CN117551607A - 一种恶性胸/腹水til细胞的培养方法 - Google Patents

一种恶性胸/腹水til细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种恶性胸/腹水TIL细胞的培养方法。本发明针对现有体外TIL扩展技术的不足，提供一种人IL‑21联合IL‑33“驯化型”胸/腹水TIL细胞培养方法，该培养方法取样方便，操作性简单，能高效扩增培养出大量功能增强型TIL细胞，为一种新型高扩增效率、杀伤力及浸润性TIL培养新技术。所获得的功能增强型TIL细胞免疫抑制状态被解除，显著增强体内抗实体瘤效能，提高肿瘤反应性CD8+T细胞的特异性、敏感性和靶向性，将对社会肿瘤防治事业做出重大贡献，有着重大的社会价值。

Description

一种恶性胸/腹水TIL细胞的培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种恶性胸/腹水TIL细胞的培养方法。
背景技术
根据近年来全国肿瘤登记中心发布的最新统计数据显示，肿瘤已经成为我国常见的致死性疾病之一。肿瘤的转移和复发是造成晚期肿瘤患者死亡的直接原因。对于发生肿瘤转移和复发的大多数患者，手术、放疗和化疗等常规治疗手段已不再奏效，机体本身自然抗力虚弱无法承受常规治疗带来的损伤，致使这部分患者治疗获益不足。虽然近年来肿瘤的诊治有了较大进展，但现有肿瘤治疗药物和技术手段疗效远未满足临床需求，因此该领域的发展必然蕴含着巨大的社会价值和经济价值。肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能状态密切相关。在正常的机体内，有着多种抗肿瘤免疫机制的存在，包括杀伤性CD8+T细胞、NK细胞等。但肿瘤患者体内的肿瘤微环境及肿瘤源免疫抑制性因素（如调节性T细胞、骨髓来源的抑制性细胞、免疫抑制性细胞因子）的存在，使得患者自身的这些细胞的杀肿瘤功能受到明显抑制。因此，在新型肿瘤治疗策略中，免疫生物学治疗无疑是未来最有前途的一种治疗方向，并已在全世界范围内获得了学术界、产业界的强烈关注，在体外训化、加工制备效应性杀伤性细胞并过继性输入至患者体内用于抗肿瘤成为了一种有效的治疗策略。
为了提高过继性T细胞的抗肿瘤效应，近来，出现了将患者的T细胞在体外进行基因修饰后过继的治疗策略。CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T cell）疗法是利用基因工程手段使T细胞拥有靶向肿瘤抗原的CAR结构，过继回输到患者体内时，T细胞能靶向杀伤癌症细胞。目前CAR-T细胞治疗在血液瘤治疗中取得了一定的进展，试验结果表明，在100例进行CD19-CAR-T细胞治疗急性淋巴细胞白血病患者中，90%的患者得到了完全缓解。然而，此类治疗仍面临着缺乏适合肿瘤靶抗原的严重缺陷。就CD19-CAR-T细胞治疗而言，CD19不仅表达于B系白血病细胞上，也表达于正常的B细胞表面，因此，部分成熟的B淋巴细胞遭受到CAR-T脱靶攻击而有所损耗。目前在实体瘤的治疗中，还缺乏有力的临床试验案例支撑。主要原因为：①实体瘤细胞可进行抗原编辑，改变其抗原性，使CAR-T细胞失去其靶向性。②实体瘤内强大的免疫抑制性微环境限制了免疫细胞在瘤内的杀伤作用。而且，在应用过程中面临细胞因子释放综合症、肿瘤裂解综合症和神经毒性综合征等诸多挑战。其次，由于CAR-T的制备过程繁琐，难度大，属于个体定制化服务，绝大多数病人难以承担起极其昂贵的治疗费用。
二十世纪的九十年代初，Rosenberg团队从小鼠肿瘤组织中提取出淋巴细胞并在体外使用白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）扩增培养，开创性地建立的体外培养、扩增患者肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的先河。有研究显示其有较强的抗肿瘤作用可以有效控制肝癌、肺癌的生长及转移，并且在黑素色实体瘤临床试验治疗显示疾病控制率高达80.3％、客观缓解率达到36.4%，开辟了实体肿瘤治疗的新篇章。由于从肿瘤组织中提取TIL技术难度较大、细胞数量有限以及部分晚期患者不能耐受手术切除肿瘤组织等困难，限制了其发展。然而，恶性胸/腹水中存在大量的TIL，并且早期可以清除胸/腹水内的肿瘤细胞。因此，选择恶性肿瘤患者的临床“废物”胸/腹水作为TIL扩增培养的“种子”来源，具有非常好的临床依从性。多项临床试验显示，恶性胸/腹水源TIL经体外培养后重新回至患者体内，可以很好的抑制胸腹水再生及部分抑制肿瘤生长。CD8+ T淋巴细胞作为抗肿瘤免疫的主要效应细胞，在介导T细胞对靶细胞进行杀伤作用中，其数量越高杀伤效果越好。但是，目前TIL存在对效应性CD8+ T淋巴细胞选择性扩增差，扩增细胞数量难以达到临床治疗数量级，并且存在扩增TIL对肿瘤病灶趋化能力不足以及细胞易衰老等主要问题，制约了该项技术在临床的应用与发展。另外，TIL培养过程中需使用大量IL-2，可促使Treg扩增，从而影响TIL细胞的抗肿瘤活性，导致肿瘤免疫逃逸的发生。因此，如何研发出一种适用于大量扩增、具有高效杀瘤活性的功能增强型TIL细胞，是目前TIL细胞临床应用需要亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有体外TIL扩展技术的不足，提供一种恶性胸/腹水TIL细胞的培养方法。所提供的培养方法取样方便，操作性简单，能高效扩增培养出大量功能增强型TIL细胞，并且所获得的功能增强型TIL细胞免疫抑制状态被解除，显著增强体内抗实体瘤效能。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种恶性胸/腹水TIL细胞的培养方法，所述的培养方法包括以下步骤：
（1）淋巴细胞分离：无菌条件下收集恶性胸/腹水，加入肝素钠抗凝，所述胸/腹水中肝素钠的浓度为10~15 U/mL，室温离心2000 rpm×5 min弃上清，加入1×Hanks重悬获得细胞悬液；采用Ficoll梯度密度分离淋巴细胞，分离后的淋巴细胞用生理盐水洗涤，室温离心2000 rpm×5 min弃上清获得TIL细胞沉淀物；
（2）初始启动培养：步骤（1）获得的TIL细胞沉淀物加入初始培养基，置于T25培养瓶中，培养1天获得启动TIL细胞；所述初始培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10~20 ng/mL人IFN-γ；
（3）诱导活化培养：用诱导培养基换液重悬步骤（2）获得的TIL细胞，置于37℃、5％CO2孵箱进行诱导培养，两天后转至T75培养瓶中继续培养至第5天，培养期间每天进行半定量换液；所述诱导活化培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10~20 ng/mL 人CD3单抗和1000 ~2000 U/mL人IL-2。
（4）高速扩增培养：第5天将活化后的TIL细胞1200 rpm离心5 min，换用高速扩增培养基转至T125培养瓶中，扩展培养至第8天，期间根据扩增情况对TIL细胞进行扩瓶或扩袋半定量换液培养；所述高速扩增培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和1000~2000 U/mL人IL-2。
（5）功能“驯化”增强：在培养第8天，对步骤（4）所获得的TIL细胞进行功能“驯化”培养，培养至第12-13天，将细胞由培养瓶扩增至细胞培养袋，200~300 mL/袋，置于37℃、5％CO2孵箱培养至第20天，离心1200 rpm×5 min弃上清液，细胞沉淀用0.9％注射用生理盐水洗涤，将细胞收集置于0.9％注射用生理盐水中，充分混匀，获得功能增强型TIL细胞；所述功能“驯化”培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1000~2000 U/mL人IL-2、10~30 ng/mL人IL-21以及10~30ng/mL人IL-33。
步骤（1）中所述的Ficoll梯度密度分离的过程为将分离液按照从下至上100%Ficoll：75% Ficoll：细胞悬液为3：3：4进行配置，加入离心管中，室温2000 rpm×20 min梯度离心，100% Ficoll与75% Ficoll中间层为淋巴细胞。
优选的，步骤（2）中，所述初始培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10 ng/mL人IFN-γ。
优选的，步骤（3）中，所述诱导活化培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10 ng/mL人CD3单抗和1000 U/mL人IL-2。
优选的，步骤（4）中所述高速扩增培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和1000 U/mL人IL-2。
优选的，步骤（5）所述功能“驯化”培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1000 U/mL人IL-2、20 ng/mL人IL-21以及20 ng/mL人IL-33。
优选的，功能“驯化”型TIL细胞扩增培养过程中，每三天对培养细胞抽样送检，进行细菌、真菌、支原体以及病毒等检测，确定培养所得TIL是否安全可靠。
本发明还提供了由上述培养方法制备得到的TIL细胞。
本发明还提供了由上述培养方法制备得到的TIL细胞在制备肿瘤治疗或预防药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的目的在于针对现有体外TIL扩展技术的不足，提供一种人IL-21联合IL-33“驯化型”胸/腹水TIL细胞培养方法，该培养方法取样方便，操作性简单，能高效扩增培养出大量功能增强型TIL细胞，为一种新型高扩增效率、杀伤力及浸润性TIL培养新技术。所获得的功能增强型TIL细胞免疫抑制状态被解除，显著增强体内抗实体瘤效能，提高肿瘤反应性CD8+T细胞的特异性、敏感性和靶向性，将对社会肿瘤防治事业做出重大贡献，有着重大的社会价值。
附图说明
图1是IL-21联合IL-33刺激促进TIL扩增能力情况图；
图2是IL-21联合IL-33作用增强TIL抗肿瘤能力对比图；
图3是IL-21联合IL-33诱导改善TIL向CD8+TIL分化图；
图4是IL-21联合IL-33诱导提升CD8+TILs细胞活化水平对比图；
图5是IL-21联合IL-33刺激降低TIL免疫耗竭状态图；
图6是新型“驯化”型TIL表面趋化因子受体表达对比图；
图7是新型“驯化”型TIL向肿瘤细胞趋化能力对比图；
图8是新型“驯化”型TIL体内抗肿瘤能力对比图；图中，A是瘤体大小，B是体积、重量评价对比；
图9是体内回输新型“驯化”型TIL的生存能力对比图。
实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试剂：1640培养基、青霉素和链霉素购自Gibco公司；灭活人AB血清购自OmegaScientific；人IFN-γ购自PeproTech公司，人CD3单抗为OKT3、人IL-21、IL-33均购自MCE公司。
本发明提供了一种恶性胸/腹水TIL细胞的培养方法，所述的培养方法包括以下步骤：
（1）淋巴细胞分离：无菌条件下收集恶性胸/腹水，加入肝素钠抗凝，所述胸/腹水中肝素钠的浓度为10~15 U/mL；室温离心弃上清，加入1×Hanks重悬获得细胞悬液；采用Ficoll梯度密度分离淋巴细胞，分离后的淋巴细胞用生理盐水洗涤，室温离心后弃上清获得TIL细胞沉淀物；
（2）初始启动培养：步骤（1）获得的TIL细胞沉淀物加入初始培养基，置于T25培养瓶中，培养1天获得启动TIL细胞；所述初始培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10~20 ng/mL人IFN-γ；
（3）诱导活化培养：用诱导培养基换液重悬步骤（2）获得的TIL细胞，置于37℃、5％CO2孵箱进行诱导培养，两天后转至T75培养瓶中继续培养至第5天，培养期间每天进行半定量换液；所述诱导活化培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10~20 ng/mL 人CD3单抗和1000~2000 U/mL人IL-2；
（4）高速扩增培养：第5天将活化后的TIL细胞1200 rpm离心5 min，换用高速扩增培养基转至T125培养瓶中，扩展培养至第8天，期间根据扩增情况对TIL细胞进行扩瓶或扩袋半定量换液培养；所述高速扩增培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和1000~2000 U/mL人IL-2；
（5）功能“驯化”增强：在培养第8天，对步骤（4）所获得的TIL细胞进行功能“驯化”培养，培养至第12~13天，将细胞由培养瓶扩增至细胞培养袋，200～300 mL/袋，置于37℃、5％CO2孵箱培养至第20天，离心1200 rpm×5 min弃上清液，细胞沉淀用0.9％注射用生理盐水洗涤，将细胞收集置于0.9％注射用生理盐水中，充分混匀，获得功能增强型TIL细胞；所述功能“驯化”培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1000~2000 U/mL人IL-2、10~30 ng/mL人IL-21以及10~30ng/mL人IL-33；
（6）TIL细胞扩增培养过程中，每三天对培养细胞抽样送检，进行细菌、真菌、支原体以及病毒检测，确定培养所得TIL是否安全可靠。
实施例1：新型“驯化”型TIL培养方法
对江苏大学附属医院肿瘤科肺癌患者行胸/腹腔穿刺术后引流出的胸/腹水进行“驯化型培养，培养方法包括以下步骤：
（1）淋巴细胞分离：无菌条件下收集肿瘤科肺癌患者行穿刺术后引流的恶性胸/腹水400 mL，并使用肝素钠抗凝（10 U/mL胸/腹水），室温离心2000 rpm×5 min弃上清，加入1×Hanks重悬获得细胞悬液，随后采用Ficoll梯度密度分离淋巴细胞，分离液按照从下至上100% Ficoll：75% Ficoll：细胞悬液为3：3：4进行配置，缓慢加入50 mL离心管中，室温2000rpm×20 min（升速5 rpm，降速5 rpm）梯度离心，75% Ficoll与1×Hanks中间层为癌细胞，100% Ficoll与75% Ficoll中间层为淋巴细胞，分别取中间层细胞用生理盐水洗涤两次，室温离心2000 rpm×5 min弃上清获得细胞沉淀备用，肿瘤细胞加入细胞冻存液冻存于-80℃备用。
（2）初始启动培养：步骤（1）获得的TIL细胞加入20 mL初始培养基，置于T25培养瓶中，进行启动激活TIL细胞，培养一天获得启动TIL细胞；所述初始培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10 ng/mL人IFN-γ（1640培养基、青霉素和链霉素购自Gibco公司；灭活人AB血清购自OmegaScientific；人IFN-γ购自PeproTech公司）；
（3）诱导活化培养：用诱导培养基换液重悬步骤（2）获得的TIL细胞，置于37℃、5％CO2孵箱进行诱导培养，两天后转至T75培养瓶中继续培养至第5天（期间每天进行半定量换液）；所述诱导活化培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10 ng/mL 人CD3单抗（OKT3）和1000 U/mL人IL-2（人OKT3购自eBioscience公司；人IL-2购自上海华新生物）；
（4）高速扩增培养：第5天将活化后的TIL细胞1200 rpm离心5 min，并换用高速扩增培养基转至T125培养瓶中，扩展培养至第8天，期间根据扩增情况对TIL细胞进行扩瓶半定量换液培养；所述高速扩增培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和1000 U/mL人IL-2；
（5）功能“驯化”增强：在培养第8天，对步骤（4）所获得的TIL细胞放入功能“驯化”培养基中进行功能“驯化”培养，培养至第12-13天，将细胞由175 cm2培养瓶扩增至细胞培养袋，200~300 mL/袋，置于37℃、5％CO2孵箱培养至第20天，离心1200 rpm×5 min弃上清液，细胞沉淀用0.9％注射用生理盐水洗涤2次，将细胞收集置于0.9％注射用生理盐水中，充分混匀备用。所述功能“驯化”培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1000 U/mL人IL-2、20 ng/mL人IL-21以及20ng/mL人IL-33（人IL-21和IL-33购自MCE公司）；
（6）细胞收集和鉴定：收集步骤（5）获得的TIL细胞进行功能检测，获得新型TIL细胞。另外，TIL细胞扩增培养过程中，每三天对培养细胞抽样送检，进行细菌、真菌、支原体以及病毒等检测，确定培养所得TIL是否安全可靠。
作为参照对比，分别设置Control组、IL-21诱导组、IL-33诱导组对收集的江苏大学附属医院肿瘤科肺癌患者行胸/腹腔穿刺术后引流出的胸/腹水进行培养处理；区别仅在于步骤（5）中所述功能“驯化”培养基中的20 ng/mL人IL-21+20 ng/mL人IL-33+1000 U/mL人IL-2分别替换为1000 U/mL人IL-2、20 ng/mL人IL-21+1000 U/mL人IL-2及20 ng/mL人IL-33+1000 U/mL人IL-2；每隔两天混匀细胞后统计培养基体积，取10 µL细胞悬液用细胞计数仪进行计数，记录细胞增值情况。图1是IL-21联合IL-33刺激促进TIL扩增能力情况图；如图1 所示，IL-21联合IL-33“驯化”的TIL细胞扩增能力明显高于单独使用IL-21或者IL-33以及传统仅依靠IL-2诱导的扩增能力。
实施例2：IL-21联合IL-33显著增强恶性胸/腹水TIL抗肿瘤能力
收集实施例1各组中培养第23天的 TIL细胞悬液，分别与肺癌（A549）、食管癌（TE）以及肝癌细胞株（HepG2）于96孔板中共培养24 h和48 h（效靶比为10:1，细胞株均购自上海ATCC细胞库），然后用1×PBS清洗两次，洗去悬浮TIL细胞，接着每孔加入10% CCK8工作试剂继续培养2 h，随后采用分光光度计（波长为450nm、630nm）测定吸光度，检测癌细胞活性进行体外抗肿瘤能力评估。图2是IL-21联合IL-33作用增强TIL抗肿瘤能力对比图；如图2所示，IL-21联合IL-33“驯化”型TIL对三种癌细胞抗肿瘤能力明显提高，并且对A549抗肿瘤能力的提升最为显著，表明TIL对肿瘤细胞的杀伤能力具有一定的特异性。
实施例3：IL-21联合IL-33显著增强TIL向CD8+TIL分化
收集实施例1各组中培养第23天的TIL细胞悬液0.5 mL，1200 rpm/5min离心后用1×PBS清洗1次，加入200 µL 1×PBS重悬，随后分别加入2 µL PE-Cy7-CD4、FITC-CD8抗体（购自Biolegend公司）室温孵育25 min，1200 rpm/5min离心后用1×PBS清洗2次，加入200µL 1×PBS重悬使用流式细胞仪检测CD4+T细胞和CD8+T细胞比例。图3是IL-21联合IL-33诱导改善TIL向CD8+TIL分化图；如图3所示，随着培养时间的延长，TIL中CD8+T细胞比例逐渐升高，并且，与仅用IL-2培养的传统方法相比，IL-21联合IL-33明显促进TIL向CD8+T细胞分化。
实施例4：新型“驯化”型TIL培养方式有助于CD8+TILs细胞活化
收集实施例1各组中培养第23天后的 TIL细胞悬液0.5 mL分别于4支流式管中，1200 rpm/5min离心后用1×PBS清洗1次，加入200 µL 1×PBS重悬，随后加入PE-Cy7-CD4、FITC-CD8以及PE-SLAMF7或PE-CD45RO或APC-CD30或Alexa Fluor-647-GzmB各2 µL（购自Biolegend公司）室温孵育25 min，然后再次1200 rpm/5min离心后用1×PBS清洗2次，加入200 µL 1×PBS重悬进行流式细胞仪检测CD8+T细胞上细胞活化指标表达。图4是IL-21联合IL-33诱导提升CD8+TILs细胞活化水平对比图；由图4可见，IL-21联合IL-33“驯化”型CD8+TILs上颗粒酶B、SLAMF7、CD45RO以及CD30表达相较于对照组、IL-21诱导组以及IL-33诱导组明显提高，表明新型“驯化”型TIL培养方式有助于细胞活化。
实施例5：IL-21联合IL-33改善TIL免疫耗竭状态
收集实施例1各组中培养第23天后的TIL细胞悬液0.5 mL，1200 rpm/5min离心后用1×PBS清洗1次，加入200 µL 1×PBS重悬，随后加入PE-Cy7-CD4，FITC-CD8以及BV421-PD-1各2 µL（购自Biolegend公司）室温孵育25min，然后再次1200 rpm/5min离心后用1×PBS清洗2次，加入200 µL 1×PBS重悬进行流式细胞仪检测CD8+TILs上PD-1表达水平。图5是IL-21联合IL-33刺激降低TIL免疫耗竭状态图；如图5所示，IL-21联合IL-33“驯化”型CD8+TILs细胞和上PD-1high水平明显低于IL-21、IL-33、IL-2培养型CD8+TILs上PD-1high表达情况，表明IL-21联合IL-33有助于挽救淋巴细胞免疫耗竭。
实施例6：“驯化”型TIL向肿瘤细胞趋化能力显著提升
收集实施例1中各组培养第23天的TIL细胞悬液各0.5 mL于流式管中，1200 rpm/5min离心后用1×PBS清洗1次，加入200 µL 1×PBS重悬，随后加入 PE-Cy7-CD4、FITC-CD8以及PE-CCR1或APC-CCR2或PE-CCR3或APC-CCR5或PE-CCR10各2 µL（购自Biolegend公司），室温孵育25 min，然后再次1200 rpm/5min离心后用1×PBS清洗2次，加入200 µL 1×PBS重悬进行流式细胞仪检测CD8+TILs上趋化因子受体表达水平。图6是新型“驯化”型TIL表面趋化因子受体表达对比图；结果6所示，IL-21联合IL-33促进了CD8+TILs上CCR1、CCR2、CCR3以及CCR5的表达，但是对于CCR10改变不明显，新型“驯化”型TIL表面趋化因子受体表达明显增高。另外，采用Transwell方法将肺癌细胞A549置于Transwell小室的下室，不同培养方式得到的TIL置于Transwell小室的上室，置于37℃、5％CO2孵箱培养3 h，通过对下室淋巴细胞计数评估TIL向肿瘤细胞趋化能力。图7是新型“驯化”型TIL向肿瘤细胞趋化能力对比图；如图7可见，IL-21联合IL-33的新型“驯化”型TIL靶向淋巴细胞的能力显著升高。
实施例7：新型“驯化”型TIL体内抗肿瘤能力明显提升
从常州卡文斯动物实验动物公司购买30只无胸腺裸鼠饲养在江苏大学动物实验中心，采用皮下注射荷瘤方式构建肺癌模型（每只肩部皮下注射5×107个A549癌细胞），分为NC组、Control组、IL-21诱导组、IL-33诱导组以及新型IL-21联合IL-33“驯化”组，每组6只。一周后瘤体成形成，通过尾静脉分别回输PBS、Control-TIL、IL-21-TIL、IL-33-TIL以及IL-21+IL-33-TIL细胞悬液1 mL（5×108个细胞/只），通过观察裸鼠生存情况以及28天后依照动物实验伦理原则处死裸鼠，测量瘤体大小以及重量评价不同培养方式下TIL体内抗肿瘤能力。图8是新型“驯化”型TIL体内抗肿瘤能力对比图；图中，A是瘤体大小，B是体积、重量评价对比；如图8所示，用IL-2联合IL-33培养的TILs显示出对A549肿瘤生长的显著抑制作用，肿瘤体积和重量明显下降。图9是体内回输新型“驯化”型TIL的生存能力对比图；如图9可见，肺癌小鼠回输IL-21和IL-33共培养的TIL后，新型“驯化”型TIL组小鼠长期存活率显著高于对照组以及IL-21或IL-33诱导的TIL处理组。因此，上述结果提示IL-21和IL-33可协同增强TIL的体内抗肿瘤能力。
通过上述案例表明，与现有体外TIL培养技术相比，本发明所述的IL-21联合IL-33培养方法获得功能“驯化”型TIL细胞，该细胞能有效提高TIL细胞的扩展以及杀伤肿瘤细胞的活性，并显著促进TIL细胞向CD8+T细胞分化及活化，以及分泌抗肿瘤的颗粒酶B，同时通过抑制TIL细胞上PD-1的表达解除细胞免疫抑制。因此，本发明所述的驯化型培养方法能获得具有增殖能力更强、高杀伤肿瘤细胞的能力、低细胞免疫抑制以及分泌更多的抗肿瘤细胞因子的功能增强“驯化”型TIL细胞。
上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方法的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方法，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种恶性胸/腹水TIL细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养方法包括以下步骤：
（1）淋巴细胞分离：无菌条件下收集恶性胸/腹水，加入肝素钠抗凝，室温离心弃上清，加入1×Hanks重悬获得细胞悬液；采用Ficoll梯度密度分离淋巴细胞，分离后的淋巴细胞用生理盐水洗涤，室温离心后弃上清获得TIL细胞沉淀物；
（2）初始启动培养：步骤（1）获得的TIL细胞沉淀物加入初始培养基，置于T25培养瓶中，培养1天获得启动TIL细胞；所述初始培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10~20 ng/mL人IFN-γ；
（3）诱导活化培养：用诱导培养基换液重悬步骤（2）获得的TIL细胞，置于37℃、5％CO2孵箱进行诱导培养，两天后转至T75培养瓶中继续培养至第5天，培养期间每天进行半定量换液；所述诱导活化培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10~20 ng/mL 人CD3单抗和1000~2000 U/mL人IL-2；
（4）高速扩增培养：第5天将活化后的TIL细胞1200 rpm离心5 min，换用高速扩增培养基转至T125培养瓶中，扩展培养至第8天，期间根据扩增情况对TIL细胞进行扩瓶或扩袋半定量换液培养，所述高速扩增培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和1000~2000 U/mL人IL-2；
（5）功能“驯化”增强：在培养第8天，对步骤（4）所获得的TIL细胞进行功能“驯化”培养，培养至第12-13天，将细胞由培养瓶扩增至细胞培养袋，200~300 mL/袋，置于37℃、5％CO2孵箱培养至第20天，离心1200 rpm×5 min弃上清液，细胞沉淀用0.9％注射用生理盐水洗涤，将细胞收集置于0.9％注射用生理盐水中，充分混匀，获得功能增强型TIL细胞，所述功能“驯化”培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%~15%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1000~2000 U/mL人IL-2、10~30 ng/mL人IL-21以及10~30 ng/mL人IL-33。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述的Ficoll梯度密度分离的过程为将分离液按照从下至上100% Ficoll：75% Ficoll：细胞悬液为3：3：4进行配置，加入离心管中，室温2000 rpm×20 min梯度离心，100% Ficoll与75% Ficoll中间层为淋巴细胞。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述胸/腹水中肝素钠的浓度为10~15 U/mL。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述初始培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和10ng/mL人IFN-γ。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）中，所述诱导活化培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10 ng/mL 人CD3单抗和1000 U/mL人IL-2。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（4）中，所述高速扩增培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和1000 U/mL人IL-2。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（5）中所述功能“驯化”培养基是在无血清1640培养基的基础上加入10%灭活人AB血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1000 U/mL人IL-2、20 ng/mL人IL-21以及20 ng/mL人IL-33。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于TIL细胞扩增培养过程中，每三天对培养细胞抽样送检，进行细菌、真菌、支原体以及病毒检测，确定培养所得TIL是否安全可靠。
9.根据权利要求1-8任一项所述的培养方法制备得到的TIL细胞。
10.根据权利要求1-8任一项所述的培养方法制备得到的TIL细胞在制备肿瘤治疗或预防药物中的应用。
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