时候是离子与乳酸菌结合。在由凝乳酶消解κ酪蛋白后，使得酪蛋白/磷酸钙胶束不稳定，发生凝结，从而引起凝乳的形成。因此，大多数情况下会使用凝乳酶。然而，如上所述，存在不同类型的凝乳酶。传统的凝乳酶源自小牛的胃，但已经开发出其他类型的凝乳酶，包括基于植物的凝乳酶和源自重组微生物的凝乳酶。这种非动物的凝乳酶可以来自例如Chr.Hansen Lab.(DK)，Gist Brocades/DSM.(NL)，Pfizer Inc.(USA)(参见Le fromage Gillis JC，Ayerbe A(2018)，Lavoisier编，巴黎)。

在一个更优选的实施方案中，添加非动物源的凝乳剂。在一个优选的实施方案中，所述凝乳剂不是凝乳酶，而是酸化剂。在一个优选的实施方案中，所述凝乳剂为乳酸菌或者乳酸、柠檬酸或乙酸。

发酵物

在一个更优选的实施方案中，添加发酵物。乳酸菌为乳酪发酵物的必要成分。乳酸菌有助于乳酸产生，继而改变pH，从而改变物理化学条件，与凝乳酶一起影响终产品的质地。在一个甚至更优选的实施方案中，该发酵物包含至少一种乳酸菌。在一个甚至更优选的实施方案中，乳酸菌选自乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、二乙酰乳酸链球菌(Streptococcus diacetylactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)、柠檬酸明串珠菌(Leuconostoc citrovorum)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。

乳酸菌是最早在奶和凝乳中繁殖的微生物，通过改变凝乳的组成，为下一轮的发酵铺平道路。与下一轮发酵一起，乳酸菌有助于成熟或陈化，包括非发酵剂乳酸菌(NSLAB)和其他微生物。在一个甚至更优选的实施方案中，发酵物包含至少一种NSLAB。在一个甚至更优选的实施方案中，该NSLAB选自副乳酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、乳酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus ramnosus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus bucheneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、粪肠球菌(Enterocuccus faecalis)、屎肠球菌(Enterocuccus faecium)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和拉尔芳香碳杆菌(Carbiobacterium laltaromatium)。

在一个甚至更优选的实施方案中，发酵物包含至少另一种不是乳酸菌的微生物，其可以为酵母、霉菌或非乳酸菌。在一个甚至更优选的实施方案中，发酵物包含至少另一种微生物，其为选自以下的酵母：汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、白地霉(Geotrichum candidum)、拉尔克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces larxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、链状假丝酵母(Candida catenulate)、中间假丝酵母(Candida intermediata)、德氏圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、诞沫假丝酵母(Candida zeylanoides)、米糠毕赤酵母(Pichia mebranifaciens)、鲁吉奥斯假丝酵母(Candida rugiosa)和发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)。

在一个甚至更优选的实施方案中，发酵物包含至少另一种微生物，其为选自以下的霉菌：卡门培尔青霉菌(Penicillium camemberti)、娄地青霉菌(Penicilliumroqueforti)、硫磺金孢子菌(Chrysosporum sulfureum)、家畜镰刀菌(Fusariumdomesticum)、Isomucor fuscus、铅色毛霉菌(Mucor plumbeus)、团青霉菌(Penicilliumcommune)和Sprendonema casei。

发酵物可以从许多公司商业获得，包括例如Chr.Hansen。

水(水分)

在牛奶中，水占约87.4％(重量含量)，并且在无脂肪基础上占90.8％。含水量(重量含量)为给定体积中水的质量除以总重量。在无脂肪基础上的含水量(也称为水分)为产品中存在的水的质量除以总质量减去脂肪的质量(＝水的质量/(总质量-脂肪的质量))。水分为乳酪类型的重要特征，是下文定义的乳酪类型的主要标准。

理想情况下，LpCC中的水分应尽可能低，以避免浪费，同时仍允许一些沥水。在软质乳酪或半软质乳酪以及结实乳酪或硬质乳酪(参见下文)的情况下，LpCC的含水量可以明显低于奶的含水量。

在一个优选的实施方案中，LpCC中的含水量在无脂肪基础上低于90％。在一个更优选的实施方案中，其低于80％。

当使用干燥的酪蛋白时，可以添加水和脂肪以及乳化剂以获得LpCC。作为说明，如果使用含有约23％酪蛋白、水和其他元素(例如碳水化合物)的干燥酪蛋白，则对于1g的干燥酪蛋白，可以添加1.3g水、约2g脂肪和约0.027g乳化剂。可以用任何合适的酸性剂将pH调节到约5至5.5(可以使用柠檬汁，也可以使用乳酸、柠檬酸或乙酸)。

脂肪优选为植物脂肪，例如花生油、椰子油、菜籽油、榛子油、核桃油、鳄梨油、橄榄油。优选使用中性油(即没有味道或气味的油)。特别地，可以使用脱臭的椰子油。

乳化剂选自授权用于食品用途的此类乳化剂的列项。可以列举卵磷脂(特别是大豆卵磷脂)、脂肪酸丙二醇酯(PGMS)、甘油单酯和甘油二酯。

凝乳的加工

对凝乳则可以进行进一步加工，以获得乳酪替代品。

这种对凝乳的加工包括一个或多个步骤，例如

-将凝乳切割并加热

-将凝乳沥水以去除水(这相当于在使用奶的传统乳酪加工中去除乳清)，从而使凝乳形成垫状体

-使凝乳有质地：可以将其切成段，堆起来，翻转，压制，以在需要的情况下排出更多的水、或者使得继续发酵

-将产品干燥和/或盐渍和/或盐水处理

-形成乳酪替代品的块体。

可以将替代品存储并允许其陈化，特别是让味道和质地成熟和发展(develop)。

凝乳的加工基本上类似于用于制造乳酪的凝乳的加工。

附图说明

图1：通过SDS-PAGE对提取物的可溶性部分和不溶性部分的分析，所述提取物来自表达α-S1酪蛋白(A)、α-S2酪蛋白(B)和β酪蛋白(C)的重组细胞。用实施例1中所描述的两种不同方案裂解细胞，所述细胞是用表达酪蛋白的载体(BL21-α-S1酪蛋白、BL21-α-S2酪蛋白或BL21-β酪蛋白)或空载体(BL21)转化的细胞。将裂解物离心并通过SDS-PAGE进行分析。T：整体(离心前)，S：上清液，P：团块。

图2：对经热处理提取物的可溶性部分和不溶性部分的SDS-PAGE分析，所述经热处理提取物来自表达α-S1酪蛋白(A)、α-S2酪蛋白(B)和β酪蛋白(C)的重组细胞。将用表达酪蛋白的载体(BL21-α-S1酪蛋白、BL21-α-S2酪蛋白或BL21-β酪蛋白)或空载体(BL21)转化的细胞加热10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟或120分钟(10’；20’；30’；60’；90’；120’；0’：未加热的样品；C：在室温温育120分钟的样品)。将裂解物离心并通过SDS-PAGE进行分析。T：整体(离心前)，S：上清液，P：团块。有关详细信息，参见实施例2。

图3：对在42L发酵罐中大肠杆菌中产生的β酪蛋白的SDS-PAGE分析。A.对整体提取物的分析。T：整体提取物(在Laemmli加样缓冲液中在95℃加热5’)。C：β酪蛋白Sigma(在三个不同的泳道中加样5μg、10μg和20μg的蛋白质)。有关详细信息，参见实施例3。B.对可溶性部分和不溶性部分的分析。有关详细信息，参见实施例3。

图4：对经热处理提取物的可溶性部分和不溶性部分的SDS-PAGE分析，所述经热处理提取物来自在42L生物反应器中生长的表达β酪蛋白的重组细胞。有关详细信息，参见实施例4。A：将用表达β酪蛋白的载体转化的细胞在95℃加热30分钟、60分钟、90分钟或120分钟(30'；60'；90'；120')。将裂解物离心，并通过SDS-PAGE分析可溶性部分和不溶性部分。S：上清液；P：团块。B.：将用表达β酪蛋白的载体转化的细胞在55℃加热30分钟、60分钟、90分钟或120分钟(30'；60'；90'；120')，或在95℃下加热10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟或120分钟(10；20；30'；60'；90'；120’)。将裂解物离心，并通过SDS-PAGE分析可溶性部分和不溶性部分。0'：未加热的样品；C：在室温温育120分钟的样品。

图5：通过SDS-PAGE对大肠杆菌产生的经部分纯化的β酪蛋白的监测。(A)如实施例5所述通过以下方式制备样品：将细胞回收并重新悬浮，在95℃加热90分钟，而后通过离心和过滤进行进一步加工。(B)如实施例5所述制备样品，以对加热前后的经重新悬浮的细胞团块(裂解物)进行比较。还对经过滤的样品进行了监测。W：洗涤液；C：经重新悬浮的细胞团块；H：加热后的裂解物；S：离心后的裂解物上清液；P：裂解物团块；F：经过滤的最终样品。

图6：用部分纯化的β酪蛋白制造的凝乳。将实施例5中所描述的经部分纯化的β酪蛋白制备物加热干燥，并与如实施例6所述的其他配料混合。所得混合物在加入柠檬、进行成型和温育后形成凝乳(A)。用除了酪蛋白之外的相同配料制成混合物。该对照混合物在冷却后部分固化，但如所观察到的那样形成碎屑和不良的保水性(B)。

图7：在酸性条件下通过热裂解和沉淀对β酪蛋白进行的纯化。如实施例7所述对样品进行处理和分析。A.通过SDS-PAGE对β酪蛋白的监测。在95℃热裂解两小时、分离上清液和过滤(S)后，并且在将该上清液的pH调节至pH＝4、在40℃或90℃加热20分钟并在3220g下离心20’后，监测了β酪蛋白。在该最后的离心步骤之后，分析了上清液和团块：在40℃加热后的上清液(S40)，在40℃加热后的团块(P40)，在90℃加热后的上清液(S90)，在90℃加热后的团块(P90)。B.在纯化处理的不同步骤中监测经重新悬浮的细胞团块(CP)中的重组DNA，包括：在95℃加热2小时后的上清液(泳道A)，在将该上清液的pH调节至pH4后(泳道B)，在90℃进一步加热20分钟并将沉淀的酪蛋白离心和重新悬浮后(C)，在洗涤沉淀的酪蛋白并重新悬浮后(D)，在添加Ca(OH)₂后(Ca)。对照PCR是在没有任何DNA或细胞样品的情况下(-)或在存在表达β酪蛋白的重组质粒的情况下(+)进行的。M：1kb plus NEB标记物。

图8：用酪蛋白酸钙和胶凝剂进行的凝乳。在存在或不存在胶凝剂(琼脂)的情况下接种LpCC。在实施例中描述了组成和方案。在沥水步骤结束时展示制备物。左：在没有胶凝剂的情况下的凝乳。中：在存在0.68％琼脂的情况下的凝乳。右：0.68％的琼脂，无凝乳剂。

图9：用酪蛋白酸钙进行的凝乳以及在凝乳后所添加的胶凝剂的添加。在实施例6中描述了组成和方案。在沥水步骤结束后展示制备物。左：在凝乳后添加0.53％的琼脂。右：在没有凝乳的情况下添加0.53％的琼脂。

图10：重组酪蛋白的凝固。在实施例10中描述了组成和方案。左：用β酪蛋白进行的凝乳。在存在脂质和碳水化合物但没有胶凝剂的情况下进行凝乳。在沥水步骤结束时展示制备物。右：α-S1酪蛋白和β酪蛋白在酸性pH下的凝固。酪蛋白组合物中没有添加脂质或碳水化合物。左右图片不是按比例的。

图11：用重组酪蛋白制造软质乳酪。在实施例11中描述了组成和方案。在沥水步骤结束时展示制备物。左：在存在0.68％琼脂的情况下β酪蛋白(第1批次)的凝乳。中：β酪蛋白的凝乳，0.68％的琼脂，无凝乳剂。右：在存在0.68％琼脂的情况下α-S1酪蛋白和β酪蛋白的凝乳。

图12：在β酪蛋白凝乳后胶凝剂的添加。在实施例11中描述了组成和方案。在沥水步骤结束后展示制备物。左：在凝乳后添加0.53％的琼脂。右：在没有凝乳的情况下添加0.53％的琼脂。

图13：用重组β酪蛋白制造的软质乳酪替代品。如实施例12所述制造产品。该产品在陈化7天后展示。

图14：对纯化处理的不同步骤中的α-S1酪蛋白和β酪蛋白的SDS-PAGE分析。如实施例13所述对样品进行处理和分析。A：M：分子量标记物；泳道1：裂解物；泳道2和4：澄清的裂解物；泳道3：不溶性团块；泳道4：用活性炭处理后澄清的裂解物。M：分子量标记物。凝胶左侧显示了条带大小。

图15：乳酪替代品。如实施例14所述制得乳酪替代品。图片拍摄于凝乳后6天。

具体实施方式

实施例

实施例1：监测大肠杆菌提取物的可溶性和不溶性部分中的重组酪蛋白

天然酪蛋白基因编码包含信号肽的前体蛋白。在哺乳动物中，该肽在酪蛋白加工过程中被裂解，在奶的成熟蛋白中是不存在的。对编码α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白和β酪蛋白(分别与天然基因P02662、P02663和P02666相关)的合成基因进行了修饰以去除信号肽，新合成开放阅读框的序列显示在表1的最后一栏。将它们克隆到pET25b+中，并将所得质粒转化到BL21(DE3)菌株中。分离单独的转化克隆株，并且对于每种合成基因，使用一种克隆株接种LB培养基。使用用空载体(pET25b+)转化的克隆株作为对照。

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表1：天然酪蛋白(前体)和相关重组蛋白的序列。在天然酪蛋白中，信号肽用粗体表示。

使用两种不同的方案裂解细胞，并通过SDS-PAGE分析整体提取物以及来自可溶性部分和不溶性部分的样品。使用两种不同的方案监测细胞提取物的可溶性部分和不溶性部分中的酪蛋白。使用用空载体(pET25b+)转化的细胞作为对照。

方案1：

将获自100mL培养物的细胞团块通过在裂解缓冲液(50mM Tris HCl pH 7.5，1mg/mL溶菌酶，0.03mg/mL脱氧核糖核酸酶)中重新悬浮来进行裂解。将悬浮液在冰上温育30分钟，然后超声处理10秒(10％振幅，Q Sonica XL-2000)。取整个部分的10μL，并保存用于SDS-PAGE分析。通过在3220g和4℃下离心20分钟来分离可溶性部分和不溶性部分。回收上清液，并补充10％甘油进行保存。将团块进一步重新悬浮于具有2％SDS的50mM Tris中，并补充10％甘油进行保存。取各个部分的10μL用于SDS-PAGE。

方案2：

将获自100mL培养物的细胞团块通过在具有0.4％赖氨酸酶(Millipore)的Bugbuster(Millipole)中重新悬浮来进行裂解。将混合物在室温温育5分钟，然后在3220g和4℃下离心20分钟。回收上清液，取上清液的10μL，并保存用于SDS-PAGE分析。将团块进一步重新悬浮于2％SDS中，然后取悬浮液(代表不溶性部分)的10μL，并保存用于SDS-PAGE分析。

如图1所示，α-S1酪蛋白在可溶性部分(S)和不溶性部分(P)中均存在(图1的A)，而α-S2基本上存在于不溶性部分中(图1的B)，β酪蛋白主要(方案1)或全部(方案2)存在于不溶性部分中(图1的C)，如重组蛋白在大肠杆菌中过表达时通常观察到的那样。这表明在大肠杆菌中，酪蛋白可以存在于包涵体中。不同的定量结果可能是由于β酪蛋白的溶解度或包涵体的稳定性因方案而不同。然而，使用这些方案从提取物的可溶性部分回收酪蛋白将导致大部分或全部的重组蛋白损失。

实施例2：监测通过加热所产生的大肠杆菌提取物的可溶性和不溶性部分中的重 组酪蛋白

用实施例1中所述的重组菌株测试加热裂解对酪蛋白的影响。使用用空载体(pET25b+)转化的克隆株作为对照。

将培养物离心，将细胞团块重新悬浮于1体积的无菌水中，离心并用另一体积的水洗涤，而后重新悬浮于1体积的水中。通过在95℃加热0分钟(未加热)、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟处理该细胞悬浮液的1mL样品，导致细胞裂解，而后通过离心分离可溶性部分和不溶性部分。将不溶性部分重新悬浮于1mL的缓冲液(50mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM MgCl2，2mM DTT，0.5％Triton和Sigmafast蛋白酶抑制剂(Sigma))中，通过SDS-PAGE分析可溶性部分和不溶性部分的10μL等分试样。在这样的条件下，10μL可溶性部分样品和10μL不溶性部分样品代表大约相同量的整体细胞提取物。在未加热的情况下(图2中的0')，没有发生细胞裂解，或者只发生水中残留的细胞裂解。团块基本上含有完整的细胞，包括酪蛋白，该样品实际上代表了整体细胞提取物。

出人意料地，观察到通过温度进行的裂解影响酪蛋白在可溶性部分和不溶性部分中的分布(图2)。

在95℃加热10分钟时(或之前)，α-S1酪蛋白几乎完全存在于可溶性部分中(图2的A)，而在实施例1中，其以相似的量在可溶性部分和不溶性部分中均存在。

酪蛋白β逐渐转移至可溶性部分，所述可溶性部分在加热10分钟时(或之前)含有大量的这种重组蛋白，并且在加热30分钟时含有大部分(图2的C)。在实施例1中，β酪蛋白大部分或完全存在于不溶性部分中。

酪蛋白α-S2的分布(在实施例1中完全在不溶性部分中)似乎对热不太敏感，并且在加热120分钟时仍在很大程度上存在于不溶性部分中(图2的B)。然而，它在95℃加热20分钟时出现于可溶性部分中，并且随着时间的推移在不溶性部分中略有减少。

来自不溶性部分的许多其他蛋白带也随着时间的推移而减少(图2的A、图2的B和图2的C)，但没有转移到可溶性部分中。在经加热样品的可溶性部分中，除了酪蛋白带外，只能看到一些模糊的蛋白带。

这些结果表明，加热裂解是快速纯化酪蛋白(尤其是α-S1酪蛋白和β酪蛋白)的好方法。

实施例3：在42L发酵罐中生产重组β酪蛋白

使用实施例1中所述的重组菌株的培养物接种42L发酵罐(Biostat CPlus，Sartorius)。

将补充有30g/L酵母提取物(NuCel 751Mg)和0.1mg/L氨苄青霉素的30升LB培养基倒入42L发酵罐中。用重组克隆株的预培养物接种发酵罐，以达到0.06的初始OD₆₀₀。发酵以分批进料模式进行，其中pH＝7；T＝37℃；pO₂＝10％，向培养物供给含有143g/L的D-葡萄糖和214g/L的酵母提取物的溶液。在24小时后添加氨苄青霉素(0.1mg/L培养物)。17小时后，培养物达到约10的OD，并通过添加IPTG(最终1mM)而开始生产。在T＝41.3时停止培养，其中OD₆₀₀＝44。在10℃通过离心收获细胞。

为了分析，将细胞等分试样离心并重新悬浮于1体积的裂解缓冲液(50mM TrisHCl pH 7.5，300mM NaCl，10mM MgCl2，2mM DTT，0.5％Triton和Sigmafast蛋白酶抑制剂(Sigma))中。将悬浮液在冰上温育30分钟，然后超声处理1分钟(15％振幅，Q Sonica XL-2000)，并对整个部分的10μL通过SDS-PAGE进行分析(图3的A)。

使用来自奶的经纯化的β酪蛋白(Sigma)作为对照，但其如先前其他人所观察到的，显示出更高的表观分子量(Simons等人Overproduction of bovine beta-casein inEscherichia coli and engineering of its main chymosin cleavage site(1993)Protein Engineering 7:763-770)。重组酪蛋白的产量估算为在细菌培养物的3g/L范围内。

还使用与实施例1相同的两种方案，分析了样品在可溶性部分和不溶性部分中的重组β酪蛋白的存在情况，结果与实施例1中所观察到的结果相似，大部分(方案1)或全部(方案2)酪蛋白β存在于不溶性部分中(图3的B)。

实施例4：监测通过在不同温度加热所产生的大肠杆菌提取物的可溶性和不溶性 部分中的重组β酪蛋白

在实施例3中所述的菌株培养物上测试了加热裂解对重组β酪蛋白的影响。

将1L细胞(约15g的干细胞重量)离心，将细胞重新悬浮于1L无菌水中，离心并用另一升水洗涤，而后重新悬浮于1L水中。通过在95℃加热30分钟、60分钟、90分钟和120分钟处理该细胞悬浮液的70mL样品，导致细胞裂解，而后通过离心分离可溶性部分和不溶性部分。将不溶性部分重新悬浮于1体积的裂解缓冲液(50mM Tris HCl pH 7.5，300mM NaCl，10mMMgCl2，2mM DTT，0.5％Triton和Sigmafast蛋白酶抑制剂(Sigma))中，通过SDS-PAGE分析10μL等分试样。

如图4的A所示，根据在进行热裂解的实施例2中所观察到的结果，并且与在进行其他裂解方案的实施例1中所观察到的结果相比，过表达的蛋白质在加热30分钟时(或之前)主要存在于可溶性部分中。

来自不溶性部分的许多其他蛋白带也随着时间的推移而减少，但没有转移到可溶性部分中。在经加热样品的可溶性部分中，除了β酪蛋白带外还能看到一些模糊的蛋白带，但这些模糊的蛋白带也随着时间的推移而减少，这一结果在实施例2中几乎观察不到，可能是由于样品浓度较低。

这些结果与在专门用于生产和纯化嗜热或耐热蛋白的研究中所观察到的裂解物蛋白质的渐进式热降解一致(Takesawa等人(1990)Heat-induced precipitation of cellhomogenates:an investigation of the recovery of thermostable proteins.EnzymeMicrob.Technol.12，184-189；Kirk和Cowan 1995Optimising the recovery ofrecombinant thermostable proteins expressed in mesophilic hosts.J.ofBiotechnology 42:177-184；Sundarrajan等人(2018)Novel properties of recombinantSso7d-Taq DNA polymerase purified using aqueous two-phase extraction:Utilities of the enzyme in viral diagnosis.Biotechnol Rep(Amst)19:e0270；US8603782；WO2011119703)。

按照相同的方案，还测试了不同温度(即55℃、75℃和95℃)对可溶性部分和不溶性部分的影响。如图4的B所示，在55℃，120分钟时可观察到可溶性部分中β酪蛋白的量略有增加。在75℃，1小时时观察到可溶性部分(和不溶性部分)中其他可溶性蛋白减少，可溶性部分中β酪蛋白的回收更为明显。在95℃，加热10分钟时在可溶性部分中清楚地观察到β酪蛋白，而在不溶性部分和可溶性部分中其他条带随着时间的推移均减少，该最后的观察结果在加热30分钟时在两个部分中均很清楚。

这些结果表明，通过溶解细胞内酪蛋白和去除非酪蛋白，加热裂解对于快速纯化β酪蛋白是有益的。

它还表明，独立于裂解，可以使用加热将酪蛋白与其他非耐热性蛋白分离。

实施例5：粗纯化重组β酪蛋白

制定了从细胞中粗纯化酪蛋白β的方案。

将相当于15g干细胞重量的细胞样品重新悬浮在1L的无菌水中。通过在95℃加热90分钟来处理细胞。将裂解物在3220g和4℃下离心20分钟，并使用真空驱动过滤系统(Stericup Quick Release，Millipore)将上清液用0.2μm膜过滤。

通过SDS-PAGE分析来自不同步骤的样品的等分试样。如图5所示，最终过滤的蛋白部分(泳道F)显著富集重组蛋白，所述重组蛋白最终占制备物中蛋白质的大部分。

此外，包括热裂解的方案可以具有非常好的产率。在另一个实验中，将相当于7.5g干细胞重量的细胞样品洗涤并重新悬浮于无菌水中，并在95℃加热90分钟前后通过SDS-PAGE监测β酪蛋白。发现在这两种条件下，以及在经加热提取物的过滤样品中，β酪蛋白的量非常相似(图第5的B)。通过与标准蛋白制备物的视觉比较来估算β酪蛋白的量，显示了在所有三种样品中均可以观察到每升培养物中约3g重组蛋白。当将来自相同培养物的样品在100℃和2巴压力下加热30分钟而不是在95℃加热90分钟时，观察到类似的定量结果。

实施例6：用部分纯化的β酪蛋白制造凝乳

将实施例5中所述的酪蛋白溶液(第1批次)加热干燥。使用SDS-PAGE分析将该提取物中的酪蛋白定量，估算为干燥产品的23％对应于β酪蛋白。

将1.8g的干燥酪蛋白制备物(0.41g的酪蛋白)与2.4g的水混合，并在室温温育3.5小时以充分复水。添加3.5g脱臭的椰子油(BioPlanète，法国)和0.05g卵磷脂，并用0.1g柠檬汁将pH调节至5。将混合物在4℃温育30分钟以进行成型，然后在室温从模具中取出。

该产品的最终组成(Chives奶酪除外)汇总在表2中(组成1)，其特征如图6的A所示，脱模后在室温显示出结实的稳定质地，具有完好的保水性。酪蛋白含量估算为5.3％。

当不添加1.8g的干燥酪蛋白制备物时，无法实现这种质地和保水性(表2中的组成2，图6的B)。相反，由于椰子油，观察到了固相，但在脱模后形成碎屑，并且观察到显著的水分损失。

表2.不同的组成

实施例7：通过加热和酸沉淀将重组β酪蛋白纯化以及对重组DNA进行监测

如实施例5中所述的那样处理实施例3中所述培养物的样品：将细胞重新悬浮于无菌水中，离心，重新悬浮于水中，将悬浮液在95℃加热2小时，而后分离裂解物上清液并用0.2μm膜过滤。然后，在酸性条件下加热上清液以沉淀酪蛋白：用0.1M的HCl溶液将上清液的pH降至pH 4，然后在40℃或90℃加热20分钟。然后将悬浮液在3220g下离心20分钟，并通过SDS-PAGE分析上清液和团块。如图7的A所示，在这样的酸性条件下的加热导致酪蛋白β在40℃部分地沉淀，并且在90℃完全沉淀。

为了获得pH中性的溶液，在该方案中添加了额外的步骤：用pH 4的H₂SO₄溶液将含有沉淀的酪蛋白的团块洗涤一次，用无菌水洗涤一次，并重新悬浮于无菌H₂O中，用1M Ca(OH)₂将pH调节至7，得到酪蛋白酸钙悬浮液(未示出)。

已知在酸性条件下的加热会促进DNA降解。为了评估酪蛋白制备物中微生物生产菌株的DNA的存在，将相同的方案应用于另一个样品(但跳过了过滤步骤)，并使用PCR扩增监测DNA。使用两种引物进行反应，所述两种引物被设计用于扩增含有β酪蛋白编码序列的929bp区域。引物1：ATACATATGCGCGAGTTAGAAGAG(SEQ ID NO:10)

引物2：CTTAATGCGCCGCTACAG(SEQ ID NO:11)

在使用DreamTaq Green PCR Master Mix(2X)(ThermoScientific)的20μL中用1μL样品进行PCR反应。使用SimpliAmp thermal Cycler(Applied Biosystems)进行PCR，循环条件如下：95℃持续5分钟，主反应30个循环(95℃持续30秒，61.4℃持续30秒钟，72℃持续1分钟)，72℃持续5分钟。将扩增的产物加样到1％琼脂糖凝胶上，并使用GeneFlash(Syngene)UV透照器进行可视化。如图7的B所示，在热解(泳道A)以及将上清液的pH调节至pH 4(泳道B)后，在这些条件下仍然能检测到重组DNA，但在这样的酸性条件下90℃加热后(泳道C)以及在随后的步骤(泳道D和Ca)中无法检测到。

实施例8：测试胶凝剂对新鲜乳酪替代品制备的影响

将酪蛋白酸钙、琼脂、水、脱臭的椰子油和葡萄糖混合：

将18g酪蛋白酸钙酪蛋白(Armor Protéines，含有92％的酪蛋白酸盐形式的酪蛋白、1％的脂质和1％的钙)重新悬浮于195g水中，得到7.8％(w/w)酪蛋白的水悬浮液。将十五克这种酪蛋白组合物与2g脱臭的椰子油(BioPlanète，法国)和2.5g的25％(w/w)葡萄糖水溶液混合。将新组合物在45℃加热，添加4ml经加热的0％、2％、3％或4％琼脂制备物(在水中融化的琼脂)并同时轻轻混合。样品1至4以一式两份进行，样品5至8也一样(样品1、4和8在第二个独立实验中以一式两份进行)。所得组成(LpCC)描述在表4中。pH为约7.0。

表4.LpCC的组成

凝乳

将0.2g乳酸发酵物(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、Alsa)添加到样品1至4(初始温度为25℃)中，但不添加到样品5至8中(参见表5)，将组合物在40℃温育10小时。在样品1至4中，pH值降至约4.5，表明乳酸发酵活跃。在样品5至8中，pH稳定地保持在7.0左右。

沥水

将整个组合物轻轻搅拌以破坏在最高琼脂浓度下获得的光滑结构，将其置于乳酪包布上以在4℃沥水16小时。如表5中所描述，凝乳重量的范围为约7g至约15g。基于酪蛋白、脂质和琼脂完全保留在凝乳中的假设，对组成进行了估算(表5)。事实上，在样品1至4的沥出液体中几乎没有观察到着色，并且在4℃沥出的液体中没有观察到椰子油或琼脂凝结物。相反，钙和葡萄糖估算值是最大化的估算值，因为这些化合物的一部分可能存在于沥出的液体中。出于同样的原因，含水量估算值(在整体基础上和在无脂肪基础上)是最小化的估算值。

表5.凝乳的组成

^*两次实验的平均

结果表明胶凝剂可用于调节水分，从而调节整体的组成。使用0.68％的琼脂，保留了超过60％的LpCC(相比与没有胶凝剂时的30％)，该产品具有新鲜乳酪的酪蛋白含量和水分，以及如预期的可塑(plastic)质地和外观(图8)。

在没有乳酸发酵的情况下，样品5至8产生各种尺寸的固相，这取决于琼脂浓度。沥出液体的颜色表明部分酪蛋白从固相中丢失，因此在表4中未显示估算值。相较于其发酵的凝乳对应物(表4)，未经发酵获得的固相较小，而且还保持松散的结构(图8)。

在凝乳后添加胶凝剂的情况

通过凝乳后添加胶凝剂也可以实现同样的效果：样品：具有相似组成的LpCC与乳酸菌在40℃温育10小时。pH从约7.0下降至约4.5。凝乳后，如上所述，添加3ml在水中的琼脂4％，将包含凝乳和液相在内的整体混合物轻轻搅拌，并置于乳酪包布上沥水。

在凝乳前(LpCC)的组成、在凝乳并添加琼脂之后的组成以及在沥水后的估算值显示在表6中，关于在凝乳和沥水后的组成与上述规定相同。在4℃沥水16小时后，在两个独立的样品中获得了约12g的凝乳，显示出保水性(总量的53％)高于在没有胶凝剂的情况下所观察到的保水性(参见上文)。

该产品具有新鲜乳酪的酪蛋白含量和水分(表6)，以及如预期的可塑质地和外观(图9)。因此，对于保持半固体形式的某些类型的乳酪，可以在凝乳之前或之后添加胶凝剂。

在没有发酵物的情况下重复该程序。获得较低重量的固相(约6g，总量的27％)。然而，质地非常松散，如图9所示。

表6.在用于新鲜乳酪替代品生产的方法中的组成

实施例9：重组α和β酪蛋白批次的生产

天然酪蛋白基因编码包含信号肽的前体蛋白。在哺乳动物中，该肽在酪蛋白加工过程中被裂解，在奶的成熟蛋白中是不存在的。如实施例1所示，对编码α-S1酪蛋白和β酪蛋白(分别与天然基因P02662和P02666相关)的合成基因进行了修饰以去除信号肽，新合成开放阅读框的序列显示在表7的最后一栏。

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表7.天然酪蛋白(前体)和相关重组蛋白的序列。在天然酪蛋白中，信号肽用粗体表示。

将得到的ORF在细菌中过表达，并根据在先前的实施例中所述的方法纯化酪蛋白。最终，获得了三批酪蛋白酸钙形式的不含动物的重组酪蛋白：为了获得浓缩的酪蛋白酸钙，将在pH＝4.6用H₂SO₄沉淀的酪蛋白提取物重新悬浮在水中，用Ca(OH)₂将pH缓慢调节至7，而后使用Rotavapor R-300(Buchi)设备通过蒸发将制备物浓缩。

第1批次：β酪蛋白(酪蛋白酸钙)，150mg/g组合物，pH7。

第2批次：α-S1酪蛋白和β酪蛋白(酪蛋白酸钙)，分别约为50mg/g和25mg/g，pH＝7

第3批次：α-S1酪蛋白和β酪蛋白(酪蛋白酸钙)，分别约为6mg/g和3mg/g，pH＝7

在这些批次中，可能存在其他蛋白质和其他有机分子，但酪蛋白占全部蛋白质的90％以上，估算为占干重的2/3以上。

实施例10：测试经部分纯化的重组β酪蛋白进行的凝乳

使用来自实施例9的第1批次，在不存在任何质地剂的情况下，使用含有重组β酪蛋白的酪蛋白组合物来测试重组β酪蛋白的凝乳能力。为此，制备了具有与实施例8的样品1大致相同的酪蛋白、脂质和含水量的制备物，但用重组β酪蛋白代替商业酪蛋白酸盐。

将第1批次的制备物用水稀释，以获得浓度为58.7mg/g的重组β酪蛋白组合物。将二十克的该酪蛋白组合物与溶解在水中的椰子油、葡萄糖和琼脂混合，从而得到23.5g组合物，其含有在水中的5％酪蛋白、8.5％脂质、2.7％葡萄糖和0.68％琼脂。额外的碳水化合物和蛋白质可以来自酪蛋白组合物以及盐，而未在该表中说明。因此，含水量也只是估算值，但考虑到在初始的酪蛋白组合物中酪蛋白占干重的至少2/3，因此含水量的误差不应超过3％。

将组合物用0.3g乳酸发酵物接种，在40℃温育10小时。pH从约7.0下降至约4.5。然后将整个组合物置于乳酪包布上以在4℃沥水16小时。沥水后可获得7g的凝乳(图10)，尽管不如在类似条件下使用商业酪蛋白酸盐所获得的凝乳结实。

简单地通过以下方式测试了来自实施例7的α-S1酪蛋白和β酪蛋白在低pH下有效凝固的能力：将乳酸添加到90ml的低浓度第3批次组合物中，以将pH调节至约4.5。通过在乳酪包布上过滤分离后获得了约0.7g材料(图6)。相反，当没有向相同体积的组合物中添加乳酸时，整个组合物流过乳酪包布。

实施例11：用部分纯化的重组酪蛋白制造新鲜乳酪替代品

将第1批次的制备物用水稀释，以获得浓度为78.2mg/g的重组β酪蛋白组合物。如实施例8所述，将十五克的该酪蛋白组合物与椰子油、葡萄糖和琼脂混合，以获得表5中所述的组成。额外的碳水化合物和蛋白质可以来自酪蛋白组合物以及盐，而未在该表中说明。因此，含水量也只是估算值，但考虑到在初始的酪蛋白组合物中酪蛋白占干重的至少2/3，因此含水量的误差不应超过3％。

将组合物用0.3g乳酸发酵物接种，在40℃温育10小时。pH从约7.0下降至约4.5。将整个组合物轻轻搅拌并置于乳酪包布上以在4℃沥水16小时。

凝乳重量为约14g。估算了其组成(表8)，其中规定与上文和实施例9相同。保留了约60％的LpCC。得到的产品具有针对新鲜乳酪所期望的酪蛋白含量和水分。质地不像实施例8中使用商业酪蛋白酸钙的情况那样坚硬，但尽管如此，仍然适合用于新鲜乳酪，显示出成形为稳定形式的可塑性和结实度(图11)。为了进行比较，按照相同的程序但无乳酸菌地制备样品。在没有凝乳剂的情况下，可以获得约13g的固相，但结构松散，不能稳定地保持形状(图11)。

按照相同的程序，使用第2批次酪蛋白，其含有α-S1酪蛋白和β酪蛋白。仅保留了38％的LpCC，这可能是由于蛋白质含量低(2.5％的LpCC)，但得到的产品具有针对新鲜乳酪所期望的酪蛋白含量和水分。质地不像实施例8中使用商业酪蛋白酸钙的情况那样坚硬，但尽管如此，仍然适合用于新鲜乳酪，显示出成形为稳定形式的可塑性和结实度(图11)。

表8.在制造可食用组合物的过程中的组成

在凝乳后添加胶凝剂的情况

还按照与实施例8相同的程序测试了在凝乳后的胶凝剂的添加。在凝乳前(LpCC)的组成、在凝乳并添加琼脂之后的组成以及在沥水后的估算值显示在表9中，关于在凝乳和沥水后的组成与上述规定相同。在乳酸发酵、添加琼脂(0.53％)以及在乳酪包布中在4℃沥水16小时后，获得了约10g(总量的44％)的凝乳。在没有发酵物的情况下，获得了较低重量的固相(约6g，总量的27％)。然而，质地非常松散，如图12所示。

表9.在制造可食用组合物的过程中的组成

实施例12：用部分纯化的重组酪蛋白制造软质乳酪替代品

将第1批次制备物进一步浓缩，以达到250mg/g组合物的浓度。

将十五克葵花油、34g水合腰果(水合腰果的组成参见上述实施例5)、70g水和1.5g琼脂混合。将混合物煮沸，煮沸10至20秒。将一百克的含有25g重组β酪蛋白的浓缩酪蛋白组合物添加到该混合物中，轻轻混合。LpCC的组成详见表10。

凝乳、沥水、盐渍和陈化

在低于35℃的温度，将200g的这种LpCC(总量220.5g)接种发酵物，所述发酵物包含乳酸菌(MBT，SOGEBUL，Dole，法国)、酵母(DH2d SOGEBUL，Dole，法国)和额外的熟化发酵物(PC12H，SOGEBUL，Dole，法国)。在模具中，将组合物在20℃温育24小时。

将产品从模具中取出，放置在格状件上以进行沥水。将产品和格状件置于盒中以控制湿度。根据期望的味道，可以将约1/4到1/2茶匙的食盐(La Baleine，法国)涂布在上表面，并且在14℃温育产品。在二十四小时后，将产品翻转，将相同的盐组合物涂布在另一面上。将格状件上的产品在14℃并在精制箱中温育以控制湿度，每隔一天翻转一次，持续数周。在此期间，规律地从精制箱中去除水。第7天的产品的特征如图13所示。

重量减轻基本上在于水。由于初始组成是已知的(干腰果的组成为约22％的碳水化合物、20％的蛋白和53％的脂质，以及百分之几的水)，评价失水量可以用于计算产品组成，以及获得预期的组成或软质乳酪，尤其是在水分方面(在无脂肪基础上，水分在62％至80％之间)。在第7天，产品估算为150g，蛋白质和脂质含量分别为17.4％(包含15.1％酪蛋白和衍生的肽)和16.6％，在无脂肪基础上的水分为76％。

表10.LpCC的组成

重量(g)	220.5g
		蛋白质(w/w)	13.1％
所包含的酪蛋白	11.3％
		脂质(w/w)	12.5％
葡萄糖(w/w)	1.2％
		琼脂(w/w)	0.68％
水(w/w)	72.5％
		总计(w/w)	100％
水(无脂肪基础上)	82.9％

实施例13：纯化重组α-S1酪蛋白和β酪蛋白

构建载体以共表达重组α-S1酪蛋白和β酪蛋白。大体而言，将表1中编码α-S1酪蛋白和β酪蛋白的ORF(P02662和P02666)均插入到pET25+中，其中β酪蛋白靠近启动子，T7核糖体结合位点插入在两个ORF中的每一个之前。将得到的质粒转化到BL21(DE3)菌株中。分离单独的转化克隆株，并且使用一克隆株接种LB培养基。然后如实施例3所示，在42L发酵罐(Biostat CPlus，Sartorius)中进行细菌生长和酪蛋白表达。

在发酵结束时，最终OD为约70。通过离心(2000g，30分钟，+4℃)收获细胞，并在-80℃存储。获得了一种透明的黄色上清液，其OD在0至1之间。在解冻后，将细胞重新悬浮于15L的反渗透无菌水中，直到得到均匀的悬浮液，然后在95℃加热120分钟。通过离心(2000g，40分钟，+4℃)去除细胞碎片和大肠杆菌沉淀的蛋白质。将OD在0至1之间的透明浅黄色上清液在-20℃进行存储。在解冻后，在以下条件下进行额外的高速离心以去除悬浮液中残留的细胞碎片和沉淀的蛋白质：13000g，+4℃，20分钟。

将澄清的浅黄色上清液与浓度为10g.L^-1的商业活性炭(Sigma-Aldrich，参考号161551)在200rpm和+22℃下搅拌30分钟。然后通过高速离心(13000g，20分钟，+4℃)去除活性炭，并使用真空驱动过滤系统(Stericup Quick Release，Millipore)在0.2μm过滤器上过滤上清液。出于实际原因，将澄清的米色上清液在+4℃存储一晚。然后用商业乳酸溶液(Sigma-Aldrich，参考号27714)将溶液的pH降低至pH 4.6。逐渐出现白色沉淀物。将所得的悬浮液离心(2000g，20分钟，RT)，并去除无色的浑浊上层液。然后将酸性沉淀的酪蛋白重新悬浮于7.5L的反渗透无菌水中，并将所得的均匀悬浮液离心(2000g，20分钟，RT)；去除洗涤水。在相同的实验条件下进行另外的洗涤步骤。

将酸性沉淀的酪蛋白重新悬浮于750mL的反渗透无菌水中。将得到的均匀悬浮液在+30℃以600rpm搅拌，并通过添加浓度为0.2M的均匀氢氧化钙悬浮液将pH逐渐升高至pH＝7.0。然后将得到的悬浮液在-80℃冷冻3小时，接下来冻干(0.002毫巴，+4℃，60小时)。在-20℃存储冻干的酪蛋白酸钙，以供进一步使用或分析。

如图14所示，在该方法的不同步骤中通过SDS PAGE对样品进行分析。

实施例14：用重组酪蛋白α-S1和β制造软质乳酪替代品

通过在相同细菌中共表达酪蛋白α-S1和酪蛋白β来制备酪蛋白组合物。为此，将表1中的开放阅读框P02662和P02666克隆在相同的表达载体中并转化到大肠杆菌中，采用实施例13中所描述的方案(使用0.45mm过滤，而不是0.2mm)在发酵罐中进行生产。通过SDS-PAGE估算了酪蛋白浓度。该制备物被估算为具有至少95％的纯度，并且含有约一半的α-S1酪蛋白和一半的β酪蛋白。在以下所有估算中，该组合物将被视为纯的(因此酪蛋白含量应精确到95％)。

将13克的这种干酪蛋白组合物与39g的水混合，并在14℃温育3小时。将水(15g)、腰果(20g)、葵花油(30g)、碳酸钙(1g)和葡萄糖(10g)的混合物混合，将22g的该混合物与16g的水一起添加到45g的上述水合酪蛋白组合物中，得到表11中所述的LpCC。

表1.LpCC的组成

重量(g)	83g
		蛋白质(w/w)	14.3％
所包含的酪蛋白	13.5％
		脂质(w/w)	12.8％
糖(w/w)	4.0％
		盐(w/w)	0.5％
水(w/w)	68.5％
		总计(w/w)	100％
水(无脂肪基础)	78.5％

将80g的该组合物放入接种有发酵物的模具中，并在50℃的温度温育16小时，所述发酵物包含乳酸菌(MBT，SOGEBUL，Dole，法国)、酵母(DH2d SOGEBUL，Dole，法国)和额外的熟化发酵物(PC12H，SOGEBUL，Dole，法国)。

然后将产品从模具中取出，放置在格状件上以进行沥水。将产品和格状件置于盒中以控制湿度。将食盐(La Baline.法国)涂布在上表面，并且在14℃温育产品。在二十四小时后，将产品翻转，将相同的盐组合物涂布在另一面上。将格状件上的产品在14℃并在精制箱中温育以控制湿度，每隔一天翻转一次，持续6天，然后保持在4℃。产品重量估算为60g，其组成如表12所述。该组成还考虑了各类别的降解产物(其是因发酵剂细菌和熟化发酵物的活性引起的脂解、蛋白水解和糖代谢而产生的)。在无脂肪基础上，水分估算为68.5％。第6天的产品的特征如图15所示。

表2.软质乳酪的最终组成(盐不包含所添加的食盐)

重量(g)	60g
		蛋白质(w/w)	19.7％
所包含的酪蛋白	18.8％
		脂质(w/w)	17.7％
糖(w/w)	5.5％
		盐(w/w)	0.7％
水(w/w)	56.3％
		总计(w/w)	100％
水(无脂肪基础)	68.5％

序列表

<110> 立颂公司

<120> 用于生产酪蛋白的方法及其用途

<130> BRV 197 - WO

<150> EP21305736.7

<151> 2021-06-01

<150> EP21306294.6

<151> 2021-09-18

<150> EP22305313.3

<151> 2022-03-16

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 牛

<400> 1

Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg

1 5 10 15

Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn

20 25 30

Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly

35 40 45

Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr

50 55 60

Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile

65 70 75 80

Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile

85 90 95

Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln

100 105 110

Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro

115 120 125

Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His Ala

130 135 140

Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro Ser

165 170 175

Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala Pro

180 185 190

Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys

195 200 205

Thr Thr Met Pro Leu Trp

210

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重组α-S1酪蛋白

<400> 2

Met Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val

1 5 10 15

Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val

20 25 30

Phe Gly Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu

35 40 45

Ser Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu

50 55 60

Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys

65 70 75 80

His Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu

85 90 95

Glu Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile

100 105 110

Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile

115 120 125

His Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala

130 135 140

Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp

165 170 175

Ala Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser

180 185 190

Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp

195 200

<210> 3

<211> 200

<212> PRT

<213> 牛

<400> 3

Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg

1 5 10 15

Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn

20 25 30

Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly

35 40 45

Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr

50 55 60

Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile

65 70 75 80

Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile

85 90 95

Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Ile

100 105 110

Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile

115 120 125

His Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala

130 135 140

Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp

165 170 175

Ala Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser

180 185 190

Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp

195 200

<210> 4

<211> 206

<212> PRT

<213> 牛

<400> 4

Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg

1 5 10 15

Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn

20 25 30

Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Glu Val Phe Gly

35 40 45

Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr

50 55 60

Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser Ile

65 70 75 80

Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Glu Gln Lys His Ile

85 90 95

Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln

100 105 110

Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Arg Leu His

115 120 125

Ser Met Lys Glu Gly Ile His Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly

130 135 140

Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe

145 150 155 160

Tyr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu

165 170 175

Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro

180 185 190

Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp

195 200 205

<210> 5

<211> 222

<212> PRT

<213> 牛

<400> 5

Met Lys Phe Phe Ile Phe Thr Cys Leu Leu Ala Val Ala Leu Ala Lys

1 5 10 15

Asn Thr Met Glu His Val Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Ile Ser Gln

20 25 30

Glu Thr Tyr Lys Gln Glu Lys Asn Met Ala Ile Asn Pro Ser Lys Glu

35 40 45

Asn Leu Cys Ser Thr Phe Cys Lys Glu Val Val Arg Asn Ala Asn Glu

50 55 60

Glu Glu Tyr Ser Ile Gly Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ala Glu Val Ala

65 70 75 80

Thr Glu Glu Val Lys Ile Thr Val Asp Asp Lys His Tyr Gln Lys Ala

85 90 95

Leu Asn Glu Ile Asn Gln Phe Tyr Gln Lys Phe Pro Gln Tyr Leu Gln

100 105 110

Tyr Leu Tyr Gln Gly Pro Ile Val Leu Asn Pro Trp Asp Gln Val Lys

115 120 125

Arg Asn Ala Val Pro Ile Thr Pro Thr Leu Asn Arg Glu Gln Leu Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Glu Asn Ser Lys Lys Thr Val Asp Met Glu Ser Thr Glu

145 150 155 160

Val Phe Thr Lys Lys Thr Lys Leu Thr Glu Glu Glu Lys Asn Arg Leu

165 170 175

Asn Phe Leu Lys Lys Ile Ser Gln Arg Tyr Gln Lys Phe Ala Leu Pro

180 185 190

Gln Tyr Leu Lys Thr Val Tyr Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp

195 200 205

Ile Gln Pro Lys Thr Lys Val Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu

210 215 220

<210> 6

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重组α-S2酪蛋白

<400> 6

Met Lys Asn Thr Met Glu His Val Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Ile

1 5 10 15

Ser Gln Glu Thr Tyr Lys Gln Glu Lys Asn Met Ala Ile Asn Pro Ser

20 25 30

Lys Glu Asn Leu Cys Ser Thr Phe Cys Lys Glu Val Val Arg Asn Ala

35 40 45

Asn Glu Glu Glu Tyr Ser Ile Gly Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ala Glu

50 55 60

Val Ala Thr Glu Glu Val Lys Ile Thr Val Asp Asp Lys His Tyr Gln

65 70 75 80

Lys Ala Leu Asn Glu Ile Asn Gln Phe Tyr Gln Lys Phe Pro Gln Tyr

85 90 95

Leu Gln Tyr Leu Tyr Gln Gly Pro Ile Val Leu Asn Pro Trp Asp Gln

100 105 110

Val Lys Arg Asn Ala Val Pro Ile Thr Pro Thr Leu Asn Arg Glu Gln

115 120 125

Leu Ser Thr Ser Glu Glu Asn Ser Lys Lys Thr Val Asp Met Glu Ser

130 135 140

Thr Glu Val Phe Thr Lys Lys Thr Lys Leu Thr Glu Glu Glu Lys Asn

145 150 155 160

Arg Leu Asn Phe Leu Lys Lys Ile Ser Gln Arg Tyr Gln Lys Phe Ala

165 170 175

Leu Pro Gln Tyr Leu Lys Thr Val Tyr Gln His Gln Lys Ala Met Lys

180 185 190

Pro Trp Ile Gln Pro Lys Thr Lys Val Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu

195 200 205

<210> 7

<211> 224

<212> PRT

<213> 牛

<400> 7

Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg

1 5 10 15

Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu Ser Leu Ser

20 25 30

Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Arg Ile Asn Lys Lys Ile Glu Lys Phe

35 40 45

Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys Ile

50 55 60

His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro

65 70 75 80

Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro

85 90 95

Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys

100 105 110

Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys

115 120 125

Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr Asp

130 135 140

Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met His

145 150 155 160

Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln Ser

165 170 175

Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala

180 185 190

Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu Tyr

195 200 205

Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val

210 215 220

<210> 8

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重组β酪蛋白

<400> 8

Met Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Arg Ile Asn Lys Lys Ile Glu

20 25 30

Lys Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp

35 40 45

Lys Ile His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro

50 55 60

Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln

65 70 75 80

Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val

85 90 95

Ser Lys Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe

100 105 110

Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu

115 120 125

Thr Asp Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ser Trp

130 135 140

Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro

145 150 155 160

Gln Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln

165 170 175

Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu

180 185 190

Leu Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile

195 200 205

Ile Val

210

<210> 9

<211> 190

<212> PRT

<213> 牛

<400> 9

Met Met Lys Ser Phe Phe Leu Val Val Thr Ile Leu Ala Leu Thr Leu

1 5 10 15

Pro Phe Leu Gly Ala Gln Glu Gln Asn Gln Glu Gln Pro Ile Arg Cys

20 25 30

Glu Lys Asp Glu Arg Phe Phe Ser Asp Lys Ile Ala Lys Tyr Ile Pro

35 40 45

Ile Gln Tyr Val Leu Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr

50 55 60

Gln Gln Lys Pro Val Ala Leu Ile Asn Asn Gln Phe Leu Pro Tyr Pro

65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Gln

85 90 95

Trp Gln Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala Lys Ser Cys Gln Ala Gln

100 105 110

Pro Thr Thr Met Ala Arg His Pro His Pro His Leu Ser Phe Met Ala

115 120 125

Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn

130 135 140

Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu Ala Val

145 150 155 160

Glu Ser Thr Val Ala Thr Leu Glu Asp Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser

165 170 175

Pro Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala Val

180 185 190

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增含有β酪蛋白编码序列的区域的引物

<400> 10

atacatatgc gcgagttaga agag 24

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增含有β酪蛋白编码序列的区域的引物

<400> 11

cttaatgcgc cgctacag 18

Claims (18)

1.一种用于在组合物中富集酪蛋白的方法，所述组合物含有酪蛋白和其他蛋白质，所述方法包括：

i)提供含有酪蛋白和其他蛋白质的组合物，其中所述组合物的pH等于或高于6.5并且优选低于9

ii)加热所述组合物以使组合物的可溶性部分中其他蛋白质的量减少，其中在介于75℃至105℃之间的温度进行加热

iii)回收可溶性部分，

从而在组合物中富集酪蛋白。

2.一种用于生产酪蛋白组合物的方法，其包括：

i)提供微生物组合物，其中，所述微生物组合物包含已用至少一种编码酪蛋白的核酸转化的微生物，所述微生物已经过培养从而表达和产生了酪蛋白，其中组合物的pH等于或高于6.5并且优选低于9

ii)加热所述微生物组合物以使组合物的可溶性部分中其他蛋白质的量减少，其中在介于75℃至105℃之间的温度进行加热

iii)从裂解的细胞组合物中分离可溶性部分

从而获得酪蛋白组合物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在ii)中的加热进行至少一个小时。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在ii)中的加热使可溶性部分中的酪蛋白的比率增加。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中，所述微生物组合物中的微生物未被裂解，在ii)中的加热将所述微生物裂解。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，在约95℃的温度进行ii)中的加热。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在ii)中的加热进行至少一小时。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中，所述微生物已用一种或多种编码多于一种酪蛋白的核酸转化。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述酪蛋白选自β酪蛋白、α-S1酪蛋白、α-S2酪蛋白和这些酪蛋白的混合物。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述酪蛋白选自β酪蛋白、α-S1酪蛋白和这些酪蛋白的混合物。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：对iii)中所获得的可溶性部分的酪蛋白进行进一步的纯化。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，应用于可溶性部分的进一步步骤包括选自添加活性炭、膜过滤、色谱法和酪蛋白沉淀中的至少一个步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述进一步步骤是将酪蛋白酸性沉淀。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，将酪蛋白酸性沉淀的进一步步骤通过在90℃、pH＝4下加热来进行。

15.根据权利要求2至14中任一项所述的方法，其中，所述微生物组合物为细菌组合物。

16.一种酪蛋白组合物，其易于通过根据权利要求1或15中任一项所述的方法获得。

17.一种用于获得凝乳的方法，其包括

i)提供根据权利要求16所述的酪蛋白组合物，

ii)将所述酪蛋白组合物与包含选自水、钙、脂质和碳水化合物中的至少一种成分的至少一种其他配料混合，以获得液体预凝乳组合物(LpCC)

iii)将至少一种凝乳剂添加至液体组合物以获得凝乳。

18.一种用于生产可食用组合物的方法，其包括

i)实施权利要求1至15中任一项所述的方法，以及

ii)进一步加工凝乳以获得可食用组合物。