CN117487866A - 一种合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法 - Google Patents
一种合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种合成γ‑叔醇‑(S)‑α‑氨基酸的酶催化方法,包括:在磷酸吡哆醛存在下,UstD酶催化L‑天冬氨酸脱羧并和邻位二酮类化合物发生羰基加成反应,生成手性γ‑叔醇‑(S)‑α‑氨基酸。该方法操作简单、反应条件温和、立体选择性和区域选择性好,转化率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化化学反应领域,特别是涉及一种合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法。
背景技术
Type I、Type II、Type III、Type IV类非天然氨基酸的结构如下。
Type I类非天然氨基酸是一种非常重要的手性砌块,应用于很多生物活性化合物的合成中,例如γ-羟基氧代吲哚基-L-丙氨酸是具有潜在蛋白酶抑制活性化合物TMC-95类似物的重要结构片段。
文献(J.Med.Chem.2018,145,570-587.)报道的制备Type I类化合物的方法如下所示,其以取代的色氨酸为原料,通过双氧水氧化等多步骤,得到γ位选择性不好的γ-叔醇-(S)-α-氨基酸。此方法立体选择性差,步骤繁琐,收率低,从经济学角度考虑,不适合工业化大规模生产。
i.DMSO,t-BuBr,45℃,24h ii.H2O2,catalytic KI(11%),CH3CN,RT,18h.iii.R1NH2,THF,RT,1.5 to 18h;
iv.H2,Pd/C,MeOH,RT,ovemight,then 1 eq.anhydrous HCl or TFA
此外,目前还没有合适的合成方法可以高选择性地制备Type II、Type III、TypeIV类非天然氨基酸。
生物酶法因为具有立体选择性好、反应条件温和、环境友好等优点,受到越来越广泛的关注和越来越深入的研究。但目前关于高选择性地制备高光学纯度的γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的方法仍然没有相关报道。
发明内容
本发明针对现有γ-叔醇-(S)-α-氨基酸制备方法中,反应步骤多、操作繁琐、方法立体选择性差等问题,提供一种选择性高、反应步骤少、反应条件温和的酶催化方法。
具体地,本发明提供一种合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,包括:在磷酸吡哆醛(PLP)存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位双酮化合物1发生羰基加成反应,生成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸2,如反应式I所示:
其中,X、Y各自独立地选自C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;优选选自C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;优选选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基;更优选地,X、Y各自独立地选自C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基、乙氧基)、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基(特别是苯乙基);所述C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基中的取代基所取代,所述C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基、5-12元杂芳基C1-C10烃基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基C1-C10烷基、5-12元杂芳基C1-C10烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基C1-C6烷基、C6-C12芳基C1-C4烷基可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;
或,X和Y与连接的邻位双酮构成4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮;所述C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮可由1、2或3个C6-C12芳基或5-12元杂芳基与4-10元脂环烃基二酮或5-10元杂环二酮形成并环结构;所述5-10元杂环二酮是指环中含有选自N、O或S中的1、2、3或4个杂原子,且环碳被两个氧代基团取代的饱和或部分不饱和的单环或多环非芳香性杂环化合物;优选地,所述4-10元脂环烃基二酮选自邻位环丁二酮、邻位环戊二酮、邻位环己二酮、邻位环庚二酮或邻位环辛二酮,所述5-10元杂环二酮选自吡咯-2,3-二酮、呋喃-2,3-二酮、噻吩-2,3-二酮;更优选地,X和Y与连接的邻位双酮构成4-10元环烷二酮、二氢吲哚-2,3-二酮、1,2-茚满二酮或菲-9,10-二酮;所述4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮、4-10元环烷二酮、二氢吲哚-2,3-二酮、1,2-茚满二酮或菲-9,10-二酮可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C10烷基C1-C10烷基氧基、C1-C10烷基C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基中的取代基所取代;更优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基中的取代基所取代;进一步优选地被一个或多个选自卤素(特别是氟、氯、溴)、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基、乙氧基)、C1-C4烷胺基、C1-C4烷巯基、C1-C4酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷胺基、C3-C7环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基中的取代基所取代。
在一些实施方式中,所述方法中的γ-叔醇-(S)-α-氨基酸2进一步通过与X相连的羰基与α-氨基发生自发成环反应而成环。
在一些实施方式中,所述酶催化方法选自下列方法一至四之一:(1)方法一:
如反应式I-1所示,在磷酸吡哆醛(PLP)存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位双酮化合物1-1发生羰基加成反应生成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸2-1,其为Type I类非天然氨基酸;
其中,
环A为C6-C12的芳基环或5-12元的杂芳基环;
Z选自NR2、O、S;
m为0-12的整数;优选地,m为0-10的整数,例如0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10;
各R1独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;优选地,各R1独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;更优选地,各R1独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;进一步优选地,各R1独立地选自卤素(特别是氟、氯、溴)、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基)、C1-C4烷基胺基、C1-C4烷基巯基、C1-C4酰基、C3-C6环烷基、C3-C6环烷氧基、C3-C6环烷胺基、C3-C6环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;
R2选自氢、C1-C10酰基、C1-C10烃基、C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;优选选自氢、C1-C8酰基、C1-C10烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;更优选选自氢、C1-C6酰基、C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;进一步优选为氢、C1-C4酰基、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基)、C3-C6环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基;
(2)方法二:
如反应式I-2所示,在磷酸吡哆醛(PLP)存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位双酮化合物1-2发生羰基加成反应生成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸2-2,其为Type II类非天然氨基酸;
其中,
环B为C6-C12的芳基环或5-12元的杂芳基环;
n为0-12的整数;优选地,n为0-10的整数,例如0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10;
p为0-6的整数;优选地,p为0-4的整数,例如0,1,2,3,4;
各R3独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;优选地,各R3独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;更优选地,各R3独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;进一步优选地,各R3独立地选自卤素(特别是氟、氯、溴)、C1-C4烷基(特别是甲基)、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基胺基、C1-C4烷基巯基、C3-C6环烷基、C3-C6环烷氧基、C1-C4酰基、C3-C6环烷胺基、C3-C6环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;
(3)方法三:
如反应式I-3所示,在磷酸吡哆醛(PLP)存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位双酮化合物1-3发生羰基加成反应生成化合物2-a,然后化合物2-a中与X3相连的羰基与α-氨基自发成环生成化合物2-3,其为Type III类非天然氨基酸;
其中,
X3、Y3各自独立地选自C1-C10烃基、C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;优选选自C1-C10烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;更优选选自C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;更进一步优选地,X3、Y3各自独立地选自C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C3-C6环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基;所述C1-C10烃基、C1-C10烷基、C1-C6烷基、C1-C4烷基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基的取代基所取代;所述的C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基C1-C10烷基、5-12元杂芳基C1-C10烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基C1-C6烷基、5-12元杂芳基C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10酰基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;
或,X3、Y3与连接的邻位双酮构成4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮;所述C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮可由1、2或3个C6-C12芳基或5-12元杂芳基与4-10元脂环烃基二酮或5-10元杂环二酮形成并环结构;所述5-10元杂环二酮是指环中含有选自N、O或S中的1、2、3或4个杂原子,且环碳被两个氧代基团取代的饱和或部分不饱和的单环或多环非芳香性杂环化合物;优选地,所述4-10元脂环烃基二酮选自邻位环丁二酮、邻位环戊二酮、邻位环己二酮、邻位环庚二酮或邻位环辛二酮;所述5-10元杂环二酮选自吡咯-2,3-二酮、呋喃-2,3-二酮、噻吩-2,3-二酮;更优选地,X和Y与连接的邻位双酮构成4-10元环烷二酮、二氢吲哚-2,3-二酮、1,2-茚满二酮或菲-9,10-二酮;所述4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮、4-10元环烷二酮、二氢吲哚-2,3-二酮、1,2-茚满二酮或菲-9,10-二酮可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基的取代基所取代;优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C10烷基C1-C10烷基氧基、C1-C10烷基C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基中的取代基所取代;更优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基中的取代基所取代;进一步优选地被一个或多个选自卤素(特别是氟、氯、溴)、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基、乙氧基)、C1-C4烷胺基、C1-C4烷巯基、C1-C4酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷胺基、C3-C7环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基中的取代基所取代。
(4)方法四:
如反应式I-4所示,在磷酸吡哆醛(PLP)存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位酮酸酯化合物1-4发生羰基加成反应生成化合物2-b,然后化合物2-b中与X4相连的酯羰基与α-氨基自发成环,并脱去X4基团,生成化合物2-4,其为Type IV类非天然氨基酸;
其中,
X4为C1-C10烃基氧基,优选为C1-C10烷氧基,更优选为C1-C6烷氧基,进一步优选为C1-C4烷氧基(特别是乙氧基);
Y4选自C1-C10烃基、C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;优选选自C1-C10烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C8烷基或5-12元杂芳基C1-C8烷基;优选选自C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;更优选地,Y4选自C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基(特别是苯乙基);所述C1-C10烃基、C1-C10烷基、C1-C6烷基、C1-C4烷基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基的取代基所取代;所述C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基C1-C8烷基、5-12元杂芳基C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基C1-C6烷基、5-12元杂芳基C1-C6烷基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;
在具体的实施方式中:邻位双酮化合物1-1选自以下结构:
其中R1、R2定义如前所述;
优选地,邻位双酮化合物1-1选自以下结构:
在具体的实施方式中,邻位双酮化合物1-2选自以下结构:
R3定义如前所述;
优选地,邻位双酮化合物1-2选自以下结构:
在具体的实施方式中,邻位双酮化合物1-3选自以下结构:
在具体的实施方式中,邻位酮酸酯化合物1-4选自以下结构:
在具体的实施方式中,所述UstD酶具有:
(a)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列;
或者
(b)对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内,进行一个或者多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加所得到的氨基酸序列。
在具体的实施方式中,所述UstD酶的编码基因序列选自以下组:
(a)如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所述的核苷酸序列;
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸;或
(c)与(a)限定的序列具有至少70%(优选至少75%、80%、85%、90%,更优选至少95%、96%、97%、98%、99%)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在具体的实施方式中,将所述UstD酶的编码基因通过分子克隆技术引入到表达载体中,从而利用大肠杆菌作为宿主异源表达蛋白,所述载体可以选自但不限于pETDuet、PACYCDuet、RRSFDuet、pET28a(+)或者pET-22b9(+)等大肠杆菌表达载体。
在本发明中,所述UstD酶的来源包括但不限于绿核菌、黄曲霉菌,优选UstD来源为黄曲霉菌,或来源于将所述菌种的基因重组表达的大肠杆菌、酵母或者链霉菌等微生物中。
在具体的实施方式中,对反应温度没有特别限制,只要使得UstD酶能够具有催化活性即可,例如可以为15℃-50℃,例如,20、25、30、35、40、45℃等,优选为30℃-40℃。
在具体的实施方式中,对反应pH没有特别限制,只要使得UstD酶能够具有催化活性即可,例如可以为4-11,例如5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5等;优选地,pH为6-9;更优选地pH为7-8。
在具体的实施方式中,对反应时间没有特别限制,只要所需的化合物即可,例如为0.1小时以上,0.5小时以上,1小时以上,例如0.1到120小时,例如5、10、12、15、18、24、30、36、48、60、72、80、100小时等;优选为0.5到80小时;更优选为1到72小时,进一步优选为4-72小时。
在具体的实施方式中,所述反应体系中,所述邻位二酮化合物1和L-天冬氨酸的摩尔比可以为1∶0.1~10,例如1∶0.2、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶7等,优选为1∶2~5。优选地,所述反应体系中,所述邻位二酮化合物起始浓度为0.1-200mM,L-天冬氨酸的起始浓度为0.1-200mM,例如0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200mM等;更优选地,所述邻位二酮化合物起始浓度为4-12mM,L-天冬氨酸的起始浓度为10-40mM。
在具体的实施方式中,所述UstD酶的摩尔浓度是底物(邻位二酮化合物1和L-天冬氨酸)摩尔浓度的0.000001-10倍,例如0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、10倍等,优选为0.0001-1倍。
在具体的实施方式中,所述反应可以在缓冲液(缓冲盐水溶液体系)中进行。通过缓冲液对反应pH进行调节控制,以保持反应稳定进行。常用的缓冲液包括但不限于磷酸盐、Tris、醋酸铵缓冲液。
在具体的实施方式中,所述反应体系还可以含有助溶剂;所述助溶剂为有机溶剂。
在具体的实施方式中,所述助溶剂可以选自:二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮,或者其组合。优选地,所述助溶剂选自二甲基亚砜。所使用的助溶剂应当与水可以混溶,以进一步增加底物的溶解性。优选地,所述助溶剂占反应体系总体积的1%-25%。
在具体的实施方式中,本发明的酶催化方法还包括分离出γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的步骤。
具体地,所述分离出γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的步骤包括:将反应完成且冷冻干燥后的反应物中加入水,离心取上清后,使用快速制备液相色谱纯化产物,用甲醇/水体系纯化产物,其中水相中加入甲酸。
在具体的实施方式中,进行快速制备液相色谱的色谱柱为column;所述甲醇/水体系中,水相中加入0.1%的甲酸,进行梯度洗脱,梯度洗脱程序为:0-30min,1%-70%,50mL/min。
有益效果
本发明以L-天冬氨酸和邻位二酮化合物为底物,使用特定序列的UstD酶来催化合成制备高光学纯度的多官能团非天然氨基酸,特别是Type I-IV四种类型的手性γ-叔醇-(S)-α-氨基酸。该方法在实验操作上简单可行、选择性好、转化率高,对底物的最高转化率可达到99%,所获得产物的d.r.值可大于99∶1,反应条件温和、绿色环保,为工业化生产高光学纯度的非天然氨基酸提供了新的思路与策略,具有工业推广的潜力。
附图说明
图1是实施例1中载有SEQ ID NO:2的pET-28a(+)(左)和SEQ ID NO:4的pET-22b(+)(右)载体结构。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明,需要声明的是,下述实施例仅仅作为解释和说明,不以任何方式限制本发明的范围。
术语
除非另有说明,本文所用术语有如下定义:
如本文所用,术语“卤素”是指氟、氯、溴及碘;优选为氟、氯或溴。
如本文所用,术语“烃基”是指直链或支链的饱和或不饱和烃基,指相应的烃失去一个氢原子(H)后剩下的基团,包括烷基、烯基、炔基。例如,“C1-C10烃基”是指包含1-10个碳原子的烃基,可以包括C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基,本文优选为C1-C10烷基。
如本文所用,术语“烷基”是指直链或支链的饱和烃基,例如C1-C10烷基指含有1-10个碳原子的直链或支链的饱和烃基,C1-C6烷基、C1-C4烷基依此类推,烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1-乙基丙基、异戊基、新戊基、异己基、3-甲基戊基或正己基等,优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基或异丁基。
如本文所用,术语“烯基”是指含一个或多个双键且通常长度为2至10个碳原子的直链或支链的烃基。例如,“C2-C8烯基”含有2-8个碳原子。本文C2-C10烯基优选为C2-C6烯基,更优选为C2-C4烯基。烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、庚烯基、辛烯基等。
如本文所用,术语“炔基”表示含一个或多个三键且通常长度为2至10个碳原子的直链或支链的烃基。例如,“C2-C8炔基”含有2-8个碳原子。本文中的C2-C10炔基优选为C2-C6炔基,更优选为C2-C4炔基。炔基包括但不限于例如乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、庚炔基、辛炔基等。
如本文所用,术语“烃基氧基”是指直链或支链的饱和或不饱和烃基与氧原子连接形成的基团;例如,“C1-C10烃基氧基”可以包括C1-C10烷基氧基、C2-C10烯基氧基、C2-C10炔基氧基,其中,C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基定义如前所述。本文优选为C1-C10烷基氧基,更优选为C1~C6烷氧基、C1~C4烷氧基,例如,甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、异己氧基、3-甲基戊氧基或正己氧基等,优选为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基或异丁氧基。
如本文所用,术语“烃基胺基”是指直链或支链的饱和或不饱和烃基与胺基连接形成的基团,包括一烃基取代胺基或二烃基取代胺基;例如,“C1-C10烃基胺基”可以包括C1-C10烷基胺基、C2-C10烯基胺基、C2-C10炔基胺基,其中,C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基定义如前所述。本文优选为C1-C10烷基胺基,更优选为C1~C6烷胺基、C1~C4烷胺基,例如,甲胺基、乙胺基、正丙胺基、异丙胺基、正丁胺基、异丁胺基、叔丁胺基、仲丁胺基、正戊胺基、异戊胺基、新戊胺基、异己胺基、3-甲基戊胺基或正己胺基等,优选为甲胺基、乙胺基、正丙胺基、异丙胺基、正丁胺基或异丁胺基。
如本文所用,术语“烃基巯基”是指直链或支链的饱和或不饱和烃基与硫原子连接形成的基团;例如,“C1-C10烃基巯基”可以包括C1-C10烷基巯基、C2-C10烯基巯基、C2-C10炔基巯基,其中,C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基定义如前所述。本文优选为C1-C10烷基巯基,更优选为C1~C6烷巯基、C1~C4烷巯基,例如,甲巯基、乙巯基、正丙巯基、异丙巯基、正丁巯基、异丁巯基、叔丁巯基、仲丁巯基、正戊巯基、异戊巯基、新戊巯基、异己巯基、3-甲基戊巯基或正己巯基等,优选为甲巯基、乙巯基、正丙巯基、异丙巯基、正丁巯基或异丁巯基。
如本文所用,术语“酰基”是指直链或支链的饱和或不饱和烃基与羰基连接形成的基团,优选为烷基酰基,例如“C1-C10酰基”是指含有10个碳的酰基,本文优选为C1-C8酰基、C1-C6酰基、C1-C4酰基,进一步优选为甲酰基、乙酰基、丙酰基等。
如本文所用,术语“脂环烃基”是指饱和脂环烃和不饱和脂环烃(分子中含有一个或多个碳碳双键),例如环烷基、环烯基、环炔基,也包括单环和多环脂环烃基。例如,“C3-C10脂环烃基”可以包括C3-C10环烷基、C3-C10环烯基、C3-C10环炔基,本文优选为C3-C10环烷基。
如本文所用,“C3-C10环烷基”是指含有3-10个碳原子的饱和单环、双环或三环烃基,“C3-C7环烷基”依此类推,本文优选为单环烷基,例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基、环庚基。
如本文所用,“C3-C10环烯基”是指分子中含有一个或多个双键的单环或二环的环状烯基,例如包括环丙烯基,环丁烯基,环戊烯基,环己烯基,及桥环(如降莰烯基)、螺环或融合环的环状烯基。支化环烯基诸如1-甲基环丙烯基和2-甲基环丙烯基包括在“环烯基”的定义中。如本文所用,“C3-C10环炔基”是指分子中含有一个或多个三键的单环或二环的环状炔基。
如本文所用,术语“脂环烃基氧基”是指饱和脂环烃和不饱和脂环烃(分子中含有一个或多个碳碳双键)与氧原子连接形成的基团,包括环烷基氧基、环烯基氧基、环炔基氧基。例如,“C3-C10脂环烃基氧基”可以包括C3-C10环烷基氧基、C3-C10环烯基氧基、C3-C10环炔基氧基,本文优选为C3-C7烷基氧基,更优选为C3~C6环烷氧基、C5~C6环烷氧基。
如本文所用,术语“脂环烃基胺基”是指饱和脂环烃和不饱和脂环烃(分子中含有一个或多个碳碳双键)与胺基连接形成的基团,包括一脂环烃基取代胺基和二脂环烃基取代胺基。其包括环烷基胺基、环烯基胺基、环炔基胺基。例如,“C3-C10脂环烃基胺基”可以包括C3-C10环烷基胺基、C3-C10环烯基胺基、C3-C10环炔基胺基,本文优选为C3-C7烷基胺基,更优选为C3~C6环烷胺基、C5~C6环烷胺基。
如本文所用,术语“脂环烃基巯基”是指饱和脂环烃和不饱和脂环烃(分子中含有一个或多个碳碳双键)与硫原子连接形成的基团,包括环烷基巯基、环烯基巯基、环炔基巯基。例如,“C3-C10脂环烃基巯基”可以包括C3-C10环烷基巯基、C3-C10环烯基巯基、C3-C10环炔基巯基,本文优选为C3-C7烷基巯基,更优选为C3~C6环烷巯基、C5~C6环烷巯基。
如本文所用,术语“C6-C12芳基”是指包含6-12个环原子但环原子中不含杂原子的单环或多环芳香族环基,“C6-C10芳基”依此类推,例如苯基、萘基。
如本文所用,术语“5-12元杂芳基”是指含有1-4个、优选1-3个选自N、O或S的环杂原子的5-12元、优选5-10元、更优选5-7元或5-6元芳香族环系,包括单环或二环或稠合多环,其余环原子为碳原子。杂芳基的实例包括但不限于:吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、吡啶基、吡喃基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、噁嗪基、噁二嗪基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并噁嗪基、2H-色烯、苯并吡喃基、苯并噻吩基、吲哚基、吲唑基、苯并吡唑、苯并咪唑基、咪唑并吡啶基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、7-氮杂吲哚基、6-氮杂吲哚基、5-氮杂吲哚基、4-氮杂吲哚基、1H-苯并[d][1,2,3]三唑基、[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶、吡唑并[1,5-a]吡啶等。如本文所用,术语“C6-C12芳基C1-C10烃基”是指C6~C12芳基与C1~C10烃基连接,包括C6-C12芳基C1-C10烷基、C6-C12芳基C2-C10烯基、C6-C12芳基C2-C10炔基,本文优选为C6-C12芳基C1-C10烷基,更优选为C6-C12芳基C1-C6烷基、C6-C12芳基C1-C4烷基,例如苄基、苯乙基、苯丙基等。
如本文所用,术语“5-12元杂芳基C1-C10烃基”是指是指5-12元杂芳基与C1~C10烃基连接,包括5-12元杂芳基C1-C10烷基、5-12元杂芳基C2-C10烯基、5-12元杂芳基C2-C10炔基,本文优选为5-12元杂芳基C1-C10烷基,更优选为5-12元杂芳基C1-C6烷基、5-12元杂芳基C1-C4烷基,例如吡咯基甲基、呋喃基甲基、噻吩基乙基等。
如本文所用,术语“4-10元脂环烃基二酮”是指C5-C10饱和脂环烃和不饱和脂环烃(分子中含有一个或多个碳碳双键)的环碳被两个氧代基团取代得到的化合物,本文优选两个氧代基团为邻位,优选为“4-10元环烷二酮”,即C4-C10环烷化合物的环碳被两个氧代基团取代得到的化合物,例如1,2-环丁二酮、1,2-环戊二酮、1,2-环己二酮、2,3-环己二酮、1,2-环庚二酮、2,3-环庚二酮、1,2-环辛二酮、2,3-环辛二酮、3,4-环辛二酮等。
如本文所用,术语“5-10元杂环二酮”为环中含有选自N、O或S中的1、2、3或4个杂原子,且环碳被两个氧代基团取代的饱和或部分不饱和的单环或多环非芳香性杂环化合物,本文优选两个氧代基团为邻位,例如吡咯-2,3-二酮、呋喃-2,3-二酮、噻吩-2,3-二酮等。
如本文所用,“氧代”是指“=O”,即氧原子通过双键与其它原子连接。
主要试剂与耗材:
带有SEQ ID NO:2的pET-28a(+)或带有SEQ ID NO:4的pET-22b(+)质粒均从GenScript购买。表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)从Sangon Biotech购买。
抗生素卡那霉素、异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和二硫苏糖醇(DTT)购自Sangon Biotech科技公司。L-天冬氨酸购自RHAWN。酮类底物购自J&K SCIENTIFIC LTD和bidephamarmatech。磷酸吡哆醛(PLP)购自J&K。氘化溶剂从J&K SCIENTIFIC LTD购买。高压细胞破碎剂和Ni NTA unionrose 6FF琼脂糖从Union Biotech购买。
实施例一:蛋白表达
通过热击法将带有SEQ ID NO:2的pET-28a(+)或带有SEQ ID NO:4的pET-22b(+)转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Condon Plus感受态细胞菌株。带有SEQ ID NO:2的pET-28a(+)或带有SEQ ID NO:4的pET-22b(+)的载体结构如图1所示。转化细胞首先在固体培养基(含50μg/ml卡那霉素或35μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板)上37℃恒温培养12h,在超净工作台中使用无菌接种环将菌落挑至150ml液体培养基(含有50μg/ml卡那霉素或35μg/ml氨苄青霉素的LB培养基)37℃、180rpm过夜培养。将1L过夜液体培养基分装至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基的3L摇瓶中,37℃、180rpm培养细胞四至六小时,直到OD 600达到1.0。将培养物冷却至18℃,并补充100μM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。18℃下过夜培养20小时。在13000rpm离心15分钟收集细胞,并在-20℃下储存。
实施例二:蛋白纯化
将10g收集的菌体细胞悬浮于50ml的细胞裂解液中(50mM的磷酸钠盐,300mM的NaCl,pH=8)。使用高压均质机常压破碎三次,粉碎体积较大菌体颗粒,加压至700-800KPa,破碎三次,破碎细胞壁,使得目标蛋白酶从菌体内裂解出来,便于后续纯化。4℃下离心裂解液18000rpm 15min,除去不溶性杂质,将裂解上清液均速缓慢地加载至Ni NTA Unionrose6FF琼脂糖柱。上样3-4次蛋白吸附至镍柱后,依次用含有150mM、200mM咪唑的细胞裂解液洗去杂蛋白,然后再用含有500mM的咪唑裂解缓冲液洗脱蛋白质,收集含有蛋白质的部分,用透析缓冲液透析(50mM的磷酸钠盐,50mM的NaCl,pH=7.4)。透析后可直接使用目标蛋白酶。
实施例三:反应转化率、d.r值、收率的计算
反应总体积1-40ml,液体反应体系中加入4mM-12mM的邻位双酮底物、10-40mM L-天冬氨酸、1mM DTT、100μM磷酸吡哆醛(PLP)和50mM磷酸钠、50mM NaCl、0.3mg/mLUstD,根据底物的溶解性不同,可以加入适量的DMSO助溶,DMSO的比例约为1%-25%,v/v,在pH=7.4、37℃条件下反应1-72小时。
(1)将反应完毕的反应混合物冷冻干燥,加入约600μl的氘代水,离心取上清液,采集1H NMR核磁谱图,通过对产物、副产物L-丙氨酸、还剩余没有反应完的L-天冬氨酸的特征氢信号进行积分,计算反应的转化率和收率;
(2)取20μl反应完毕的反应混合物,加入180μl的50%的甲醇-水溶液,混匀,过滤,UPLC-MS检测,提取所需的分子量,对差相异构体进行峰面积积分,得出产物γ-位羟基所连碳的d.r值;
(3)将反应完毕的反应混合物冷冻干燥,加入约5ml-10ml的水提取产物,离心取上清液,使用快速制备液相色谱柱column(SD-8101-120,120g)纯化产物,用甲醇/水体系纯化产物(水相中加入0.1%的甲酸),(0-30min,1%-70%,50mL/min)梯度洗脱,收集含有产物的组分,通过旋转蒸发仪器去除溶剂以得到产物,用氘代试剂溶解,通过1HNMR、13CNMR谱,以及二维谱HSQC、HMBC等核磁技术以及结合高分辨质谱等手段鉴定和验证产物结构。
邻位双酮化合物的结构和浓度、L-天冬氨酸的浓度、反应时间、反应产物结构、产物d.r值、反应转化率和收率如下表1所示,产物的1H NMR和高分辨质谱表征数据如表2所示。
表1
表2
Claims (10)
1.一种合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,所述酶催化方法包括:在磷酸吡哆醛存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位双酮化合物1发生羰基加成反应,生成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸2,如反应式I所示:
其中,X、Y各自独立地选自C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;其中,所述C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基中的取代基所取代,所述C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基、5-12元杂芳基C1-C10烃基可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;
或,X和Y与连接的邻位双酮构成4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮;所述杂环二酮是指环中含有选自N、O或S中的1、2、3或4个杂原子,且环碳被两个氧代基团取代的饱和或部分不饱和的单环或多环非芳香性杂环化合物;所述4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;
可选地,所述方法中的γ-叔醇-(S)-α-氨基酸2进一步通过与X相连的羰基与α-氨基发生自发成环反应而成环。
2.根据权利要求1所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,
X、Y各自独立地选自C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;
优选地,X、Y各自独立地选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基;
更优选地,X、Y各自独立地选自C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基、乙氧基)、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基(特别是苯乙基);
优选地,所述C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基中的取代基所取代;
所述C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基、5-12元杂芳基C1-C10烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基C1-C6烷基、C6-C12芳基C1-C4烷基可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;
优选地,所述4-10元脂环烃基二酮选自邻位环丁二酮、邻位环戊二酮、邻位环己二酮、邻位环庚二酮或邻位环辛二酮,所述5-10元杂环二酮选自吡咯-2,3-二酮、呋喃-2,3-二酮、噻吩-2,3-二酮;
优选地,所述4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C10烷基C1-C10烷基氧基、C1-C10烷基C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基中的取代基所取代;优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基中的取代基所取代;进一步优选地被一个或多个选自卤素(特别是氟、氯、溴)、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基、乙氧基)、C1-C4烷胺基、C1-C4烷巯基、C1-C4酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷胺基、C3-C7环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基中的取代基所取代;
更优选地,X和Y与连接的邻位双酮构成4-10元环烷二酮、二氢吲哚-2,3-二酮、1,2-茚满二酮或菲-9,10-二酮;
所述4-10元环烷二酮、二氢吲哚-2,3-二酮、1,2-茚满二酮或菲-9,10-二酮可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C10烷基C1-C10烷基氧基、C1-C10烷基C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基中的取代基所取代;更优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基中的取代基所取代;进一步优选地被一个或多个选自卤素(特别是氟、氯、溴)、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基、乙氧基)、C1-C4烷胺基、C1-C4烷巯基、C1-C4酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷胺基、C3-C7环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基中的取代基所取代。
3.根据权利要求1所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,所述酶催化方法选自下列方法一至四之一:
(1)方法一:
如反应式I-1所示,在磷酸吡哆醛存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位双酮化合物1-1发生羰基加成反应生成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸2-1,其为Type I类非天然氨基酸;
其中,
环A为C6-C12的芳基环或5-12元的杂芳基环;
Z选自NR2、O、S;
m为0-12的整数;优选地,m为0-10的整数;
各R1独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;
R2选自氢、C1-C10酰基、C1-C10烃基、C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;
(2)方法二:
如反应式I-2所示,在磷酸吡哆醛存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位双酮化合物1-2发生羰基加成反应生成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸2-2,其为Type II类非天然氨基酸;
其中,
环B为C6-C12的芳基环或5-12元的杂芳基环;
n为0-12的整数;优选地,n为0-10的整数;
p为0-6的整数;
优选地,p为0-4的整数;
各R3独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;
(3)方法三:
如反应式I-3所示,在磷酸吡哆醛存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位双酮化合物1-3发生羰基加成反应生成化合物2-a,然后化合物2-a中与X3相连的羰基与α-氨基自发成环生成化合物2-3,其为Type III类非天然氨基酸;
其中,
X3、Y3各自独立地选自C1-C10烃基、C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;其中,所述C1-C10烃基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基的取代基所取代;所述的C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10酰基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;
或X3、Y3与连接的邻位双酮构成4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮;所述C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮由1、2或3个C6-C12芳基或5-12元杂芳基与4-10元脂环烃基二酮或5-10元杂环二酮形成并环结构;所述5-10元杂环二酮是指环中含有选自N、O或S中的1、2、3或4个杂原子,且环碳被两个氧代基团取代的饱和或部分不饱和的单环或多环非芳香性杂环化合物;所述4-10元脂环烃基二酮、5-10元杂环二酮、C6-C12芳基并4-10元脂环烃基二酮、5-12元杂芳基并4-10元脂环烃基二酮、C6-C12芳基并5-10元杂环二酮、5-12元杂芳基并5-10元杂环二酮可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基的取代基所取代;
(4)方法四:
如反应式1-4所示,在磷酸吡哆醛存在下,UstD酶催化L-天冬氨酸脱羧并和邻位酮酸酯化合物1-4发生羰基加成反应生成化合物2-b,然后化合物2-b中与X4相连的酯羰基与α-氨基自发成环,并脱去X4基团,生成化合物2-4,其为Type IV类非天然氨基酸;
其中,
X4为C1-C10烃基氧基;
Y4选自C1-C10烃基、C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基;其中,所述C1-C10烃基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基的取代基所取代;所述C3-C10脂环烃基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代。
4.根据权利要求3所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,
方法一中,
各R1独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;
优选地,各R1独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;
进一步优选地,各R1独立地选自卤素(特别是氟、氯、溴)、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基)、C1-C4烷基胺基、C1-C4烷基巯基、C1-C4酰基、C3-C6环烷基、C3-C6环烷氧基、C3-C6环烷胺基、C3-C6环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;
R2选自氢、C1-C8酰基、C1-C10烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;
R2优选选自氢、C1-C6酰基、C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;
R2进一步优选为氢、C1-C4酰基、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基)、C3-C6环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基;
方法二中,
各R3独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;
优选地,各R3独立地选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;
进一步优选地,各R3独立地选自卤素(特别是氟、氯、溴)、C1-C4烷基(特别是甲基)、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基胺基、C1-C4烷基巯基、C3-C6环烷基、C3-C6环烷氧基、C1-C4酰基、C3-C6环烷胺基、C3-C6环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;
方法三中,
X3、Y3各自独立地选自C1-C10烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基;
优选地,X3、Y3各自独立地选自C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;所述C1-C10烷基、C1-C6烷基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基的取代基所取代;
所述的C3-C10环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基、5-12元杂芳基C1-C10烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基C1-C6烷基、5-12元杂芳基C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10酰基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代;
更进一步优选地,X3、Y3各自独立地选自C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C3-C6环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基;
优选地,所述4-10元脂环烃基二酮选自邻位环丁二酮、邻位环戊二酮、邻位环己二酮、邻位环庚二酮或邻位环辛二酮;所述5-10元杂环二酮选自吡咯-2,3-二酮、呋喃-2,3-二酮、噻吩-2,3-二酮;
或,X和Y与连接的邻位双酮构成4-10元环烷二酮、二氢吲哚-2,3-二酮、1,2-茚满二酮或菲-9,10-二酮;
所述4-10元环烷二酮、5-10元杂环二酮、二氢吲哚-2,3-二酮、1,2-茚满二酮或菲-9,10-二酮可选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基的取代基所取代;优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基巯基、C1-C10烷基C1-C10烷基氧基、C1-C10烷基C1-C10烷基胺基、C1-C10烷基C1-C10烷基巯基、C1-C8酰基、C3-C10环烷基、C3-C10环烷氧基、C3-C10环烷胺基、C3-C10环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烷基或5-12元杂芳基C1-C10烷基中的取代基所取代;更优选地被一个或多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基胺基、C1-C6烷基巯基、C1-C6酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基胺基、C3-C7环烷基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基中的取代基所取代;进一步优选地被一个或多个选自卤素(特别是氟、氯、溴)、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C1-C4烷氧基(特别是甲氧基、乙氧基)、C1-C4烷胺基、C1-C4烷巯基、C1-C4酰基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷胺基、C3-C7环烷巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基中的取代基所取代;
方法四中,
X4为C1-C10烷氧基,优选为C1-C6烷氧基,进一步优选为C1-C4烷氧基(特别是乙氧基);
Y4选自C1-C10烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C8烷基或5-12元杂芳基C1-C8烷基;
优选地,Y4选自C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C6烷基或5-12元杂芳基C1-C6烷基;
更优选地,Y4选自C1-C4烷基(特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基)、C3-C7环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基(特别是苯乙基);
所述C1-C10烷基、C1-C6烷基、C1-C4烷基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基的取代基所取代;
所述C3-C10环烷基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C8烷基、5-12元杂芳基C1-C8烷基、C3-C7环烷基、C6-C12芳基C1-C6烷基、5-12元杂芳基C1-C6烷基、C6-C12芳基C1-C4烷基或5-12元杂芳基C1-C4烷基可选地被一个或者多个选自卤素、硝基、羟基、胺基、巯基、C1-C10烃基、C1-C10烃基氧基、C1-C10烃基胺基、C1-C10烃基巯基、C1-C10酰基、C3-C10脂环烃基、C3-C10脂环烃基氧基、C3-C10脂环烃基胺基、C3-C10脂环烃基巯基、C6-C12芳基、5-12元杂芳基、C6-C12芳基C1-C10烃基或5-12元杂芳基C1-C10烃基中的取代基所取代。
5.根据权利要求3所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,所述邻位双酮化合物1-1选自以下结构:
其中R1、R2定义如权利要求3所述;
优选地,所述邻位双酮化合物1-1选自以下结构:
和/或,所述邻位双酮化合物1-2选自以下结构:
R3定义如权利要求3所述;
优选地,所述邻位双酮化合物1-2选自以下结构:
和/或,所述邻位双酮化合物1-3选自以下结构:
和/或,所述邻位酮酸酯化合物1-4选自以下结构:
6.根据权利要求1-5任一项所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,所述UstD酶具有:
(a)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列;或者,
(b)对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内,进行一个或者多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加所得到的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-5任一项所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,所述UstD酶的编码基因序列选自:
(a)如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所述的核苷酸序列;
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸;或
(c)与(a)限定的序列具有至少70%(优选至少75%、80%、85%、90%,更优选至少95%、96%、97%、98%、99%)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
8.根据权利要求1-5任一项所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,所述反应温度为15℃-50℃,优选为30℃-40℃;
和/或,所述反应pH为4-11;优选地,pH为6-9;更优选地pH为7-8;
和/或,所述反应时间为0.1到120小时,优选为0.5到80小时,更优选为1到72小时,进一步优选为4-72小时;
和/或,所述邻位二酮化合物1和L-天冬氨酸的摩尔比为1∶0.1~10,优选为1∶2~5;
优选地,所述反应体系中,所述邻位二酮化合物起始浓度为0.1-200mM,L-天冬氨酸的起始浓度为0.1-200mM;更优选地,所述邻位二酮化合物起始浓度为4-12mM,L-天冬氨酸的起始浓度为10-40mM;
和/或,所述UstD酶的摩尔浓度是底物邻位二酮化合物1和L-天冬氨酸摩尔浓度的0.000001-10倍,优选为0.0001-1倍;
和/或所述反应在缓冲液中进行,所述缓冲液包括磷酸盐、Tris、醋酸铵缓冲液。
9.根据权利要求1-5任一项所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,所述反应体系还含有助溶剂;所述助溶剂为有机溶剂,所述有机溶剂选自:二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮,或者其组合,优选为二甲基亚砜;优选地,所述助溶剂占反应体系总体积的1%-25%。
10.根据权利要求1-5任一项所述合成γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的酶催化方法,其特征在于,所述酶催化方法还包括分离出γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的步骤;
优选地,所述分离出γ-叔醇-(S)-α-氨基酸的步骤包括:将反应完成且冷冻干燥后的反应物中加入水,离心取上清后,使用快速制备液相色谱纯化产物,用甲醇/水体系纯化产物,其中水相中加入甲酸;
更优选地,进行快速制备液相色谱的色谱柱为column;所述甲醇/水体系中,水相中加入0.1%的甲酸,进行梯度洗脱,梯度洗脱程序为:0-30min,1%-70%,50mL/min。
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