CN117467782A - 一种生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及恒温扩增荧光检测技术领域，具体涉及一种生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统。该恒温荧光检测系统，包括微流控芯片，所述微流控芯片包括加样腔和至少一个反应腔，所述加样腔通过缓冲腔和/或流道与反应腔连通，每个所述反应腔内设有冻干球，所述冻干球包括扩增体系和消泡剂，所述扩增体系包括引物组、探针组、Bst DNA聚合酶和RNase HII，每个所述反应腔中的引物组至少包括两个靶标，所述探针组包括至少两个探针，所述探针的序列中包括至少一个RNA碱基。该恒温应该检测系统具有简便、快速且准确的特点，弥补了PCR方法的缺点，兼具成本低廉和可大规模应用推广的优点。

Description

一种生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统
技术领域
本发明涉及恒温扩增荧光检测技术领域，具体涉及一种生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统。
背景技术
性传播疾病(Sexually transmitted diseases,STD)是一类严重危害人类健康的疾病，其发病率逐年增高，尤其在15～25岁的人群中，世界卫生组织已把STD列为一类可以治疗的重要性仅次于癌症的妇科疾病。全球每天逾百万人感染性传播疾病，多数为无症状。每年估计有3.74亿人新增感染以下四种性传播疾病中的一种：衣原体疾病、淋病、梅毒和滴虫病。此外，据估计，世界范围内有1/7以上的妇女感染了人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)；全世界每年分别诊断出约1.28亿和8200万新发沙眼衣原体和淋病奈瑟菌病例。在我国，性传播感染的现状也不容乐观：梅毒、淋病是国家法定传染病中发病数居前5位的病种；淋病发病总人数127803人，发病率为9/10万；2008～2017年中国生殖器疱疹报告发病率为6.14/10万～8.65/10万。
性传播疾病具有以下特点：1.无症状感染人群占比多：大部分性传播感染通常不会引起症状或可能有很长的无症状期，尤其是低危人群更不易发现，可能会在性接触或妊娠期间不知不觉地水平或垂直传播。如感染淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)后，10％男性感染者无症状，50％女性感染者无症状；感染沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，CT)后，50％男性感染者无症状，70％女性感染者无症状。2.交叉混合感染率高：如阴道毛滴虫病常与沙眼衣原体感染和淋病并存，CT/NG感染可能促进HPV、HIV等病毒感染。3.感染症状相似，难以仅从临床表现进行鉴别诊断：如淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、生殖支原体(Mycoplasma genitalium，MG)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)、人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)感染后都可以表现为尿道分泌物增多、排尿困难等尿道炎症状，在没有病原学依据的情况下，很难实现针对病原体的精准治疗。因此，选择特异度和灵敏度高、快速的检测方法对感染早期诊断、治疗和控制具有重要的临床意义。
性传播感染通过污名化、不育症、癌症和妊娠并发症对性健康和生殖健康产生直接影响，并可能增加感染艾滋病毒的风险。由于STD对患者及其性伴所产生的生理和心理问题，对优生优育的危害，为了预防和控制该类疾病的发生和发展，为患者提供早期的治疗，使患者早日康复，STD的早期诊断成为关键。
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)、生殖支原体(Mycoplas magenitalium，MG)、人型支原体(Mycoplasma hominis，MH)是常见的生殖道感染病原体，目前在实验室的检测方法主要为显微镜检查、细胞培养法、血清学检测、核酸检测等。
细胞培养法(培养法)是沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)、解脲脲原体(UU)、生殖支原体(MG)、人型支原体(MH)等疾病的金标准，一般需要数小时或几天才能得到结果，且需要完善的实验设备，有操作复杂、耗时长等缺点，很难在临床工作特别是基层医疗单位应用和推广。
分子生物学的发展为STD等传染病的诊断研究提供了新的发展机遇和挑战。申请号为202010081192.9的中国发明专利公开了一种快速检测沙眼衣原体的RDA方法及试剂盒，该试剂盒基于RDA(重组酶依赖型扩增技术)技术扩增病原核酸，同时加入特异性的荧光探针检测产物，检测快速简便。但是试剂中所使用的原料酶较多，包括重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶等，试剂的成本高，不利于大规模生产和推广。
核酸检测的敏感性高于细胞培养法，适用于各种类型临床样本的检测，且检测周期短。应用较多的是PCR荧光探针法和PCR-杂交膜法，PCR的敏感性和探针杂交的特异性合二为一，灵敏度及特异性均很高，为核酸检测的主流技术。但针对病原的PCR检测需要配套的仪器和专业的实验室，对人员的要求较高，存在产物污染的风险，且应用场景不灵活。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种灵敏度高，特异性高，不易产生污染且应用场景灵活的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，包括微流控芯片，所述微流控芯片包括加样腔和至少一个反应腔，所述加样腔与反应腔通过缓冲腔和/或流道连通，每个所述反应腔内设有冻干球，所述冻干球包括扩增体系和消泡剂，所述扩增体系包括引物组、探针组、Bst DNA聚合酶和RNase HII，每个所述反应腔中的引物组至少包括两个靶标，所述探针组包括至少两个探针，所述探针的序列中包括至少一个RNA碱基。
本发明的有益效果在于：本发明的恒温荧光检测系统将LAMP技术、荧光探针技术、冻干技术与微流控芯片技术的结合应用，探针中内嵌RNA碱基，当探针与单链DNA杂交形成双链DNA时，体系中的RNase HII特异性地识别双链DNA中的RNA碱基并水解其5’方向DNA碱基的磷酸二酯键，使探针发生断裂产生荧光信号实现荧光检测。本发明的恒温荧光检测系统具有以下优势：
(1)试剂冻干后常温2～30℃储存，试剂储存要求低，避免了运输或储存不当导致的试剂失效。
(2)微流控芯片小巧、便携，降低了运输成本与储存成本。通过应用微流控芯片，可在没有任何精密仪器的条件下，实现核酸定性检测，为应对公共卫生突发事件提供更全面的信息。
(3)LAMP技术与荧光探针技术相结合，可以提升特异性，降低假阳性概率。
(4)LAMP核酸扩增与微流控芯片的联合使用可省去其他检测方法(如常规PCR法或常规LAMP法)所必须的提取过程，大大缩短了总体检测时间，在10～35min内即可获取结果。
(5)本发明在LAMP法的基础上，采用2个靶标设计引物，相较于常规的一个靶标，检测灵敏度更高。
附图说明
图1为采用实施例二的检测系统检测得到的沙眼衣原体orf2基因扩增曲线；
图2为采用实施例三的检测系统检测得到的沙眼衣原体orf2基因扩增曲线；
图3为采用实施例二的检测系统检测得到的沙眼衣原体gyrA基因扩增曲线；
图4为采用实施例三的检测系统检测得到的沙眼衣原体gyrA基因扩增曲线；
图5为单靶标以及双靶标检测样本1沙眼衣原体的扩增曲线图；
图6为单靶标以及双靶标检测样本2沙眼衣原体的扩增曲线图；
图7为单靶标以及双靶标检测样本3沙眼衣原体的扩增曲线图；
图8为单靶标以及双靶标检测样本4沙眼衣原体的扩增曲线图；
图9为实施例四的引物示意图；
图10为实施例四中引物组1的错配分析图；
图11为实施例四中引物组2的错配分析图；
图12为实施例四中引物组1和2的错配分析图；
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
一种生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，包括微流控芯片，微流控芯片包括加样腔和至少一个反应腔，加样腔通过缓冲腔和/或流道与反应腔连通，每个反应腔内设有冻干球，冻干球包括扩增体系和消泡剂，扩增体系包括引物组、探针组、Bst DNA聚合酶和RNase HII，每个反应腔中的引物组至少包括两个靶标，探针组包括至少两个探针，探针的序列中包括至少一个RNA碱基。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：常规RNase HII应用时将RNA碱基修饰在引物上，RNase HII把扩增后的DNA-RNA杂合链切断，但同时也会将部分形成杂合链的引物切断，检测的灵敏度较低。
鉴于传统检测方法所存在的缺陷，本发明结合了分子生物学技术、冻干技术和微流控芯片技术，开发出更适用于基层单位中方便使用的现场快速恒温荧光检测系统。其检测原理为：在特异性引物和Bst DNA聚合酶作用下，靶序列实现快速扩增，探针中内嵌RNA碱基，并修饰有荧光基团和荧光淬灭基团，当探针与单链DNA杂交形成双链DNA时，体系中的核糖核酸酶HII(RNase HII)特异性地识别双链DNA中的RNA碱基并水解其5’方向DNA碱基的磷酸二酯键，使探针发生断裂产生荧光信号。本发明在LAMP法的基础上，采用2个靶标设计引物，相较于常规的一个靶标，检测灵敏度更高；同时采用荧光探针技术，提升了检测的特异性。
在使用过程中，无需提取，只需将待测样本裂解后加入微流控芯片，溶解微流控芯片中的冻干球再将芯片插入仪器，仪器对微流控芯片进行加热和恒温控制，使得核酸样品进入扩增反应，分析扩增时产生的荧光信号，实现了即时扩增，即时检测。同时检测系统的操作简单方便，即使在缺乏专业人员的情况下，依照说明书仍可在10～35min内完成快速筛查，适用于基层医疗机构，可满足临床使用要求。将扩增体系制备成冻干球密封至微流控芯片中，避免交叉污染，密封后可常温2～30℃储存12个月，有效避免了试剂运输过程储存不当导致的试剂失效问题，降低了运输和储存的成本。检测时将不同病原体的扩增体系放在不同的反应腔中，可实现一个待测样本同时检测多种病原体，显著提高检测效率。
进一步的，同一个反应腔中探针的淬灭基团相同，同一个反应腔中探针的荧光基团相同。
从上述描述可知，同一个反应腔中探针的淬灭基团以及荧光基团相同，可通过任一单靶标或者双靶标的叠加荧光信号提高扩增的灵敏度。
进一步地，淬灭基团和荧光基团分别位于探针的两端或位于RNA碱基的两侧。
进一步地，淬灭基团和荧光基团分别位于RNA碱基的两侧时，淬灭基团和荧光基团的距离为5～8bp。
进一步地，淬灭基团和荧光基团分别位于探针的两端时，淬灭基团和荧光基团的距离为15～27bp。
从上述描述可知，淬灭基团和荧光基团分别位于RNA碱基的两侧时，淬灭基团和荧光基团的距离为5～8bp时，荧光信号的背景值低，且RNase HII的切割效率高，荧光信号增量大，结果重复性较好。
进一步的，探针中GC含量为40～60％，连续相同碱基＜5，连续10个碱基中相同碱基数＜7个，且20个碱基中任意两种碱基数量之和＜16。
从上述描述可知，由于每个反应腔中的引物组至少包括两个靶标，更容易形成二聚体和发卡结构，以及错配，因此对探针的要求也更高。GC含量为40～60％时，Tm值为60～67℃之间，检测温度较低；对探针中的重复碱基进行多项限定，可尽可能的减少引物和探针的错配。
进一步的，引物组中每对引物连续互补AT碱基≤4对，连续互补GC碱基≤3对，自由能≤7。
从上述描述可知，由于每个反应腔中的引物组至少包括两个靶标，引物之间更容易发生错配，完全通过实验筛选引物，存在筛选周期长，成本高，筛选效率低等问题。本发明通过识别引物对中互补碱基的个数以及结合的自由能，限定连续互补碱基AT不超过4对，GC不超过3对；自由能的值不大于7，可有效减少引物错配现象。
进一步的，反应腔内对应的生殖道感染病原体为沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、生殖支原体和人型支原体中的任意一种。
进一步的，生殖道感染病原体为沙眼衣原体时，引物组的靶标为ORF2和gyrA基因，引物组由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:12所示的12条引物组成，探针组为SEQ ID NO:13～SEQID NO:14或SEQ ID NO:70～SEQ ID NO:71所示的2条探针组成。
进一步的，生殖道感染病原体为淋病奈瑟菌时，引物组的靶标为porA和rsmB基因，引物组由SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:26所示的12条引物组成，探针组为SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:72～SEQ ID NO:73所示的2条探针组成。
进一步的，生殖道感染病原体为解脲脲原体时，引物组的靶标为ureA和ureB基因，引物组由SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:40所示的12条引物组成，探针组为SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:74～SEQ ID NO:75所示的2条探针组成。
进一步地，生殖道感染病原体为生殖支原体时，引物组的靶标为gap和fts Y基因，引物组由SEQ ID NO:43～SEQ ID NO:53所示的11条引物组成，探针组由SEQ ID NO:54～SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:76～SEQ ID NO:77所示的2条探针组成。
进一步地，生殖道感染病原体为人型支原体时，引物组的靶标为gap和fts Y基因，引物组由SEQ ID NO:56～SEQ ID NO:67所示的12条引物组成，探针组由SEQ ID NO:68～SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:78～SEQ ID NO:79所示的2条探针组成。
进一步的，还包括5×buffer和dNTPs。
进一步的，还包括冻干保护剂，冻干保护剂的质量分数为：20％～25％的葡聚糖20，2.5％～5％的牛血清白蛋白。
从上述描述可知，冻干保护剂可防止扩增体系因冻干而失效。其中葡聚糖20的羟基可以与蛋白质形成氢键以取代水，保证了蛋白质的稳定性，在溶液中它们易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护的目的。、牛血清白蛋白是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附。并且能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的酶的变性。
以下实施例所使用的试剂包括冻干试剂(见表1)和裂解液(见表2)冻干试剂中包括10×缓冲液(见表3)、引物预混液(表4)和5×冻干保护剂(表5)
表1
表2
组分 浓度 加入量(mL)
KCl 2M 1.75～2.5
KOH 2M 调整pH值至12.0～14.0
表3
组分 浓度 25μL体系加入量(μL)
PEG8000 50％ 15.0～20.0
甘氨酸 1M 10.0～12.5
(NH4)2SO4 2M 1.0～1.25
MgSO4或MgCl2 2M 2.0～2.5
Tris-HCl(pH8.0) 2M 8.0～10.0
Nuclease-free Water - 定容到50mL
表4
引物名称 浓度 25μL体系加入量(μL)
FIP 200μM 0.2～0.4
BIP 200μM 0.2～0.4
F3 200μM 0.025～0.05
B3 200μM 0.025～0.05
LF 200μM 0.05～0.1
LB 200μM 0.05～0.1
表5
组分 加入量
葡聚糖20 20～25g
牛血清白蛋白 2.5～5g
Nuclease-freeWater 定容至100mL
本发明的实施例一为：沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、生殖支原体和人型支原体的引物探针设计，包括以下步骤：
S1：选取靶标。从NCBI上下载有关病原体的所有基因组，通过软件比对选择出靶标的保守序列。
S2：分别选取沙眼衣原体的ORF2和gyrA基因，淋病奈瑟菌的porA和rsmB基因，解脲脲原体的ureA和ureB基因，生殖支原体的gap和ftsY基因，人型支原体的gap和mgpa基因作为靶标，首先对FIP/BIP进行设计，多引物序列错配分析，以确保引物间无错配；然后进行LF/LB的设计和错配分析，最后进行F3/B3的设计和错配分析，以最大限度地保证引物的质量进而保证检测的灵敏度。引物对中互补碱基的个数以及结合的自由能，连续互补碱基AT不超过4对，GC不超过3对；自由能的值不大于7，达到筛选引物的目的并形成2个靶标的二重扩增体系。
S3：设计探针。探针中GC含量为40～60％，连续相同碱基＜5，连续10个碱基中相同碱基数＜7个，且20个碱基中任意两种碱基数量之和＜16，在探针中内嵌RNA碱基。
根据上述设计方法，设计得到的沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)、解脲脲原体(UU)、生殖支原体(MG)和人型支原体(MH)的引物、探针见表6，探针的5’端设有FAM基团，探针的3’端设有BHQ1基团，FAM基团和BHQ1基团距离在15～27bp之间。
表6
另一探针选择：根据上述设计方法设计沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)、解脲脲原体(UU)、生殖支原体(MG)和人型支原体(MH)的探针，探针中RNA碱基的两侧分别设有FAM基团和BHQ1基团，FAM基团和BHQ1基团距离在5～8bp之间，得到的探针序列见表7
表7
本发明的实施例二：一种生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，包括微流控芯片，微流控芯片包括加样腔和八个反应腔，加样腔与八个反应腔均连通，七个反应腔内各放置有检测一种病原体的冻干球，剩余一个反应腔内放置人源内参的冻干球，将冻干试剂以15μL为一份逐个滴入液氮中速冻，形成小冰球。收集冰球并置于预冷至-50℃的冻干机中，经过一次干燥、二次干燥，去除冰球中的水分，制成冻干试剂球。冻干机的参数见表8和9。冻干试剂成分见表10，表10中混合引物和探针的具体序列见表6、10×缓冲液的成分见表11、引物预混液的成分见表12、5×冻干保护剂的成分见表13。
表8
区段 运行时间 结束温度(℃)
1 5时0分 -50.0
2 18时0分 -50.0
3 1时0分 -20.0
4 1时0分 0.0
5 1时0分 20
6 4时0分 30.0
表9
表10
组分 浓度 加入量(μL)
5×冻干保护剂 5× 3.0
10×缓冲液 10× 3.0
dNTPs 25mM 2
硅基消泡剂A600465 50％ 0.02
引物预混液 / 1
探针 50μM 0.2
RNase HII 5U/μL 1
BstDNA聚合酶 8U/μL 1.5
RNA酶抑制剂(靶标为DNA时添加) 40U/μL 1
Nuclease-freeWater - 补足到15μL
表11
组分 浓度 加入量(mL)
PEG8000 50％ 18
甘氨酸 1M 11
(NH4)2SO4 2M 1.1
MgSO4或MgCl2 2M 2.3
Tris-HCl(pH8.0) 2M 9
Nuclease-free Water - 定容到50mL
表12
引物名称 浓度 加入量(μL)
FIP 100μM 0.3
BIP 100μM 0.3
F3 100μM 0.04
B3 100μM 0.04
LF 100μM 0.5
LB 100μM 0.5
表13
组分 加入量
葡聚糖20 23g
牛血清白蛋白 4g
Nuclease-freeWater 定容至100mL
本发明的实施例三为：
实施例三与实施例二的区别仅在于：探针的具体序列见表7。
提取待测样本核酸，加入裂解液(成分见表14)中混合，然后分别滴入实施例二与实施例三的加样腔中，再将芯片放入奥吉芯恒温核酸扩增分析仪中进行检测。沙眼衣原体orf2基因检测到的扩增曲线分别见图1和图2，沙眼衣原体gyrA基因检测到的扩增曲线分别见图3和图4(图1～4中横坐标为循环数，纵坐标为荧光值)。将图1和图2进行对比，将图3和图4进行对比可知，淬灭基团和荧光基团分别设置在RNA碱基的两侧时，背景值较低，荧光的增量较高。
表14
组分 浓度 加入量(mL)
KCl 2M 2
KOH 2M 调整pH值至13
Nuclease-freeWater - 定容至50mL
本发明的对比例一为：
对比例一与实施例二的区别仅为：采用单一的ORF2基因作为靶标检测沙眼衣原体。
本发明的对比例二为：
对比例二与实施例二的区别仅为：采用单一的gyrA基因作为靶标检测沙眼衣原体。
采用实施例二与对比例一和二的方法检测4个样本的沙眼衣原体，检测结构见图5～6。由图5～8可知，双靶标相对单靶标检出较早，且荧光值更高，在低浓度样本上，双靶标相对单靶标检出灵敏度高。
本发明的实施例四为：比较单一靶标引物组和两个靶标引物组的错配程度。
采用图9(引物上标记-1的为引物组1，引物上标记-2的为引物组2)中的引物进行错配验证。引物组1的错配分析结果见图10，图10中引物之间错配的ΔG最大为6.7，错配较少；引物组2的错配分析结果见图11，图11中引物之间错配的ΔG最大为6.6，错配较少；引物组1和2两个靶标引物组的错配分析结果见图12，图12中两组引物之间错配的ΔG最大为10.9，且较多引物对之间错配的ΔG值大于7，相对单组引物，错配严重。
综上所述，本发明提供的恒温荧光检测系统将LAMP技术、冻干技术与微流控芯片技术的结合应用，LAMP技术与荧光探针技术相结合，可以提升特异性，降低假阳性概率；LAMP核酸扩增与微流控芯片的联合使用可省去其他检测方法缩短总体检测时间。同时本发明的探针中内嵌RNA碱基，当探针与单链DNA杂交形成双链DNA时，体系中的RNase HII特异性地识别双链DNA中的RNA碱基并水解其5’方向DNA碱基的磷酸二酯键，使探针发生断裂产生荧光信号实现对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、人型支原体和生殖支原体核酸的快速高效检测。扩增体系采用2个靶标设计引物检测灵敏度更高，扩增时只需Bst DNA聚合酶、核糖核酸酶(RNase HII)两种酶原料，成本较低，利于大规模的生产和应用。该检测方法具有简便、快速且准确的特点，弥补了PCR方法的缺点，兼具成本低廉和可大规模应用推广的优点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，包括微流控芯片，所述微流控芯片包括加样腔和至少一个反应腔，所述加样腔通过缓冲腔和/或流道与反应腔连通，每个所述反应腔内设有冻干球，所述冻干球包括扩增体系和消泡剂，所述扩增体系包括引物组、探针组、BstDNA聚合酶和RNaseHII，每个所述反应腔中的引物组至少包括两个靶标，所述探针组包括至少两个探针，所述探针的序列中包括至少一个RNA碱基。
2.根据权利要求1所述的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，同一个所述反应腔中探针的淬灭基团相同，同一个所述反应腔中探针的荧光基团相同。
3.根据权利要求1所述的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，淬灭基团和荧光基团分别位于探针的两端或位于RNA碱基的两侧。
4.根据权利要求3所述的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，淬灭基团和荧光基团分别位于RNA碱基的两侧时，淬灭基团和荧光基团的距离为5～8bp。
5.根据权利要求3所述的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，淬灭基团和荧光基团分别位于探针的两端时，淬灭基团和荧光基团的距离为15～27bp。
6.根据权利要求1所述的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，所述探针中GC含量为40～60％，连续相同碱基＜5，连续10个碱基中相同碱基数＜7个，且20个碱基中任意两种碱基数量之和＜16。
7.根据权利要求1所述的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，所述引物组中每对引物连续互补AT碱基≤4对，连续互补GC碱基≤3对，自由能≤7。
8.根据权利要求1所述的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，所述反应腔内对应的生殖道感染病原体为沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体、生殖支原体和人型支原体中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的生殖道感染病原体的恒温荧光检测系统，其特征在于，所述生殖道感染病原体为沙眼衣原体时，所述引物组的靶标为ORF2和gyrA基因，所述引物组由SEQID NO:1～SEQ ID NO:12所示的12条引物组成，所述探针组由SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:70～SEQ ID NO:71所示的2条探针组成；
所述生殖道感染病原体为淋病奈瑟菌时，所述引物组的靶标为porA和rsmB基因，所述引物组由SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:26所示的12条引物组成，所述探针组由SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:72～SEQ ID NO:73所示的2条探针组成；
所述生殖道感染病原体为解脲脲原体时，所述引物组的靶标为ureA和ureB基因，引物组由SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:40所示的12条引物组成，所述探针组为SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:74～SEQ ID NO:75所示的2条探针组成；
所述生殖道感染病原体为生殖支原体时，所述引物组的靶标为gap和fts Y基因，引物组由SEQ ID NO:43～SEQ ID NO:53所示的11条引物组成，所述探针组由SEQ ID NO:54～SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:76～SEQ ID NO:77所示的2条探针组成；
所述生殖道感染病原体为人型支原体时，所述引物组的靶标为gap和fts Y基因，所述引物组由SEQ ID NO:56～SEQ ID NO:67所示的12条引物组成，探针组由SEQ ID NO:68～SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:78～SEQ ID NO:79所示的2条探针组成。
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