CN117503803A - 一种可触发的前药纳米涂层及其应用 - Google Patents

一种可触发的前药纳米涂层及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可触发的前药纳米涂层及其应用。本发明采用活性氧响应的芳香硫缩醛连接键制备阳离子壳聚糖‑药物偶联物，通过静电相互作用在活菌表面形成纳米涂层。在给药后，包裹的细菌可以通过纳米涂层的屏蔽作用防止体内的损伤，并以时空同步的方式与缀合药物共同递送。到达病变部位后，高活性氧触发硫缩醛键的原位裂解，导致偶联药物和连接键衍生的有治疗作用的肉桂醛的释放。同时，通过产生带负电荷的巯基化壳聚糖实现电荷反转，诱导纳米涂层的解离，导致活菌的同步释放。在结肠炎小鼠模型的体内评估表明，在病变部位充分激活联合疗法显示出优越的协同治疗效果。本发明提供了一种将活微生物和小分子疗法结合起来的联合治疗策略。

Description

一种可触发的前药纳米涂层及其应用
技术领域
本发明涉及一种可触发的前药纳米涂层及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
活微生物疗法(LMTs)和小分子药物(SMDs)的协同作用已经被广泛探索并用于治疗各种疾病，因为每种治疗方式都有各自的独特优势：SMDs的快速和直接活性与LMTs的缓慢但长期疗效的结合。结合LMTs和SMDs的主要方法，是同时口服LMTs和SMDs，这种联合疗法在肠道微生物群在维持人体健康方面至关重要。然而，即使在治疗胃肠道相关疾病时，这种组合策略也不可避免地遇到一些挑战。首先，胃酸和抗生素物质等多种腔内损伤的存在会降低LMTs的活力，从而限制药物的生物利用度。其次，由于LMTs和SMDs的理化特性差异较大，给药后生物分布往往不匹配，难以同步到达病变部位发挥协同治疗作用。最后，SMDs的被动扩散往往会导致不必要的脱靶效应，而LMTs的自我增殖和运动能力会导致不受控制的肠道定位，导致整体治疗效果不理想，甚至可能产生副作用。因此，迫切需要能够精准协同输送SMDs和LMTs的方法来解决这些困难。
细胞内负载和表面附着是改善联合治疗中小分子药物(SMDs)和大分子药物(LMTs)共同输送的两种主要策略。受细胞摄取机制的启发，SMDs可以通过被LMTs内吞的方式形成细胞内药物负荷系统，实现同步输送。然而，由于存在致密的细胞壁和SMDs的细胞内暴露可能引发对LMTs的直接细胞毒性，药物的负荷量通常较低。通过共价键合或超分子相互作用，将SMDs或SMDs荷载的纳米颗粒附着在LMTs的表面上是一种优越的共同输送系统开发方法。除了增加细胞相容性外，表面附着还具有灵活性，易于携带不同的SMDs，并调控其药物的负荷和释放行为。尽管这种共同输送系统具有诸多优点，但以往的研究侧重于如何改善SMDs的输送，很少关注LMTs，特别是如何保护LMTs免受体内损害并促进其在病变部位的富集。
我们前期的研究中使用纳米涂层包覆技术来修饰细菌，可以赋予LMTs可调节的外源功能，以解决体内输送过程中的限制。例如，制备矿物纳米涂层可以中和胃酸，增加口服利用度，构建肠溶纳米涂层可以根据肠腔pH值的变化实现药物按需释放。因此，如果能够通过功能性纳米包覆以实现同时提高药物生物利用度，并在特定的部位实现共同药物的同步分布和释放，将有利于最终最大化地提高LMTs和SMDs的协同治疗效果。
发明内容
本发明的目的是：针对目前LMTs和SMDs的联合策略存在生物利用度低、时空分布不均、药物释放过早等技术问题，本发明提供一种可触发的前药纳米涂层及其应用，本发明采用活性氧响应的芳香硫缩醛连接键制备阳离子壳聚糖-药物偶联物，通过静电相互作用在活菌表面形成纳米涂层，可以按需激活微生物和小分子治疗药物进行联合治疗。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于可触发前药纳米涂层的药物递送系统，所述药物递送系统包括连接有小分子药物的ROS响应型前药纳米涂层和活体益生菌，所述前药纳米涂层包含壳聚糖片段、芳香基硫缩酮连接剂片段和小分子药物，所述前药纳米涂层通过芳香基硫缩酮(TA)连接剂片段分别偶联阳离子壳聚糖CS和小分子药物，并通过静电相互作用在活体益生菌的带负电表面上形成纳米涂层；
所述小分子药物为电中性或带正电荷的小分子药物，其正电荷来源于小分子药物本身自带的正电荷基团或是通过化学修饰接枝的正电荷基团；
所述药物递送系统在病变部位能够实现对活体细菌和小分子药物的激活，病变部位的活性氧触发硫缩醛键的原位裂解，导致偶联的小分子药物的释放和产生带负电荷的巯基化壳聚糖CS-SH，实现电荷反转，诱导纳米涂层的解离，导致活体医生菌的同步释放。
优选地，所述芳香基硫缩酮连接剂的化学结构式如下所示：
所述芳香基硫缩酮连接剂通过两端的羧基分别与壳聚糖和小分子药物偶联。
优选地，所述芳香基硫缩酮连接剂裂解后转变为肉桂醛。肉桂醛(CA)是一种对病原体具有特异性抑制作用的治疗物质，对结肠炎有益。
优选地，所述小分子药物为小分子抗炎化合物。
优选地，所述小分子抗炎化合物为双胍类药物。
优选地，所述前药纳米涂层的化学结构式如下所示：
优选地，所述前药纳米涂层的制备方法包括以下步骤：
步骤1：以肉桂醛和3-巯基丙酸为原料合成巯基乙酸二酸(TADA)；
步骤2：硫缩醛-双胍前药(TAA-BG)的合成：将巯基乙酸二酸和EDCI分散于有机溶剂中，加入N-BOC-乙二胺和1-羟基苯并三唑(HOBt)，搅拌反应，收集反应产物并纯化，得ATAA，以Fe3+为催化剂，将氰胍偶联到ATAA的氨基上；
步骤3：将硫缩醛-双胍前药(TAA-BG)与壳聚糖通过酰胺缩合反应制备得到前药纳米涂层CS-TA-BG。
优选地，所述药物递送系统的制备方法包括：配制不同浓度的CS-TA-BG溶液，加入NaCl溶液和益生菌，搅拌反应，离心后，收集得到包覆有前药纳米涂层的益生菌药物递送系统。
更优选地，所述CS-TA-BG溶液的浓度为0.1～5mg/mL，所述NaCl溶液的浓度为0.4～0.6M NaCl；所述益生菌包括但不限于大肠杆菌EcN。
本发明还提供了上述药物递送系统在制备用于联合治疗胃肠道疾病的药物中的应用，所述联合治疗指的是活体益生菌联合小分子化学药物。
优选地，所述胃肠道疾病包括胃肠道炎症性疾病。
本发明的原理：
本发明利用可触发的前药纳米涂层实现病变靶向的LMTs和SMDs双重激活的联合治疗策略(图1a)。具体而言，应用能够对活性氧(ROS)做出响应的芳香基硫缩酮(TA)连接剂合成阳离子壳聚糖(CS)-药物缀合物，通过静电相互作用，能够在活体细菌的带负电表面上形成纳米涂层。经口给药后，包覆的细菌可以受纳米涂层的屏蔽效应保护免受肠道内胃酸和抗生素的影响，并以时空同步的方式与结合的药物共同输送。到达病变部位后，表现出广泛存在于多种病理组织中的过表达ROS触发TA连接剂的原位断裂，释放共轭的药物并生成肉桂醛(CA)作为治疗物质。同时，由于产生的负电巯基化壳聚糖(CS-SH)可引发电荷反转，促使纳米涂层的解离，从而诱导携带的活体细菌的同步释放。在病变部位充分暴露的组合治疗显示出显著的协同治疗效果，这一点在使用结肠炎小鼠模型的体内评估中得到了验证。考虑到包裹不同菌种和连接不同分子的灵活性，我们预计纳米涂层的使用可以为准备下一代LMTs和SMDs的多种组合提供灵活的方法，以实现对不同疾病的协同治疗。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明采用活性氧响应的芳香硫缩醛连接键制备阳离子壳聚糖-药物偶联物，通过静电相互作用在活菌表面形成纳米涂层。在给药后，包裹的细菌可以通过纳米涂层的屏蔽作用防止体内的损伤，并以时空同步的方式与缀合药物共同递送；到达病变部位后，高活性氧触发硫缩醛键的原位裂解，导致偶联药物和连接键衍生的有治疗作用的肉桂醛的释放；同时，通过产生带负电荷的巯基化壳聚糖实现电荷反转，诱导纳米涂层的解离，导致活菌的同步释放；在结肠炎小鼠模型的体内评估表明，在病变部位充分激活联合疗法显示出优越的协同治疗效果；因此，本发明基于前药纳米涂层提供了一种将活微生物和小分子疗法结合起来的联合治疗策略，具有巨大的临床应用潜力。
附图说明
图1为本发明的前药纳米涂层应用及制备示意图：
(a)利用可触发的前药纳米涂层实现病变靶向双激活用于联合治疗的示意图；
(b)ROS响应型CS-TA-BG的合成路径；
图2为EcN@TA的表征：
(a)EcN和EcN@TA的典型扫描电子显微镜(SEM)图像；
(b)EcN和EcN@TA的典型透射电子显微镜(TEM)图像，比例尺：1μm；
(c)使用荧光标记的CS-TA-BG制备的EcN和EcN@TA的流式细胞术直方图(FCM)；
(d)EcN和EcN@TA的激光共聚焦显微镜(LSCM)图像，红色：表达mCherry的EcN，绿色：荧光标记的CS-TA-BG，比例尺：2μm；
(e)不同浓度的CS-TA-BG制备的EcN和EcN@TA的Zeta电位；
图3为纳米涂层的保护效果和稳定性，在与以下物质孵育后，存活的EcN、EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA的计数结果分别为：
(a)在SGF中孵育30分钟后；
(b)在ApAm中孵育5小时后；
(c)在含100μM H2O2的PBS中孵育12小时后；
(d)EcN@TA在SGF中孵育30分钟或SIF中孵育4小时后的激光共聚焦显微镜(LSCM)图像；红色：表达mCherry的EcN；绿色：荧光标记的CS-TA-BG。
比例尺：10μm；
(e)在SGF中孵育30分钟后，EcN、EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA的流式细胞术直方图(FCM)；
(f)在SIF中孵育4小时后，EcN、EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA的FCM直方图；
(g)接种SGF中孵育30分钟后，EcN@TA的典型透射电子显微镜(TEM)图像；
(h)接种SIF中孵育4小时后，EcN@TA的典型TEM图像。比例尺：1μm；
数据以均值±标准偏差(SD)(n＝3)的形式呈现；使用单因素方差分析(ANOVA)结合Fisher's最小显著差异(LSD)检验进行多重比较，并给出P值；*P<0.05，***P<0.001表示统计显著性；
图4为氧化应激触发的TA酶解和连接药物的释放：
(a)ROS存在下CS-TA-BG降解机制；
(b～e)分别在0μM，100μM，1mM和10mM的H2O2条件下，游离二甲双胍、EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA释放的BG的累积释放曲线；
(f)在与H2O2孵育后，从CS-TA-BG纳米涂层中释放出的巯基苄胺(BG-SH)的ESI-MS光谱图；
(g)在与H2O2孵育后，从CS-TA-BG纳米涂层中释放出的对羟基肉桂酸(CA)的ESI-MS光谱图；
(h)EcN@TA在100μM H2O2条件下处理24小时期间，ζ电位的变化；
(i)EcN@TA在无处理、100μM处理或1mM处理的H2O2条件下处理30分钟期间的ζ电位；
图5为氧化应激诱导的纳米涂层解离和细菌活化：
(a)EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA经100μM H2O2处理6小时后的激光共聚焦显微镜图像；比例尺：10μm；
(b)EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA在指定时间点经100μM H2O2处理后的典型透射电子显微镜图像；裸露的EcN作为对照显示；比例尺：1μm；
(c)EcN@12C在未经处理和经100μM H2O2处理6小时和12小时后的流式细胞仪直方图；EcN作为对照；
(d)EcN@TA在未经处理和经100μM H2O2处理6小时和12小时后的流式细胞仪直方图；EcN作为对照。
(e)不同浓度范围从0.1至5mg/mL的CS-TA-BG形成的EcN@TA的生长曲线；
(f)在不同H2O2浓度范围从100nM到10mM的条件下EcN的生长曲线；
(g)在不同H2O2浓度下经5mg/mL的CS-TA-BG形成的EcN@TA的生长曲线。
(h)经100μM H2O2处理12小时后EcN@12C和EcN@TA的剩余ROS水平；数据以平均值±标准差表示(n＝3)；
通过未配对的两组使用学生t检验或使用Fisher的LSD多重比较检验的单因素方差分析进行显著性评估，得到P值，***P<0.001，****P<0.0001；
图6为病灶部位的增强体内输送：
(a)DSS诱导的结肠炎小鼠模型中EcN@TA体内功能验证的实验设计；小鼠在整个实验期间饮水中加入2％的DSS；从第1天开始，小鼠每天进行一次口服PBS、EcN+metformin、EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA的灌胃治疗，连续六天；第7天，收集样品进行分析；
(b)来自PBS、EcN+metformin、EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA组的胃肠道IVIS图像；采用表达mCherry的EcN；
(c)结肠段mCherry荧光强度的定量结果；
(d)在STm诱导的结肠炎小鼠模型中口服PBS、EcN+metformin、EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA后的粪便中的EcN数量；
(e)口服EcN@TA后从STm诱导的小鼠的肠道内容物中提取的ESI-MS光谱；
(f)口服EcN@12C后从STm诱导的小鼠的肠道内容物中提取的ESI-MS光谱；数据以平均值±标准差表示(n＝3或5)；
通过一种使用Fisher的LSD多重比较检验的单因素方差分析进行显著性评估，得到P值，**P<0.01，***P<0.001；
图7为EcN@TA的治疗效果：
(a)STm诱导的结肠炎小鼠模型中评估EcN@TA的实验设计；小鼠在STm感染前一天进行链霉素口服(1×107CFU)；从第1天开始，小鼠每天进行一次口服PBS、EcN+metformin、EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA的灌胃治疗，连续六天；第7天，收集样品进行分析；
(b)实验期间体重的变化；
(c)STm诱导的结肠炎小鼠模型中口服PBS、EcN+metformin、EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA后的粪便中的STm数量；
(d)不同治疗后小鼠的结肠长度；
(e～f)通过ELISA试剂盒测得血清中(e)促炎细胞因子IL-6和(f)TNF-α的表达水平；
(g～h)不同治疗后结肠组织的(g)H&E和(h)MPO染色示意图；蓝色和红色箭头表示炎症细胞浸润；比例尺：100μm；
(i～j)未经BG-SH处理或经BG-SH处理的巨噬细胞中(i)TNF-α的表达和(j)总NO产生；巨噬细胞J774A.1细胞经过10μM的二甲双胍或BG-SH预处理，并与1μM的LPS共孵育12小时；
(k)经过计数得到的存活STm和EcN的数量；
(l～m)在不同浓度范围从1nM到10mM的CA存在下，(l)STm和(m)EcN的生长曲线；数据以平均值±标准差表示(n＝3或5)；
通过一种使用Fisher的LSD多重比较检验的单因素方差分析进行显著性评估，得到P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。ns表示无显著性差异；
图8为非响应性的对照物CS-12C-BG的合成路线；
图9为TADA在DMSO-d6中的核磁氢谱图；
图10为TADA的质谱图(ESI-MS)；
图11为TAA-BG在DMSO-d6中的核磁氢谱图；
图12为TAA-BG的质谱图(ESI-MS)；
图13为CS-TA-BG在D2O中的核磁氢谱图；
图14为12C-BG在D2O and DMSO-d6的混合氘代溶剂中的核磁氢谱图；
图15为12C-BG的质谱图(ESI-MS)；
图16为CS-12C-BG在D2O中的核磁氢谱图；
图17为Typical SEM images of EcN@CS和EcN@12C的典型SEM图；标尺：1μm；
图18为(a)采用浓度为0.2mg/mL的CS制备的EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA的TEM图像和(b)分别采用1，2，5mg/mL的CS制备的EcN@TA的TEM图像；标尺:1μm；
图19为EcN@CS和EcN@12C的流式细胞术(FCM)直方图，EcN为对照；
图20为EcN@CS和EcN@12C的激光扫描共聚焦显微(LSCM)图；红色：表达mCherry的EcN；绿色：荧光标记的CS或CS-12C-BG；标尺:2μm；
图21为分别与SGF共孵育30min和与SIF共孵育4h后的EcN@CS和EcN@12C的LSCM图；红色:表达mCherry的EcN；绿色:荧光标记的CS或CS-12C-BG；标尺:10μm；
图22为分别与SGF共孵育30min和与SIF共孵育4h后的EcN@CS和EcN@12C的典型TEM图；标尺:1μm；
图23为用10μM CA处理12h后存活的EcN和STm的平板计数图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例
1、实验材料和方法
(1)材料和菌株
肉桂醛(CA)、3-巯基丙酸和N-BOC-乙二胺购自上海浩宏科技有限公司，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)羰基二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯购自北京太阳生物科技有限公司。去乙酰化壳聚糖(CS)购自AVT(上海)医药科技有限公司。二甲基亚砜(DMSO)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)由Sigma-Aldrich(美国)提供。硫酸卡那霉素和硫酸庆大霉素购自山东斯巴克杰生物科技有限公司。LB培养基由Sangon Biotech公司提供。硫酸葡聚糖钠盐(DSS盐，60316ES60)由怡森生物科技(上海)有限公司提供。NO检测试剂盒(JL-T1270)购自上海江来生物科技有限公司。小鼠TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒由深圳市达科威生物工程有限公司提供。小鼠IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒购自Multisciences公司。联科生物科技有限公司EcN和STm购自中国普通微生物培养收集中心(GMCC，China)。质粒pBBR1MCS2-Tac-mCherry(卡那霉素耐药)和pMP2444-GFP(庆大霉素耐药)从国内供应商获得并使用。所有细菌在37℃LB培养基中培养，并添加合适的抗生素。
(2)ROS响应型CS-TA-BG的制备(制备路线如图1b所示)
所有反应均在黑暗和氮气保护下进行。在反应之前，所有溶剂都经过脱氧处理。所得化合物的结构通过质子核磁共振光谱(1H NMR，JEOL JNM-ECS 400光谱仪)和ESI-MS(Thermo LCQ Deca XP Plus离子阱质谱仪)在正离子模式下进行电喷雾电离验证。化学位移(δ)以ppm表示。
巯基乙酸二酸(TADA)的合成：将CA(1.32克，10.0mmol)和3-巯基丙酸(2.23克，21.0mmol)溶解于20毫升乙酸乙酯中，然后加入200微升三氟乙酸。反应混合物在冰槽中搅拌过夜，经蒸发浓缩后，交替用冷水和正己烷洗涤三次，然后通过硅胶柱层析纯化。经过真空干燥过夜后，收集了浅黄色固体TADA。化学分子式为C15H18O4S2，经过核磁氢谱和质谱确认其化学结构，如图9～10所示。图10质谱图结果显示，ESI-MS(m/z)：[M+Na]+＝349.1，计算得到分子量：M[C15H18O4S2]＝326.06。
硫缩醛-双胍前药(TAA-BG)的合成：将TADA(1.63g，5.0mmol)和EDCI(1.44g，7.5mmol)分散于20mL乙酸乙酯中，在0℃下连续搅拌0.5h。加入N-BOC-乙二胺(0.961g，6.0mmol)和1-羟基苯并三唑(HOBt，1.01g，7.5mmol)，搅拌12h，蒸发浓缩，硅胶柱层析纯化，得ATAA。以Fe3+为催化剂，将氰胍偶联到ATAA的氨基上。简单地说，将ATAA(737mg，2.0mmol)和双氰胺(168mg，2.0mmol)分散在1,4-二恶烷中，在油浴中缓慢加热并搅拌至95℃。然后加入无水FeCl3(389mg，2.4mmol)，95℃回流搅拌反应混合物2h，旋转蒸发除溶剂，酸化提取，生理盐水洗涤，冻干，闪柱层析纯化，TAA-BG得率为48.6％。其化学分子式为C19H28O6N3S2，经过核磁氢谱和质谱确认其化学结构，如图11～12所示。图12质谱图结果显示，ESI-MS(m/z)：[m+H]+＝453.2，计算得到分子量：M[C19H28O6N3S2]＝452.17。
巯基乙酸-双胍类前药连接的壳聚糖合成(CS-TA-BG)：通过壳聚糖的酰胺缩合反应得到CS-TA-BG。简单来说，将EDCI(767毫克，4.0mmol)，NHS(345毫克，3.0mmol)和TAA-BG(905毫克，2.0mmol)溶解在DMF中，并在室温下持续搅拌6小时。然后，将溶解在去离子水中的500毫克脱乙酰化壳聚糖加入反应中，继续搅拌12小时。所得混合物经过DMF和水的透析处理2天，然后经过冻干并在冷干燥的条件下储存，得到了82.3％的CS-TA-BG产率。核磁氢谱表征结果如图13所示。
(3)制备非响应型壳聚糖-十二烷酸-双胍(CS-12C-BG，作为对照)
合成十二烷酸-双胍前药12C-BG：先将12-氨基十二酸(452毫克，2.1mmol)溶解在1,4-二噁烷中，然后加入二氰胍(168毫克，2.0mmol)。将得到的混合物缓慢加热并在油浴中搅拌，直到达到95℃。然后加入无水FeCl3(389毫克，2.4mmol)，并将反应混合物在95℃下回流搅拌24小时。在整个反应过程中，所有溶液都受到光和氮气保护，以最小化氧化作用。反应完成后，使用旋转蒸发器去除溶剂，然后通过过量12M盐酸(HCl)结晶提取产生物，用盐水洗涤，再经过快速柱层析纯化。计算得到12C-BG的产率为57.2％。其化学分子式为C14H29O5N2，经过核磁氢谱和质谱确认其化学结构，如图14～15所示。图15质谱图结果显示，ESI-MS(m/z)：[M+K]+＝338.38，计算得到分子量：M[C14H29O5N2]＝299.42)
合成十二烷酸-双胍前药接枝的壳聚糖(CS-12C-BG)：EDCI(767毫克，4.0mmol)、NHS(345毫克，3.0mmol)、12C-BG(599毫克，2.0mmol)和500毫克脱乙酰化壳聚糖溶解在DMF中，在室温下持续搅拌6小时。然后将壳聚糖的DMF溶液加入反应中，并再次搅拌12小时。得到的混合物进行DMF和水的透析处理2天，然后冻干并在寒冷干燥的环境中储存。计算得到CS-12C-BG的产率为69.4％。核磁氢谱表征结果如图16所示。
合成荧光染料FITC标记的壳聚糖(FITC-标记的CS)、CS-12C-BG和CS-TA-BG。标记是在37℃下用FITC与胺基的摩尔比1:1000的比例孵育2小时完成的。得到的溶液与甲醇/去离子水以体积比1:1进行透析处理3天。产品经蒸发和冻干后纯化和收集，并保存在黑暗中。
(4)EcN@TA的构建
利用阳离子壳聚糖-三氨基胍前药(CS-TA-BG)通过静电相互作用包覆EcN表面。制备一系列浓度从0.1到5mg/mL的CS-TA-BG溶液，溶液中加入0.5MNaCl。随后，分别将1mL的EcN(3×10^8CFU/mL)悬浮在这些溶液中，在37℃下连续搅拌30分钟。通过离心(6000rpm，5分钟)收集具有不同包覆厚度的EcN@TA，进行三次洗涤，并重新悬浮在0.5M NaCl中。通过使用脱乙酰化壳聚糖和阳离子壳聚糖-十二烷酸-双胍前药(CS-12C-BG)，相应制备EcN@CS和EcN@12C。
(5)EcN@TA对胃酸和抗生素物质的耐受能力
采用平皿计数法评估经过酸和抗生素处理后幸存细菌的计数。分别将EcN、EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA中相等数量的细菌(1.8×10^8CFU)与1mL的SGF(pH 2)在37℃下连续搅拌30分钟。收集100μL的每个样品，并用适当的浓度梯度稀释进行细菌计数。对于抗生素抗性试验，将相等数量的EcN、EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA(2.7×10^7CFU)与含有7.5mg/mL阿普拉霉素和7.5mg/mL氨苄西林的混合抗生素溶液ApAm孵育在37℃下连续搅拌5小时。然后，收集100μL的每个样品进行细菌计数。
(6)纳米涂层的稳定性
EcN@TA、EcN@CS或EcN@12C在37℃下连续搅拌暴露在SGF中30分钟或在SIF中连续搅拌4小时。将样品离心收集，用PBS洗涤，并使用激光共聚焦显微镜(LSCM，Leica TCS SP8，Germany)、流式细胞仪(FCM，CytoFLEX，Beckman Coulter，USA)和透射电子显微镜(TEM，Hitachi，Japan)进行评估。在LSCM和FCM分析中，使用标记了mCherry的EcN(卡那霉素耐药性)以及标记了FITC的CS-TA-BG、CS和CS-12C-BG。
(7)包覆纳米涂层后的细菌临时失活
通过将EcN与不同浓度(从0.1到5mg/mL)的CS-TA-BG共孵育，制备了具有不同纳米涂层厚度的EcN@TA。样品收集后转移到96孔板中(每孔5×10^5个细胞)。最终加入含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，使总体积达到200μL。混合物在37℃下轻轻摇动孵育12小时。使用微板读数器(HIMF，BioTek，USA)以0.5小时间隔记录EcN的OD600 nm值，以研究细菌生长情况。
(8)ROS诱导的结合药物释放
将含有1×10^8CFU/mL EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA的1mL PBS置于分子量截止为10kDa的透析袋中，并浸入含有100μM H2O2的20mL PBS中，在37℃下连续搅拌24小时。在指定时间点(0、0.5、1、2、4、8、12和24小时)，取出1mL溶液进行高效液相色谱法(HPLC，Agilent&1260Infinity II，USA)定量分析释放的BG-SH。同时，补充1mL新溶液以保持体积恒定。24小时后，收集所有释放溶液并冻干进行ESI-MS检测。
(9)ROS诱导的电荷反转
将EcN@TA浸入含有100μM H2O2的PBS中24小时。每隔一定时间间隔，取少量样品进行洗涤，以测定ζ电位(DLS，Malvern Zetasizer Nano ZS，UK)。为了加速反转，将EcN@TA暴露在1mM H2O2中30分钟。然后，通过DLS确定获得样品的ζ电位。
(10)ROS诱导的纳米涂层解离
EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA在含100μM H2O2的PBS中孵育4、6、8和12小时。每个时间点，通过离心收集样品，用PBS洗涤，并使用LSCM、FCM和TEM进行分析。在LSCM和FCM研究中，使用标记了mCherry的EcN(卡那霉素耐药性)以及标记了FITC的CS-TA-BG、CS和CS-12C-BG。
(11)纳米涂层解离介导的细菌活化
将以5mg/mL CS-TA-BG制备的EcN@TA暴露于不同浓度的H2O2(10、50和100μM)中孵育12小时。然后，收集样品并转移至96孔板中(每孔5×10^5个细胞)。最终加入含100μg/mL卡那霉素的LB培养基，使总体积达到200μL。在37℃下轻轻摇动孵育14小时。使用微板读数器记录细菌的OD600 nm值，以研究细菌的活化和生长情况。
(12)EcN@TA对ROS的消耗
分别将等量EcN(1×10^8CFUs)的EcN@TA和EcN@12C浸入含有100μMH2O2的1mL PBS中，孵育8小时。然后，将所有样品离心，上清液转移到96孔板中，用荧光探针DCFH-DA进行ROS检测。在37℃下与10μmol/L DCFH-DA共孵育20分钟后，使用微板读数器记录在ex 488/em 630nm处的荧光强度。
(13)动物
由上海接斯杰实验动物有限公司提供6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，用于DSS诱导和STm诱导的结肠炎小鼠模型。所有小鼠都处于受控环境条件下，包括12小时黑暗/亮光循环，环境温度25℃和湿度55％。所有动物实验均按照上海交通大学动物实验委员会伦理委员会评估和批准的指导方针执行(A2020033)。
(14)DSS诱导的结肠炎小鼠模型
将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为5组(每组n＝5)，连续7天给予2％DSS溶于饮用水诱导结肠炎。从第1天开始，小鼠每天口服PBS、EcN和游离甲状腺素(EcN+metformin)、EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA一次，共6天。每组EcN(卡那霉素耐药性，表达mCherry)的数量设为1×10^8CFUs。第7天，取样分析使用IVIS分析。收集结肠内容物，并随后用稀释的HCl和甲醇混合液进行提取，制备适合ESI-MS检测的溶液。
(15)STm诱导的结肠炎小鼠模型
将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为5组(每组n＝5)，在感染前一天经口给予100μL链霉素(200mg/mL)，然后经口给予1×10^7CFUs STm感染。从第1天开始，小鼠每天口服PBS、EcN+metformin、EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA，共6天。第7天，安乐死并收集样品进行分析。每组EcN(卡那霉素耐药性，表达mCherry)的数量设为1×10^8CFUs。每天记录体重。第7天测量结肠长度。从每组收集粪便样本，用PBS均质后，分别进行EcN和STm的平板计数。采集小鼠眼窝静脉的血样，离心(4000g，5min)分离血清。使用商用ELISA试剂盒确定血清中IL-6和TNF-α的表达水平。将结肠组织浸入4％多聚甲醛溶液中固定。然后使用标准的石蜡包埋方案进行进一步处理。随后，根据制造商的说明，在组织样本上进行H&E染色和MPO染色。
(16)BG-SH和CA的功能验证
通过评估巨噬细胞产生的TNF-α和NO水平来确认释放的BG-SH的抗炎功效，采用JA744A.1细胞系。将这些细胞在含有1μM LPS或LPS补充10μM甲状腺素或释放的BG-SH的Dulbecco修饰的鹰的培养基中培养在96孔板中，持续12小时。使用商用ELISA试剂盒和Griess试剂盒分别定量分析J774A.1细胞产生的TNF-α和NO。通过抗生素平板计数和生长曲线分析来确认CA对STm和EcN的抑制作用。简而言之，将1×10^8CFUs的EcN(卡那霉素耐药性)或STm(庆大霉素耐药性)与10μM CA在37℃下持续搅拌。
2、实验设计、表征和结果
为了验证原理，本发明使用对病变有响应的前药纳米涂层将LMTs和SMDs结合起来，并探索其治疗结肠炎的潜力。结肠炎是一种慢性复发性疾病，其特征为炎症和肠道微生物组失调。结合能够重塑肠道微生物群稳态的益生菌(LBPs)和具有抗炎活性的小分子抗炎化合物(SMCs)，可以对结肠炎产生双重治疗效果。为此，本发明选择了临床上常用的益生菌菌株大肠杆菌Nissle 1917(EcN)，该菌株已用作口服治疗以调节肠道微生物组，以及双胍类药物(BG)，一种带正电荷的二甲双胍衍生物，具有抗炎活性，分别作为模型LMTs和SMCs。本发明使用壳聚糖(CS)作为前体来制备前药，因为壳聚糖有许多突出的氨基基团可作为药物连接位点，而且其带正电的特性可以通过静电相互作用在细菌表面形成纳米涂层。考虑到结肠炎病变部位的ROS水平升高，本发明选择氧化应答型芳香基TA作为连接剂，制备CS-BG前药(称为CS-TA-BG)，用于在EcN上形成保护性纳米涂层。需要注意的是，使用这种TA连接剂可以在不影响CS正电荷的情况下共价结合BG，这对后续在带负电细菌表面沉积至关重要。同时，在ROS的作用下，TA连接剂转变为CA，这是一种对病原体具有特异性抑制作用的治疗物质，对结肠炎有益。更重要的是，TA连接剂的断裂产生具有许多带负电巯基的CS，通过电荷反转介导纳米涂层的解离从而释放EcN。也就是说，使用基于CS-TA前药纳米涂层包裹可以同时在ROS过表达的病变部位释放包括LMTs、SMDs和CA在内的三种治疗剂。
(1)制备结果及表征
CS-TA-BG通过按照图1b所示的合成路线进行的五步反应合成。非响应性的对照物(CS-12C-BG)也被制备出来(图8)。这些共轭物的成功合成通过核磁共振光谱和电喷雾离子化质谱(ESI-MS)得到了确认(图9～16)。计算得到CS-TA-BG中BG的连接率为46.3％(图S6)。通过静电相互作用，将EcN与CS-TA-BG在37℃下孵育30分钟后，纳米涂层很容易形成。获得的CS-TA-BG涂层覆盖的EcN被称为EcN@TA。未被涂层包覆的EcN，未改性的CS涂层的EcN(EcN@CS)和非响应的CS-12C-BG涂层的EcN(EcN@12C)也作为对照进行了制备。典型的扫描电子显微镜(SEM)图像显示每个细菌表面存在一个完整的外壳(图2a和图17)。透射电子显微镜(TEM)图像确定，当CS浓度设定为0.2mg/mL时，涂覆EcN的外壳厚度约为100nm(图2b和18a)。纳米涂层的厚度随着CS浓度从0.5mg/mL增加到5mg/mL而逐渐增加(图18b)。还合成了荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的CS、CS-12C-BG和CS-TA-BG，并用于制备流式细胞仪(FCM)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测量的涂层细菌。通过FCM分析，与未被涂覆的EcN相比，EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA的荧光峰明显向更高强度方向移动(图2c和图S12)。通过LCSM显像，所有的EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA都显示出围绕每个表达mCherry的EcN的均匀绿色外壳，而原生EcN仅表现为胞内红色荧光(图2d和图20)。本发明实施例进一步测量了使用不同浓度的CS-TA-BG制备的EcN@TA的ζ电位(图2e)。与裸露的EcN(-33.0mV)相比，随着CS-TA-BG浓度从0.1mg/mL增加到5mg/mL，EcN@TA的ζ电位显著增加。当CS-TA-BG浓度为0.5mg/mL时，EcN@TA发生电荷反转，呈现出16.4mV的正ζ电位。随着浓度进一步增加至5mg/mL，ζ电位达到了38.8mV。需要注意的是，以5mg/mL的CS-TA-BG浓度获得的EcN@TA被用于进一步的研究。简而言之，这些结果证明了涂层细菌的成功制备。
(2)纳米涂层的保护效应和稳定性
递送系统保持活性生物治疗产品(LBPs)的能力是实现满意治疗效果的关键先决条件，因为LBPs往往难以在复杂的体内环境中存活。首先，本发明实施例中检测了EcN@TA对胃肠道相关胃酸和抗生素的耐受能力。将EcN@TA直接孵育在模拟胃液(SGF)中以测试其对胃酸的抵抗力。作为对照，将EcN同样暴露于SGF中30分钟，然后在Luria-Bertani(LB)琼脂平板上计数存活细菌的数量。在这种恶劣条件下，EcN的存活率仅为1.3％，而CS-TA-BG纳米包覆层显示出显著的保护效果，存活菌数量增加了5.1倍(图3a)。为了测试对肠腔内抗生素的抵抗能力，将EcN@TA与含有7.5mg/mL阿布拉霉素和7.5mg/mL氨苄青霉素的抗生素混合物(ApAm)一起孵育，5小时后，与EcN组相比，EcN@TA组的存活菌数增加了7.7倍(图3b)。接下来，本发明评估了涂层包覆的EcN对抗ROS的能力，ROS也是在炎症病变部位广泛存在的体内侵袭因子。本发明选择过氧化氢(H2O2)作为ROS的原型代表，它在细胞内自发产生。引人注目的是，与裸露的EcN相比，经过包覆的EcN对ROS显示出改善的耐受性，在EcN@TA组的细菌存活率增加了18.0倍(图3c)。发现EcN@CS和EcN@12C也对这些恶劣条件显示出类似的抵抗力。这些改进验证了纳米包覆层保护胃肠道内环境侵袭的效果。由于纳米包覆层的稳定性对于共递送细菌和结合药物至关重要，本发明测量了纳米包覆层在SGF或模拟肠液(SIF)中孵育后的保留情况。正如激光共聚焦显微镜(LSCM)图像所示，经过30分钟SGF孵育或4小时SIF孵育后，EcN@TA组中mCherry表达的细菌表面仍可观察到完整荧光标记的纳米包覆层(图3d)。流式细胞术(FCM)分析显示，与裸露的EcN相比，EcN@TA组中纳米包覆层的荧光强度在SGF和SIF处理后仍显著更高(图3e-f)。此外，通过透射电子显微镜(TEM)图像显示，孵育后的EcN@TA表面结构保持几乎不变(图3g-h)。有趣的是，EcN@CS和EcN@12C在相同处理下也表现出一致的稳定性(图21～22)。总的来说，这些发现支持使用CS-TA-BG纳米包覆层实现联合治疗物同步递送至结肠炎病变部位的能力。
(3)活性氧触发TA断裂和药物释放
芳香基TA连接键作为化学桥连基团，由于其对氧化物敏感性，当暴露在富含ROS的环境中时，TA中的醛的中心碳原子可以被氧化剂或亲核试剂的自由基攻击，形成亚砜或砜中间体。随后，通过电子重新分布生成巯基末端和芳香醛中间体的两个模块(图4a)。为了验证巯基末端的BG(BG-SH)和TA连接键衍生的CA的释放情况，将EcN@TA与含有或不含H2O2的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)一起孵育，并使用高效液相色谱法(HPLC)测量不同时间点的累积释放量。与此相似，将EcN@CS、EcN@12C和自由二甲双胍作为对照同样进行孵育。如预期的那样，自由二甲双胍在PBS中在0.5小时内突然释放了98.8％，而所有没有添加H2O2补充物的EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA组中都没有检测到可察觉的BG-SH的释放(图4b)。然而，在添加H2O2后，EcN@TA组中的BG-SH的释放显著增加，并且释放速率随着H2O2浓度的增加而增加。与100μM的H2O2一起孵育24小时后，BG-SH的总释放量达到44.2％(图4c)，而随着H2O2浓度增加到1mM，该释放量增加到63.2％(图4d)。此外，一旦H2O2浓度进一步增加到10mM，EcN@TA组在8小时内差不多完全释放了BG-SH，TA连接键也几乎完全降解(图4e)。然而，对于没有ROS响应性连接键的EcN@CS和EcN@12C组，即使在100μM到10mM H2O2补充物的情况下，也没有检测到可忽略的BG释放。为了进一步分析H2O2处理后的BG-SH和CA的释放情况，进行了ESI-MS分析。如图4f-g所示，从CS-TA-BG纳米包覆层释放的碎片化合物的分子量(MW)分别为233.31和155.20，分别与BG-SH(MW.232.31)的[M+H]+信号和CA(MW.132.16)的[M+Na]+信号完全匹配。释放研究证实了ROS诱导的TA断裂以及BG-SH和TA连接键衍生的CA成功从EcN@TA中释放出来。
(4)活性氧引发涂层解离
接下来，本发明检测了在EcN@TA中纳米涂层受ROS响应后的解离，因为TA连接键的断裂会产生带负电的CS-SH。为了追踪表面电荷的变化，将EcN@TA暴露在100μM H2O2中，通过动态光散射(DLS)监测其zeta电位。有趣的是，随着培养时间的延长，EcN@TA的zeta电位持续降低，最终呈现出明显的电荷变化，最终达到65.97mV(图4h)。仅暴露0.5小时的H2O2后，zeta电位迅速从+31.57降至+19.57mV，随着孵育时间延长到1小时，进一步降至-8.46mV的负值。将培养时间延长至12小时后，zeta电位降至最低值-33.97mV，与EcN的本底表面电荷相当。这种变化揭示了在接受100μM ROS作用12小时后，CS-TA-BG纳米涂层的电荷反转和完全解离。如图4i所示，通过增加H2O2浓度可以加速电荷反转和相关纳米涂层的解离。当H2O2浓度增加到1mM时，仅经过30分钟孵育后，EcN@TA的zeta电位急剧变为-5.12mV的负值。这种变化表明，除了与孵育时间相关的方式外，纳米涂层的解离还依赖于ROS的水平。为了可视化纳米涂层的解离，分别使用带FITC标记的CS-TA-BG和mCherry表达的EcN制备了EcN@TA。同样地，也使用带FITC标记的CS和CS-12C-BG分别制备了mCherry表达的EcN@CS和EcN@12C。将它们暴露在100μM H2O2中，通过激光共聚焦显微镜(LSCM)和透射电子显微镜(TEM)检查表面涂层的完整性。浸泡6小时后，EcN@TA周围的绿色荧光显著减弱，大部分细菌显示出不可观察到的荧光壳。相比之下，EcN@CS和EcN@12C的表面仍被明亮的绿色荧光包围，与mCherry表达的EcN显示一致的荧光共定位(图5a)。TEM图像显示，在与H2O2孵育4小时后，EcN@TA的纳米涂层部分解离，可以看到鞭毛和菌毛的存在。当浸泡时间延长至12小时，EcN@TA群体出现了与裸露的EcN类似的表面结构，表明纳米涂层几乎完全被去除(图5b)。不同的是，即使在12小时的孵育后，EcN@CS和EcN@12C仍被完整的纳米涂层覆盖，这进一步强调了在富含ROS环境下CS-TA-BG纳米涂层的解离。通过流式细胞术(FCM)进一步研究了解离的动态过程。在与H2O2孵育之前，EcN@TA和EcN@12C的荧光信号峰值基本一致，均比未包被的EcN的强度高(图5c-d)。然而，经过6小时的处理后，EcN@TA而不是EcN@12C在荧光强度较低的区域显示出一个新的峰值，表明纳米涂层部分脱落。随着处理时间延长至12小时，EcN@TA的荧光峰值进一步转移到与裸露的EcN几乎相同，确认纳米涂层的完全解离。
(5)纳米涂层解离介导的细菌激活
正如之前报道的，可以使用适当厚度的刺激响应型纳米涂层来抑制细菌增殖，并且在特定条件下可以实现包被细菌的重新活化。因此，本发明考察了将EcN包裹在CS-TA-BG纳米涂层中的暂时失活，并在富含ROS的条件下研究了纳米涂层解离后包裹细菌的存活性。记录并显示了不同浓度CS-TA-BG包裹的EcN细菌在600nm处的光密度(OD600)值的生长曲线，如图5e所示。随着CS-TA-BG的给料浓度增加，包裹的EcN的增殖逐渐减少。与裸露的EcN相比，0.1mg/mL的CS-TA-BG形成的纳米涂层稍微抑制了包裹细菌的生长，而且生长平台也略有降低。随着CS-TA-BG的给料浓度增加到5mg/mL，EcN的增殖明显受到影响。在这种情况下，细菌只有在大约8小时的培养后才开始生长，并且显示出明显延迟和降低的生长平台，某种程度上意味着包裹EcN的休眠状态。然后，鉴于纳米涂层的ROS响应解离，本发明检测了存在H2O2时EcN@TA的存活率和生长情况。值得注意的是，发现H2O2对未包被的EcN的细菌生活力有浓度依赖性的抑制作用(图5f)。裸露的EcN的生长平台在100μM H2O2中减少了一半，并且在H2O2浓度增加到1mM时没有观察到增殖。相反，从5mg/mL的CS-TA-BG制备的EcN@TA在H2O2浓度从0增加到100μM时并未受到抑制，而是增强了生长(图5g)。这表明EcN@TA中的细菌进入增殖阶段较早，最终达到正常的生长平台。本发明中使用ROS检测试剂盒来测量EcN@TA与H2O2孵育期间ROS水平的变化。使用100μM H2O2孵育的EcN@12C作为对照。孵育12小时后，EcN@TA消耗了更多的ROS，通过将EcN@TA组的残余ROS的荧光强度与EcN@12C组相比较，降低了32.46％(图5h)。因此，细菌的生长既可以归因于纳米涂层的解离，也可以归因于通过氧化介导的TA连接键催化氧解而中和产生的ROS。也就是说，纳米涂层的解离可以将EcN释放到ROS水平较低的微环境中，这可以保持脱涂细菌的存活性以进一步增殖。考虑到病理性炎症环境中的ROS水平约为100μM，使用ROS响应性的前药纳米涂层可以使得包裹的细菌在病变部位释放和激活。
(6)向肠炎部位的递送提高
在体外确认了BG-SH、CA和活性EcN对环境侵害和ROS响应释放的改善后，我们还评估了EcN@TA的体内性能。作为典型的结肠炎模型，我们建立了两种模型：硫酸葡聚糖(DSS)和鼠伤寒沙门氏菌SL1344(STm)诱导的小鼠结肠炎，并进行了体内评估。如图6a所示，小鼠连续7天用2％的DSS溶液饮水诱导结肠炎，导致主要发生在结肠直肠区域的炎症损伤。从第1天开始，小鼠每天经口灌胃给予PBS、EcN联合游离甲糖胺(EcN+甲糖胺)、EcN@CS、EcN@12C或EcN@TA治疗6天。每组中EcN(卡那霉素耐药，表达mCherry)的数量设定为1×10^8CFU。在第7天，使用体内成像系统(IVIS)对肠段进行成像(图6b)。预期地，PBS组在整个肠道中都没有出现荧光信号，而从EcN+甲糖胺组的样品中仅出现了片段性的弱荧光信号。相反，EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA组肠道中的总荧光信号明显增强，表明纳米涂层对保护EcN免受胃肠道相关的侵害并增强其肠内存活的作用。重要的是，仅EcN@TA组中的荧光信号在结肠区域呈现出优先分布，与非响应性EcN@12C组相比，结肠中的辐射强度明显更高(图6c)。这些发现证实了EcN@TA的存活率和选择性递送，以增强在结肠炎症病变部位的富集。通过使用由1×10^7CFU STm诱导的结肠炎小鼠进一步验证了EcN@TA在口服后在胃肠道内的存活性。通过进行平板计数分析，定量分析了反映在肠道中富集的细菌丰度的粪便中的EcN数量。如图6d所示，与EcN+甲糖胺组相比，EcN@CS、EcN@12C和EcN@TA组中活性EcN的粪便丰度显著增加，再次确认了纳米涂层在胃肠道通过途径中增强细菌存活的保护效应。值得注意的是，ROS响应型EcN@TA组显示出最高的细菌丰度，比非响应型EcN@12C组高出1.9倍。为了分析与ROS触发的TA连接键催化裂解相应的BG-SH和CA在体内的释放，本发明收集肠道的肠内容物并进行ESI-MS分析。令人鼓舞的是，通过口服EcN@TA后，成功在肠道内检测到与BG-SH[M+H]+和CA[M]对应的分子量(图6e)，而EcN@12C组则没有检测到这样的信号(图6f)。这些数据阐明了CS-TA-BG纳米涂层改善了封装EcN的口服生物利用度的潜力，并且能够在结肠炎症病变部位过度表达的ROS下首选释放携带的BG-SH和CA以及活性细菌。
(7)缀合药物的协同效应
在验证了EcN@TA的治疗潜力之后，本发明进一步检测了释放的BG-SH和CA的功能，以了解潜在的协同作用。最近的报告揭示了BG化合物，特别是甲糖胺，在通过激活腺苷酸(AMP)活化蛋白激酶(AMPK)的治疗结肠炎中具有引人注目的抗炎作用，该酶调节上皮细胞紧密连接的组装并保持肠道屏障完整性。基于此，本发明检查了释放的BG-SH是否能够抑制炎症因子的产生。将EcN@TA暴露于10mM的H2O2中12小时，通过透析和冷冻干燥收集脱落的BG-SH。使用ELISA评估宏噬细胞系J774A.1细胞在LPS(1μM)刺激下孵育12小时时，上清液中炎症因子TNF-α的水平，同时提供BG-SH(10μM)作为补充品，以LPS组作为对照组。甲糖胺作为阳性对照。如图7i所示，BG-SH处理组中TNF-α的表达显著降低，相比未经BG-SH处理的LPS组减少了2.2倍。此外，BG-SH还降低了LPS刺激后的巨噬细胞产生的一氧化氮(NO)总量。请注意，BG-SH在减少炎症因子和NO产生方面表现出与甲糖胺相当的能力(图7j)。这些发现表明，受ROS触发释放的BG-SH具有强效的抗炎作用。本发明进一步检测了CA的生物活性，CA是FDA批准的食品添加剂，已被证实对抑制鼠伤寒沙门氏菌具有有效性。为了揭示与EcN以外的鼠伤寒沙门氏菌的特异性抗菌效应，通过将相等数量(1×10^8CFU)的鼠伤寒沙门氏菌或EcN在含有10μMCA的LB培养基中孵育12小时，确定CA的抑菌能力。如图7k和图23所示，通过平板计数计算存活的EcN数量显著高于鼠伤寒沙门氏菌，增加了5.8倍。我们还使用微孔板读板仪监测鼠伤寒沙门氏菌和EcN在不同浓度CA孵育过程中的生长情况。在低浓度1μM CA下，对鼠伤寒沙门氏菌生长有显著抑制作用(图7l)，而即使在高浓度100μM CA下，对EcN的抑制效果也不明显(图7m)，表明CA偏好抑制致病菌。总之，上述结果验证了除EcN的有益作用之外，CA对鼠伤寒沙门氏菌的选择性抑制能力和BG-SH的抗炎效果协同贡献了EcN@TA的治疗潜力。
综上所述，本发明提供了一种可触发的前药纳米涂层，实现了病变特异性的LMTs和SMDs的双重激活联合治疗。具体实施例中，本发明选择CS作为载体，通过静电相互作用将带正电的SMDs共轭到带负电的LMTs表面。选择芳香性的TA连接剂，因为它能够解离共轭药物，并在与炎症性疾病相关的高氧自由基条件下产生治疗效果的CA。这种纳米涂层可以通过将前药与目标LMTs混合并通过离心纯化来轻松形成。口服后，生成的纳米涂层能够通过其保护作用保护LMTs免受胃肠道内生物和化学攻击，并在其稳定性的帮助下实现联合LMTs和SMDs的时空同步共输送至病变部位。一旦到达病变部位，上调的ROS可以触发TA连接剂的原位裂解，从而双重释放共轭药物和连接剂衍生的CA。同时，由生成的负电荷CS-SH介导的电荷反转不仅引发了纳米涂层的解离，还释放和激活了载入的LMTs以进一步增殖。LMTs和SMDs的同步共输送，以及额外的连接剂衍生抗菌CA到病变部位，展示了对由致病菌感染引起的结肠炎小鼠模型的令人满意的协同治疗效果。通过灵活调控纳米涂层的结构和功能，纳米涂层的包覆以实现智能药物搭载被视为一种多功能方法，用于开发创新的LMTs和SMDs的组合治疗药物，以协同治疗各种疾病。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于可触发前药纳米涂层的药物递送系统，其特征在于，所述药物递送系统包括连接有小分子药物的ROS响应型前药纳米涂层和活体益生菌，所述前药纳米涂层包含壳聚糖片段、芳香基硫缩酮连接剂片段和小分子药物，所述前药纳米涂层通过芳香基硫缩酮(TA)连接剂片段分别偶联阳离子壳聚糖CS和小分子药物，并通过静电相互作用在活体益生菌的带负电表面上形成纳米涂层；
所述小分子药物为电中性或带正电荷的小分子药物，其正电荷来源于小分子药物本身自带的正电荷基团或是通过化学修饰接枝的正电荷基团；
所述药物递送系统在病变部位能够实现对活体细菌和小分子药物的激活，病变部位的活性氧触发硫缩醛键的原位裂解，导致偶联的小分子药物的释放和产生带负电荷的巯基化壳聚糖CS-SH，实现电荷反转，诱导纳米涂层的解离，导致活体医生菌的同步释放。
2.如权利要求1所述的药物递送系统，其特征在于，所述芳香基硫缩酮连接剂的化学结构式如下所示：
所述芳香基硫缩酮连接剂通过两端的羧基分别与壳聚糖和小分子药物偶联。
3.如权利要求2所述的药物递送系统，其特征在于，所述芳香基硫缩酮连接剂裂解后转变为肉桂醛。肉桂醛(CA)是一种对病原体具有特异性抑制作用的治疗物质，对结肠炎有益。
4.如权利要求1所述的药物递送系统，其特征在于，所述小分子药物为小分子抗炎化合物。
5.如权利要求4所述的药物递送系统，其特征在于，所述小分子抗炎化合物为双胍类药物。
6.如权利要求1～5中任意一项所述的药物递送系统，其特征在于，所述前药纳米涂层的化学结构式如下所示：
7.如权利要求6所述的药物递送系统，其特征在于，所述前药纳米涂层的制备方法包括以下步骤：
步骤1：以肉桂醛和3-巯基丙酸为原料合成巯基乙酸二酸(TADA)；
步骤2：硫缩醛-双胍前药(TAA-BG)的合成：将巯基乙酸二酸和EDCI分散于有机溶剂中，加入N-BOC-乙二胺和1-羟基苯并三唑(HOBt)，搅拌反应，收集反应产物并纯化，得ATAA，以Fe3+为催化剂，将氰胍偶联到ATAA的氨基上；
步骤3：将硫缩醛-双胍前药(TAA-BG)与壳聚糖通过酰胺缩合反应制备得到前药纳米涂层CS-TA-BG。
8.如权利要求6所述的药物递送系统，其特征在于，所述药物递送系统的制备方法包括：配制不同浓度的CS-TA-BG溶液，加入NaCl溶液和益生菌，搅拌反应，离心后，收集得到包覆有前药纳米涂层的益生菌药物递送系统。
更优选地，所述CS-TA-BG溶液的浓度为0.1～5mg/mL，所述NaCl溶液的浓度为0.4～0.6M NaCl；所述益生菌包括但不限于大肠杆菌EcN。
9.权利要求1～5中任意一项所述的药物递送系统在制备用于联合治疗胃肠道疾病的药物中的应用，所述联合治疗指的是活体益生菌联合小分子化学药物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述胃肠道疾病包括胃肠道炎症性疾病。
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