CN117471098B - 肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片，包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道左端与盖片上开设的缓冲液加样孔连通，右端与第二废液区连通，所述微通道从左到右依次设置有标记区、检测区、样本加样区，所述标记区与检测区之间设置有第一废液区，所述第一废液区设置在所述微通道宽度方向的两端，并通过控制阀与所述微通道相连通，所述检测区设置有第一检测位点、第二检测位点、共用参考点，所述标记区设置有标记抗人IgM抗体，所述第一检测位点设置有肺炎支原体重组抗原，所述第二检测位点设置有肺炎衣原体重组抗原。可以消除间接法中非特异性IgM抗体干扰。

Description

肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片及应用

技术领域

本发明属于体外诊断及免疫检测技术领域，特别涉及一种肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片及应用。

背景技术

肺炎支原体（mycoplasmal pneumonia，MP）是介于细菌与病毒之间的已知能独立生活的最小病原微生物，由于缺少细胞壁，其形态高度多样化。MP主要通过飞沫传播，是引起儿童呼吸道感染的常见病原体，全球感染率约为9.6%-66.7%。近年来，MP已成为儿童社区获得性肺炎（community acquired pneumonia,CAP）最常见的病原体之一，约占CAP病原的10%-30%不等。研究发现，MP不仅可以引起上呼吸道感染和下呼吸道感染，也可导致重症肺炎，并且遗留有肺不张、支气管扩张等后遗症。

肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae，CP）是一种专性细胞内致病微生物，是成人和儿童呼吸道感染的常见病原体，不仅能引起咽炎、鼻窦炎、中耳炎，以及下呼吸道感染如急性支气管炎和肺炎，而且在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病的发病中也起着重要的作用，严重者可造成多系统、多器官的损伤。

病原体入侵机体后，刺激机体启动免疫应答反应，分为初次免疫应答与再次免疫应答。其中初次免疫应答产生抗体的潜伏期较长，抗体量少，且与抗原结合的亲和力较低。此期出现最早的抗体为IgM抗体，可在血液中维持数周或数月。后期可产生IgG抗体，当IgM抗体接近消失时，正是IgG抗体达到高峰的时期，其在血液中维持的时间较长可达数年以上。在初次免疫应答的终末期，抗原被清除，大量浆细胞和效应T细胞死亡，体内抗体水平逐渐下降，机体免疫系统又恢复到自身稳定的基础状态。当病原体再次入侵机体时，体内的记忆性淋巴细胞可快速、特异、高效的产生再次免疫应答反应。再次免疫应答产生抗体的潜伏期短，主要为IgG抗体，抗体浓度高，亲和力高，且持续时间长。因此，由病原体所致的感染性疾病早期，检测病原体特异性IgM抗体有较大的诊断价值，而病原体特异性IgG抗体检测主要反映既往感染，无法进行早期诊断，主要用于流行病学调查。

病原体IgM抗体检测在常规层析或侧向流分析中，在检测区包被病原体的重组抗原，在标记区放置标记抗人IgM抗体。滴加样本后，样本中的IgM抗体（包括特异性IgM抗体和非特异性IgM抗体）首先与标记抗人IgM抗体结合，随后与检测区包被的病原体重组蛋白结合，形成抗原-特异性IgM抗体-标记抗人IgM抗体复合物。但在此种模式下，标本中非特异性IgM抗体会产生干扰，中和标记抗人IgM抗体，分析敏感度不能满足临床需求。

发明内容

本发明针对现有病原体IgM抗体在常规侧向流检测的不足，提供一种肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片及应用，利用该芯片可有效规避非特异性IgM抗体的干扰，提高分析敏感度。

为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的，一种肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片，包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道左端与盖片上开设的缓冲液加样孔连通，右端与第二废液区连通，所述第二废液区控制微通道内液体向第二废液区的流动，所述微通道从左到右依次设置有标记区、检测区、样本加样区，所述标记区与检测区之间设置有第一废液区，所述第一废液区设置在所述微通道宽度方向的两端，并通过控制阀与所述微通道相连通，所述检测区设置有第一检测位点、第二检测位点、共用参考点，所述标记区设置有标记抗人IgM抗体，所述第一检测位点设置有肺炎支原体重组抗原，所述第二检测位点设置有肺炎衣原体重组抗原。

在本发明的一个实施方案中，所述第一废液区、第二废液区均设置在所述盖片下表面，所述第一废液区、第二废液区均设置有吸水材料，所述第一废液区为矮圆柱形，所述第二废液区的吸水材料为可移动的滤纸片，所述滤纸片移动时接触或远离所述微通道。

在本发明的一个实施方案中，所述样本加样区包括所述盖片上设置的样本加样孔，所述样本加样孔与所述微通道相连通。

在本发明的一个实施方案中，所述控制阀设置在所述盖片上，所述控制阀为设置在所述微通道内的两个弧形挡板，且外弧面朝向标记区，所述弧形挡板一端伸入所述微通道并向所述检测区延伸，另一端与所述第一废液区相连。

在本发明的一个实施方案中，所述标记区、检测区均设置在所述基片上表面，所述第一检测位点、第二检测位点、共用参考点在检测区从左到右依次分布。

在本发明的一个实施方案中，所述标记抗人IgM抗体为荧光微球标记的抗体。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述任一一个技术方案中的芯片对肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体进行联合检测的应用，包括至少以下步骤：

1）在样本加样区滴加样本，液体流动方向是由右向左移动，样本中的靶分析物优先以侧向流方式与检测区的肺炎支原体/肺炎衣原体重组抗原结合，剩余样本或样本中其它物质被收集在第一废液区；

2）在缓冲液加样孔注入蒸馏水，同时将位于第二废液区的滤纸片左移，与微通道内液体接触，液体由左向右移动，溶解标记区的标记抗人IgM抗体，标记抗体继续移动至检测区，与已被捕获的待检肺炎支原体/肺炎衣原体-特异性IgM抗体结合，而过剩的标记抗体随液体流动被收集在第二废液区；

3）按常规微流控读取检测区和共用参考区的信号值，获得比值：检测区信号值/共用参考区信号值，并根据比值进行后续的定性检测。

通过上述技术方案得到的一种肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片及应用，其有益效果是：

规避非特异性IgM抗体干扰：本技术发明提出的双向和双驱模式，在滴加样本后，样本首先流至检测区，样本中的待检病原体特异性IgM抗体与此处包被的重组抗原结合，而非特异性IgM抗体和其他干扰物质在第一驱动力的作用下进入第一废液区；随后于缓冲液加样孔加入蒸馏水，溶解缓冲干粉，并溶解标记区的标记抗体，流至检测区时，与已被捕获的病原体特异性IgM抗体结合，可以巧妙消除间接法中非特异性IgM抗体的干扰。

附图说明

图1是本发明所述微流控芯片的结构示意图；

图2是本发明所述基片上表面的结构示意图；

图3是本发明所述盖片下表面的结构示意图；

图4是本发明所述微流控芯片在S孔滴加液体的原理图；

图5是本发明所述微流控芯片在B孔滴加液体的原理图；

图6是本发明其中一个技术方案的肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测芯片的结构示意图;

图7是本发明在图6的芯片上滴加待测样本后的原理图；

图8是本发明在图6的芯片上滴加蒸馏水后的原理图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明总体来说涉及免疫检测技术领域，涉及肺炎支原体和肺炎衣原体IgM抗体的联合检测，本技术发明的核心基于微流控技术，设计一种“双向+双驱”的免疫微流控芯片，采用间接法同时检测肺炎支原体与肺炎衣原体IgM抗体，可有效规避非特异性IgM抗体的干扰。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的解释说明，可以理解的是，本发明并不限于描述的具体实施方式。

如图1所示，本发明提出一种肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片，包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道左端与盖片上开设的缓冲液加样孔B连通，右端与第二废液区W2连通，所述第二废液区W2控制微通道内液体向第二废液区W2的流动，所述微通道从左到右依次设置有标记区L、检测区、样本加样区，所述标记区L与检测区之间设置有第一废液区W1，所述第一废液区W1设置在所述微通道宽度方向的两端，并通过控制阀V与所述微通道相连通，控制阀V控制微通道内的液体在从右往左流动时，液体从检测区向第一废液区流动，所述检测区设置有第一检测位点T1、第二检测位点T2、共用参考点R，所述标记区L设置有标记抗人IgM抗体，所述第一检测位点T1设置有肺炎支原体重组抗原（下称：MP重组抗原），所述第二检测位点T2设置有肺炎衣原体重组抗原（下称：CP重组抗原）。MP重组抗原\CP重组抗原可以与靶分析物、标记抗人IgM抗体结合，形成双抗体夹心复合物。

如图3所示，所述第一废液区W1、第二废液区W2均设置在所述盖片下表面，所述第一废液区W1、第二废液区W2均设置有吸水材料，所述第一废液区W1为矮圆柱形，所述第二废液区W2的吸水材料为可移动的滤纸片，所述滤纸片移动时接触或远离所述微通道。

所述控制阀V设置在所述盖片上，所述控制阀V为设置在所述微通道内的两个弧形挡板，且外弧面朝向标记区，所述弧形挡板一端伸入所述微通道并向所述检测区延伸，另一端与所述第一废液区W1相连，使微通道内的液体通过检测区向标记区L流动时通过弧形挡板的圆弧内侧流入第一废液区W1，而微通道内的液体通过标记区L向检测区流动时通过弧形挡板的圆弧外侧继续向检测区流动，不流入第一废液区W1。

与常规侧向流微流控相比，本发明设置两个废液区，均设置吸水材料，并作为微流控液体流动的主要驱动力。

其中，第一废液区位于标记区的右侧，分布于微通道的两侧，面积大小和需收集的液体（样本量）相关。第一废液区为固定区域且不能移动，主要作为第一次驱动力，如图4所示，加入样本后，让样本由右侧向左侧逆向流动，位于第二废液区的滤纸片未接触到微通道，由于表面张力作用，液体不会流出，当完成样本与捕获抗体的特异性结合，未参加反应物质被收集于第一废液区。

第二废液区位于右侧终端，且根据需要移动滤纸片来控制液体流动的开启，作为第二次驱动力。如图5所示，此时，于缓冲液孔注入一定蒸馏水，同时启动第二次驱动力，将第二废液区的滤纸片向左移动并接触到微通道，液体进入滤纸片并驱动液体流动。

所述共用参考点R按常规设置，例如设置与标记抗体相匹配的抗抗体，为消除芯片检测过程的误差，分别读取第一检测位点T1、第二检测位点T2和共用参考点R信号值，计算T1/R（或T2/R）。

所述样本加样区包括所述盖片上设置的样本加样孔S，所述样本加样孔S与所述微通道相连通。

如图2所示，所述标记区L、检测区设置在所述基片上表面，所述第一检测位点T1、第二检测位点T2、共用参考点R在检测区从左到右依次分布。

所述标记抗人IgM抗体为荧光微球标记的抗体。

实施例

1. 芯片制备

（1）盖片的制作

双驱双向免疫微流控芯片的制作选用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材料，芯片盖片的微通道结构采用CAD软件进行设计，随后用CO2激光刻蚀机对PMMA表面进行加工处理。

（2）芯片表面改性处理

采用常规的处理方式，如等离子体处理方式对PMMA微流控芯片进行表面改性处理，将原本较为疏水的表面改性为较为亲水的表面。

（3）基片的制作

首先在底片的T1区、T2区、R区分别点样活化亲和素，孵育，清洗底片，干燥后于T1区、T2区、R区依次点样生物素化MP重组抗原、生物素化CP重组抗原、生物素化羊抗鼠IgG多克隆抗体，继续孵育，再次清洗底片后，于L区和B孔对应位置分别点样荧光微球标记鼠抗人IgM抗体和缓冲液，37℃干燥，至此生物芯片制备完成。

（4）双驱双向免疫微流控芯片的组装

首先将吸水材料分别放入对应的第一废液区与第二废液区，然后将制备好的生物芯片与含通道结构的芯片盖片进行键合，微流控芯片制备完成。

微流控芯片生物分子分布

如图6所示，

标记区L：标记鼠抗人IgM抗体。

第一检测区T1：包被MP重组抗原。

第二检测区T2：包被CP重组抗原。

共用参考区R：包被与标记抗体相匹配的抗抗体，如羊抗鼠IgG多克隆抗体。

在此基础上，说明间接法检测病原体IgM抗体的原理。

病原体IgM抗体的检测原理

以病原体是MP-特异性IgM抗体为例，采用双向双驱微流控芯片检测病原体的原理：

本技术发明采用分步间接法，如图7所示，于S孔滴加样本，液体流动方向是由右向左移动，标本中的待检MP-特异性IgM抗体优先以侧向流方式结合T1区的MP重组抗原，剩余液体或标本中其它物质被收集在第一废液区。随后，如图8所示，于B孔注入蒸馏水，溶解缓冲液干粉，同时，将位于第二废液区的滤纸片左移，与微通道内液体接触，使液体由左向右移动，依次溶解荧光微粒标记的抗体，标记抗体继续移动至检测区，与已被捕获的待检MP-特异性IgM抗体结合，未结合的标记抗体继续流动，至参考区被相应物质捕获，而过剩的标记抗体随液体流动被收集在第二废液区。最后，按常规微流控读取T1和R信号值，获得T1/R。

病原体是CP-特异性IgM抗体时，原理和步骤相同，只是结合区域从T1区移至T2区，最终读取T2和R信号值，获得T2/R，在此不再赘述。

另通过检测健康人群，获得临界值 (cut off)，一般设定为1。若待检患者的T1/R（T2/R）大于1报阳性，说明存在MP-特异性IgM抗体（CP-特异性IgM抗体）；小于或等于1报阴性，说明不存在MP-特异性IgM抗体（CP-特异性IgM抗体）。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片，包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，其特征在于，所述微通道左端与盖片上开设的缓冲液加样孔连通，右端与第二废液区连通，所述第二废液区控制微通道内液体向第二废液区的流动，所述微通道从左到右依次设置有标记区、检测区、样本加样区，所述标记区与检测区之间设置有第一废液区，所述第一废液区设置在所述微通道宽度方向的两端，并通过控制阀与所述微通道相连通，所述检测区设置有第一检测位点、第二检测位点、共用参考点，所述标记区设置有标记抗人IgM抗体，所述第一检测位点设置有肺炎支原体重组抗原，所述第二检测位点设置有肺炎衣原体重组抗原，所述共用参考点设置有与标记抗体相匹配的抗抗体；

所述第一废液区、第二废液区均设置在所述盖片下表面，所述第一废液区、第二废液区均设置有吸水材料，所述第一废液区为固定区域且不能移动，所述第二废液区的吸水材料为可移动的滤纸片，所述滤纸片移动时接触或远离所述微通道；

所述样本加样区包括所述盖片上设置的样本加样孔，所述样本加样孔与所述微通道相连通；

所述控制阀设置在所述盖片上，所述控制阀为设置在所述微通道内的两个弧形挡板，且外弧面朝向标记区，所述弧形挡板一端伸入所述微通道并向所述检测区延伸，另一端与所述第一废液区相连。

2.根据权利要求1所述的肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片，其特征在于，所述标记区、检测区均设置在所述基片上表面，所述第一检测位点、第二检测位点、共用参考点在检测区从左到右依次分布。

3.根据权利要求1所述的肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的芯片，其特征在于，所述标记抗人IgM抗体为荧光微球标记的抗体。

4.一种肺炎支原体、肺炎衣原体IgM抗体联合检测的非诊断目的的应用，其特征在于，应用权利要求1-3中任一项的芯片进行检测，包括至少以下步骤：

1）在样本加样区滴加样本，液体流动方向是由右向左移动，样本中的靶分析物优先以侧向流方式与检测区的肺炎支原体/肺炎衣原体重组抗原结合，剩余样本或样本中其它物质被收集在第一废液区；

2）在缓冲液加样孔注入蒸馏水，同时将位于第二废液区的滤纸片左移，与微通道内液体接触，液体由左向右移动，溶解标记区的标记抗人IgM抗体，标记抗体继续移动至检测区，与已被捕获的待检肺炎支原体/肺炎衣原体-特异性IgM抗体结合，而过剩的标记抗体随液体流动被收集在第二废液区；

3）按常规微流控读取检测区和共用参考区的信号值，获得比值：检测区信号值/共用参考区信号值，并根据比值进行后续的定性检测。