CN117551208A - 一种基于环状重排荧光蛋白的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种基于环状重排荧光蛋白的L‑2‑羟基戊二酸生物传感器及其应用。本发明将恶臭假单胞菌W619中L‑2‑羟基戊二酸特异性转录调控因子LhgR与环状重排黄色荧光蛋白相结合,开发了一种高性能的L‑2‑羟基戊二酸生物传感器;证明了该生物传感器适用于人体血清、尿液等不同生物学样品中L‑2‑羟基戊二酸的精准、高效、高通量检测,以及可实现哺乳动物细胞胞内及不同亚细胞区室内L‑2‑羟基戊二酸的实时、原位检测。所述L‑2‑羟基戊二酸生物传感器具有响应幅度高、荧光亮度强、亲和力合适等优势,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种基于环状重排荧光蛋白的L-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
L-2-羟基戊二酸(L-2-Hydroxyglutarate,L-2-HG)是TCA循环中2-酮基戊二酸(2-ketoglutarate,2-KG)的结构类似物。在哺乳动物及植物中,L-2-HG被报道来源于L-乳酸脱氢酶(LDH)与L-苹果酸脱氢酶(MDH)对2-KG的非特异性还原活性,其分解依赖于L-2-HG脱氢酶(L2HGDH)催化脱氢生成2-KG。在微生物中,L-2-HG由戊二酸羟化酶(CsiD)催化戊二酸羟基化产生,通过L-2-HG氧化酶(LhgO)催化分解。L-2-HG可竞争性抑制多种2-KG依赖性双加氧酶的活性,导致L-2-HG尿症、多种脑部肿瘤和肾脏肿瘤等疾病的发生,其定量检测对L-2-HG相关疾病的诊疗具有重要临床意义。另外最近有研究发现,L-2-HG在细胞正常生理代谢中也发挥重要作用,可帮助细胞适应缺氧环境、参与免疫反应等,建立细胞内L-2-HG高效、高时空分辨的检测方法对确定L-2-HG在不同生物体内的代谢机制,鉴定其多样性的生理功能至关重要。
当前L-2-HG的检测主要依赖于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)、磁共振波谱(MRS)等昂贵、繁琐的技术手段,难以实现活细胞内L-2-HG的实时检测,限制了L-2-HG相关疾病诊疗、L-2-HG代谢机制及功能多样性研究的开展。近期有研究报道了一种基于高催化活性L-2-HG脱氢酶的L-2-HG生物传感器EaLHGFR。EaLHGFR将L-2-HG脱氢酶介导的L-2-HG脱氢反应与刃天青介导的氧化还原反应报告系统相结合实现L-2-HG的检测,该方法较为繁琐且与活细胞内L-2-HG实时检测不兼容。另外,近期还报道了一种基于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)W619中L-2-HG特异性转录调控因子LhgR与荧光共振能量转移(FRET)技术的L-2-HG生物传感器LHGFR0N3C与LHGFR0N7C。然而LHGFR0N3C与LHGFR0N7C对L-2-HG的响应幅度(ΔRmax)较低,分别为56.13±0.29%和60.37±1.30%,且对L-2-HG的亲和力过高,表观解离常数(Kd)分别为29.33±1.24μM和7.22±0.38μM,使得二者在活细胞内L-2-HG的实时定量分析方面受到限制。因此,亟需开发一种高效、高响应幅度、高时空分辨、低成本的高性能L-2-HG生物传感器以满足L-2-HG体内、体外定量检测的需要。
发明内容
针对上述现有技术的不足,发明人经长期的技术与实践探索,提供一种基于环状重排荧光蛋白的高性能L-2-HG生物传感器及其应用。所述L-2-HG生物传感器至少包含由L-2-HG特异性转录调控因子与环状重排荧光蛋白组成的融合蛋白。经试验证明,本发明所开发的生物传感器具备响应幅度高、荧光亮度强、亲和力适中等优点,可以高效、高时空分辨、低成本的方式实现不同生物学样品中以及哺乳动物细胞内L-2-HG的定量检测。基于上述研究成果,从而完成本发明。
具体的,为实现上述技术目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一个方面,提供一种融合蛋白,所述融合蛋白由L-2-HG特异性转录调控因子与环状重排荧光蛋白组成。
其中,所述L-2-HG特异性转录调控因子可以为来源恶臭假单胞菌W619的特异性转录调控因子LhgR;其是发明人在前首次发现的参与调控L-2-HG代谢且特异性响应于L-2-HG的转录调控因子。当然,基于本发明的构思,现有已知的其他L-2-HG特异性转录调控因子同样适用于本申请的技术方案,因此理应属于本申请的保护范围之内。
所述环状重排荧光蛋白为一类可视化的报告基因编码蛋白,包括环状重排青色荧光蛋白(cpTFP)、环状重排绿色荧光蛋白(cpGFP)、环状重排黄色荧光蛋白(cpYFP)、环状重排红色荧光蛋白(cpRFP)等;在本发明的一个具体实施方式中,所采用的环状重排荧光蛋白为cpYFP或采用的为发明人首次构建的含四突变位点的cpYFP变体(命名为环状重排超折叠黄色荧光蛋白cpSFYFP,cpSFYFP具有荧光亮度强的特点)。当L-2-HG存在时,L-2-HG与转录调控因子LhgR结合所诱导的LhgR构象改变可导致cpYFP或cpSFYFP的构象改变,进而使得传感器的荧光性质极大改变,从而实现对L-2-HG的检测。
具体的,所述融合蛋白选自:
(a1)SEQ ID NO.1-2任一项所示氨基酸序列组成的蛋白质;
(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同或相近功能的蛋白质;
(a3)与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到40%或40%以上并且具有与(a1)或(a2)所示的蛋白质具有相同或相近功能的蛋白质。
本发明的第二个方面,提供一种核酸分子,所述核酸分子能够编码上述融合蛋白。
具体的,所述核酸分子具有(b1)-(b4)中任一所述核苷酸序列:
(b1)如SEQ ID NO.3-4任一项所示的核苷酸序列;
(b2)如(b1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列;
(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有40%或40%以上的同一性,且编码所述融合蛋白的核酸分子;
(b4)在严格条件下能够与如(b1)-(b3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同功能融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的第三个方面,提供一种重组表达载体,所述重组表达载体至少包含上述核酸分子。
本发明的第四个方面,提供一种宿主细胞,所述宿主细胞含有上述核酸分子、上述重组表达载体或者能够表达上述融合蛋白。
本发明的第五个方面,提供上述融合蛋白、核酸分子、重组表达载体和/或宿主细胞在制备检测L-2-HG的生物传感器中的应用。
本发明的第六个方面,提供一种检测L-2-HG的生物传感器,所述生物传感器至少包含上述融合蛋白。
所述生物传感器还可以包含其他用于L-2-HG检测的试剂、装置和/或设备,在此不做具体限定。
上述生物传感器在实际应用过程中,可以以检测试剂盒形式存在,特别是在(体外)环境中检测L-2-HG时。
而当生物传感器用于机体内(如细胞内)L-2-HG的检测时,可直接诱导上述生物传感器在细胞内表达,从而用于检测胞内L-2-HG浓度变化。
本发明的第七个方面,提供一种体外检测L-2-HG的方法,所述方法至少包括:将待测样品与所述生物传感器进行孵育,根据L-2-HG生物传感器荧光信号变化,分析待测样品中L-2-HG的浓度或有无;
本发明的第八个方面,提供一种细胞内检测L-2-HG的方法,所述方法至少包括:诱导L-2-HG生物传感器在细胞内表达,根据L-2-HG生物传感器荧光信号变化,分析细胞内L-2-HG的浓度或有无。
其中,所述细胞可以为哺乳细胞,在本发明的具体实施方式中,所述细胞选用人胚胎肾细胞HEK293FT。
与现有技术方案相比,上述一个或多个技术方案具有如下有益技术效果:
(1)上述技术方案提供的L-2-HG生物传感器sfLHGFR是将环状重排荧光蛋白插入至来源于恶臭假单胞菌W619的L-2-HG特异性转录调控因子LhgR内部的适当位置构成。L-2-HG与LhgR结合引发的构象改变,导致环状重排荧光蛋白插入位点处多肽主链和氨基酸侧链构象变化,进一步显著改变环状重排荧光蛋白的荧光强度,该荧光强度的改变可用作L-2-HG浓度的检测指标。
(2)上述技术方案提供的基于环状重排荧光蛋白的L-2-HG生物传感器sfLHGFR中,包含一种低检测范围的传感器变体,其命名为sfLHGFRL,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,sfLHGFRL对L-2-HG的响应幅度达623.01±8.52%,检测范围为0.14-100μM,检测下限低至0.14μM,适用于不同生物学样品中较低水平的L-2-HG的体外检测,具有制备简易、成分简单、成本较低、易于操作、可实现高通量检测等优点,对L-2-HG相关疾病诊疗技术的发展具有重要临床应用价值。
(3)上述技术方案提供的基于环状重排荧光蛋白的L-2-HG生物传感器sfLHGFR中,还包含一种高检测范围的传感器变体,其命名为sfLHGFRH,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,sfLHGFRH对L-2-HG的响应幅度达909.23±16.19%,检测范围为0.56-70,000μM,适用于哺乳动物细胞中较高水平的L-2-HG的体内检测,具有无创、高时空分辨、高通量等优点,可实现哺乳动物细胞中L-2-HG的实时、原位检测,对L-2-HG代谢机制及功能多样性研究的开展具有重要理论意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中基于环状重排荧光蛋白的L-2-HG生物传感器sfLHGFR表达纯化的SDS-PAGE验证。
图2为本发明实施例1中筛选的不同基于环状重排荧光蛋白的L-2-HG生物传感器sfLHGFR的结构示意图及对L-2-HG的ΔRmax比较。
图3为本发明实施例2中sfLHGFRH-1对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图4为本发明实施例2中sfLHGFRH-2的结构示意图及对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图5为本发明实施例2中sfLHGFRH-3的结构示意图及对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图6为本发明实施例2中sfLHGFRH-3与sfLHGFRH-2的荧光强度比较。a图为488nm激发下各传感器变体间的荧光强度比较;b图为405nm激发下各传感器变体间的荧光强度比较。
图7为本发明实施例2中所筛选的736个sfLHGFRH-3随机突变体对L-2-HG的响应幅度比较。
图8为本发明实施例2中sfLHGFRH的结构示意图及对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图9为本发明实施例3中sfLHGFRL-1对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图10为本发明实施例3中sfLHGFRL-2的结构示意图及对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图11为本发明实施例3中sfLHGFRL-3的结构示意图及对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图12为本发明实施例3中sfLHGFRL-3与sfLHGFRL-2的荧光强度比较。a图为488nm激发下各传感器变体间的荧光强度比较;b图为405nm激发下各传感器变体间的荧光强度比较。
图13为本发明实施例3中所筛选的276个sfLHGFRL-3随机突变体对L-2-HG的响应幅度比较。
图14为本发明实施例3中sfLHGFRL的结构示意图及对L-2-HG的剂量-响应曲线。
图15为本发明实施例4中sfLHGFRL与LC-MS/MS用于人体血清样品中L-2-HG检测的一致性分析。
图16为本发明实施例4中sfLHGFRL与LC-MS/MS用于人体尿液样品中L-2-HG检测的一致性分析。
图17为本发明实施例5中sfLHGFRH在人胚胎肾细胞HEK293FT中对外源L-2-HG添加的实时响应。
图18为本发明实施例5中sfLHGFRH在人胚胎肾细胞HEK293FT的不同亚细胞区室定位及对L-2-HG的响应。a图为sfLHGFRH在人胚胎肾细胞HEK293FT的不同亚细胞区室定位的成像结果图;b图为不同亚细胞区室定位的sfLHGFRH对L-2-HG的响应。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型具体实施方式中,提供一种融合蛋白,所述融合蛋白由L-2-HG特异性转录调控因子与环状重排荧光蛋白组成。
其中,所述L-2-HG特异性转录调控因子可以为来源恶臭假单胞菌W619的特异性转录调控因子LhgR;其是发明人在前首次发现的参与调控L-2-HG代谢且特异性响应于L-2-HG的转录调控因子。当然,基于本发明的构思,现有已知的其他L-2-HG特异性转录调控因子同样适用于本申请的技术方案,因此理应属于本申请的保护范围之内。
所述环状重排荧光蛋白为一类可视化的报告基因编码蛋白,包括环状重排青色荧光蛋白(cpTFP)、环状重排绿色荧光蛋白(cpGFP)、环状重排黄色荧光蛋白(cpYFP)、环状重排红色荧光蛋白(cpRFP)等;在本发明的一个具体实施方式中,所采用的环状重排荧光蛋白为cpYFP或采用的为发明人首次构建的含四突变位点(S30R、Y39N、N105T、Y145F)的cpYFP变体(命名为环状重排超折叠黄色荧光蛋白cpSFYFP,cpSFYFP具有荧光亮度强的特点)。当L-2-HG存在时,L-2-HG与转录调控因子LhgR结合所诱导的LhgR构象改变可导致cpYFP或cpSFYFP的构象改变,进而使得上述融合蛋白所构成的L-2-HG生物传感器的荧光性质极大改变,从而实现对L-2-HG的检测。
具体的,所述融合蛋白选自:
(a1)SEQ ID NO.1-2任一项所示氨基酸序列组成的蛋白质;
(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同或相近功能的蛋白质;
(a3)与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到40%或40%以上并且具有与(a1)或(a2)所示的蛋白质具有相同或相近功能的蛋白质。
其中,所述(a2)中,所述一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加一般为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(a1)–(a3)中所示蛋白质可以人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达获得。
本发明一个或多个具体实施方式中,提供一种核酸分子,所述核酸分子能够编码上述融合蛋白。
具体的,所述核酸分子具有(b1)-(b4)中任一所述核苷酸序列:
(b1)如SEQ ID NO.3-4任一项所示的核苷酸序列;
(b2)如(b1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列;
(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有40%或40%以上的同一性,且编码所述融合蛋白的核酸分子;
(b4)在严格条件下能够与如(b1)-(b3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同功能融合蛋白的核苷酸序列。
需要说明的是,术语“同一性”指与氨基酸/核苷酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述40%以上同一性,可以为40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%以上的同一性。
所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA等,在此不做具体限定。
本发明一个或多个具体实施方式中,提供一种重组表达载体,所述重组表达载体至少包含上述核酸分子。
所述重组表达载体通过上述核酸分子有效地连接到表达载体上获得,所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种;病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体,人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体;进一步优选为质粒;所述质粒包括但不限于pETDuet-1、pcDNA3.1(+)。
本发明一个或多个具体实施方式中,提供一种宿主细胞,所述宿主细胞含有上述核酸分子、上述重组表达载体或者能够表达上述融合蛋白。
所述宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞或动物细胞;
所述细菌可以为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属中的任意一种或多种。
本发明的一个或多个具体实施方式中,所述细菌包括但不限于大肠杆菌(如BL21(DE3))、根癌农杆菌(如GV3101)、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌。
所述真菌细胞包括酵母菌。
所述动物细胞可以为哺乳动物细胞,更具体的,所述哺乳动物细胞包括但不限于人胚胎肾细胞HEK293FT、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7。
本发明一个或多个具体实施方式中,提供上述融合蛋白、核酸分子、重组表达载体和/或宿主细胞在制备检测L-2-HG的生物传感器中的应用。
本发明一个或多个具体实施方式中,提供一种检测L-2-HG的生物传感器,所述生物传感器至少包含上述融合蛋白。
也即,L-2-HG生物传感器可以为将cpSFYFP以N-末端linker为“脯氨酸-天冬氨酸”、C-末端linker为“亮氨酸-丝氨酸-组氨酸”,插入至LhgR的94-137位氨基酸与138-236位氨基酸之间所构成的高检测范围L-2-HG生物传感器sfLHGFRH(其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示);或将cpSFYFP以N-末端linker为“丝氨酸-丙氨酸-甘冬氨酸”、C-末端linker为“亮氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸”,插入至LhgR的94-231位氨基酸与232-236位氨基酸之间所构成的低检测范围L-2-HG生物传感器sfLHGFRL(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
进一步的,所述生物传感器还可以包含其他用于L-2-HG检测的试剂、装置和/或设备,在此不做具体限定。
比如,本发明中,所述试剂可以包含检测缓冲液(如荧光测定缓冲液:100mMHEPES、100mM KCl,pH 7.4)。
上述生物传感器在实际应用过程中,可以以检测试剂盒形式存在,特别是在(体外)环境中检测L-2-HG时。
而当生物传感器用于机体内(如细胞内)L-2-HG的检测时,可直接诱导上述生物传感器在细胞内表达,从而用于检测胞内L-2-HG浓度变化。
本发明一个或多个具体实施方式中,提供一种体外检测L-2-HG的方法,所述方法至少包括:将待测样品与所述生物传感器进行孵育,根据L-2-HG生物传感器荧光信号变化,分析待测样品中L-2-HG的浓度或有无。
其中,所述待测样品为含有或疑似含有L-2-HG的样品,所述样品可以为生物样品或环境样品,所述生物样品包括但不限于细菌培养基、细菌裂解液、细胞培养基、细胞裂解液、动物血清、动物尿液和动物组织液;
所述动物可以为哺乳动物,其中,人是优选的。
此时,所述L-2-HG生物传感器中还可以包括其他用于L-2-HG检测的试剂、装置和/或设备;
所述试剂包括检测缓冲液(如荧光测定缓冲液:100mM HEPES、100mM KCl,pH7.4)。
本发明一个或多个具体实施方式中,提供一种细胞内检测L-2-HG的方法,所述方法至少包括:诱导L-2-HG生物传感器在细胞内表达,根据L-2-HG生物传感器荧光信号变化,分析细胞内L-2-HG的浓度或有无。
此时,所述L-2-HG生物传感器即上述融合蛋白。
其中,所述细胞可以为哺乳细胞,在本发明的具体实施方式中,所述细胞包括但不限于人胚胎肾细胞HEK293FT。
通过上述方法可实现对体外或体内L-2-HG定性或定量检测。
以下结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实例仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。下述实施例中,使用的表达载体pETDuet-1和表达载体pcDNA3.1(+)购自Novagen公司;其他所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均从商业途径得到。所使用的实验方法,未做具体说明的,均为常规方法。
实施例1:基于环状重排荧光蛋白的L-2-HG生物传感器(sfLHGFR)的初步构建
(1)LhgR表达质粒的构建
PCR扩增来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)W619中LhgR编码基因lhgR(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010501.1),使用BamHI/HindIII双酶切基因片段与pETDuet-1质粒,通过T4 DNA连接酶连接,得到重组质粒pETDuet-LhgR,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选构建成功的菌株。挑取单菌落,菌液PCR验证成功后保存菌株。
通过PCR扩增Pseudomonas putida W619来源的lhgR基因,引物设计如下:
上游引物:5’-AATTGGATCCGATGCTAGAACTCCAGC-3’,携带一个BamHI位点;
下游引物:5’-AATTAAGCTTTTAGTCGAGTGCAGGT-3’,携带一个HindIII位点。
(2)cpYFP在LhgR内部不同插入位点所形成的多种L-2-HG生物传感器(sfLHGFR)的构建
本实施例中,以pETDuet-LhgR为基础,选择以下位点插入cpYFP,构建pETDuet-sfLHGFRX/Y(本文中,sfLHGFRX/Y表示为将cpYFP插入至LhgR序列内X位氨基酸与Y位氨基酸之间所形成的传感器;如sfLHGFR137D/138F为将cpYFP插入至LhgR序列内137D与138F位氨基酸之间)重组质粒:114R/115R、115R/116R、116R/117D、117D/118E、133D/134K、134K/135R、135R/136S、136S/137D、137D/138F、156S/157K、157K/158N、158N/159D、159D/160Y、184A/185A、185A/186H、186H/187S、187S/188V、188V/189G、189G/190G、190G/191S、191S/192A、207D/208G、208G/209D、209D/210R、228L/229K、231E/232L。此外,通过将cpYFP插入全长的LhgR与截除DNA结合结构域的LhgR(D2)之间,分别可以得到pETDuet-sfLHGFRLhgR-cpYFP-LhgR、pETDuet-sfLHGFRLhgR-cpYFP-LhgR(D2)、pETDuet-sfLHGFRLhgR(D2)-cpYFP-LhgR、pETDuet-sfLHGFRLhgR(D2)-cpYFP-LhgR(D2)等重组质粒。在上述编码各传感器变体的重组质粒中,cpYFP均以N末端为“丝氨酸-丙氨酸-甘氨酸”、C末端为“甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸”的linker分别与LhgR的上、下两片段相连。
构建方法如下:cpYFP的编码基因由通用生物(安徽)股份有限公司合成,连接于pETDuet-1质粒,并保存于Escherichia coli Top10菌株。以重组质粒pETDuet-LhgR为模板,PCR扩增不同插入位点的LhgR上片段;以重组质粒pETDuet-cpYFP为模板,PCR扩增cpYFP的DNA片段;以重组质粒pETDuet-LhgR为模板,PCR扩增不同插入位点的LhgR下片段。使用重组PCR依次连接LhgR上片段、cpYFP、LhgR下片段,得到重组的目的基因片段。进一步使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法插入pETDuet-1中。即使用BamHI/HindIII双酶切重组质粒pETDuet-1,随后在15μL连接体系中加入5μL重组的目的基因片段与线性化质粒,其中目的基因片段与线性化质粒的摩尔比为4:1。在30℃条件下孵育40分钟,随后置于冰上冷却10分钟,得到重组质粒pETDuet-sfLHGFRX/Y、pETDuet-sfLHGFRLhgR-cpYFP-LhgR、pETDuet-sfLHGFRLhgR-cpYFP-LhgR(D2)、pETDuet-sfLHGFRLhgR(D2)-cpYFP-LhgR、pETDuet-sfLHGFRLhgR(D2)-cpYFP-LhgR(D2)。
通过PCR扩增Pseudomonas putida W619来源的LhgR上片段,引物设计如下:
LhgR上片段上游引物:5’-ATCACCACAGCCAGGATCCGATGCTAGAACTCCAGCGC-3’;
LhgR全长下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGTCGAGTGCAGGTAGTTCT-3’;
去除DNA结合结构域的LhgR(D2)上游引物:5’-ATCACCACAGCCAGGATCCGATGCTGGTGCAGATGTTCG-3’;
LhgR上片段114R/115R下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGCGCGCGGCGATGGCCGCT-3’;
LhgR上片段115R/116R下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGATCGGCGCGCGGCGATGGC-3’;
LhgR上片段116R/117D下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAACGTCGGCGCGCGGCGAT-3’;
LhgR上片段117D/118E下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGTCACGTCGGCGCGCGGC-3’;
LhgR上片段133D/134K下游引物:5’-CGCTGTTGTAGCCTGCAGAGTCGAGCATCTCCTGCAGGG-3’;
LhgR上片段134K/135R下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGATTTGTCGAGCATCTCCT-3’;
LhgR上片段135R/136S下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGCGTTTGTCGAGCATCTCC-3’;
LhgR上片段136S/137D下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGCTGCGTTTGTCGAGCAT-3’;
LhgR上片段137D/138F下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGTCGCTGCGTTTGTCGAGC-3’;
LhgR上片段156S/157K下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGCTGGCTTCGGCGATGGCC-3’;
LhgR上片段157K/158N下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGACTTGCTGGCTTCGGCGAT-3’;
LhgR上片段158N/159D下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGTTCTTGCTGGCTTCGGCG-3’;
LhgR上片段159D/160Y下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAATCGTTCTTGCTGGCTTCG-3’;
LhgR上片段184A/185A下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGATGCGGAGTTTTCCCAGGCG-3’;
LhgR上片段185A/186H下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGGCTGCGGAGTTTTCCCAG-3’;
LhgR上片段186H/187S下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAATGGGCTGCGGAGTTTTCC-3’;
LhgR上片段187S/188V下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGACGAATGGGCTGCGGAGTTT-3’;
LhgR上片段188V/189G下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGACACCGAATGGGCTGCGGA-3’;
LhgR上片段189G/190G下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGCCCACCGAATGGGCTGC-3’;
LhgR上片段190G/191S下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGCCGCCCACCGAATGGGCT-3’;
LhgR上片段191S/192A下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGACGAGCCGCCCACCGAATG-3’;
LhgR上片段207D/208G下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGTCGGCGATGGCCTGATAA-3’;
LhgR上片段208G/209D下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAACCGTCGGCGATGGCCTGA-3’;
LhgR上片段209D/210R下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGAGTCACCGTCGGCGATGGC-3’;
LhgR上片段228L/229K下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGACAGGCGTTTGGCAGAGGCG-3’;
LhgR上片段231E/232L下游引物:5’-TCGCTGTTGTAGCCTGCAGATTCTATTTTCAGGCGTTTG-3’。
通过PCR扩增cpYFP片段,引物设计如下:
cpYFP上游引物:5’-TCTGCAGGCTACAACAGCGACAAC-3’;
cpYFP下游引物::5’-ACAGCCACCGTTGTACTCCAGCTTG-3’。
通过PCR扩增Pseudomonas putida W619来源的LhgR下片段,引物设计如下:
LhgR全长上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTATGCTAGAACTCCAGCGC-3’;
去除DNA结合结构域的LhgR(D2)上游引物:
5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTCTGGTGCAGATGTTCGAAA-3’;
LhgR下片段114R/115R上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTCGACGTGACGAACACGATC-3’;
LhgR下片段115R/116R上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTCGTGACGAACACGATCTGG-3’;
LhgR下片段116R/117D上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGACGAACACGATCTGGCGA-3’;
LhgR下片段117D/118E上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGAACACGATCTGGCGAAC-3’;
LhgR下片段133D/134K上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTAAACGCAGCGACTTCGCCA-3’;
LhgR下片段134K/135R上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTCGCAGCGACTTCGCCACT-3’;
LhgR下片段135R/136S上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTAGCGACTTCGCCACTGCCT-3’;
LhgR下片段136S/137D上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGACTTCGCCACTGCCTCGG-3’;
LhgR下片段137D/138F上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTTTCGCCACTGCCTCGGCAG-3’;
LhgR下片段156S/157K上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTAAGAACGATTACTTCGTGG-3’;
LhgR下片段157K/158N上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTAACGATTACTTCGTGGCCT-3’;
LhgR下片段158N/159D上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGATTACTTCGTGGCCTT-3’;
LhgR下片段159D/160Y上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTTACTTCGTGGCCTTCCAT-3’;
LhgR下片段184A/185A上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGCCCATTCGGTGGGCGGCT-3’;
LhgR下片段185A/186H上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTCATTCGGTGGGCGGCTCGG-3’;
LhgR下片段186H/187S上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTTCGGTGGGCGGCTCGGC-3’;
LhgR下片段187S/188V上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGTGGGCGGCTCGGCCGAAG-3’;
LhgR下片段188V/189G上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGGCGGCTCGGCCGAAGCCA-3’;
LhgR下片段189G/190G上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGGCTCGGCCGAAGCCAATC-3’;
LhgR下片段190G/191S上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTTCGGCCGAAGCCAATCGC-3’;
LhgR下片段191S/192A上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGCCGAAGCCAATCGCGA-3’;
LhgR下片段207D/208G上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGGTGACCGCCAAAGGGCTG-3’;
LhgR下片段208G/209D上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTGACCGCCAAAGGGCTGCG-3’;
LhgR下片段209D/210R上游引物:5’-TGGAGTACAACGGTGGCTGTCGCCAAAGGGCTGCGGCGT-3’;
LhgR下片段228L/229K上游引物:5’-GGCACAAGCTGGAGTACAACGGTGGCTGTAAAATAGAACTACCT-3’;
LhgR下片段231E/232L上游引物:5’-GCACAAGCTGGAGTACAACGGTGGCTGTCTACCTGCACTCGACTAA-3’;
LhgR下片段下游引物:5’-CATTATGCGGCCGCAAGCTTTTAGTCGAGTGCAGGTAGT-3’。
(3)cpYFP在LhgR内部不同插入位点所形成的不同L-2-HG生物传感器变体的外源表达、分离纯化及对L-2-HG响应的测定
将编码上述生物传感器核酸序列的重组质粒pETDuet-sfLHGFRX/Y、pETDuet-sfLHGFRLhgR-cpYFP-LhgR、pETDuet-sfLHGFRLhgR-cpYFP-LhgR(D2)、pETDuet-sfLHGFRLhgR(D2)-cpYFP-LhgR、pETDuet-sfLHGFRLhgR(D2)-cpYFP-LhgR(D2)分别转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选构建成功的菌株。挑取单菌落,经菌液PCR验证成功后,以1.5%比例接种于1L含有氨苄青霉素的LB培养基中,在37℃与180rpm的条件下培养至OD600nm约0.6,加入1mM IPTG,在16℃与160rpm的条件下过夜诱导蛋白表达;离心收集菌体,使用结合缓冲液洗涤两次并重悬至OD600 nm为20,加入1mM PMSF与10%甘油,高压破碎菌体,12,000rpm、4℃离心50min去除细胞碎片后获得粗提取液;所得粗提取液经0.22μm的滤头过滤后,使用5mL镍柱分离纯化,采用不同浓度的洗脱缓冲液洗脱获得纯化的sfLHGFRX/Y蛋白、sfLHGFRLhgR-cpYFP-LhgR蛋白、sfLHGFRLhgR-cpYFP-LhgR(D2)蛋白、sfLHGFRLhgR(D2)-cpYFP-LhgR蛋白与sfLHGFRLhgR(D2)-cpYFP-LhgR(D2)蛋白。其中,sfLHGFRX/Y蛋白的纯化结果如附图1所示。
使用检测缓冲液(100mM HEPES,100mM KCl,pH 7.4)稀释纯化后的各传感器变体蛋白至4/3μM,使用检测缓冲液(100mM HEPES,100mM KCl,pH 7.4)配制梯度浓度的L-2-HG,在避光条件下,将纯化的L-2-HG生物传感器与L-2-HG溶液以3:1的体积比混合,取100μL混合物转移至黑色平底96孔板中,于珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪下读取cpYFP的荧光发射强度。仪器参数设置为:激发波长分别为488nm与405nm,发射波长为528nm。在每个发射波长下扣除不含L-2-HG生物传感器的背景荧光强度。以扣除背景后的488nm激发下测定的荧光强度与405nm激发下测定的荧光强度的比值(F488 nm/F405 nm)为纵坐标,以L-2-HG浓度为横坐标,拟合获得不同生物传感器对L-2-HG的剂量-响应曲线,计算各传感器对L-2-HG的响应幅度ΔRmax(即最大比值变化)。如附图2所示,将cpYFP插入至LhgR内氨基酸位点为137D/138F或231E/232L所获得传感器变体的ΔRmax较高,分别为133.26±5.62%与131.71±0.86%。
其中,上述步骤(1)中所述的LB培养基配方是:蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L;NaCl10g/L,pH 7.0;121℃灭菌20分钟。
上述步骤(2)中所述的基于T5核酸外切酶的DNA组装方法中15μL连接体系的配方为:4μL 5×等温反应缓冲液(0.5M Tris-HCl,0.05M MgCl2,0.05M二硫苏糖醇),0.004μL10U/μL T5核酸外切酶,11μL ddH2O。
上述步骤(3)中所述的结合缓冲液配方为:20mM Na2HPO4,20mM咪唑,500mM NaCl,调整pH为7.4;洗脱缓冲液配方为:20mM Na2HPO4,500mM咪唑,500mM NaCl,调整pH为7.4。
实施例2:高检测范围的L-2-HG生物传感器(sfLHGFRH)的构建
(1)sfLHGFRH-1的检测性质分析
上述实施例1中发现,cpYFP插入至LhgR内氨基酸位点为137D/138F所获得传感器变体的ΔRmax较高,为133.26±5.62%。如附图3所示,进一步分析其对L-2-HG的剂量-响应曲线发现,其对L-2-HG的Kd值为234.11±13.74μM,适用于较高水平的体内L-2-HG检测,将其命名为sfLHGFRH-1。
(2)以截短linker与去除LhgR DNA结合域的策略实现sfLHGFRH-1响应幅度的优化(获得sfLHGFRH-2)
在实施例1中所构建的编码sfLHGFRH-1核酸序列的重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-1中,cpYFP以N-末端linker为“丝氨酸-丙氨酸-甘氨酸”、C-末端linker为“甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸”,插入至LhgR内氨基酸位点137D/138F处,拟通过依次截短cpYFP的N-、C-末端linker提高传感器对L-2-HG的响应幅度。构建方法如下:以重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-1为模板,反向PCR扩增获得在137D与138F位点处断裂的pETDuet-LhgR线性化质粒骨架;以重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-1为模板,PCR扩增获得在N末端及C末端含不同长度linker的cpYFP突变体;使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法连接cpYFP突变体片段与线性化pETDuet-LhgR质粒,得到编码含不同长度linker的传感器变体的重组质粒。
以上述编码含不同长度linker的传感器变体的重组质粒为模板,PCR扩增得到去除LhgR DNA结合结构域的目的基因片段。按照实施例1中所述方法,将目的基因片段插入pETDuet-1载体中,得到编码含去除DNA结构域且含不同长度linker的传感器变体的重组质粒。
按照实施例1中所述方法,诱导表达并分离纯化得到上述突变体蛋白,使用检测缓冲液(100mM HEPES,100mM KCl,pH 7.4)稀释纯化后的各突变体,并与梯度浓度的L-2-HG在避光条件下以3:1的体积比混合。取100μL混合物转移至黑色平底96孔板后,使用珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪测定各突变体对L-2-HG的响应幅度ΔRmax(即最大比值变化)。如附图4所示,在cpYFP的N-末端截短1个氨基酸,同时去除LhgR的DNA结合结构域,所获得传感器变体具备较高的ΔRmax,为349.16±11.94%,Kd为1128.46±101.53μM,将其命名为sfLHGFRH-2。
通过反向PCR扩增在LhgR中137D与138F位点断裂的pETDuet-LhgR线性化质粒骨架,引物设计如下:
反向PCR上游引物:5’-GTCGCTGCGTTTGTCG-3’;
反向PCR下游引物:5’-TTCGCCACTGCCTCGG-3’。
通过PCR扩增含不同长度linker的cpYFP片段,引物设计如下:
cpYFP-0N:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACTCTGCAGGCTACAACAGCG-3’;
cpYFP-1N:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCTACAACAGCGACA-3’;
cpYFP-2N:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGGCTACAACAGCGACAACG-3’;
cpYFP-3N:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACTACAACAGCGACAACGTCT-3’;
cpYFP-0C:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCGTTGTACTCC-3’;
cpYFP-1C:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAGCCACCGTTGTACTCCAGC-3’;
cpYFP-3C:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACCGTTGTACTCCAGCTTG-3’;
cpYFP-4C:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAGTTGTACTCCAGCTTGTGC-3’。
通过PCR扩增去除DNA结合结构域的生物传感器突变体,引物设计如下:
上游引物:5’-ATCACCACAGCCAGGATCCGATGCTGGTGCAGATGTTCG-3’;
下游引物:5’-CATTATGCGGCCGCAAGCTTTTAGTCGAGTGCAGGTAGT-3’。
(3)以引入超折叠位点的策略实现sfLHGFRH-2荧光强度的优化(获得sfLHGFRH-3)
基于环状重排荧光蛋白的生物传感器由于破坏荧光蛋白固有结构,导致荧光亮度通常较弱,且传感器成熟时间较长、需要较低的折叠温度。为提高sfLHGFRH-2的荧光强度,一方面将sfLHGFRH-2中的cpYFP替换为不同荧光蛋白(cpBFP、cpTFP、cpGFP、cpEGFP、cpSFGFP、cpVenus、cpYFP、cpmOrange、cpmApple、Cherry、cpmKate等),尝试以直接改变荧光蛋白类型的方式提高sfLHGFRH-2的荧光强度;另一方面在cpYFP中引入来自superfolderGFP的四个超折叠位点(S30R、Y39N、N105T及Y145F)(所获得的cpYFP命名为cpSFYFP),尝试以促进cpYFP生色团成熟的方式提高传感器的荧光强度。
cpBFP、cpTFP、cpGFP、cpEGFP、cpSFGFP、cpVenus、cpYFP、cpmOrange、cpmApple、Cherry、cpmKate的编码基因由通用生物(安徽)股份有限公司合成,分别作为模板,PCR扩增获得不同荧光蛋白的基因片段;以重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-2为模板,反向PCR扩增获得在137D与138F位点处断裂的pETDuet-LhgR线性化质粒骨架;使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法连接获得编码不同荧光蛋白替换突变体的重组质粒。
以重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-2为模板,PCR扩增分别获得cpSFYFP的上片段与下片段,并通过重组PCR连接cpSFYFP的上、下片段;以重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-2为模板,反向PCR扩增线性化的质粒骨架;使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法连接重组cpSFYFP片段与线性化的质粒骨架,获得编码含4个超折叠位点的传感器变体的重组质粒。
按照实施例1中所述方法,诱导表达并分离纯化得到上述突变体蛋白,使用检测缓冲液(100mM HEPES,100mM KCl,pH 7.4)稀释纯化后的各突变体,并与梯度浓度的L-2-HG在避光条件下以3:1的体积比混合。取100μL混合物转移至黑色平底96孔板后,使用珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪测定各突变体响应于L-2-HG的荧光强度变化与响应幅度ΔRmax(即最大比值变化)。将sfLHGFRH-2中的cpYFP替换为cpGFP、cpEGFP、cpSFYFP或cpmKate虽可提高传感器的荧光强度,然而其ΔRmax均显著降低;而在sfLHGFRH-2中替换为cpSFYFP的传感器变体仍保留较高的ΔRmax,为237.53±6.61%,将其命名为sfLHGFRH-3(附图5)。与sfLHGFRH-2相比,sfLHGFRH-3在488nm激发下,不结合L-2-HG的荧光强度增加5.32倍,饱和L-2-HG的荧光强度增加7.76倍;在405nm激发下,不结合L-2-HG的荧光强度增加1.28倍,饱和L-2-HG的荧光强度增加2.49倍(附图6)。
通过PCR扩增不同荧光蛋白的基因片段,引物设计如下:
cpBFP上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCAACGTTTACATCAAG-3’;
cpBFP下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCATTATATTCCAGTTT-3’;
cpTFP上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCAACGTGTATATCATG-3’;
cpTFP下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCGTTATATTCCAGTTT-3’;
cpGFP上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCAACGTGTATATCAAG-3’;
cpGFP下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCATTATATTCCAGTTT-3’;
cpEGFP上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCAACGTTTACATCAAG-3’;
cpEGFP下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCGTTATATTCCAGTTT-3’;
cpSFGFP上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCAGTCATAACGTGTA-3’;
cpSFGFP下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCAAAGTTATATTCCAG-3’;
cpVenus上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCTACAACAGTGATAAC-3’;
cpVenus下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCATTATATTCCAGTTT-3’;
cpmOrange上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCGTGAGTGAACGTATG-3’;
cpmOrange下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCTGCTTCCCAACCCAT-3’;
cpmApple上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCGTGAGCGAACGTATG-3’;
cpmApple下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCGGCTTCCCAACCCAT-3’;
mCherry上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCATGGTTAGTAAGGGT-3’;
mCherry下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCTTTATACAGTTCATC-3’;
cpmKate上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCATGGGTGGCCGTAGTA-3’;
cpmKate下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCTTTTTTACTGCGATA-3’;
反向PCR上游引物:5’-GTCGCTGCGTTTGTCG-3’;
反向PCR下游引物:5’-TTCGCCACTGCCTCGG-3’。
通过PCR扩增在cpYFP中引入超折叠位点,引物设计如下:
cpSFYFP上片段上游引物:5’-ACGGCCACAAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTG-3’;
cpSFYFP上片段下游引物:5’-ACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGGTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGA-3’;
cpSFYFP下片段上游引物:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACGCAGGCTTCAACAGCGACAACGTCTATAT-3’;
cpSFYFP下片段下游引物:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAACAGCCACCGTTGTACTCCA-3’;
cpSFYFP反向PCR上游引物:5’-CACGCTGAACTTGTGGC-3’;
cpSFYFP反向PCR下游引物:5’-TACAAGACCCGCGCCGA-3’。
(4)以linker随机突变结合高通量筛选的策略实现sfLHGFRH-3进一步优化(获得sfLHGFRH)
进一步以sfLHGFRH-3为基础,通过结合随机突变与高通量筛选实现传感器检测性能的进一步优化。以重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-3为模板,使用简并引物(如0N-mutation与0C-mutation)PCR扩增含随机linker的cpSFYFP片段;以重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-3为模板,反向PCR扩增获得在137D与138F位点处断裂的pETDuet-LhgR线性化质粒骨架;使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法连接重组含随机linker的cpSFYFP片段与线性化的质粒骨架,获得编码含随机linker的传感器变体的重组质粒。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)表达菌株,于添加100mg L-1氨苄青霉素的LB平板中培养;从平板中挑取明亮荧光的单菌落,在1mM IPTG存在的条件下过夜诱导蛋白表达;取15mL菌液,在4℃、6,000rpm离心10min,收集菌体,使用2.5mL检测缓冲液(100mM HEPES,100mM KCl,pH 7.4)重悬,转移至48孔深孔板中,加入终浓度为1mM的PMSF;使用Scientz-48TD多通道超声波破碎仪破碎菌体,取1mL破碎液在4℃、13,000rpm离心5min,收集上清液;上清液分别与0mM、1mM L-2-HG混合,结合荧光酶标仪,分析各随机突变体对1mM L-2-HG的响应,从中筛选具备高响应幅度与荧光强度的随机突变体,测序获得传感器序列。如附图7所示,在筛选的736个随机突变体中,169个突变体的响应幅度明显提高。如附图8所示,cpSFYFP以N-末端linker为“脯氨酸-天冬氨酸”、C-末端linker为“亮氨酸-丝氨酸-组氨酸”,插入至LhgR内氨基酸位点137D/138F处所形成的传感器变体具备最高的ΔRmax,为909.23±16.19%,其Kd值为181.77±17.41μM,检测范围为0.56-70,000μM,将其命名为sfLHGFRH,应用于后续L-2-HG的体内检测。
通过PCR扩增获得含随机linker的sfLHGFRH-3突变体,引物设计如下:
0N-mutation:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACNNBNNBNNBTTCAACAGCGACAACGTCTA-3’;
1N-mutation:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACNNBNNBTTCAACAGCGACAACGTCTA-3’;
2N-mutation:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACNNBTTCAACAGCGACAACGTCTA-3’;
3N-mutation:5’-TGCTCGACAAACGCAGCGACTTCAACAGCGACAACGTCTA-3’;
0C-mutation:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAVNNVNNVNNGTTGTACTCCAGCTTGTGC-3’;
1C-mutation:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAVNNVNNGTTGTACTCCAGCTTGTGC-3’;
2C-mutation:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAVNNGTTGTACTCCAGCTTGTGC-3’;
3C-mutation:5’-GCTGCCGAGGCAGTGGCGAAGTTGTACTCCAGCTTGTGC-3’;
反向PCR上游引物:5’-GTCGCTGCGTTTGTCG-3’;
反向PCR下游引物:5’-TTCGCCACTGCCTCGG-3’。
实施例3:低检测范围的L-2-HG生物传感器(sfLHGFRL)的构建
(1)sfLHGFRL-1的检测性质分析
上述实施例1中发现,cpYFP插入至LhgR内氨基酸位点为231E/232L所获得传感器变体的ΔRmax较高,为131.71±0.86%。如附图9所示,进一步分析其对L-2-HG的剂量-响应曲线发现,其对L-2-HG的Kd值为16.09±2.27μM,适用于较低水平的体外L-2-HG检测,将其命名为sfLHGFRL-1。
(2)以去除LhgR DNA结合域及引入超折叠位点的策略实现sfLHGFRL-1的响应幅度与荧光强度的优化(获得sfLHGFRL-2与sfLHGFRL-3)
按照实施例2中所述方法,以实施例1中所构建的编码sfLHGFRL-1核酸序列的重组质粒pETDuet-sfLHGFRL-1模板,PCR扩增得到去除LhgR DNA结合结构域的目的基因片段。按照实施例1中所述方法,将目的基因片段插入pETDuet-1载体中,得到编码含去除DNA结构域的传感器变体的重组质粒。按照实施例1中所述方法,诱导表达并分离纯化得到上述突变体蛋白sfLHGFRL-2,进一步使用珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪测定sfLHGFRL-2对L-2-HG的剂量-响应曲线。如附图10所示,传感器变体sfLHGFRL-2对L-2-HG的ΔRmax为20.26±6.00%,Kd为5.80±2.27μM。
进一步以重组质粒pETDuet-sfLHGFRL-2模板,反向PCR扩增获得在231E与232L位点处断裂的pETDuet-LhgR线性化质粒骨架;以重组质粒pETDuet-sfLHGFRH-3为模板,PCR扩增cpSFYFP片段;使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法连接重组cpSFYFP片段与线性化的质粒骨架,获得编码sfLHGFRL-3的重组质粒。按照实施例1中所述方法,诱导表达并分离纯化得到上述突变体蛋白sfLHGFRL-3,进一步使用珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪测定sfLHGFRL-3对L-2-HG的剂量-响应曲线。如附图11所示,传感器变体sfLHGFRL-3对L-2-HG的ΔRmax为82.47±5.83%,Kd为2.48±0.08μM。此外,与sfLHGFRL-2相比,sfLHGFRL-3在488nm激发下,不结合L-2-HG的荧光强度增加6.38倍,饱和L-2-HG的荧光强度增加5.76倍;在405nm激发下,不结合L-2-HG的荧光强度增加1.97倍,饱和L-2-HG的荧光强度增加1.29倍(附图12)。
通过反向PCR扩增去除DNA结合结构域的生物传感器突变体,引物设计如下:
反向PCR上游引物:5’-CATCGGATCCTGGCTGTG-3’;
反向PCR下游引物:5’-CAAACGCCTGAAAATAGA-3’。
通过PCR扩增去除DNA结合结构域的生物传感器突变体,引物设计如下:
上游引物:5’-ACCACAGCCAGGATCCGATGCTGGTGCAGATGTTCGAAA-3’;
下游引物:5’-ATTCTATTTTCAGGCGTTTGGCAGAGGCGCGCAGATG-3’。
通过反向PCR扩增在LhgR中231E与232L位点断裂的pETDuet-LhgR线性化质粒骨架,引物设计如下:
反向PCR上游引物:5’-GCCTGCAGATTCTATTTT-3’;
反向PCR下游引物:5’-GGTGGCTGTCTACCTGCA-3’。
通过PCR扩增获得cpSFYFP片段,引物设计如下:
上游引物:5’-TGAAAATAGAATCTGCAGGCTTCAACAGCGACAACGTCT-3’;
下游引物:5’-AGTGCAGGTAGACAGCCACCGTTGTACTCCAGCTTGT-3’。
(3)以linker随机突变结合高通量筛选的策略实现sfLHGFRL-3进一步优化(获得sfLHGFRL)
按照实施例2中所述方法,进一步以sfLHGFRL-3为基础,通过结合随机突变与高通量筛选实现传感器检测性能的进一步优化。以重组质粒pETDuet-sfLHGFRL-3为模板,使用简并引物(如0N-mutation与0C-mutation)PCR扩增含随机linker的cpSFYFP片段;以重组质粒pETDuet-sfLHGFRL-3为模板,反向PCR扩增获得在231E与232L位点处断裂的pETDuet-LhgR线性化质粒骨架;使用基于T5核酸外切酶的DNA组装方法连接重组含随机linker的cpSFYFP片段与线性化的质粒骨架,获得编码含随机linker的传感器变体的重组质粒。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)表达菌株,于添加100mg L-1氨苄青霉素的LB平板中培养;从平板中挑取明亮荧光的单菌落,在1mM IPTG存在的条件下过夜诱导蛋白表达;取15mL菌液,在4℃、6,000rpm离心10min,收集菌体,使用2.5mL检测缓冲液(100mM HEPES,100mMKCl,pH 7.4)重悬,转移至48孔深孔板中,加入终浓度为1mM的PMSF;使用Scientz-48TD多通道超声波破碎仪破碎菌体,取1mL破碎液在4℃、13,000rpm离心5min,收集上清液;上清液分别与0mM、100μM L-2-HG混合,结合荧光酶标仪,分析各随机突变体对100μML-2-HG的响应,从中筛选具备高响应幅度与荧光强度的随机突变体,测序获得传感器序列。如附图13所示,在筛选的276个随机突变体中,28个突变体的响应幅度明显提高。如附图14所示,cpSFYFP以N-末端linker为“丝氨酸-丙氨酸-甘氨酸”、C-末端linker为“亮氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸”,插入至LhgR内氨基酸位点232E/232L处所形成的传感器变体具备最高的ΔRmax,为623.01±8.52%,其Kd值为9.94±0.46μM,检测范围为0.14-100μM,检测下限低至0.14μM,将其命名为sfLHGFRL,应用于后续L-2-HG的体内检测。
通过PCR扩增获得含随机linker的sfLHGFRL-3突变体,引物设计如下:
0N-mutation:5’-CCAAACGCCTGAAAATAGAANNBNNBNNBTTCAACAGCGACAACGTCTA-3’;
1N-mutation:5’-CCAAACGCCTGAAAATAGAANNBNNBTTCAACAGCGACAACGTCTA-3’;
2N-mutation:5’-CCAAACGCCTGAAAATAGAANNBTTCAACAGCGACAACGTCTA-3’;
3N-mutation:5’-CCAAACGCCTGAAAATAGAATTCAACAGCGACAACGTCTA-3’;
0C-mutation:5’-TTTTAGTCGAGTGCAGGTAGVNNVNNVNNGTTGTACTCCAGCTTGTG-3’;
1C-mutation:5’-TTTTAGTCGAGTGCAGGTAGVNNVNNGTTGTACTCCAGCTTGTG-3’;
2C-mutation:5’-TTTTAGTCGAGTGCAGGTAGVNNGTTGTACTCCAGCTTGTG-3’;
3C-mutation:5’-TTTTAGTCGAGTGCAGGTAGGTTGTACTCCAGCTTGTG-3’;
实施例4:sfLHGFRL在人体血清、尿液样品中L-2-HG定量检测中的应用
(1)人体血清和尿液样品制备
按照伦理规范,通过静脉采血法收集健康成年人血液于促凝管中,室温放置2h后,在4℃、3,000rpm离心10min,上清经0.22μm滤膜过滤后获得血清,储存于-20℃备用。直接采集健康成年人尿液,经0.22μm滤膜过滤后,储存于-20℃备用。
(2)sfLHGFRL与LC-MS/MS的检测一致性分析
在上述血清和尿液样品中加入梯度浓度L-2-HG(1、3、5、10、20、30、40、50、60、70μM),使用检测缓冲液(100mM HEPES,100mM KCl,pH 7.4)稀释纯化后sfLHGFRL至4/3μM,在避光条件下,将纯化的sfLHGFRL与上述血清、尿液样品以3:1的体积比混合,取100μL混合物转移至黑色平底96孔板中,于珀金埃尔默Ensight荧光酶标仪下读取sfLHGFRL的荧光发射强度。仪器参数设置为:激发波长分别为488nm与405nm,发射波长为528nm。在每个发射波长下扣除不含L-2-HG生物传感器的背景荧光强度。将扣除背景后的488nm激发下测定的荧光强度与405nm激发下测定的荧光强度的比值(F488 nm/F405 nm)代入上述实施例3中所测得sfLHGFRL对L-2-HG的剂量-响应曲线中,获得不同生物样品中L-2-HG的具体浓度。另取上述相同样品,以LC-MS/MS分析确定上述样品中L-2-HG的实际浓度。sfLHGFRL与LC-MS/MS对人体血清、尿液中L-2-HG检测结果的比较如附图15与附图16所示,sfLHGFRL的测定结果与当前标准L-2-HG检测方法LC-MS/MS高度一致,表明其应用于人体体液L-2-HG定量检测的准确性。
实施例5:sfLHGFRH在哺乳动物细胞内L-2-HG定量检测中的应用
(1)人胚胎肾细胞HEK293FT中sfLHGFRH的功能鉴定
将sfLHGFRH的核酸序列由通用生物系统(安徽)有限公司进行哺乳动物密码子优化并全基因合成,在起始密码子前加入kozark序列,5’-GCCACC-3’,连接于pcDNA3.1(+)质粒,并保存于Escherichia coli Top10菌株。提取该菌株中重组质粒pcDNA3.1-sfLHGFRH,并转染至HEK293FT细胞中。在转染26h后,使用补加20mM HEPES的1×Hank’s平衡盐缓冲液清洗细胞两遍,之后将细胞置于Zeiss 900激光共聚焦下以30s的时间间隔进行荧光成像。仪器参数设置为:激发波长为405nm与488nm,发射波段为497至617nm。首先在成像培养基中添加80μM洋地黄皂苷处理细胞,使细胞渗透化,5min后加入5mM L-2-HG,并连续成像表达于HEK293FT细胞内的sfLHGFRH对L-2-HG的响应。如附图17所示,sfLHGFRH可迅速且实时响应于L-2-HG的添加,证明其可用于哺乳动物细胞中L-2-HG的实时检测。
(2)sfLHGFRH在不同亚细胞区室L-2-HG定量检测中的应用
为分析不同亚细胞区室中L-2-HG的代谢途径与转运机制,分别将出核序列、线粒体定位序列、细胞核定位序列融合至sfLHGFRH的N-末端、N-末端、C-末端。如附图18a所示,与sfLHGFRH相比,分别融合不同定位序列的sfLHGFRH成功定位于细胞质基质、线粒体及细胞核中。进一步如上所述,在表达不同亚细胞区室定位的sfLHGFRH的HEK293FT中外源添加5mML-2-HG,并使用激光共聚焦显微镜成像L-2-HG添加前后,sfLHGFRH的荧光比值变化。如附图18b所示,分别定位于细胞质基质、线粒体及细胞核中的sfLHGFRH均可以同等的响应幅度应答于外源5mM L-2-HG的添加,证明其可用于哺乳动物细胞中L-2-HG的原位检测。
本发明中所涉及的核苷酸/氨基酸序列
sfLHGFRH的氨基酸序列:
MLVQMFEMRLWIETQAAAIAARRRDEHDLANMAQALQEMLDKRSDPDFNSDNVYIMADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSFQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYNVDGGSGGTGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKLICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGLKCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIGFKEDGNILGHKLEYNLSHFATASAADVAFHRAIAEASKNDYFVAFHDFLGGQLANARRTAWENSAAHSVGGSAEANREHQALYQAIADGDRQRAAACAEAHLRASAKRLKIELPALD(SEQ ID NO.1)
sfLHGFRL的氨基酸序列:
MLVQMFEMRLWIETQAAAIAARRRDEHDLANMAQALQEMLDKRSDFATASAADVAFHRAIAEASKNDYFVAFHDFLGGQLANARRTAWENSAAHSVGGSAEANREHQALYQAIADGDRQRAAACAEAHLRASAKRLKIESAGFNSDNVYIMADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSFQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYNVDGGSGGTGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKLICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGLKCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIGFKEDGNILGHKLEYNLFVLPALD(SEQ ID NO.2)
sfLHGFRH的核酸序列:
ATGCTGGTGCAGATGTTCGAAATGCGCCTGTGGATCGAAACCCAGGCAGCGGCCATCGCCGCGCGCCGACGTGACGAACACGATCTGGCGAACATGGCCCAGGCCCTGCAGGAGATGCTCGACAAACGCAGCGACCCTGATTTCAACAGCGACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACGTCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTTCCAGTCCGTCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAACGTGGATGGCGGTAGCGGTGGCACCGGCAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTCGGCTACGGCCTGAAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCACCTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGGCTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACCTCAGCCATTTCGCCACTGCCTCGGCAGCTGATGTGGCCTTCCACAGGGCCATCGCCGAAGCCAGCAAGAACGATTACTTCGTGGCCTTCCATGACTTTCTCGGCGGCCAGTTGGCCAATGCACGGCGCACCGCCTGGGAAAACTCCGCAGCCCATTCGGTGGGCGGCTCGGCCGAAGCCAATCGCGAACACCAAGCGCTTTATCAGGCCATCGCCGACGGTGACCGCCAAAGGGCTGCGGCGTGTGCCGAAGCGCATCTGCGCGCCTCTGCCAAACGCCTGAAAATAGAACTACCTGCACTCGACTAA(SEQ ID NO.3)
sfLHGFRL的核酸序列:
ATGCTGGTGCAGATGTTCGAAATGCGCCTGTGGATCGAAACCCAGGCAGCGGCCATCGCCGCGCGCCGACGTGACGAACACGATCTGGCGAACATGGCCCAGGCCCTGCAGGAGATGCTCGACAAACGCAGCGACTTCGCCACTGCCTCGGCAGCTGATGTGGCCTTCCACAGGGCCATCGCCGAAGCCAGCAAGAACGATTACTTCGTGGCCTTCCATGACTTTCTCGGCGGCCAGTTGGCCAATGCACGGCGCACCGCCTGGGAAAACTCCGCAGCCCATTCGGTGGGCGGCTCGGCCGAAGCCAATCGCGAACACCAAGCGCTTTATCAGGCCATCGCCGACGGTGACCGCCAAAGGGCTGCGGCGTGTGCCGAAGCGCATCTGCGCGCCTCTGCCAAACGCCTGAAAATAGAATCTGCAGGCTTCAACAGCGACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACGTCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTTCCAGTCCGTCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAACGTGGATGGCGGTAGCGGTGGCACCGGCAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTCGGCTACGGCCTGAAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCACCTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGGCTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTTGTTCGTCCTACCTGCACTCGACTAA(SEQ ID NO.4)
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白由L-2-HG特异性转录调控因子与环状重排荧光蛋白组成;
其中,所述L-2-HG特异性转录调控因子包括但不限于来源恶臭假单胞菌W619的特异性转录调控因子LhgR;
所述环状重排荧光蛋白包括但不限于环状重排青色荧光蛋白、环状重排绿色荧光蛋白、环状重排黄色荧光蛋白、环状重排红色荧光蛋白。
2.如权利要求1所述融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白选自:
(a1)SEQ ID NO.1-2任一项所示氨基酸序列组成的蛋白质;
(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同或相近功能的蛋白质;
(a3)与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到40%或40%以上并且具有与(a1)或(a2)所示的蛋白质具有相同或相近功能的蛋白质。
3.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1或2所述融合蛋白;
进一步的,所述核酸分子具有(b1)-(b4)中任一所述核苷酸序列:
(b1)如SEQ ID NO.3-4任一项所示的核苷酸序列;
(b2)如(b1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列;
(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有40%或40%以上的同一性,且编码所述融合蛋白的核酸分子;
(b4)在严格条件下能够与如(b1)-(b3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同功能融合蛋白的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体至少包含权利要求3所述核酸分子。
5.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述重组表达载体或者能够表达权利要求1-2任一项所述融合蛋白。
6.权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述重组表达载体和/或权利要求5所述宿主细胞在制备检测L-2-HG的生物传感器中的应用。
7.一种检测L-2-HG的生物传感器,其特征在于,所述生物传感器至少包含权利要求1或2所述融合蛋白。
8.如权利要求7所述生物传感器,其特征在于,所述生物传感器还包含其他用于L-2-HG检测的试剂、装置和/或设备;
进一步的,所述试剂包含检测缓冲液。
9.一种体外检测L-2-HG的方法,其特征在于,所述方法至少包括:将待测样品与所述权利要求7或8所述生物传感器进行孵育,根据L-2-HG生物传感器荧光信号变化,分析待测样品中L-2-HG的浓度或有无;
所述待测样品可以为任意含有L-2-HG或怀疑含有L-2-HG的生物样品或环境样品,所述生物样品包括但不限于受试者血清、尿液、细胞培养基和细胞裂解物;所述受试者可以为人或非人动物,优选为人。
10.一种细胞内检测L-2-HG的方法,其特征在于,所述方法至少包括:诱导权利要求7所述L-2-HG生物传感器在细胞内表达,根据L-2-HG生物传感器荧光信号变化,分析细胞内L-2-HG的浓度或有无;
进一步的,所述细胞为哺乳细胞;更进一步的,所述哺乳细胞包括但不限于人胚胎肾细胞HEK293FT、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7。
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CN202311497918.7A CN117551208A (zh) | 2023-11-10 | 2023-11-10 | 一种基于环状重排荧光蛋白的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用 |
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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CN202311497918.7A Pending CN117551208A (zh) | 2023-11-10 | 2023-11-10 | 一种基于环状重排荧光蛋白的l-2-羟基戊二酸生物传感器及其应用 |
Country Status (1)
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CN (1) | CN117551208A (zh) |
-
2023
- 2023-11-10 CN CN202311497918.7A patent/CN117551208A/zh active Pending
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