CN117448482A - 一套萝卜核心kasp标记开发及其利用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一套萝卜核心KASP标记开发及其利用，通过DDBJ数据库中公布的萝卜基因组数据和浙江省农业科学院蔬菜所提供的8份萝卜重测序数据开发核心SNP标记，并基于KASP技术在萝卜栽培种中进行验证，本发明给出的32个核心标记分型准确，进一步通过提取萝卜不同品种的DNA结合本发明的KASP引物对萝卜品种进行分型，通过对标记的组合，可以快速的对萝卜品种进行鉴别，而不用采用表型鉴定的方法，可以明显提高育种效率，节约育种成本。

Description

一套萝卜核心KASP标记开发及其利用

技术领域

本发明涉及萝卜品种鉴定的分子标记，属于生物检测领域。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)是十字花科萝卜属的一种重要蔬菜，在世界各地广泛种植。在其传播过程中，世界各地演化出了不同的变种，如樱桃萝卜、油用萝卜、饲用的鼠尾根萝卜、黑萝卜以及大根型萝卜。由于不同地区引种频繁，地方品种资源保存困难，加上选育新品种不断增加，难免发生同名异种和同种异名的现象，极大的增加了萝卜品种鉴定的难度。

近年来，随着基因组测序工作的开展以及分子生物学的应用，DNA分子标记是继形态标记、细胞标记、生化标记之后较为理想的遗传标记。分子标记技术具有检测手段简单迅速、不受环境影响、各个发育阶段均可检测到的特点，已经在品种鉴定、种子纯度鉴定等方面得到广泛应用。目前，SNP分子标记作为最主流的第三代分子标记，其标记具有数量分布广、多态性高、稳定性好的特点，被国际植物新品种保护联盟(UPOV)认为是用于品种鉴定的有效方法之一。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele specific PCR,KASP)是一种新型高通量SNP分型技术，该技术准确度高，通量大，成本低，是目前最理想的基因分型技术。目前已广泛的应用于水稻、小麦、玉米、黄瓜和葡萄等作物。

萝卜种质资源是萝卜新品种选育、遗传背景研究以及农业生产的重要物质基础。对于育种工作者来说，明确种质资源和育种材料的遗传关系十分重要。近年来，选育萝卜新品种不断增加，在种子市场上同名异物及同物异名的情况时有发生，甚至一些不合格种子混入市场，造成巨大的经济损失；此外，种质资源快速鉴定及分类也是一个难点问题。因此，基于全基因组开发SNP,利用KASP技术对萝卜种质资源核心SNP分型，对品种鉴定具有重要意义。

发明内容

目前在十字花科蔬菜中，例如大白菜、花椰菜、甘蓝等，均有SNP分子标记的开发用于品种鉴定，但在萝卜中研究报道较少，并且其他分子标记无法有效应用于品种鉴定。

本发明是利用在DDBJ(DNA DataBankof Japan)数据库中公布520份萝卜简化基因组数据和浙江省农业科学研究院蔬菜所提供的8份萝卜重测序数据，开发用于萝卜品种鉴定的SNP分子标记，基于KASP技术可快速检测品种基因型，为实现萝卜品种的快速鉴定提供了新的分子标记。

本发明的第一方面提供基于KASP技术开发的用于萝卜栽培种鉴定的核心SNP分子标记组合，其核心标记信息如表1所述：

表1 32个核心SNP标记信息

编号

染色体

SNP物理位置

等位基因

编号

染色体

SNP物理位置

等位基因

Chr1-21

Chr1

18753042

[T/C]

Chr5-34

Chr5

43324346

[C/T]

Chr1-45

Chr1

58808047

[T/A]

Chr5-36

Chr5

44922478

[G/A]

Chr2-16

Chr2

14156674

[C/T]

Chr6-6

Chr6

30694641

[G/A]

Chr2-26

Chr2

44476246

[G/A]

Chr6-15

Chr6

38117650

[A/G]

Chr2-27

Chr2

45748274

[A/G]

Chr6-19

Chr6

42865438

[A/T]

Chr2-33

Chr2

54832993

[G/T]

Chr6-20

Chr6

43227414

[T/A]

Chr3-1

Chr3

301586

[A/G]

Chr7-2

Chr7

16504349

[C/T]

Chr3-2

Chr3

362352

[G/A]

Chr7-12

Chr7

27487519

[G/C]

Chr3-17

Chr3

29949211

[G/A]

Chr7-23

Chr7

36882600

[G/A]

Chr4-3

Chr4

1251819

[T/A]

Chr8-10

Chr8

20479094

[G/A]

Chr4-7

Chr4

2932692

[C/G]

Chr8-23

Chr8

35858487

[G/T]

Chr4-23

Chr4

34449708

[C/T]

Chr9-1

Chr9

652195

[G/A]

Chr4-33

Chr4

44369429

[T/G]

Chr9-2

Chr9

1929299

[A/G]

Chr5-12

Chr5

11242018

[A/G]

Chr9-14

Chr9

15485852

[G/T]

Chr5-22

Chr5

33498683

[T/C]

Chr9-22

Chr9

40713031

[C/T]

Chr5-24

Chr5

35234907

[T/C]

Chr9-24

Chr9

42576246

[C/T]

本发明的第二个方面是提供一种特异性检测上述SNP分子标记组合的试剂；优选的，所述的试剂为引物和/或探针；更优选的，所述的引物或探针为荧光标记的引物和/或探针；更优选的，所述的引物的序列如下表所示：

表2特异检测32个SNP的引物序列信息

本发明的第三个方面是提供第一方面所述的SNP组合在鉴定萝卜品种的应用。

本发明的第四个方面是提供第二方面所述的引物和/或探针在鉴定萝卜品种中的应用。

本发明的第五个方面是提供本发明第一方面所述的SNP组合在萝卜育种中的应用。

本发明的第六个方面是提供第二方面所述的引物和/或探针在萝卜育种中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过DDBJ数据库中公布的520份萝卜基因组数据和浙江省农业科学院蔬菜所提供的8份萝卜重测序数据开发核心SNP标记，并基于KASP技术在46份萝卜栽培种中进行验证，32个核心标记分型准确，进一步通过提取萝卜不同品种的DNA结合本发明的KASP引物对萝卜品种进行分型，通过对标记的组合，可以快速的对萝卜品种进行鉴别

附图说明

图1：标记Chr9-02在46份萝卜品种中分型结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，需明确：本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：基于KASP技术开发的32个用于萝卜栽培种鉴定的核心SNP标记：

1、核心SNP位点的确定：基于DDBJ数据库中公布的520份萝卜基因组数据和浙江省农业科学院蔬菜所提供的8份萝卜基因组重测序数据，通过Linux服务器进行SNP筛选，具体筛选流程为：

(1)SNP位点前后50bp无其他变异位点；

(2)保留双等位基因位点；

(3)过率基因型缺失率小于0.5，最小等位基因计数小于3，最小质量分数小于30；

(4)过滤次等位基因频率小于0.05，平均测序深度小于1.2×；并通过46份具有代表性的萝卜栽培种进行核心SNP筛选。

最终获得32个核心SNP标记，具体信息如下表所述。

2、引物设计：

提取32个SNP位点前后100bp的侧翼保守序列，针对每个SNP位点，采用LGC提供的软件在SNP位点上游设计两条正向引物，下游设计一条反向引物。32个SNP标记的引物序列信息见下表。

实施例2样板检测

1、提取DNA样本：

对46份具有代表性的萝卜品种进行DNA提取，46份萝卜品种信息如表3所述，

表3 46份萝卜的品种信息

具体步骤为下列所述：

(1)将-80℃超低温冰箱中冻结的样品迅速转移至用2ml离心管中，加入直径约4mm左右的钢珠，液氮中充分冷冻后，用组织研磨仪将样品磨成粉末状；

(2)向充分研磨成粉末状的样品中加入CTAB提取液，65℃孵育2小时，12,000×g 4℃离心10分钟；

(3)取上清液转移至新的离心管，加入等体积氯仿，充分混匀后，12,000×g 4℃离心10分钟；

(4)取上清液并转移至新的离心管，加入2/3体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置30min，12,000×g 4℃离心10分钟，弃上清；

(5)加入1ml预冷的70％乙醇，摇匀，漂洗沉淀，12,000×g 4℃离心10分钟，弃上清(本步骤重复2次)；

(6)室温晾干至沉淀为无色透明状，加入无菌ddH2O溶解DNA沉淀。

(7)使用BioDropuLite核酸微量测定仪对待测样品进行DNA浓度测量和质量检测，并根据检测结果将所有待测样品统一稀释至适宜的上机浓度(10-20ng/μl左右)，-20℃冻存备用。

2、PCR反应

PCR反应体系为：参照384孔array tape，其中湿DNA：0.8ul，2x KASP Master mix+Assay：0.8ul，总反应体积：1.6ul。

PCR反应程序为：1.预变性：温度94℃，15min，1次循环；2.变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度61-55℃，60sec(-0.6℃/循环)；第2步10次循环；3.变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度55℃，60sec，第3步26次循环。

3、荧光数据读取和分析

PCR反应结束后，利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析。荧光FAM激发(nm)485，发射(nm)520；HEX激发535，发射556，ROX激发575，发射610。根据分型结果确定核心标记。

结果如图1所示，结果显示，利用本发明的SNP组合设计的PCR引物，结合竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele specific PCR,KASP)可以将不同的萝卜品系进行区分。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一组基于KASP技术开发的用于萝卜栽培种鉴定的核心SNP分子标记组合，其核心标记信息如下表所示：

编号 染色体 SNP物理位置 等位基因 编号 染色体 SNP物理位置 等位基因 Chr1-21 Chr1 18753042 [T/C] Chr5-34 Chr5 43324346 [C/T] Chr1-45 Chr1 58808047 [T/A] Chr5-36 Chr5 44922478 [G/A] Chr2-16 Chr2 14156674 [C/T] Chr6-6 Chr6 30694641 [G/A] Chr2-26 Chr2 44476246 [G/A] Chr6-15 Chr6 38117650 [A/G] Chr2-27 Chr2 45748274 [A/G] Chr6-19 Chr6 42865438 [A/T] Chr2-33 Chr2 54832993 [G/T] Chr6-20 Chr6 43227414 [T/A] Chr3-1 Chr3 301586 [A/G] Chr7-2 Chr7 16504349 [C/T] Chr3-2 Chr3 362352 [G/A] Chr7-12 Chr7 27487519 [G/C] Chr3-17 Chr3 29949211 [G/A] Chr7-23 Chr7 36882600 [G/A] Chr4-3 Chr4 1251819 [T/A] Chr8-10 Chr8 20479094 [G/A] Chr4-7 Chr4 2932692 [C/G] Chr8-23 Chr8 35858487 [G/T] Chr4-23 Chr4 34449708 [C/T] Chr9-1 Chr9 652195 [G/A] Chr4-33 Chr4 44369429 [T/G] Chr9-2 Chr9 1929299 [A/G] Chr5-12 Chr5 11242018 [A/G] Chr9-14 Chr9 15485852 [G/T] Chr5-22 Chr5 33498683 [T/C] Chr9-22 Chr9 40713031 [C/T] Chr5-24 Chr5 35234907 [T/C] Chr9-24 Chr9 42576246 [C/T]

。

2.一种特异性检测权利要求1所述SNP分子标记组合的试剂。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述的试剂为引物和/或探针；更优选的，所述的引物或探针为荧光标记的引物和/或探针。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述的引物的序列如下表所示：

5.权利要求1所述的SNP组合在鉴定萝卜品种的应用。

6.权利要求2或3中所述的述的引物和/或探针在鉴定萝卜品种中的应用。

7.权利要求4所述的试剂在鉴定萝卜品种中的应用。

8.权利要求1所述的SNP组合在萝卜育种中的应用。

9.权利要求2或3中所述的述的引物和/或探针在萝卜育种中的应用。

10.权利要求4所述的试剂在萝卜育种中的应用。