CN117535146A - 超声振荡装置、细胞脱壁系统和细胞脱壁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超声振荡装置、细胞脱壁系统和细胞脱壁方法。超声振荡装置包括：振荡槽，所述振荡槽用于装载超声波传导介质；超声换能器，所述超声换能器用于对所述振荡槽内的所述超声波传导介质进行超声振荡；培养瓶，所述培养瓶用于装载细胞溶液；驱动机构，所述驱动机构用于移动所述培养瓶进入所述振荡槽内以及调节所述培养瓶在所述振荡槽内的位置。通过驱动机构将培养瓶移动至振荡槽的合适位置，利用超声换能器对振荡槽内的超声波传导介质进行超声振荡，实现细胞脱壁，无需采用胰蛋白酶，避免对细胞造成损伤，同时脱壁过程的步骤较少，自动化程度较高，提高了脱壁效率。

Description

超声振荡装置、细胞脱壁系统和细胞脱壁方法

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域，具体地讲，涉及一种超声振荡装置、细胞脱壁系统和细胞脱壁方法。

背景技术

细胞培养技术是生物工程研究及其应用的基础，该技术能够规模生产均匀生长的细胞。其主要过程包括接种、培养、分离和收集细胞，为提升细胞培养效率目前已有大量的相关环节研究。而这其中，细胞脱壁过程对培养效率的影响最大。

解决细胞脱壁问题的主要技术方案是胰蛋白酶消化方案，胰蛋白酶消化法存在两个主要问题：一是对与细胞活性显著相关的细胞膜蛋白造成不可逆损伤，二是操作流程繁琐，自动化脱壁实现复杂。长时间的胰蛋白酶消化延迟了细胞的第一次分裂，高浓度的胰蛋白酶降低了细胞的活力。此外，暴露于胰蛋白酶中的细胞的蛋白质表达可能发生改变，有研究表明与代谢和生长相关的蛋白下调，而与凋亡相关的蛋白上调。并且使用胰蛋白酶进行细胞脱壁的过程复杂耗时，需要分解成12步：打开培养瓶盖子，倒出原液，加入生理盐水冲洗，倒出生理盐水，加入胰蛋白酶，放入培养箱，拿出拍打晃动，加入中和液，吹打，倒入离心管，离心，倒出上清液，才能得到纯净细胞。流程较为繁琐，实现自动化操作负责困难。

发明内容

本申请解决的技术问题是：如何提高细胞脱壁的效率和避免脱壁过程对细胞造成损伤。

本申请公开了一种超声振荡装置，所述超声振荡装置包括：

振荡槽，所述振荡槽用于装载超声波传导介质；

超声换能器，所述超声换能器用于对所述振荡槽内的所述超声波传导介质进行超声振荡；

培养瓶，所述培养瓶用于装载细胞溶液；

驱动机构，所述驱动机构用于移动所述培养瓶进入所述振荡槽内以及调节所述培养瓶在所述振荡槽内的位置。

优选地，所述振荡槽的底部抵接于所述超声换能器。

优选地，所述驱动机构包括直线滑台、滑块、步进电机和夹持器，所述滑块与所述直线滑台滑动连接，所述夹持器固定于所述滑块上，且所述夹持器用于夹持所述培养瓶，所述步进电机用于驱动所述滑块滑动。

优选地，所述超声换能器的数量为多个，多个所述超声换能器呈阵列分布。

本申请还公开了一种细胞脱壁系统，所述细胞脱壁系统包括信号发生单元和超声振荡装置，所述信号发生单元用于产生振荡信号并将所述振荡信号输入至所述超声换能器，以使所述超声换能器产生超声波。

优选地，所述细胞脱壁系统还包括信号检测单元，所述信号检测单元用于检测所述振荡信号的波形。

优选地，所述细胞脱壁系统还包括移动控制单元，所述移动控制单元用于产生控制信号并将所述控制信号发送至步进电机，所述控制信号用于控制所述步进电机的工作过程。

优选地，所述信号发生单元包括信号发生器和功率放大器，所述信号发生器用于产生振荡信号，所述功率放大器用于对所述振荡信号进行放大。

本申请还公开了一种采用上述细胞脱壁系统的细胞脱壁方法，所述细胞脱壁方法包括：

利用驱动机构将装载有细胞溶液的培养瓶移动至振荡槽的预定位置；

利用信号发生单元产生参数达到预定条件的振荡信号，并将振荡信号输入至超声换能器，对细胞溶液进行超声振荡；

在超声振荡完成之后，收集脱落的细胞。

优选地，所述参数包括电压、频率和时长。

本发明公开的一种超声振荡装置、细胞脱壁系统和细胞脱壁方法，具有如下技术效果：

通过驱动机构将培养瓶移动至振荡槽的合适位置，利用超声换能器对振荡槽内的超声波传导介质进行超声振荡，实现细胞脱壁，无需采用胰蛋白酶，避免对细胞造成损伤，同时脱壁过程的步骤较少，自动化程度较高，提高了脱壁效率。

附图说明

图1为本发明的实施例一的超声振荡装置的结构示意图；

图2为本发明的实施例二的细胞脱壁系统的原理框图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在详细描述本申请的各个实施例之前，首先简单描述本申请的技术构思：现有技术中采用胰蛋白酶消化法进行细胞脱壁时会对细胞造成损伤，同时细胞脱壁过程步骤繁杂。为此，本申请提供了一种超声振荡装置，通过驱动机构将培养瓶移动至振荡槽的合适位置，利用超声换能器对振荡槽内的超声波传导介质进行超声振荡，实现细胞脱壁，无需采用胰蛋白酶，避免对细胞造成损伤，同时脱壁过程的步骤较少，自动化程度较高，提高了脱壁效率。

具体来说，如图1所示，本实施例一的超声振荡装置包括振荡槽10、超声换能器20、培养瓶30和驱动机构40。振荡槽10用于装载超声波传导介质，超声换能器20用于对振荡槽10内的超声波传导介质进行超声振荡，培养瓶30用于装载细胞溶液，驱动机构40用于移动培养瓶30进入振荡槽10内以及调节培养瓶30在振荡槽10内的位置。

示例性地，振荡槽10为具有敞口的长方体槽体，振荡槽10的底部抵接于超声换能器20上，振荡槽10内装载的超声波传导介质可以为去离子水。超声换能器20的数量为多个，多个超声换能器20呈阵列分布。示例性地，本实施例一的超声换能器20的数量为4个，4个超声换能器20呈2行2列分布。驱动机构40包括直线滑台41、滑块(图未示)、步进电机42和夹持器43，滑块与直线滑台41滑动连接，夹持器43固定于滑块上，且夹持器43用于夹持培养瓶30，步进电机42用于驱动滑块滑动。示例性地，直线滑台41竖直设置，夹持器43和培养瓶30位于振荡槽10上方，通过步进电机42驱动滑块，从而上下移动夹持器43和培养瓶30，使得培养瓶30处于振荡槽10内的合适位置。其中，步进电机42驱动滑块移动的原理为本领域技术人员的熟知技术，在此不进行赘述。

进一步地，如图2所示，本实施例二的细胞脱壁系统包括信号发生单元200以及实施例一的超声振荡装置100。信号发生单元200用于产生振荡信号并将振荡信号输入至超声换能器20，以使超声换能器20产生超声波。示例性地，信号发生单元200包括信号发生器50和功率放大器60，信号发生器50用于产生振荡信号，功率放大器60用于对振荡信号进行放大。

示例性地，细胞脱壁系统还包括信号检测单元300，信号检测单元300用于检测振荡信号的波形。示例性地，信号检测单元300采用示波器，通过示波器来验证振荡信号的波形是否符合要求。

示例性地，细胞脱壁系统还包括移动控制单元400，移动控制单元400用于产生控制信号并将控制信号发送至步进电机42，控制信号用于控制步进电机42的工作过程，使得培养瓶30到达振荡槽10内的合适位置。

进一步地，本实施例三的细胞脱壁方法包括如下步骤：

步骤S10、利用驱动机构将装载有细胞溶液的培养瓶30移动至振荡槽10的预定位置；

步骤S20、利用信号发生单元200产生参数达到预定条件的振荡信号，并将振荡信号输入至超声换能器20，对细胞溶液进行超声振荡；

步骤S30、在超声振荡完成之后，收集脱落的细胞。

其中，振荡信号的相关参数，如信号幅值、频率和时长均对细胞脱壁效果有影响。另外，培养瓶30在振荡槽10内的位置，即培养瓶30与超声换能器20之间的距离d，以及培养瓶30内的溶液类型和溶液深度均对细胞脱壁效果有影响。

作为超声换能器20的控制信号振荡信号的幅值、作用时间可以直接决定作用在细胞上力的大小和作用时长；作用方式的不同也会导致流体切向力的不同；振荡信号的频率不仅直接关系到超声换能器20的频率特性和方向特性，也影响到超声换能器20的发射功率、效率和灵敏度等重要性能指标。下面对各个参数进行实验研究。

第一、通常来说，超声换能器20工作在自身的谐振基频时获得最佳工作状态、产生最大发射功率和效率。考虑到低频超声对细胞的空化作用会损伤细胞，谐振基频并非最佳选择。因此需要以频率为变量进行实验。为验证本实施例三的细胞脱壁方法的优势，并探究各参数控制因素的合适参数，设计了如下实验方案。

首先将待实验细胞取出，在培养瓶30中原液替换为待测液体，并使用基于亮场显微镜的人脐带间充质干细胞融合度检测方法来检测细胞脱壁情况，用夹持器43固定，控制步进电机42使培养瓶30移动到指定距离d，利用信号发生器50和功率放大器60给超声换能器20施加指定频率、幅值的指定波形对细胞进行超声震荡实验。

接着，收集震荡结束后的细胞，再次检测细胞融合度，通过细胞进行超声脱壁前后对细胞融合度的检测，可以得到细胞脱壁面积的百分比，即细胞脱壁率。同时，利用台盼蓝特性，即活细胞的胞膜结构完整能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内，而丧失活性或细胞膜不完整的细胞可被台盼蓝染成蓝色，来检测细胞死亡率，对收集的细胞进行死亡率的测录。

进一步地，为更加直观的判断细胞震荡脱壁的效果，引入脱壁效果参数K作为判断依据，K为细胞脱壁率和细胞成活率的乘积，K值越大脱壁效果越好。为降低单瓶细胞导致的误差，每组实验会对三瓶细胞进行相同的处理，每组实验重复4次。采用T检验评价差异的统计学意义，当P<0.05时被认为具有统计学意义。

第二、超声换能器的输入电压直接影响细胞所经受的超声辐射压力，这里的输入电压为振荡信号的幅值，选择200V、240V、280V、320V电压做对照实验，频率为160kHz，时间为2min，距离d＝0mm。实验结果显示，施加电压为200V在此参数条件下基本无法造成细胞脱壁，240V约可造成40％面积细胞脱壁，280V和320V基本均为85％面积细胞脱壁。对震荡脱壁细胞使用台盼蓝观察细胞死亡率可得，320V震落细胞明显死亡率高于其他三组脱壁死亡率。以5V为步长补充了240-280V之间震荡的实验，255V作为最佳输入电压k值最高。

第三、将振荡信号的频率分别设置为37.5kHz、105kHz、160kHz。振荡信号的幅值设置为255V，时间为2min，距离d＝0mm，使用15ml生理盐水作为瓶内液体。实验结果显示，37.5kHz与160kHz均可使细胞脱壁面积至85％，然而105kHz组细胞脱壁面积仅为10％。但与理论相同的是，160kHz组细胞死亡率远小于37.5kHz组，在频率为160kHZ时为最佳。

第四、为了便于直观感受波形的影响，使用了致细胞脱壁率较低的105kHz区间频率，对105kHz持续脉冲、104.7-106.4kHz扫频脉冲和105kHz突发脉冲进行了实验，发现在同谐振频率区间中，扫频脉冲的细胞脱壁面积要大于持续脉冲大于突发脉冲，且三者细胞死亡率没有明显区别。故后续实验使用159-161kHz扫频脉冲进行细胞脱壁。

第五、培养瓶30与超声换能器20之间不同的距离d，也对细胞的脱壁有一些影响。分别设置培养瓶30与超声换能器20的距离d为2，3，4mm。其他参数设置：电压设置为255V，频率为159-161kHz扫频脉冲，时间为2min，使用12ml生理盐水作为瓶内液体。实验结果显示，在2mm处细胞脱壁面积约为85％，在3mm处细胞脱壁面积仅为95％，在4mm处细胞脱壁面积约为60％，其中2mm组死亡率最高，在距离d为3mm时最佳。

第六、培养瓶30瓶内液体的成分和液位高度对震荡脱壁的影响都很显著。以瓶内液体成分为变量，选择15ml血替原液、15ml生理盐水、7.5ml血替原液+7.5ml生理盐水作为瓶内液体a，b，c进行实验。其他参数设置：电压设置为255V，频率为159-161kHz扫频脉冲，时间为2min，距离d＝3mm，进行实验。

实验结果显示，15ml血替原液组细胞脱壁面积约为5％，15ml生理盐水组细胞脱壁面积约为95％，死亡率约为30％。7.5ml血替原液+7.5ml生理盐水组细胞脱壁面积约为60％，死亡率约为30％，在瓶内溶液为15ml生理盐水时最佳。

选择了生理盐水作为液体后，溶液体积设置为9ml、10.5ml、12ml、13.5ml、15ml，也即液体高度为1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm，其他参数设置：电压设置为255V，频率为159-161kHz扫频脉冲，时间为2min，距离d＝3mm。实验结果显示，细胞脱壁面积为7.5ml组<10ml组<12.5ml组＝15ml组＝17.5ml组，而脱壁细胞死亡率为7.5ml组＝10ml组>12.5ml组<15ml组<17.5ml组，在瓶内溶液高度h为1.6mm时最佳。

实验结果表明不同的输入电压、频率、波形对震荡脱壁的影响都十分显著。

不同电压对脱壁率影响的实验结果表明，电压与细胞脱壁正相关，与细胞死亡率负相关，也即增大电压可以增大细胞脱壁面积，但是会对细胞造成损伤。因此需要在致脱壁率较大的电压中选择对细胞伤害较小电压，在本实验条件下255V是一个合适的选择。

不同频率对脱壁率影响的实验结果表明，细胞脱壁率与频率并无线性关系，但频率增大会有效降低细胞死亡率。因此可以选择致脱壁率类似的高次谐振频率，本实验中160kHz为最佳。并通过对输入波形的实验可以得出，相同频率区间下，扫频脉冲在不造成细胞损伤前提下，对细胞脱壁率提升最高。

通过不同培养瓶30与超声换能器20之间不同的距离d的实验，可以发现，细胞脱壁率与死亡率与距离d并无线性关系。在距离为2mm时，培养瓶与超声振荡装置有接触，因此可能有一部分细胞是由于接触传导的机械振动力产生脱壁，且死亡率较高。但3mm处脱壁率反而增大，结合瓶中液位高度h的实验结果，我们推测细胞脱壁率与驻波出现位置相关。在水下声速为1480m/s情况下，160kHz频率对应的波长为9.25um。当n取1时，在高度4.625mm处形成驻波，也即当距离d为3mm时，瓶内液体高度h为1.625mm时，约12ml液体时刚好到达，此时细胞脱壁效果最佳。这一点猜想与实验结果类似。

关于瓶内液体对脱壁率影响的实验可以看出，在含有培养基也就是血替原液的液体中，细胞脱壁效果不佳，这可能与培养基本身具有促进贴壁的成分有关，因此，使用生理盐水作为细胞震荡液体效果最佳。由于在工业细胞培养传代过程中，会使用生理盐水进行清洗或离心，因此认为在细胞脱离时这样处理是合适的。

基于以上结论，得出了最适合用于细胞震荡脱壁的条件：在超声换能器20的输入电压为255V，超声频率在159-161kHz扫频，超声时间在2min时，将培养瓶30与超声换能器20距离调至3mm，使用12ml生理盐水作为震荡液体时，可以使T75瓶中细胞脱壁面积达到95％，细胞成活率达到70％。

本实施例三的细胞脱壁方法用于自动化细胞脱壁时效率很高，传统使用胰蛋白酶进行细胞脱壁的过程复杂耗时，需要分解成12步：“打开培养瓶盖子，倒出原液，加入生理盐水冲洗，倒出生理盐水，加入胰蛋白酶，放入培养箱，拿出拍打晃动，加入中和液，吹打，倒入离心管，离心，倒出上清液”才能得到纯净细胞。流程较为繁琐，实现自动化操作负责困难。而本实施例三的细胞脱壁方法省去了“加入胰蛋白酶，放入培养箱，拿出拍打晃动，加入中和液，吹打”这五步较为复杂的操作，大大提高了自动化培养效率。

上面对本发明的具体实施方式进行了详细描述，虽然已表示和描述了一些实施例，但本领域技术人员应该理解，在不脱离由权利要求及其等同物限定其范围的本发明的原理和精神的情况下，可以对这些实施例进行修改和完善，这些修改和完善也应在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种超声振荡装置，其特征在于，所述超声振荡装置包括：

振荡槽，所述振荡槽用于装载超声波传导介质；

超声换能器，所述超声换能器用于对所述振荡槽内的所述超声波传导介质进行超声振荡；

培养瓶，所述培养瓶用于装载细胞溶液；

驱动机构，所述驱动机构用于移动所述培养瓶进入所述振荡槽内以及调节所述培养瓶在所述振荡槽内的位置。

2.根据权利要求1所述的超声振荡装置，其特征在于，所述振荡槽的底部抵接于所述超声换能器。

3.根据权利要求1所述的超声振荡装置，其特征在于，所述驱动机构包括直线滑台、滑块、步进电机和夹持器，所述滑块与所述直线滑台滑动连接，所述夹持器固定于所述滑块上，且所述夹持器用于夹持所述培养瓶，所述步进电机用于驱动所述滑块滑动。

4.根据权利要求2所述的超声振荡装置，其特征在于，所述超声换能器的数量为多个，多个所述超声换能器呈阵列分布。

5.一种细胞脱壁系统，其特征在于，所述细胞脱壁系统包括信号发生单元和权利要求1至4任一项所述的超声振荡装置，所述信号发生单元用于产生振荡信号并将所述振荡信号输入至所述超声换能器，以使所述超声换能器产生超声波。

6.根据权利要求5所述的细胞脱壁系统，其特征在于，所述细胞脱壁系统还包括信号检测单元，所述信号检测单元用于检测所述振荡信号的波形。

7.根据权利要求5所述的细胞脱壁系统，其特征在于，所述细胞脱壁系统还包括移动控制单元，所述移动控制单元用于产生控制信号并将所述控制信号发送至步进电机，所述控制信号用于控制所述步进电机的工作过程。

8.根据权利要求5所述的细胞脱壁系统，其特征在于，所述信号发生单元包括信号发生器和功率放大器，所述信号发生器用于产生振荡信号，所述功率放大器用于对所述振荡信号进行放大。

9.一种采用权利要求5至8任一项所述的细胞脱壁系统的细胞脱壁方法，其特征在于，所述细胞脱壁方法包括：

利用驱动机构将装载有细胞溶液的培养瓶移动至振荡槽的预定位置；

利用信号发生单元产生参数达到预定条件的振荡信号，并将振荡信号输入至超声换能器，对细胞溶液进行超声振荡；

在超声振荡完成之后，收集脱落的细胞。

10.根据权利要求9所述的细胞脱壁方法，其特征在于，所述参数包括电压、频率和时长。