CN117511231A - 一种温敏性水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种温敏性水凝胶及其制备方法，其中温敏性水凝胶包括端环氧基嵌段共聚醚接枝壳聚糖即mPEO400‑b‑PBO‑b‑CS和作为胶凝剂的β‑甘油磷酸钠即β‑GP，所述mPEO400‑b‑PBO‑b‑CS是以聚乙二醇单甲醚400即mPEG400和环氧丁烷即BO为原料合成的双嵌段共聚醚mPEO400‑b‑PBG，其末端羟基被转化为环氧基后接枝到壳聚糖CS分子链上形成的。该温敏性水凝胶具备温敏可逆的溶液‑凝胶转变性能，还具有优异的生物相容性和优越的细胞增殖性能，其未对人表皮细胞和小鼠成纤维细胞显示出毒性，还可促进这两种细胞的增殖，其还具有可注射和体内凝胶化特性，可应用于医学领域。

Description

一种温敏性水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及水凝胶材料领域，特别是涉及一种温敏性水凝胶及其制备方法。
背景技术
温敏性水凝胶具有溶液-凝胶相变的转化是因为聚合物具有亲水和疏水部分。水凝胶可以通过其亲水基团将水分子(≥90wt.％)捕获到其结构中，常见的亲水基团有-NH2、-COOH和-SO3H，而通过疏水基团的相互作用进行凝胶化。温度影响亲水和疏水单元与水分子之间的相互作用，低温时，聚合物分子内的亲水基团与水形成氢键作用，分子链内部卷曲成线团状呈溶液状，当温度升高时，亲水基团与水分子的相互作用减弱而分子内疏水基团的相互作用力增强，分子链间相互环抱成螺旋状，胶体体积缩小形成凝胶。
温度响应性聚合物通常可以分为两类：具有低临界溶液温度(LCST)的热响应聚合物和具有高临界溶液温度(UCST)的热响应聚合物。对于具有UCST的聚合物，它们在高于UCST温度的水中混溶，在低于UCST的温度时出现相分离。而具有LCST的热响应聚合物是生物医学应用的热点，因为这些聚合物在高于LCST温度时才形成水凝胶，使得水凝胶可以在常温或低温状态下进行注射，避免了负载的药物变性。
温敏性水凝胶可广泛应用于药物缓释、细胞治疗、组织工程、伤口愈合和3D生物打印等领域。化学交联的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝胶是一种典型的温敏性水凝胶，其LCST接近人体生理温度，且溶胶—凝胶转变的温程短，广受科研工作者青睐，然而残存的引发剂及单体具有一定的毒性，聚合物无法降解等缺点限制了它在生物医学领域的应用。除PNIPAAm外，热敏聚合物通常是两亲性嵌段共聚物，而两亲性嵌段共聚物可以具有不同的连接方式，并且可以根据链段数量分为双嵌段，三嵌段和多嵌段。最具代表性的两种是Pluronic(普兰尼克)家族(例如Pluronic F-127)和PLGA/PEG(聚乳酸-羟基乙酸聚乙二醇共聚物)家族(例如PLGA-PEG-PLGA)。此外，多嵌段共聚物也可以分为线性，星形和超支化。
目前已经上市的软组织修复水凝胶产品中采用的生物高分子材料主要是透明质酸钠，所制成的产品如关节润滑液、微整形填充产品等。
其他如以α-氰基丙烯酸酯类合成高分子材料制备的软组织粘接剂，其生物相容性和生物可降解性较差，即单体残留、交联剂或引发剂残留等都具有细胞毒性，会引起炎症反应，仅用于手术切口粘接，难以在体内大剂量使用。温敏性水凝胶面临的最大挑战是其临床转化。目前的大多数研究仍处于实验室阶段，并且没有基于温敏性水凝胶的产品被批准用于临床。一个原因可能是温敏性水凝胶需要相对较高的聚合物浓度，而且持续缓慢的释放药物，可能造成慢性病频繁给药的问题。因此，对温敏聚合物的长期生物相容性、合成再现性、储存和灭菌等方面的探索和研究，对于促进其未来的临床转化具有现实意义。
β-甘油磷酸钠(β-GP)是一种天然存在于人体内的有机化合物。它通常用作治疗磷酸盐代谢紊乱的磷酸盐来源，并已被FDA(美国食品和药物管理局)批准用于静脉注射。β-GP被认为是成骨诱导液的主要成分，可促进骨髓间充质干细胞分化为骨细胞；它也被用作丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂。此外，壳聚糖(CS)本身并不是热敏型聚合物，β-GP在CS/β-GP(壳聚糖/β-甘油磷酸钠)温度敏感型水凝胶中用作胶凝剂，可在生理温度下将CS/β-GP溶胶转化为固态水凝胶，且CS/β-GP凝胶是不可逆的热致水凝胶。这种不可逆的热致水凝胶存在如下缺点：1、产品不耐环境高温，货架寿命期短，一旦凝胶化，低温时不再具有流动性，无法注射。2、在体表使用后，需要去除时，无法通过降温溶胶化方便地加以抹去。
发明内容
为了解决现有的温度敏感型水凝胶产品生物相容性欠佳且不可逆转变的问题，本发明提出一种温敏性水凝胶及其制备方法.
本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
一种温敏性水凝胶，包括端环氧基嵌段共聚醚接枝壳聚糖即mPEO400-b-PBO-b-CS和作为胶凝剂的β-甘油磷酸钠即β-GP，所述mPEO400-b-PBO-b-CS是以聚乙二醇单甲醚400即mPEG400和环氧丁烷即BO为原料合成的双嵌段共聚醚mPEO400-b-PBG，其末端羟基被转化为环氧基后接枝到壳聚糖CS分子链上形成的。
在一些实施例中，是以质量百分比计含有0.2％～2.0％的mPEO400-b-PBO-b-CS和3％～12％的β-GP的复合溶液形成的水凝胶。
本发明还提出了一种温敏性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S1、以mPEG400为起始剂，采用阴离子聚合的方法合成mPEO400-b-PBG；
S2、以mPEO400-b-PBG为原料，将端羟基转化为环氧基，制得端环氧基嵌段共聚醚；
S3、以端环氧基嵌段共聚醚和壳聚糖CS为原料，合成mPEO400-b-PBG-CS；
S4、在mPEO400-b-PBO-b-CS的水溶液中加入β-GP得到复合溶液。
在一些实施例中，步骤S1中，以mPEG400为起始剂，KOH为催化剂，通过BO的阴离子开环聚合反应，在常压下合成mPEO400-b-PBG。
在一些实施例中，步骤S1中，合成的mPEO400-b-PBG的分子量为420～600。
在一些实施例中，步骤S2中，将mPEO400-b-PBG加入适量NaH、环氧氯丙烷，反应结束后，用浓盐酸调整pH至5～6，用二氯甲烷和去离子水分液除去无机盐，收集二氯甲烷相，用旋转蒸发仪除去二氯甲烷溶剂，产物再用石油醚分三次除去体系中氢化钠表面的矿物油，用旋转蒸发仪除去残余的石油醚溶剂，烘箱干燥后得到红棕色粘稠液体。
在一些实施例中，步骤S3中，将CS粉末溶解在盐酸溶液中，制成CS酸溶液，用NaOH调节pH至5～6，加入端环氧基mPEO400-b-PBG，在氮气保护下加热搅拌，用丙酮沉淀并洗涤固体产物，冻干后得到淡黄色固体产物。
在一些实施例中，步骤S4中，将mPEO400-b-PBO-b-CS粉末溶于去离子水中，制成质量百分比0.4％～4.0％的mPEO400-b-PBO-b-CS水溶液，滴入β-GP溶液，得到所述复合溶液。
在一些实施例中，步骤S4中，滴入β-GP溶液得到以质量百分比计含有0.2％～2.0％的mPEO400-b-PBO-b-CS和3％～12％的β-GP的复合溶液。
本发明与现有技术对比的有益效果包括：
本发明通过以聚乙二醇单甲醚400即mPEG400和环氧丁烷即BO为原料合成的双嵌段共聚醚mPEO400-b-PBG，其末端羟基被转化为环氧基后接枝到壳聚糖CS分子链上形成mPEO400-b-PBO-b-CS，以胶凝剂β-甘油磷酸钠即β-GP加强凝胶化，配制mPEO-b-PBO-b-CS/β-GP温敏性水凝胶，该水凝胶相较于现有的CS/β-GP热致水凝胶具有更低用量的β-GP，且具备温敏可逆的溶液-凝胶转变性能。该温敏性水凝胶具有优异的生物相容性和优越的细胞增殖性能，其未对人表皮细胞和小鼠成纤维细胞显示出毒性，还可促进这两种细胞的增殖，并且促进小鼠成纤维细胞增殖生长的作用更加明显。在培育48h后，本发明实施例的复合溶液促进小鼠成纤维细胞的相对存活率最高可达到400％～500％。该温敏性水凝胶具有可注射和体内凝胶化特性，可应用于软组织填充、软组织粘接、关节润滑、药物缓释、细胞治疗、组织工程、伤口愈合和3D生物打印等医学领域。本发明实施例中的其他有益效果将在下文中进一步述及。
附图说明
图1是本发明实施例中mPEG400和mPEO400-b-PBG的核磁共振氢谱图。
图2是本发明实施例中氢化钠法端环氧基化mPEO400-b-PBG的合成步骤示意图。
图3是本发明实施例中mPEO400-b-PBG和端环氧基化mPEO400-b-PBG的分子结构示意图。
图4是本发明实施例中mPEO400-b-PBG的核磁共振氢谱图。
图5是本发明实施例中mPEO400-b-PBO-b-CS制备方法示意图。
图6是本发明实施例中0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/6.25％(w/w)β-GP和0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP溶液-凝胶的储能模量G'和损耗模量G”值随温度变化曲线示意图。
图7是本发明实施例中0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP复合溶液的凝胶化过程示意图。
图8a是本发明实施例中不同浓度mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶液培育HaCaT细胞24h后的细胞相对存活率示意图。
图8b是本发明实施例中不同浓度mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶液培育HaCaT细胞48h后的细胞相对存活率示意图。
图9a是本发明实施例中不同浓度mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶液培育L929细胞24h后的细胞相对存活率示意图。
图9b是本发明实施例中不同浓度mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶液培育L929细胞48h后的细胞相对存活率示意图。
具体实施方式
下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要说明的是，本实施例中的左、右、上、下、顶、底等方位用语，仅是互为相对概念，或是以产品的正常使用状态为参考的，而不应该认为是具有限制性的。
本发明实施例提出了一种温敏性水凝胶，该温敏性水凝胶以聚乙二醇单甲醚400(mPEG400)和环氧丁烷(BO)为原料，合成双嵌段共聚物mPEO400-b-PBG，并将其末端羟基转化为更具活性的环氧基，在盐酸溶液中，将环氧端封的mPEO400-b-PBG接枝到壳聚糖CS分子链上，得到端环氧基嵌段共聚醚接枝壳聚糖。以β-甘油磷酸钠即β-GP作为胶凝剂加强凝胶化，配制mPEO-b-PBO-b-CS/β-GP温敏性水凝胶，该水凝胶相较于现有的CS/β-GP热致水凝胶具有更低用量的β-GP，且具备溶液-凝胶可逆转变。
本发明实施例中温敏性水凝胶具体是以质量百分比计含有0.5％的mPEO400-b-PBO-b-CS和6.25％～8.75％的β-GP的复合溶液形成的。
本发明实施例还提出了上述温敏性水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S1、以mPEG400为起始剂，采用阴离子聚合的方法合成分子量为508.55±2.94的mPEO400-b-PBG；
S2、以mPEO400-b-PBG为原料，将反应活性较弱的端羟基转化为环氧基，制得端环氧基嵌段共聚醚，经核磁氢谱计算的转化率为93.50±1.58mol％。
S3、以端环氧基嵌段共聚醚和壳聚糖CS为原料，合成mPEO400-b-PBG-CS；
S4、在mPEO400-b-PBO-b-CS的水溶液中加入β-GP得到复合溶液。
本发明实施例中温敏性水凝胶的制备方法具体操作如下：
1共聚醚mPEO400-b-PBG的制备与表征
1.1共聚醚mPEO400-b-PBG的制备方法
制备共聚醚mPEO400-b-PBG之前需要进行如下步骤：BO使用前用氢化钠干燥12h，然后通过常压蒸馏备用。mPEG400置于60℃真空烘箱内干燥12h备用。
S1、以mPEG400为起始剂，KOH为催化剂，通过BO的阴离子开环聚合反应，在常压下合成共聚醚mPEO400-b-PBG。具体操作如下：
在120℃烘箱中烘烤带有搅拌子的250mL两颈烧瓶，蛇形冷凝管，恒压滴液漏斗。组装，磨口处涂以真空硅脂，用高温热风枪烘烤瓶子三次并在真空状态下自然冷却，每次间隔大约15min，此过程是为了除去反应瓶壁上残留的水分，保证体系内无水无氧。在氮气的保护下，将10g干燥的mPEG400加入两颈烧瓶中，再快速加入0.14g氢氧化钾(nK+：n-OH＝0.1)，抽真空，充入氮气，如此反复置换三次后，抽成真空状态，80℃下反应12h。然后在氮气保护下，用事先在鼓风烘箱烘烤并在干燥皿中冷却至室温的塑料针管刺入蒸馏接收瓶，通过吸入和挤出氮气置换针筒内氮气。将针管深入BO液面下，吸取超过所需量的BO；将针尖抽出液面，弯曲针管使针筒倒置，推压针筒活塞挤出筒内气泡并推至所需刻度，接着往外抽活塞以吸入氮气作保护层。保持针筒倒置状态，通过橡胶塞刺入两颈烧瓶中，翻转针筒，往两颈烧瓶中注射入较计量多10％干燥的BO单体，60℃下反应48h，待冷凝管停止回流，保温12h。
在阴离子开环聚合反应结束后，减压蒸出未反应的BO单体和低分子齐聚物。用适量的浓盐酸(nHCl：nKOH＝0.9)终止该聚合反应，搅拌30min后，用300mL二氯甲烷将混合物洗出，并用30mL×3的去离子水分液三次除去体系中的无机盐，收集二氯甲烷相，用旋转蒸发仪除去二氯甲烷溶剂。加30mL×3石油醚分三次除去体系中的低分子齐聚物，用旋转蒸发仪除去残余的石油醚溶剂，样品在70℃真空烘箱干燥12h，得到棕黄色的共聚醚mPEO400-b-PBG粘稠状液体。
1.2共聚醚mPEO400-b-PBG表征方法
称取约15mg的mPEO400-b-PBG样品溶于600μL氘代氯仿中，用核磁共振波谱仪测定得到样品的1H NMR谱图(核磁共振氢谱)。
原料mPEG400和产物mPEO400-b-PBG的核磁氢谱如图1所示，以氢谱曲线计算mPEO400-b-PBG的分子量，其中纵坐标是吸收峰强度，横坐标是化学位移δ(单位ppm)。化学位移δ＝0.63～1.00处的吸收峰是PBO(聚氧丁烯)嵌段中甲基的质子峰，其峰面积记做SA。化学位移δ＝1.24～1.55处的吸收峰是PBO嵌段中亚甲基的质子峰，其峰面积记为SB。化学位移δ＝3.16～3.67处的吸收峰是mPEG400嵌段中的甲氧基、亚甲基的质子峰和PBO嵌段中与醚键相连的亚甲基、次甲基的质子峰，其峰面积记做SC。
分子中PEO(聚氧乙烯)嵌段的聚合度为m，PBO嵌段的聚合度为n，从式1-1和式1-2联解得到，
mPEO400-b-PBG的相对分子质量由式1-3计算得到。按原料配比设计的分子量为506.28，实际测得分子量为508.55±2.94。
2端环氧基嵌段共聚醚的制备与表征
2.1端环氧基嵌段共聚醚的制备方法
S2、以mPEO400-b-PBG为原料，将端羟基转化为环氧基，制得端环氧基嵌段共聚醚；具体操作如下：
将10g干燥的mPEO400-b-PBG投入带有磁力搅拌、恒压滴液漏斗的干燥两口烧瓶中。体系抽真空，接着充入氮气，如此反复置换三次后，在氮气保护下加入NaH(nNaH：nmPEO400-b-PBG＝1.1equiv(当量))。室温搅拌(RT)6h后，在冰浴条件下缓慢滴加环氧氯丙烷(nECH：nmPEO400-b-PBG＝5)，滴加完毕后，常温搅拌20h，合成步骤见图2。
将端羟基转化为环氧基的反应结束后，缓慢滴加少量水淬灭过量的NaH，再用浓盐酸调整pH至5～6。用二氯甲烷和去离子水分液三次除去体系中的无机盐，收集二氯甲烷相，用旋转蒸发仪除去二氯甲烷溶剂，产物再用石油醚分三次除去体系中氢化钠表面的矿物油，用旋转蒸发仪除去残余的石油醚溶剂，得到的样品在70℃真空烘箱干燥12h，得到红棕色端环氧基嵌段共聚醚粘稠液体。
2.2表征方法
2.2.1环氧基化转化率(1H NMR核磁共振氢谱)
称取约15mg的样品溶于600μL氘代氯仿中，用核磁共振波谱仪测定得到样品的1HNMR谱图。通过核磁共振氢谱图中环氧基团上的亚甲基质子峰与聚醚分子端甲氧基质子峰的积分面积之比可求得聚醚末端羟基环氧基化的转化率。
本实施例中mPEO400-b-PBG和端环氧基化mPEO400-b-PBG的分子结构如图3所示，对应的核磁氢谱图如图4所示。在化学位移δ＝2.43～2.80处的信号归属于环氧基团上亚甲基质子(H8)，化学位移δ＝3.05～3.14处的信号归属于环氧基团上次甲基质子(H9)。化学位移δ＝3.76～4.00处为与环氧基相连的亚甲基的质子峰(H10)。根据环氧基团上亚甲基质子峰(H8)与PBG链节上的甲基质子峰(H1)的积分面积之比，由式2-1计算得到端环氧基mPEO400-b-PBG的转化率E。
其中：S1和S8分别代表H1和H8处质子峰的峰面积，m代表分子中PEO嵌段的聚合度，E代表端环氧基化mPEO400-b-PBG的转化率。采用核磁法测得的转化率为90.83±2.35mol％。
2.2.2环氧基化转化率(化学滴定)
参考GB/T 1677-2008《增塑剂环氧值的测定》测定聚醚环氧基化的转化率。配制盐酸-丙酮溶液(V盐酸:V丙酮＝1:40)和0.15mol/L的NaOH标准溶液。取20mL的盐酸-丙酮溶液于锥形瓶中，加入4滴酚酞(10g/L)试剂，用配置好的NaOH标准溶液滴定至出现粉红色，且30s内粉红色不退去，记录所消耗的NaOH标准溶液体积为V1。称取1.0g的端环氧基聚醚样品于锥形瓶中，取20mL的盐酸-丙酮溶液于锥形瓶中，振荡使其溶解均匀，加入4滴酚酞(10g/L)试剂，用配制好的NaOH溶液滴定至溶液变为粉红色，且30s内不褪色，记录所消耗的NaOH标准溶液体积为V2。
其中，E：环氧值，单位mmol/mol；
V1：滴定空白样消耗的NaOH溶液的体积，单位mL；
V2：滴定已知质量的反应混合物所消耗的NaOH溶液的体积，单位mL；
m：端环氧基聚醚的质量，单位g；
M：端环氧基聚醚的相对分子质量，单位g/mol；
c：NaOH溶液的浓度，单位mol/L。
按照式2-2计算得到转化率(环氧值)，重复测三次，计算每次的环氧值，取平均值并计算误差。
采用化学滴定法测得的转化率为93.50±1.58mol％。通过计算核磁氢谱积分面积与化学滴定的方法测得的转化率较为接近，转化率均达到90％以上。
3端环氧基嵌段共聚醚接枝CS
3.1端环氧基嵌段共聚醚接枝CS得到mPEO400-b-PBG-CS的方法S3、以端环氧基嵌段共聚醚和壳聚糖CS为原料，合成mPEO400-b-PBG-CS；制备原理如图5所示，具体制备步骤操作如下：
称取2g的CS(分子量200,000，脱乙酰度88.86％±0.52％)粉末，加入100mL、0.1mol/L的盐酸溶液中，配成CS酸溶液，室温下搅拌溶解，静置过夜。取33mL的CS酸溶液，用5mol/L的NaOH溶液将pH调节至5～6，并加入端环氧基mPEO400-b-PBG(nmPEO400-b-PBG：nCS＝1.1)，在氮气保护下，在50℃下搅拌48h。反应完成后，用丙酮沉淀出固体产物，并用丙酮反复洗涤固体产物三次，放入-58℃冻干机预冻12h，冻干12h，得到淡黄色mPEO400-b-PBG-CS固体产物。
3.2表征方法
称取2mg样品于锡舟中，包样，放入元素分析仪煅烧，测得碳和氮的质量百分比含量，每个样品平行测试三次，结果取平均值。
通过式3-1计算得到mPEO400-b-PBO-b-CS的共聚醚取代度(DS)，其中C/Nlinked CS和C/NCS分别是mPEO400-b-PBO-b-CS和原料CS中碳和氮的质量比。n是mPEO400-b-PBG的碳原子数。采用CS酸溶液与端环氧基化mPEO400-b-PBG在加热条件下反应的方法，制备mPEO400-b-PBO-b-CS的DS为16.27±1.00mol％。
4嵌段共聚醚接枝CS/β-GP温敏性水凝胶
4.1温敏性水凝胶mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合前置溶液的制备方法
S4、在mPEO400-b-PBO-b-CS的水溶液中加入β-GP得到复合溶液，具体操作如下：
准确称取0.1g的mPEO400-b-PBO-b-CS粉末，加入9.9g去离子水中，室温下搅拌溶解，配成两份1％(w/w)的mPEO400-b-PBO-b-CS溶液各10g并置于4℃冰箱储存备用。
在冰浴条件下，4℃下分别往两份mPEO400-b-PBO-b-CS溶液中缓慢滴入10g、12.5％(w/w)和17.5％(w/w)的β-GP(β-磷酸甘油酯二钠盐五水合物)溶液，边滴加边搅拌，得到0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/6.25％(w/w)β-GP和0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP的两种复合溶液。
4.2表征方法
4.2.1流变学测试分析温敏性水凝胶流变行为
为了确定初始凝胶化温度，采用流变仪测试溶液-凝胶的动态流变性能。将1mL的mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶液加载到直径25mm的流变仪平板上，其中上平板与底板间距为0.10mm，用硅油层密封试样溶液的边缘，防止圈内溶液蒸发。动态温度扫描的条件为应变1％，角频率为1rad/s，以1℃/min的速度从15℃升温至45℃。
本实施例中0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/6.25％(w/w)β-GP和0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP的两种复合溶液在升温过程中的储能模量(G')和损耗模量(G”)的变化曲线如图6所示。可以观察到，两种mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶液在35℃时，G'随温度升高而急剧增大，说明两种复合溶胶的初始凝胶化转变温度约为35℃。这归因于疏水交联和离子交联共同作用，线性分子链缠结而形成了凝胶结构。离子交联剂β-GP含量较高的0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP复合溶胶在35℃以后，G'增大得更快，表明高含量的β-GP增强了离子交联凝胶化程度。
如图7所示记录了0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP复合溶液的凝胶化过程。室温下复合溶液呈透明、流动性较好的溶液状如图7中a所示。在37℃孵育5min后完全凝胶化，如图7中b所示，呈淡乳白色凝胶，整体挂壁。将凝胶在室温下放置15min后，如图7中c所示，凝胶重新恢复为透明、流动性较好的溶液。说明该mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶胶具有温敏可逆的溶液-凝胶转变性能。
4.2.2体外细胞毒性试验分析温敏性水溶液的体外细胞毒性
使用小鼠成纤维细胞(L929)和人表皮细胞(HaCaT)，采用MTT法评估材料的细胞毒性。具体操作如下：
1.mPEO400-b-PBO-b-CS/细胞培养基的制备
将高糖培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)按9：1混合，并加入1％双抗(100U/mL青霉素+100U/mL链霉素)，配置成改良的DMEM培养基。将0.2mg的mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶液溶解于1mL改良的DMEM培养基中，在37℃、5％ CO2的细胞培养箱中混合24h。取混合液并用改良DMEM依次稀释为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL，备用。
2.细胞培养
用改良的DMEM对HFF-1细胞(人包皮成纤维细胞)和HaCaT细胞(人类永生化表皮细胞)培养至对数期，用胰酶消化，离心收集，制成细胞悬液。以每孔104个细胞的密度接种在96孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养24h。
3.MTT(MTT比色法)实验步骤
将接种后的细胞培养24h后，用一系列不同浓度的含有浸提液的DMEM培养液替换旧的培养液，每一个样品平行5个复孔，并用空白DMEM培养液作阴性对照组，PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)作归零组。再继续培养24h和48h后，除去上清液，每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h。除去MTT，加入150μL的二甲基亚砜，于暗处振荡20min，使结晶物充分溶解。用酶标仪读取490nm处的吸光度。细胞相对存活率(RGR)计算公式如下：
其中，ODtest和ODcontrol分别是在海绵提取液、空白DMEM中培养的细胞的吸光度，ODblank为PBS的吸光度。
本实施例将L929细胞和HaCaT细胞分别与一系列不同浓度的mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP复合溶液共培养24h和48h，RGR结果如图8a-8b和图9a-9b所示。如图8a和图8b所示即使试样浓度高达200μg/mL，在与HaCaT共培养24h和48h后，两种溶胶的RGR均大于100％，不仅未对HaCaT细胞显示出任何毒性，还可促进细胞的增殖。如图9a和图9b所示，两种溶液促进L929细胞增殖生长的作用更加明显，并且RGR值随着培育时间的延长、复合溶液浓度和β-GP含量的增加而增加，如图9b所示，最高可达到400％～500％，显示出优越的细胞增殖性能。
本实施例以mPEG400为起始剂，采用阴离子聚合的方法合成分子量为508.55±2.94的mPEO400-b-PBG。以mPEO400-b-PBG为原料，把反应活性较弱的端羟基转化为环氧基，制得端环氧基嵌段共聚醚，经核磁氢谱计算的转化率为93.50±1.58mol％。以端环氧基嵌段共聚醚和CS为原料，合成mPEO400-b-PBG-CS，元素分析法计算得接枝率为16.27±1.00mol％。以mPEO400-b-PBO-b-CS作为温敏性水凝胶制备的原料，制备0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/6.25％(w/w)β-GP和0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP两种复合溶液。研究β-GP含量对复合溶液温敏性凝胶化行为和体外细胞毒性的影响。得出如下实验结果：
(1)0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/6.25％(w/w)β-GP和0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP两种复合溶液的初始凝胶化转变温度均约为35℃，且高含量的β-GP增强了离子交联凝胶化程度。
(2)0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/6.25％(w/w)β-GP和0.5％(w/w)mPEO400-b-PBO-b-CS/8.75％(w/w)β-GP两种复合溶液不仅未对人表皮细胞和小鼠成纤维细胞显示出毒性，还可促进这两种细胞的增殖，并且两种复合溶液促进小鼠成纤维细胞增殖生长的作用更加明显。在培育48h后，高浓度复合溶液和高含量β-GP的复合溶液促进小鼠成纤维细胞的相对存活率最高可达到400％～500％。
以上生物相容性优异的mPEO400-b-PBO-b-CS/β-GP温敏性水凝胶具有可注射和体内凝胶化特性，可应用于软组织填充、软组织粘接、关节润滑、药物缓释、细胞治疗、组织工程、伤口愈合和3D生物打印等医学领域。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种温敏性水凝胶，其特征在于，包括端环氧基嵌段共聚醚接枝壳聚糖即mPEO400-b-PBO-b-CS和作为胶凝剂的β-甘油磷酸钠即β-GP，所述mPEO400-b-PBO-b-CS是以聚乙二醇单甲醚400即mPEG400和环氧丁烷即BO为原料合成的双嵌段共聚醚mPEO400-b-PBG，其末端羟基被转化为环氧基后接枝到壳聚糖CS分子链上形成的。
2.如权利要求1所述的温敏性水凝胶，其特征在于，是以质量百分比计含有0.2％～2.0％的mPEO400-b-PBO-b-CS和3％～12％的β-GP的复合溶液形成的水凝胶。
3.一种温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以mPEG400为起始剂，采用阴离子聚合的方法合成mPEO400-b-PBG；
S2、以mPEO400-b-PBG为原料，将端羟基转化为环氧基，制得端环氧基嵌段共聚醚；
S3、以端环氧基嵌段共聚醚和壳聚糖CS为原料，合成mPEO400-b-PBG-CS；
S4、在mPEO400-b-PBO-b-CS的水溶液中加入β-GP得到复合溶液。
4.如权利要求3所述的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，以mPEG400为起始剂，KOH为催化剂，通过BO的阴离子开环聚合反应，在常压下合成mPEO400-b-PBG。
5.如权利要求3或4所述的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，合成的mPEO400-b-PBG的分子量为420～600。
6.如权利要求3所述的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2中，将mPEO400-b-PBG加入适量NaH、环氧氯丙烷，反应结束后，用浓盐酸调整pH至5～6，用二氯甲烷和去离子水分液除去无机盐，收集二氯甲烷相，用旋转蒸发仪除去二氯甲烷溶剂，产物再用石油醚分三次除去体系中氢化钠表面的矿物油，用旋转蒸发仪除去残余的石油醚溶剂，烘箱干燥后得到红棕色粘稠液体。
7.如权利要求3所述的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，将CS粉末溶解在盐酸溶液中，制成CS酸溶液，用NaOH浓溶液调节pH至5～6，加入端环氧基mPEO400-b-PBG，在氮气保护下加热搅拌，用丙酮沉淀并洗涤固体产物，冻干后得到淡黄色固体产物。
8.如权利要求3至7任一项所述的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S4中，将mPEO400-b-PBO-b-CS粉末溶于去离子水中，制成质量百分比0.4％～4.0％的mPEO400-b-PBO-b-CS水溶液，滴入β-GP溶液，得到所述复合溶液。
9.如权利要求8所述的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S4中，滴入β-GP溶液得到以质量百分比计含有0.2％～2.0％的mPEO400-b-PBO-b-CS和3％～12％的β-GP的复合溶液。
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