CN117441669A - 一种通过轻度自噬提高小鼠肌肉分化能力的饲养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了动物科学技术领域的一种通过轻度自噬提高小鼠肌肉分化能力的饲养方法，采用小鼠纯化维持饲料喂养42‑45日龄清洁级c57BL/6雌性小鼠，进行适应性饲养2周后，按平均采食量的70%采用纯化维持饲料喂养2‑3周后，得到实验用成品小鼠。本发明按平均采食量的70%采用纯化维持饲料喂养时，可以利用更少的饲料获得更好的肌肉品质。发明提供的饲养方法简便，易于操作，易控制。采用本发明所述的促进小鼠肌肉分化的方法，能够极大的节约饲养成本并且获得更为优质的肉质产品。对家畜禽饲养业具有指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及动物科学技术领域，特别涉及一种小鼠的饲养方法。
背景技术
家畜的肌肉约占体重的30～40%，是主要的畜禽产品，在生产性能中有着举足轻重的作用。有关家畜产肉性状形成机制一直是动物遗传育种领域关注的重点，虽然近年来取得了一些重大突破和重要进展，但尚有许多未知的调控因子、调控机制有待研究。长久以来，人们一直在平衡生产性能与饲养成本之间的关系，希望以更低的成本获得更高的生产性能。现有养殖技术存在养殖饲养效率低下、肌肉转化率和肌肉品质不高等不足。
在哺乳类实验动物中，由于小鼠体小，饲养管理方便，易于控制，生产繁殖快，有明确的质量控制标准，已拥有大量的近交系、突变系和封闭群，近年来遗产工程小鼠的培育迅速增加，因此在各种实验研究中，用量最大，用途最多。
目前对小鼠肌肉转化率和肌肉品质提高缺乏行之有效的技术手段，一方面，特定的实验需要对小鼠的肌肉品质有相应的要求，另一方面，提高小鼠肌肉转化率的养殖方法对家禽的养殖具有指导性意义。通过运动提高小鼠的肌肉品质看似一种很好的办法，但是该方法对饲料的消耗相对较高，肌肉转化率并不高，此外，不同小鼠对运动的兴趣并不相同，因此，只能通过人为控制的强制运动使养殖的小鼠被动运动，其管理成本高，费时费力。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过轻度自噬提高小鼠肌肉分化能力的饲养方法，节约成本的同时促进肌肉发育，对家畜禽饲养业具有重要的指导意义。
为此，本发明提供了一种通过轻度自噬提高小鼠肌肉分化能力的饲养方法，包括如下步骤：
1）采用小鼠纯化维持饲料喂养42-45日龄清洁级c57BL/6雌性小鼠，各组小鼠提供洁净饮水，恒温恒湿，适应性饲养2周，保持清洁卫生，小鼠自由采食；
2）每日记录小鼠采食量，适应性饲养2周后，对小鼠进行称重，淘汰体重偏离中间值的前5%和后5%的小鼠；同时，计算出全部小鼠饲养2周内的平均采食量；
3）对小鼠进行单笼饲养，自由饮水，同时按平均采食量的70%采用纯化维持饲料喂养，其余条件同步骤1），喂养2-3周后，得到实验用成品小鼠。
进一步地，在饲养周期内，对小鼠采用明暗交替的模拟日光光照，光照周期12小时明，12小时暗。
进一步地，饲养周期内，在24-26℃下恒温饲养，相对湿度40-60%。
与现有技术相比，本发明采用限饲喂养，诱导小鼠自噬发生，进而影响肌肉分化，促进小鼠肌肉发育，按平均采食量的70%采用纯化维持饲料喂养时，具有最佳效果，可以利用更少的饲料获得更好的肌肉品质。发明提供的饲养方法简便，易于操作，易控制。采用本发明所述的促进小鼠肌肉分化的方法，能够极大的节约饲养成本并且获得更为优质的肉质产品。对家畜禽饲养业具有指导意义。
附图说明
图1为实施例二中五组小鼠血液胆固醇、葡糖糖含量及骨骼肌中甘油三酯含量的示意图。
图2为实施例三中五组小鼠骨骼肌线粒体膜电位、活性氧、ATP示意图。
图3为实施例四中五组小鼠骨骼肌中自噬标志蛋白P62和LC3蛋白相对表达量。
图4为实施例四中五组小鼠骨骼肌中AMPK/MTOR自噬通路蛋白相对表达量。
图5为实施例四中五组小鼠骨骼肌中线粒体自噬自蛋白PINK1和Parkin相对表达量。
图6为实施例四中五组小鼠骨骼肌中成肌分化标志蛋白Myod和MYH相对表达量。
图7为实施例四中五组小鼠骨骼肌中成脂分化标志蛋白LPL和PPARγ相对表达量。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了通过轻度自噬提高小鼠肌肉分化能力的饲养方法，具有操作方便、效果佳的优点。
1.实验材料
1.1实验小鼠：六周龄清洁级C57BL/6小鼠，一共200只；小鼠纯化维持饲料（10%Kcal）购自江苏美迪森生物。
按如下步骤进行饲养：
1）采用小鼠纯化维持饲料喂养42-45日龄清洁级c57BL/6雌性小鼠，各组小鼠提供洁净饮水，恒温24-26℃饲养，相对湿度40-60%，保持温度、湿度相对稳定，模拟日光光照，光照周期12小时明，12小时暗，适应性饲养2周，每2天更换垫料并清洗鼠笼，小鼠自由采食；
2）每日记录小鼠采食量，适应性饲养2周后，对小鼠进行称重，淘汰体重偏离中间值的前5%和后5%的小鼠，淘汰体重最重的10只和最轻的10只；同时，计算出全部小鼠饲养2周内的平均采食量；
3）将剩余小鼠随机取若干只，对小鼠进行单笼饲养，自由饮水，同时按平均采食量的70%采用纯化维持饲料进行梯度喂养，其余条件同步骤1），喂养2-3周后，得到实验用成品小鼠。
实施例2
为快速验证本发明的技术员效果，将实施例1中步骤2后的小鼠取40只，分为四组，每组10只；小鼠纯化维持饲料（10% Kcal）购自江苏美迪森生物。以自由采食组为对照组，日均采食量的70%为轻度限饲喂养组（实施例一），日均采食量的30%与0%为强烈限饲喂养组。进行为期一天的分组限饲喂养。
本实施例通过对血液生化检测五组小鼠葡萄糖含量、胆固醇含量以及肌肉中甘油三酯（TG）含量，以验证轻度限饲可提高肌肉肌内脂肪含量。
实验材料
甘油三酯试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司
高精度电子称CX－I2000凯丰集团有限公司
全自动生化分析仪AU480BECKMANCOULTER
高速冷冻离心机5810R Eppendorf
全自动生化仪分析检测血清中GLU和CHO含量
小鼠眼眶静脉窦采400ul全血置于1.5ml EP管，避免溶血，室温静置30min，1800g离心10min后再1300g离心2min，取上清，全自动生化仪分析检测血清中GLU和CHO含量。
3．骨骼肌中甘油三酯含量检测
3.1 样本处理
3.1.1将正庚烷和异丙醇按体积比 1:1 混合，各组称取约0.1g骨骼肌组织，加入1mL混合物，进行冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清待测。
3.1.2 按甘油三酯（TG）含量检测试剂盒说明书配置空白管 标准管 测定管。充分混匀，65℃水浴 15min，冷却，冷却后吸取 200μL ，96 孔板测定 420nm 处吸光度，记为 A空，A 标和 A 测。TG 含量（mg/ g 质量）=（A 测-A 空）÷（A 标-A 空）÷ W 。W：样本质量，g；
4.结果
如图1所示，不同程度限饲喂养小鼠血液中葡萄糖含量梯度降低，血液中胆固醇含量及骨骼肌中甘油三酯含量，70%轻度限饲喂养组显著高于其他对照组。
实施例3
本实施例采取各组小鼠小腿骨骼肌，进行线粒体功能检测，以验证短期轻度限饲对线粒体功能的促进作用。
实验材料
组织线粒体提取试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、ATP检测试剂盒购自碧云天生物有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；活性氧（ROS）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所
2. 线粒体膜电位检测
2.1 组织线粒体提取：
2.1.1 准备溶液：室温融解试剂盒中的各种溶液，融解后立即置于冰上并混匀。
2.1.2 剪取一小块新鲜骨骼肌组称重并且保存在冰上，用PBS洗涤组织一次。冰上剪碎成细小的组织碎片。
2.1.3 加入10体积预冷PBS，冰浴3分钟。600g离心20秒，沉淀组织样品，弃上清。再加入8体积预冷的胰酶消化液，冰浴20分钟。600g离心20秒，沉淀组织样品，弃上清。
2.1.4 加入2体积相应线粒体分离试剂，重悬组织，用于洗去残余的胰酶，600g离心20秒，沉淀组织样品，弃上清。加入8体积预冷线粒体分离试剂B冰浴上进行匀浆，匀浆20-30次。把匀浆在600g，4℃离心5分钟
2.1.5 小心把上清转移到另一离心管中，在11,000g，4℃离心10分钟小心去除上清。沉淀即为分离得到的线粒体。分离得到的线粒体用适量线粒体储存液重悬备用。
2.2 膜电位检测：
2.2.1 JC-1染色工作液的配制：按照说明书，按照每500微升JC-1（20x）加入８ml超纯水的比例稀释JC-1剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1；然后再加入2mlJC-1染色缓冲液（5x），混匀后即为JC-1染色工作液。
2.2.2 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色缓冲液(1X)稀释5倍。0.2ml5倍稀释的JC-1染色工作液中加入20ml总蛋白量为10-100µg纯化的线粒体。
2.2.3 荧光酶标仪检测：检测JC-1单体时把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。
3. ATP检测：
3.1 ATP检测试剂的配置
取适量的ATP检测试剂，按照1:9的比例用ATP检测试剂稀释液稀，配置ATP检测工作液，配置后冰上保存。
3.2 待测样品的准备
取各组小鼠腿部骨骼肌称重后取40mg加入200μL裂解液，然后玻璃匀浆器进行匀浆。充分匀浆可以确保组织被完全裂解。裂解后4℃12000g离心5分钟，取上清，用于后续的测定。
3.3 按照拭剂盒操作说明，把ATP标准溶液用ATP检测裂解液稀释成适当的浓度梯度；
3.4 ATP浓度测定
在96孔板黑板中，每个待测孔加100μLATP检测工作液，放置数分钟去除本底性ATP。在每个待测孔中加入10μL样品，混匀并间隔至少两秒后，使用具有化学发光功能的酶标仪测定ＲＬＵ值，并根据制备的ATP标准曲线计算样品中的ATP的水平；
3.5 ATP结果定量检测
为了消除细胞量不同所造成的ATP误差，使用BCA试剂检测各组样品蛋白浓度，把ATP的浓度最终换算为mnol/mg蛋白的形式。
4. 线粒体活性氧ROS检测
4.1 制备单细胞悬液：
4.1.1 取小鼠骨骼肌立即放入预冷的PBS中，清洗血迹及其它污染物。去除组织块中的块死成分、纤维、脂肪及血管。
4.1.2 用眼科剪将组织块剪成1mm3左右小块，PBS中并进行漂洗，洗去剪碎的细胞碎片。
4.1.3 将300目尼龙网扎在小烧杯上，将剪碎的组织放在网上，以眼科镊轻搓组织块，边搓边用PBS冲洗，直至将组织搓完。
4.1.4收集细胞悬液，500g离心10min，去上清留沉淀，并用PBS洗1～2次。
4.2 加入荧光探针：取不进行任何处理的细胞用0.01MPBS重悬，设为阴性对照管。用稀释好的 DCFH-DA 重悬细胞沉淀，37℃孵育细胞1h。每隔 3-5分钟颠倒混匀一下，使探针与细胞充分接触。收集孵育后的单细胞悬液。1000g，离心10min，去上清收集细胞沉淀，用PBS 洗涤 1-2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。离心收集细胞沉淀用于荧光检测。
4.3 荧光检测：
4.3.1 将上述收集好的细胞沉淀用 PBS 重悬用于检测，同时取部分单细胞悬液经过超声破碎处理，BCA测定蛋白浓度。
4.3.2 波长设置：最佳激发波长 488nm，最佳发射波长 525nm。结果以荧光度值/毫克蛋白表示。
5.结果
如图2所示，强烈限饲喂养组线粒体膜电位显著下降，活性氧显著上升，ATP含量显著下降，表明强烈限饲喂养对线粒体产生损伤，损害线粒体正常功能。轻度限饲喂养组线粒体膜电位与活性氧与正常组无显著差异，ATP较正常组显著上升，表明轻度限饲喂养对维持线粒体正常功能有着积极作用。
实施例4
本实施例采取各组小鼠小腿骨骼肌，提取蛋白，通过Western blot检测自噬通路蛋白并对相关蛋白表达与成脂成肌分化进行相关性分析，成功证明了短期轻度限饲激活AMPK/MTOR自噬通路产生自噬并对骨骼肌成肌成脂具有促进作用。
实验材料：
抗体：AMPK购自于美国CellSignaling生物；P-AMPK购自于美国GENE TEX生物；MTOR、P-MTOR、PARKIN、TUBULIN、LC3、P62购自于武汉三鹰生物技术有限公司；PINK1、LPL、PPARγ、MYOD 、MYH购自于美国SANTA生物；磷酸化抑制剂和10XReducer购自罗氏制药公司；
2. Western Blot
2.1 肌肉组织提取蛋白
采取各组小鼠小腿骨骼肌，加入含PMSF、磷酸化抑制剂和10XReducer的RIPA裂解液中剪碎，组织匀浆机匀浆，4℃,12000rpm,10min，后取上清液。BCA试剂盒液测定骨骼肌组织蛋白浓度；
2.2 电泳转膜
2.2.1制备浓缩胶和分离胶，本研究中常用的４％浓缩胶配置体系与8％分离胶配置体系；
2.2.2电泳：配置好的蛋白上样体系于95℃变性10min，每孔加入10μg蛋白样品，SDS-PAGE凝胶电泳60V30min90V60min；
2.2.3转膜：PVDF膜甲醇激活后，置于1XTransferbuffer中进行膜平衡。转膜时将转膜夹白面向下置于1XTransferbuffer中，依次放入海绵、滤纸、PVDF与胶，在取出膜与胶之间的气泡后再放入上层滤纸、海绵，固定，4℃，60v的条件下转膜120min。
2.2.4 封闭：取出膜，置于２％BSA中，室温，摇床上轻轻震荡封闭1ｈ。
2.2.5 孵育一抗：使用２％BSA稀释的一抗，４Ｃ摇床上孵育过夜，孵育完成后，在摇床上用TBST洗5次，每次5min。
2.2.6 孵育二抗：使用２％BSA稀释的二抗，室温孵育２ｈ，孵育完成后，在摇床上用TBST洗5次，每次5min。
2.2.7显影：将显影液Ａ液、Ｂ液等体积混合，均匀覆盖于PVDF膜上，孵育1min后使用自动化学发光图像分析系统进行显影；
2.2.8数据分析：采集到的图像使用ImagJ软件测定杂交条带的灰度值，目标蛋白灰度值和相应内参条带灰度值的比值为各目的条带的相对表达量。
3. 结果
如图3-7所示，短期限饲喂养激活AMPK/MTOR通路引起细胞自噬与线粒体自噬，随着限饲程度变强，自噬程度变强。其中70%轻度限饲喂养组显著高于其他对照组轻度限饲喂养成肌成脂分化标志蛋白表达量均高于其他三组，表明70%轻度限饲喂养组显著高于其他对照组轻度限饲喂养促进肌肉分化产生积极的影响。
本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种通过轻度自噬提高小鼠肌肉分化能力的饲养方法，其特征在于包括如下步骤：
1）采用小鼠纯化维持饲料喂养42-45日龄清洁级c57BL/6雌性小鼠，各组小鼠提供洁净饮水，恒温恒湿，适应性饲养2周，保持清洁卫生，小鼠自由采食；
2）每日记录小鼠采食量，适应性饲养2周后，对小鼠进行称重，淘汰体重偏离中间值的前5%和后5%的小鼠；同时，计算出全部小鼠饲养2周内的平均采食量；
3）对小鼠进行单笼饲养，自由饮水，同时按平均采食量的70%采用纯化维持饲料喂养，其余条件同步骤1），喂养2-3周后，得到实验用成品小鼠。
2.根据权利要求1所述的一种通过轻度自噬提高小鼠肌肉分化能力的饲养方法，其特征在于：饲养周期内，对小鼠采用明暗交替的模拟日光光照，光照周期12小时明，12小时暗。
3.根据权利要求1所述的一种通过轻度自噬提高小鼠肌肉分化能力的饲养方法，其特征在于：饲养周期内，在24-26℃下恒温饲养，相对湿度40-60%。
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