CN117442598A - 硝酸酯类化合物在制备改善敏感肌表皮屏障产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种硝酸酯类化合物在制备改善敏感肌表皮屏障产品中的应用，属于皮肤功能治疗修复领域，硝酸酯类化合物可以有效改善敏感肌表皮屏障功能，通过降低炎症因子IL‑1α、IL‑1β、IL‑6、CXCL1和CXCL2的mRNA表达水平来改善敏感肌的皮肤炎症；通过降低表皮屏障功能相关因子S100A7、S100A9、K1和K10的mRNA表达水平来促进敏感肌表皮屏障功能的恢复；通过降低免疫细胞活性相关因子IL‑17a、IL‑23和IL‑22的mRNA表达水平来改善敏感肌免疫功能；抑制敏感肌表皮增生；通过降低血管通透性相关因子VCAM、ICAM、VEGF和EGF的mRNA表达水平来降低敏感肌血管通透性。

Description

硝酸酯类化合物在制备改善敏感肌表皮屏障产品中的应用
技术领域
本发明属于皮肤功能治疗修复技术领域，尤其涉及硝酸酯类化合物在制备改善敏感肌表皮屏障产品中的应用。
背景技术
受环境污染、工作及生活压力、化妆品使用不当等多种内外因素的影响，具有敏感肌的人群日益增多，与健康皮肤相比，一些外界刺激对敏感肌更易造成不适感。敏感肌的主要症状包括瘙痒、热灼感、皮肤绷紧感和潮热感等，并可能伴有局部潮红、干燥、脱屑等客观体征，不仅影响皮肤外观，产生的不适感还会严重影响人们的正常生活。
敏感肌具有明显的个体差异，由多种因素诱发，受机体角质层功能、神经功能以及皮肤免疫功能的调节影响。当出现表皮通透屏障功能异常时，外界刺激性物质更易于进入皮内，引起皮肤炎症。研究显示，外涂0.5%烟酸甲酯5min后，利用激光多普勒血流成像仪测量局部充血量，敏感肌皮肤局部充血量比非敏感肌高33%。因此，改善表皮通透屏障功能是一种有效减轻敏感肌症状的途径。
硝酸酯类化合物包括硝酸甘油、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯等。硝酸异山梨酯和硝酸甘油均为经典的血管扩张药，目前主要用于心血管相关疾病的治疗中，如治疗或缓解心绞痛发作等，作用机制主要是松弛血管平滑肌，释放一氧化氮，激活鸟苷酸环化酶，使细胞内cGMP增加，促使肌球蛋白轻链去磷酸化，从而扩张外周血管，特别是增加静脉血容量，减少回流量，降低心脏前后负荷，以此来减少心肌耗氧量。
目前临床上未见将硝酸酯类化合物应用于制备改善敏感肌表皮屏障功能的产品中的研究。为了拓展硝酸酯类化合物的应用范围和减轻敏感肌症状，开发硝酸酯类化合物在改善敏感肌表皮屏障功能方面的新应用是十分必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种硝酸酯类化合物在制备改善敏感肌表皮屏障产品中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：硝酸酯类化合物在制备改善敏感肌表皮屏障产品中的应用，将硝酸酯类化合物作为活性成分制备成改善敏感肌表皮屏障的产品。
所述硝酸酯类化合物为硝酸甘油、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯中的一种。
所述产品为单一硝酸酯类化合物或硝酸酯类化合物加入药学上可接受的辅料的组合物。
进一步地，所述药学上可接受的辅料可为乙醇。
进一步地，所述产品中硝酸酯化合物的有效浓度范围为1mM（0.24g/L）-10mM（2.4g/L）。
所述硝酸酯类化合物通过降低炎症因子的mRNA表达的水平，改善敏感肌的皮肤炎症；
进一步地，所述炎症因子包括IL-1α、IL-1β、IL-6、CXCL1和CXCL2。
所述硝酸酯类化合物通过降低表皮屏障功能相关因子的mRNA表达的水平，促进敏感肌表皮屏障功能的恢复；
进一步地，所述表皮屏障功能相关因子包括S100A7、S100A9、K1和K10。
所述硝酸酯类化合物通过降低敏感肌血管通透性相关因子的mRNA表达的水平，降低血管通透性；
进一步地，所述血管通透性相关因子包括VCAM、ICAM、VEGF和EGF。
所述硝酸酯类化合物通过降低免疫细胞活性相关因子的mRNA表达的水平，改善敏感肌免疫功能；
进一步地，所述免疫细胞活性相关因子包括IL-17a、IL-23和IL-22。
所述硝酸酯类化合物通过抑制敏感肌表皮增生改善敏感肌表皮屏障功能。
所述产品包括药物、化妆品、医疗器械、消毒用品。
所述产品的剂型包括膏剂、喷剂、搽剂、贴剂、乳剂、凝胶剂。
本发明的有益效果为：
本发明公开了一种硝酸酯类化合物在制备改善敏感肌表皮屏障功能的产品中的新应用，能够有效改善皮肤炎症、促进敏感肌表皮屏障功能的恢复、改善敏感肌免疫功能、降低敏感肌血管通透性等。
结合小鼠实验发现，硝酸酯类化合物可以有效改善敏感肌表皮屏障功能，具体体现在如下一种或多种方面：1）通过降低炎症因子IL-1α、IL-1β、IL-6、CXCL1和CXCL2的mRNA表达水平来改善敏感肌的皮肤炎症；2）通过降低表皮屏障功能相关因子S100A7、S100A9、K1和K10的mRNA表达水平来促进敏感肌表皮屏障功能的恢复；3）通过降低免疫细胞活性相关因子IL-17a、IL-23和IL-22的mRNA表达水平来改善敏感肌免疫功能；4）抑制敏感肌表皮增生；5）通过降低血管通透性相关因子VCAM、ICAM、VEGF和EGF的mRNA表达水平来降低敏感肌血管通透性。
附图说明
下面通过参考附图并结合实例具体地描述本发明，本发明的优点和实现方式将会更加明显，其中附图所示内容仅用于对本发明的解释说明，而不构成对本发明的任何意义上的限制，在附图中：
图1为本发明实施例1中拍摄的各组小鼠的背部皮肤照片。
图2为本发明实施例1中各组小鼠背部皮肤的HE染色图。
图3为本发明实施例1中各组小鼠的IL-1α、IL-1β、IL-6、CXCL1和CXCL2的mRNA表达水平。
图4为本发明实施例1中各组小鼠的S100A7、S100A9、K1和K10的mRNA表达水平。
图5为本发明实施例2中拍摄的各组小鼠的耳部皮肤照片。
图6为本发明实施例2中各组小鼠耳部皮肤的HE染色图。
图7为本发明实施例2中各组小鼠耳部皮肤的表皮厚度变化图。
图8为本发明实施例2中各组小鼠的VCAM、ICAM、VEGF和EGF的mRNA表达水平。
图9为本发明实施例2中各组小鼠的IL-17a、IL-23和IL-22的mRNA表达水平。
图10为本发明实施例3中拍摄的各组小鼠的背部皮肤照片。
图11为本发明实施例3中各组小鼠背部皮肤的HE染色图。
图12为本发明实施例3中各组小鼠的IL-1α、IL-1β、IL-6、CXCL1和CXCL2的mRNA表达水平。
图13为本发明实施例3中各组小鼠的S100A7、S100A9、K1和K10的mRNA表达水平。
图14为本发明实施例4中拍摄的各组小鼠的耳部皮肤照片。
图15为本发明实施例4中各组小鼠耳部皮肤的HE染色图。
图16为本发明实施例4中各组小鼠耳部皮肤的表皮厚度变化图。
图17为本发明实施例4中各组小鼠的VCAM、ICAM、VEGF和EGF的mRNA表达水平。
图18为本发明实施例4中各组小鼠的IL-17a、IL-23和IL-22的mRNA表达水平。
图19为本发明实施例5中红区实验测试者面部不同时间的前后对比图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：硝酸异山梨酯在改善敏感肌小鼠皮肤炎症和促进表皮屏障功能的恢复中的研究。
（1）药物配制：
本实施例购买的硝酸异山梨酯成品为：山东力诺制药有限公司生产的硝酸异山梨酯喷雾剂，规格为10ml。
原液：硝酸异山梨酯浓度为52.9mM的硝酸异山梨酯喷雾剂；
浓度为10mM的硝酸异山梨酯配制：吸取原液377μL，并加入95%乙醇1623μL；
浓度为2mM的硝酸异山梨酯配制：吸取原液75.5μL，并加入95%乙醇1924.5μL。
（2）小鼠模型：
选取15只6周健康的雄性C57野生型小鼠，随机分为5组，每组3只，分别记为对照组、Tape处理组和Tape+硝酸异山梨酯处理组，其中，Tape+硝酸异山梨酯处理组具体包括Tape+硝酸异山梨酯（原液）处理组、Tape+硝酸异山梨酯（10mM）处理组、Tape+硝酸异山梨酯（2mM）处理组），各组按如下步骤制备模型：
对照组：剔除6周雄性C57野生型小鼠背部毛发，涂抹95%乙醇60μL，早晚各一次，连续涂抹三天，待第4天取皮后进行后续实验。
Tape处理组：剔除6周雄性C57野生型小鼠背部毛发，次日使用胶带（Tape）剥离小鼠背部皮肤3次，于胶带作用后分别涂抹95%乙醇60μL，早晚各一次，连续涂抹三天，待第4天取皮后进行后续实验。
Tape+硝酸异山梨酯处理组：剔除6周雄性C57野生型小鼠背部毛发，次日使用胶带（Tape）剥离小鼠背部皮肤3次，于胶带作用后分别涂抹不同浓度（原液、10mM、2mM）的硝酸异山梨酯60μL，早晚各一次，连续涂抹三天，待第4天取皮后进行后续实验。
（3）苏木素-伊红（HE）染色
取皮：
第四天用剪刀在背部剪开一小口，然后用镊子夹住皮肤，小心用剪刀剪下背部处理部位的皮肤，大小约为1cm×1cm。
石蜡切片制作：
①组织脱水处理：首先将取下的皮肤组织在4%多聚甲醛中浸泡24 h固定，次日，取出皮肤组织置于流水处冲洗30 min，尽可能去除皮肤组织表面的多聚甲醛。然后依次过70%、80%、90%、100%酒精进行梯度脱水处理，蒸馏水处理浸泡1 h，在100%酒精：二甲苯体积比为1:1的混合液中浸泡1.5 h，二甲苯I中浸泡15 min，二甲苯II中浸泡15 min；
②浸蜡包埋：将烘箱升温至65℃使石蜡融化，将透明的皮肤组织放入包埋组织固定盒中，并浸润石蜡30 min，以除去组织表面多余的二甲苯。然后将皮肤组织迅速放入石蜡包埋机中，进行二次浸蜡30 min。浸蜡过程结束后，夹取皮肤组织迅速垂直放置在包埋盒中，且与包埋板紧贴；
③石蜡切片：将恒温水浴锅换水，并将温度升至40℃待用。固定石蜡包埋组织块于切片机上，将石蜡切片机切片厚度调至5 μm，保证皮肤组织完好的情况下，将组织片在水浴锅中缓慢粘至提前标记好样品名称的防脱载破片上。将其放置于恒温干燥箱中，37℃烘干过夜。第二天，取出放于玻片盒中待用。
HE染色：
①烤片与脱蜡：首先从玻片盒中取出烘干完成的石蜡切片，将其置于恒温烘干箱中，在60℃下加热1h至石蜡融化。然后迅速放入二甲苯I中20 min，二甲苯II中15 min，100%酒精I中15 min，100%酒精II中10 min，90%酒精中10 min，80%酒精中10 min，70%酒精中10min。之后，置于蒸馏水中；
②苏木素染色：在蒸馏水中取出石蜡切片，用纸巾将皮肤组织周围多余的水分尽可能擦干，移液枪吸取50 μL苏木素轻轻滴在每片组织上，立即计时2 min，随后立即用水洗去浮色，且水流不直接冲洗组织，以防止皮肤组织脱落。将载玻片迅速置于高倍显微镜下观察苏木素颜色，进行改善；
③伊红染色：待苏木素染色结束后，用滤纸尽可能擦去组织周围水分，随后用移液枪吸取50μL伊红轻轻滴在每片皮肤组织上，立即计时2min，随后立即用水洗去浮色；
④脱水与透明：将载玻片按照70%酒精2min、80%酒精2min、90%酒精2min、100%酒精2min、二甲苯20min的流程进行梯度脱水、透明处理；
⑤树脂封片：使用滤纸尽可能将组织周围的二甲苯擦拭干净，并迅速将树脂滴于组织周围，轻轻按压盖玻片与载玻片表面，注意防止皮肤组织表面产生气泡。
（4）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测相关基因mRNA的表达。
组织RNA提取：
①提取皮肤组织，快速置于Trizol裂解液中，尽快使用低温组织研磨机器，将皮肤组织研磨打碎，待用；
②将研磨好的皮肤组织，放入4℃离心机中，12000rpm/min离心15min，吸取上清液；
③放摇床室温摇晃10min，加入100μL氯仿，颠倒混匀在室温静置15min，放入4℃离心机中，12000rpm/min离心15min；
④吸取上清液，加入250ml预冷异丙醇，颠倒混匀后室温静置8min，放入4℃离心机中，12000rpm/min离心15min；
⑤离心后弃去上清液，加入500μL预冷75%酒精，摇晃EP管，悬浮沉淀，放入4℃离心机中，8000rpm/min离心15min；
⑥离心后弃去上清液，倒扣EP管，室温风干5min，加入20μL无酶水，使用移液枪缓慢吹吸使沉淀充分溶解，将EP管置于冰上，使用Thermo Nanodrop2000检测RNA浓度。
逆转录PCR：
根据表1体系在无核酸酶八联管中加入试剂，配制逆转录体系，在冰盒上操作：
表1配置逆转录体系试剂
将配好混合液的八联管放在离心机上短暂离心，放入PCR仪中进行反应，逆转录反应条件如下：42℃15min，85℃5s。
定量PCR：
根据表2体系在无核酸酶管中加入试剂，在冰盒上操作：
表2配置定量PCR体系试剂
加样结束后，在4℃离心机上12000rpm，离心5min后放入实时荧光定量PCR仪器中进行反应，条件如下：95℃预变性持续30s，然后以95℃持续5s、60℃持续34s为一个循环，共进行40次循环，再将温度缓慢上升至99℃。
后续利用2-ΔΔCt法计算各因子相对于内参基因GAPDH的表达量。
（5）结果分析：
如图1所示，可以观察到Tape处理后，各组小鼠的背部皮肤表皮存在明显炎症和脱屑，经不同浓度的硝酸异山梨酯涂抹后均可在一定程度上改善皮肤炎症。
如图2所示，通过HE染色检测炎症因子浸润的情况，可见Tape处理后存在明显的炎症浸润（箭头所示），而不同浓度的硝酸异山梨酯涂抹后均可在一定程度上改善炎症细胞浸润。
如图3所示，利用qRT- PCR检测炎症因子mRNA的表达结果为：Tape处理后，皮肤组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、CXCL1、CXCL2的mRNA存在明显升高，不同浓度的硝酸异山梨酯均可在一定程度上抑制皮肤组织中上述炎症因子mRNA水平的升高，不同浓度的硝酸异山梨酯对不同炎症因子的抑制效果略有差异，临床上用于敏感肌等相关疾病的治疗应当考虑到炎症因子释放的类型合理调整剂量，例如，抑制IL-1β、IL-6、CXCL1、CXCL2宜选用原液，而抑制IL-1α宜选用2mM浓度。
上图中，*代表P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。*的数量越多，说明差异性越显著。
表3 硝酸异山梨酯对Tape处理后敏感肌炎症趋化相关因子mRNA表达的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与Tape处理组比较，P＜0.05。
图3和表3说明硝酸异山梨酯对于炎症因子的表达水平具有调节作用，进而能有效改善敏感肌皮肤炎症。
此外，本实施例还检测了不同浓度的硝酸异山梨酯涂抹后对表皮屏障功能相关因子S100A7、S100A9、K1、K10的mRNA的表达水平的影响，角蛋白K1、K10对表皮渗透性屏障功能和角质层的水化作用至关重要，钙结合蛋白S100A7和S100A9可诱导其他皮肤蛋白质和皮脂的合成。
如图4所示，Tape处理后S100A7、S100A9、K1、K10的mRNA存在明显升高，说明Tape处理破坏了表皮屏障功能，从而在一定程度上造成敏感肌的产生。而不同浓度的硝酸异山梨酯涂抹后均可在一定程度上抑制上述因子的升高，说明不同浓度的硝酸异山梨酯均可促进敏感肌表皮屏障功能恢复。
上图中，*代表P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。*的数量越多，说明差异性越显著。
表4硝酸异山梨酯对Tape处理后敏感肌表皮屏障相关因子mRNA表达的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与Tape处理组比较，P＜0.05。
图4和表4说明硝酸异山梨酯对于表皮屏障功能因子的表达水平具有调节作用，进而可以促进敏感肌表皮屏障功能的恢复。
实施例2：硝酸异山梨酯在改善敏感肌小鼠免疫功能、抑制敏感肌表皮增生和降低敏感肌血管通透性中的研究。
（1）药物配制：
本实施例购买的硝酸异山梨酯成品为：山东力诺制药有限公司生产的硝酸异山梨酯喷雾剂，规格为10ml。
原液：硝酸异山梨酯浓度为52.9mM的硝酸异山梨酯喷雾剂；
浓度为10mM的硝酸异山梨酯配制：吸取原液377μL，并加入95%乙醇1623μL。
（2）小鼠模型：
选取12只6周健康的雄性C57野生型小鼠，随机分为4组，每组3只，分别记为对照组、IMQ处理组、IMQ+硝酸异山梨酯处理组，其中，IMQ+硝酸异山梨酯处理组具体包括IMQ+硝酸异山梨酯（原液）处理组、IMQ+硝酸异山梨酯（10mM）处理组，各组按如下步骤制备模型：
对照组：每天早晚分别涂抹95%乙醇30μL，分别于第4天及第8天取小鼠耳部组织进行后续实验。
IMQ处理组：采用咪喹莫特（Imiquimod，IMQ）局部涂抹制作敏感肌小鼠模型，每只小鼠耳部双面共涂抹IMQ 12.5mg，连续涂抹7天，诱导小鼠敏感肌模型，同时每天早晚分别涂抹95%乙醇30μL，第4天及第8天取小鼠耳部组织进行后续实验。
IMQ+硝酸异山梨酯处理组：采用咪喹莫特（Imiquimod，IMQ）局部涂抹制作敏感肌小鼠模型，每只小鼠耳部双面共涂抹IMQ 12.5mg，连续涂抹7天，诱导小鼠敏感肌模型，同时每天早晚分别涂抹不同浓度（原液、10mM）硝酸异山梨酯30μL，第4天及第8天取小鼠耳部组织进行后续实验。
（3）苏木素-伊红（HE）染色：
取皮：
第4天及第8天用剪刀在耳朵根部靠前位置剪断，用镊子夹住小心取下耳朵组织，大小约为0.5cm×0.5cm。
石蜡切片制作：
①组织脱水处理：首先将取下的组织在4%多聚甲醛中浸泡24 h固定，次日，取出组织置于流水处冲洗30 min，尽可能去除组织表面的多聚甲醛。然后依次过70%、80%、90%、100%酒精进行梯度脱水处理，蒸馏水处理浸泡1 h，在100%酒精：二甲苯体积比为1:1的混合液中浸泡1.5 h，二甲苯I中浸泡15 min，二甲苯II中浸泡15 min；
②浸蜡包埋：将烘箱升温至65℃使石蜡融化，将透明的组织放入包埋组织固定盒中，并浸润石蜡30 min，以除去组织表面多余的二甲苯。然后将皮肤组织迅速放入石蜡包埋机中，进行二次浸蜡30 min。浸蜡过程结束后，夹取组织迅速垂直放置在包埋盒中，且与包埋板紧贴；
③石蜡切片：将恒温水浴锅换水，并温度升至40℃待用。固定石蜡包埋组织块于切片机上，将石蜡切片机切片厚度调至5 μm，保证组织完好的情况下，将组织片在水浴锅中缓慢粘至提前标记好样品名称的防脱载破片上。将其放置于恒温干燥箱中，37℃烘干过夜。第二天，取出放于玻片盒中待用。
HE染色：
①烤片与脱蜡：首先从玻片盒中取出烘干完成的石蜡切片，将其置于恒温烘干箱中，在60℃下加热1h至石蜡融化。然后迅速放入二甲苯I中20 min，二甲苯II中15 min，100%酒精I中15 min，100%酒精II中10 min，90%酒精中10 min，80%酒精中10 min，70%酒精中10min。之后，置于蒸馏水中；
②苏木素染色：在蒸馏水中取出石蜡切片，用纸巾将组织周围多余的水分尽可能擦干，移液枪吸取50 μL苏木素轻轻滴在每片组织上，立即计时2 min，随后立即用水洗去浮色，且水流不直接冲洗组织，以防止组织脱落。将载玻片迅速置于高倍显微镜下观察苏木素颜色，进行改善；
③伊红染色：待苏木素染色结束后，用滤纸尽可能擦去组织周围水分，随后用移液枪吸取50μL伊红轻轻滴在每片组织上，立即计时2min，随后立即用水洗去浮色；
④脱水与透明：将载玻片按照70%酒精2min、80%酒精2min、90%酒精2min、100%酒精2min、二甲苯20min的流程进行梯度脱水、透明处理；
⑤树脂封片：使用滤纸尽可能将组织周围的二甲苯擦拭干净，并迅速将树脂滴于组织周围，轻轻按压盖玻片与载玻片表面，注意防止组织表面产生气泡。
表皮厚度的测定：
HE染色结束后，对玻片进行拍照，随后根据图片已知长度的比例尺，在ImageJ软件中进行标定，选择直线测量工具，在图像上对于表皮厚度绘制线条，随后导出数据，统计表皮厚度的变化。
（4）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测相关基因mRNA的表达：
组织RNA提取：
①提取皮肤组织，快速置于Trizol裂解液中，尽快使用低温组织研磨机器，将组织研磨打碎，待用；
②将研磨好的组织，放入4℃离心机中，12000rpm/min离心15min，吸取上清液；
③放摇床室温摇晃10min，加入100μL氯仿，颠倒混匀在室温静置15min，放入4℃离心机中，12000rpm/min离心15min；
④吸取上清液，加入250ml预冷的异丙醇，颠倒混匀后室温静置8min，放入4℃离心机中，12000rpm/min离心15min；
⑤离心后弃去上清液，加入500μL预冷75%酒精，摇晃EP管，悬浮沉淀，放入4℃离心机中，8000rpm/min离心15min；
⑥离心后弃去上清液，倒扣EP管，室温风干5min，加入20μL无酶水，使用移液枪缓慢吹吸使沉淀充分溶解，将EP管置于冰上，使用Thermo Nanodrop2000检测RNA浓度。
逆转录PCR：
根据表5体系在无核酸酶八联管中加入试剂，配制逆转录体系，在冰盒上操作：
表5配制逆转录体系试剂
将配好混合液的八联管放在离心机上短暂离心，放入PCR仪中进行反应，逆转录反应条件如下：42℃15min，85℃5s。
定量PCR：
根据表6体系在无核酸酶管中加入试剂，在冰盒上操作：
表6配置定量PCR体系试剂
加样结束后，在4℃离心机上12000rpm，离心5min后放入实时荧光定量PCR仪器中进行反应，条件如下：95℃预变性持续30s，然后以95℃持续5s、60℃持续34s为一个循环，共进行40次循环，再将温度缓慢上升至99℃。
后续利用2-ΔΔCt法计算各因子相对于内参基因GAPDH的表达量。
（5）结果分析：
如图5所示，首先在所有处理结束后对耳部皮肤进行拍照观察，可见IMQ处理3天（Day 3）和7天（Day 7），耳部皮肤均存在明显充血和脱屑，而经不同浓度的硝酸异山梨酯涂抹后均可在一定程度上改善耳部充血和脱屑。
通过HE染色检测并用ImageJ软件测量表皮厚度的变化，结果如图6、图7以及表7所示，可见IMQ处理后耳部表皮厚度增加，IMQ处理3天耳部表皮厚度增加不明显，而处理7天后，耳部表皮厚度增加明显。而不同浓度的硝酸异山梨酯涂抹后均可在一定程度上抑制IMQ引起的敏感肌小鼠表皮增生，但是IMQ处理3天其抑制效果不明显，而处理7天后不同浓度的硝酸异山梨酯均可明显抑制敏感肌小鼠耳部表皮增生，且具有统计学差异。
上图中，*代表P值，****P<0.0001。*的数量越多，说明差异性越显著。
表7硝酸异山梨酯对IMQ处理后敏感肌表皮厚度的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与IMQ处理组比较，P＜0.05。
上述内容说明硝酸异山梨酯可明显抑制敏感肌表皮增生。
浅表微血管增生和高渗透性表型是敏感肌发生发展的重要特征。检测了不同浓度的硝酸异山梨酯涂抹后，血管通透性相关因子VCAM、ICAM、VEGF、EGF mRNA的表达水平，如图8和表8所示，IMQ处理后以上因子的表达水平明显升高，而IMQ+硝酸异山梨酯处理组处理过的以上某些因子基因表达水平有一定下降。
上图中，*代表P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。*的数量越多，说明差异性越显著。
表8硝酸异山梨酯对IMQ处理后敏感肌血管通透性相关因子mRNA表达的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与IMQ处理组比较，P＜0.05。
上述内容说明硝酸异山梨酯对于血管通透性因子的表达水平具有调节作用，进而能够有效改善敏感肌血管通透性。
IL-23/Th17是皮肤疾病免疫调节的关键通路。IL-23由皮肤驻留的树突状细胞分泌，并诱导Th17细胞极化并产生（IL-17a/IL-22等）促炎介质。因此，检测了不同浓度的硝酸异山梨酯处理后，免疫细胞活性相关因子IL-17a、IL-23、IL-22 mRNA的表达水平，结果如图9和表9所示，IMQ处理后以上因子表达水平明显升高，而IMQ+硝酸异山梨酯处理组处理后的以上因子表达水平均明显下调，并具有统计学差异。
上图中，*代表P值，**P<0.01，***P<0.001。*的数量越多，说明差异性越显著。
表9硝酸异山梨酯对IMQ处理后敏感肌免疫活性相关因子mRNA表达的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与IMQ处理组比较，P＜0.05。
上述内容说明硝酸异山梨酯对于敏感肌免疫活性相关因子的表达水平具有调节作用，进而改善敏感肌免疫功能。
实施例3：硝酸甘油在改善敏感肌小鼠皮肤炎症和促进表皮屏障功能的恢复中的研究。
（1）药物配制：
本实施例购买的硝酸甘油成品为：济宁为民制药有限公司生产的硝酸甘油气雾剂，规格为5mL。
浓度为10mM的硝酸甘油配制：吸取原液227μL，并加入95%乙醇1773μL；
浓度为2mM的硝酸甘油配制：吸取原液45.5μL，并加入95%乙醇1954.5μL。
（2）小鼠模型：
按照实施例1所述的分组及处理方法对小鼠进行相关试验：
（3）结果分析：
如图10所示，可以观察到Tape处理后，各组小鼠的背部皮肤表皮存在明显炎症和脱屑，经不同浓度的硝酸甘油涂抹后均可在一定程度上改善皮肤炎症。通过HE染色检测炎症因子浸润情况，结果如图11所示，可见Tape处理后存在明显的炎症浸润（箭头所示），而不同浓度的硝酸甘油涂抹后均可在一定程度上改善炎症细胞浸润。利用qRT-PCR检测了炎症因子mRNA的表达，结果如图12和表10所示，Tape处理后，皮肤组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、CXCL1、CXCL2的mRNA存在明显升高，而不同浓度的硝酸甘油涂抹后均可在一定程度上抑制皮肤组织中上述炎症因子mRNA水平的升高。
图12中，*代表P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，nd表示不确定。*的数量越多，说明差异性越显著。
表10 硝酸甘油对Tape处理后敏感肌炎症趋化相关因子mRNA表达的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与IMQ处理组比较，P＜0.05。
上述内容说明硝酸甘油对于炎症因子的表达水平具有调节作用，进而能有效改善敏感肌皮肤炎症。
此外，还检测了不同浓度的硝酸甘油涂抹后对表皮屏障功能相关因子S100A7、S100A9、K1、K10的mRNA的表达水平的影响，角蛋白K1、K10对表皮渗透性屏障功能和角质层的水化作用至关重要，钙结合蛋白S100A7和S100A9可诱导其他皮肤蛋白质和皮脂的合成。结果如图13和表11所示，Tape处理后上述因子mRNA存在明显升高，说明Tape处理破坏了表皮屏障功能，从而在一定程度上造成敏感肌的产生。而不同浓度的硝酸甘油涂抹后均可在一定程度上抑制上述因子的升高，说明不同浓度的硝酸甘油均可促进敏感肌表皮屏障功能恢复。
图13中，*代表P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。*的数量越多，说明差异性越显著。
表11硝酸甘油对Tape处理后敏感肌表皮屏障相关因子mRNA表达的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与Tape处理组比较，P＜0.05。
上述内容说明硝酸甘油对于表皮屏障功能因子的表达水平具有调节作用，进而可以促进敏感肌表皮屏障功能的恢复。
实施例4：硝酸甘油在改善敏感肌小鼠免疫功能、抑制敏感肌表皮增生和降低敏感肌血管通透性中的研究。
（1）药物配制：
本实施例购买的硝酸甘油成品为：济宁为民制药有限公司生产的硝酸甘油气雾剂，规格为5mL。
原液：硝酸甘油浓度为88mM的硝酸甘油气雾剂；
浓度为10mM的硝酸甘油配制：吸取原液227μL，并加入95%乙醇1773μL。
（2）小鼠模型：
按照实施例2所述的分组及处理方法对小鼠进行相关试验：
（3）结果分析：
如图14所示，首先在所有处理结束后对耳部皮肤进行拍照观察，显示IMQ处理3天（Day 3）和7天（Day 7），耳部皮肤均存在明显充血和脱屑，而经不同浓度的硝酸甘油涂抹后均可在一定程度上改善耳部充血和脱屑。通过HE染色检测并用ImageJ软件测量表皮厚度的变化，结果如图15、图16和表12所示，可见IMQ处理后耳部表皮厚度明显增加，而不同浓度的硝酸甘油涂抹后均可在一定程度上抑制IMQ引起的敏感肌小鼠表皮增生，但是不同浓度的硝酸甘油在IMQ处理3天和处理7天有所差异，IMQ处理3天时，原液的抑制效果明显，而处理7天时，10mM硝酸甘油抑制效果明显，且具有统计学差异。
表12 硝酸甘油对IMQ处理后敏感肌表皮厚度的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与IMQ处理组比较，P＜0.05。
上述内容说明硝酸甘油可明显抑制敏感肌表皮增生。
浅表微血管增生和高渗透性表型是敏感肌发生发展的重要特征。检测了不同浓度的硝酸甘油涂抹后，血管通透性相关因子VCAM、ICAM、VEGF、EGF的mRNA的表达水平，结果如图17和表13所示，IMQ处理后以上因子的表达水平明显升高，而IMQ+硝酸甘油处理组处理后的以上因子表达水平呈现下调趋势，但是IMQ处理3天和处理7天有所差异，处理7天效果更加明显，并具有统计学差异。
图17中，*代表P值，*P<0.05。*的数量越多，说明差异性越显著。
表13硝酸甘油对IMQ处理后敏感肌血管通透性相关因子mRNA表达的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与IMQ处理组比较，P＜0.05。
上述内容说明硝酸甘油对于血管通透性因子的表达水平具有调节作用，进而能够有效改善敏感肌血管通透性。
IL-23/Th17是皮肤疾病免疫调节的关键通路。IL-23由皮肤驻留的树突状细胞分泌，并诱导Th17细胞极化并产生（IL-17a/IL-22等）促炎介质。因此，检测了不同浓度的硝酸甘油处理后，免疫细胞活性相关因子IL-17a、IL-23、IL-22的mRNA的表达水平，结果如图18和表14所示，IMQ处理后以上因子表达水平明显升高，而IMQ+硝酸甘油处理组对以上因子处理3天表达水平均明显下调，具有统计学差异。但IMQ处理7天却呈现上调趋势，提示硝酸甘油调节敏感肌要控制好用量和时间，处理3天后，上述三种因子10mM浓度硝酸甘油抑制效果最佳，处理7天后，对于IL-23因子10mM浓度抑制效果最佳，其他因子无抑制作用。
图18中，*代表P值，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。*的数量越多，说明差异性越显著。
表14硝酸甘油对IMQ处理后敏感肌免疫活性相关因子mRNA表达的影响
注：*与对照组比较，P＜0.05；#与IMQ处理组比较，P＜0.05。
上述内容说明硝酸甘油对于敏感肌免疫活性相关因子的表达水平具有调节作用，进而改善敏感肌免疫功能。
实施例5：人体皮肤敏感性试验。
（1）药物配制：
本实施例购买的硝酸甘油成品为：济宁为民制药有限公司生产的硝酸甘油气雾剂，规格为5mL。
原液：硝酸甘油浓度为88mM的硝酸甘油气雾剂；
浓度为10mM的硝酸甘油配制：吸取原液227μL，并加入95%乙醇1773μL。
本次项目共12名敏感肌志愿测试者参加测试。
在恒温恒湿的环境中，测试者面部区域在测试当天不能使用任何产品并清洁面部皮肤。在测试者脸部皮肤涂抹上述浓度的硝酸甘油后，通过经表皮水分流失TEWL测试探头、皮肤水分含量测试仪，皮肤表皮油脂含量测试仪、皮肤黑色素和血红素测试仪检测、面部图像分析仪测试皮肤初始值及使用后14天、28天各指标值的变化。
其中，试验过程中各仪器型号如下：经表皮水分流失TEWL测试探头（型号Tewameter TM Hex）；皮肤水分含量测试仪（型号Corneometor CM825）；皮肤黑色素和血红素测试仪（型号Mexameter MX18）；皮肤表皮油脂含量测试仪（型号Sebumeter SM815）；面部图像分析仪(型号Visia 7)。
皮肤经表皮水分流失测试是通过经表皮水分流失量TEWL 测试仪Tewameter TMHex。结合Fick 定律中的参数，计算得到单位时间、单位面积内皮肤表面水分的扩散量，即经表皮水分流失量。经表皮水分流失量越低，角质层屏障功能越好。
表15 使用前后经表皮水分流失量测试结果
表16 使用前后经表皮水分流失量的显著性差异检验
表15和表16证实：使用硝酸甘油后，经表皮水分流失量显著性降低，与初始值相近（P<0.05），表明使用后经表皮水分流失量发生显著变化。
采用电容法测定人体角质层的水分含量是基于水和其他物质的介电常数差异显著，按照皮肤角质层水分含量的不同，测得的皮肤电容值不同，其参数可代表皮肤水分含量。测试值越大表示角质层水分含量越高。
表17 使用前后角质层水分含量测试
表18 使用前后角质层水分含量的显著性差异检验
表17和表18证明：使用硝酸甘油后，使用后皮肤水分含量显著性升高（P<0.05），表明产品使用后皮肤水分发生显著变化。
其中，皮肤黑色素和血红素测试：探头内部有八个环向均匀分布的LED白光光源，发出的光在探头内部所有方向散射，部分光穿过皮肤，部分光通过皮肤散射。只有皮肤的反射光被探头内部的XYZ传感器接收到，这样皮肤颜色可以用XYZ三基色法测试出来。ITA值越大，皮肤亮度越高。
表19使用前后皮肤血红素含量测试结果
表20使用前后皮肤血红素含量的显著性差异检验
表19和表20证明：使用硝酸甘油后，血红素显著降低（P<0.05），表明产品使用后黑色素和血红素发生显著变化。
面部图像分析仪可以证明测试者红区面积在初始、14天及28天内的皮肤红区面积。
如图19所示，测试者在使用硝酸甘油后14天，28天的红区面积对比图，证明硝酸甘油对于敏感肌皮肤屏障功能有重要作用。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.硝酸酯类化合物在制备改善敏感肌表皮屏障产品中的应用，其特征在于：将硝酸酯类化合物作为活性成分制备成改善敏感肌表皮屏障的产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硝酸酯类化合物为硝酸甘油、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯中的一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品为单一硝酸酯类化合物或硝酸酯类化合物加入药学上可接受的辅料的组合物；所述产品的剂型包括膏剂、喷剂、搽剂、贴剂、乳剂、凝胶剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品中硝酸酯化合物的有效浓度范围为1mM-10mM。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硝酸酯类化合物通过降低炎症因子的mRNA表达的水平，改善敏感肌的皮肤炎症；所述炎症因子包括IL-1α、IL-1β、IL-6、CXCL1和CXCL2。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硝酸酯类化合物通过降低表皮屏障功能相关因子的mRNA表达的水平，促进敏感肌表皮屏障功能的恢复；所述表皮屏障功能相关因子包括S100A7、S100A9、K1和K10。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硝酸酯类化合物通过降低敏感肌血管通透性相关因子的mRNA表达的水平，降低血管通透性；所述血管通透性相关因子包括VCAM、ICAM、VEGF和EGF。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硝酸酯类化合物通过降低免疫细胞活性相关因子的mRNA表达的水平，改善敏感肌免疫功能；所述免疫细胞活性相关因子包括IL-17a、IL-23和IL-22。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述硝酸酯类化合物通过抑制敏感肌表皮增生改善敏感肌表皮屏障功能。
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