CN117417437A - 一种鱼类胶原免疫调节十肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鱼类胶原免疫调节十肽，其氨基酸序列为：PGPDGPPGPM。本发明能够以沙丁鱼鱼鳞为原料，获得沙丁鱼鱼鳞免疫调节肽的氨基酸序列，且制备的沙丁鱼鱼鳞免疫调节肽具有良好的免疫调节作用。
Description
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及一种鱼类胶原免疫调节十肽。
背景技术
随着年龄的增长，人们不得不面对各种免疫功能低下或紊乱所引起问题，这也使得免疫调节类药物的研究越来越受消费者关注。炎症是身体对刺激的免疫防御反应，是一套消除威胁、促进组织修复和恢复生理平衡的保护机制。然而过度的免疫反应会对身体造成伤害，引起神经退行性疾病、骨关节炎、癌症、糖尿病、心血管疾病和炎症性肠病等多种疾病的发生。目前用于治疗炎症性疾病的合成药物有很多，如泼尼松、布洛芬和阿司匹林等。一方面，这些合成药在一定程度上可以缓解炎症，调节患者的免疫平衡，降低疾病感染的风险并辅助自身免疫病的治疗。而另一方面，这些药物大多对人体有一些不良的副作用，如降低组织的可修复性、损伤胃肠黏膜等，且经济成本也给人们带来不少的困扰。从天然成分中开发的具有免疫活性的提取物更加安全、有效，成为近年来研究的热点。如源自猪乳铁蛋白的肽LFP-20可以通过调节免疫稳态来防御LPS刺激的小鼠全身炎症反应。从乳清蛋白水解物中分离的多肽DQWL抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中IL-6，IL-1β和TNF-αmRNA的表达水平，并通过调节NF-κB和MAPK途径减轻巨噬细胞的炎症反应。Mengqi Li等人从松茸中分离鉴定的四肽(TMWP)能够通过调节细胞因子分泌量，显著降低IL-1β和IL-6的分泌以及TNF-α、COX-2和iNOS的表达，减轻LPS诱导的炎症，调节免疫平衡。
沙丁鱼(学名：Sardina pilchardus)是鲱科、沙丁鱼属鱼类。为细长的银色小鱼，体长15～30厘米，头部无鳞，体侧圆鳞大小不一。分布于北纬14-68度的海洋区域中。沙丁鱼为近海暖水性鱼类，一般不见于外海和大洋。沙丁鱼食用价值很高，整体营养价值高，被大量捕捞运用于食品加工领域。沙丁鱼也是全球重要的经济鱼类，它们往往是远洋捕捞的重要产物。沙丁鱼中含有能防止心血管病的廿碳五烯酸，还含有核酸、牛磺酸及硒等多种营养成分，药用价值非常高。同时含有丰富的DHA，对心血管有帮助。另外，富含磷脂即OMEGA-3脂肪酸、蛋白质和钙。但由于此种鱼个体小，产量高产值低，保鲜加工困难大，多做成鱼丸、鱼卷、鱼香肠、鱼罐头等多种方便食品。目前对沙丁鱼的研究主要集中在食品加工方面，鲜有对沙丁鱼深加工和生物活性研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鱼类胶原免疫调节十肽，其以沙丁鱼鱼鳞为原料，获得鱼类胶原免疫调节十肽的氨基酸序列，且制备的鱼类胶原免疫调节十肽具有良好的免疫调节作用。
为达到上述目的，本发明公开了一种鱼类胶原免疫调节十肽，其氨基酸序列为：PGPDGPPGPM。
优选地，其分子量为936.4011Da。
本发明具有以下有益效果：
本发明以沙丁鱼鱼鳞为原料，获得鱼类胶原免疫调节十肽的氨基酸序列，制备的鱼类胶原免疫调节十肽具有良好的免疫调节作用。本发明鱼类胶原免疫调节十肽以沙丁鱼鱼鳞为原料制备得到，废物利用，为沙丁鱼下脚料的高值化加工利用提供新思路，也为开发天然免疫调节产品拓展了资源。
附图说明
图1为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM的UPLC-MS/MS图。
图2为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM与TLR4蛋白分子对接3D模型。
图3为图2中A部的放大示意图。
图4为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM的2D结构图。
图5为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM结合位点疏水界面。
图6为蛋白-配体复合物所有原子对于其初始结构的均方根偏差(RMSD)走势图。
图7为蛋白-配体复合物的氨基酸骨架原子随时间变化的RMSF值。
图8为蛋白-配体复合物的原子指数随时间变化的RMSF值。
图9为配体-原子与蛋白质残基的详细相互作用示意图。
图10为蛋白-配体复合物的相互作用类型统计图(按氨基酸参与分类)。
图11为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM对RAW264.7细胞活力的影响。
图12为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM对RAW264.7细胞NO释放量的影响。
图13为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM对细胞IL-6分泌的影响。
图14为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM对细胞IL-1β分泌的影响。
图15为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM对细胞TNF-α分泌的影响。
图16为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM对斑马鱼巨噬细胞吞噬的影响。
图17为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM对斑马鱼T细胞数量的影响。
图18为鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM对斑马鱼中性粒细胞数目的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明公开了一种鱼类胶原免疫调节十肽，其氨基酸序列为：PGPDGPPGPM，如序列表SEQ ID NO：1所示。上述鱼类胶原免疫调节十肽的分子量为936.4011Da。
上述鱼类胶原免疫调节十肽的制备方法，其包括以下步骤：
S1、预处理
去除沙丁鱼鱼鳞中的钙成分和非胶原蛋白，烘干备用。先将干制(晾干)的沙丁鱼鱼鳞打碎，以使得鱼鳞网状结构被破坏。
将沙丁鱼鱼鳞按照料液比1：20加入0.75mol/L的乳酸溶液中浸泡1h，以除去钙成分为了加速鱼鳞中钙成分的去除，将乳酸浸泡的鱼鳞置于40℃，功率为100W的超声装置中进行超声。鱼鳞浸泡1h后，用蒸馏水反复冲洗鱼鳞直至中性。
将去除钙成分的沙丁鱼鱼鳞加入浓度为3％的NaCl溶液中浸泡过夜(12h)，鱼鳞和NaCl溶液的料液比为1：20。浸泡完成后用蒸馏水冲洗沙丁鱼鱼鳞至中性，滤去沙丁鱼鱼鳞中的非胶原蛋白。去除钙成分和非胶原蛋白的沙丁鱼鱼鳞在40～50℃的烘箱中烘干备用。
S2、制备鱼鳞胶原蛋白肽粗品
称取一定量预处理后的鱼鳞于烧杯中，按照料液比1:50加入蒸馏水，用盐酸或氢氧化钠溶液将pH值调至酶解最适pH值(10.5)，在40℃恒温水浴锅中预热30min，之后加入蛋白酶充分混匀进行酶解，蛋白酶的添加量为7526U/g，酶解4h。酶解过程中，不断用氢氧化钠溶液调节pH(稳定在10.5)直至鱼鳞固体基本全部消失。酶解结束后，于100℃下灭酶15min，使得蛋白酶失活，终止反应。
待酶解液冷却至室温后，对酶解液进行离心处理，离心转速为5000r/min，离心温度4℃，离心时间20min，取上清液。
上清液依次经过陶瓷膜、超滤膜和纳滤膜进行分级分离，去除杂质和脱除盐分，得到分子量＜1kDa的鱼鳞胶原蛋白肽，并冻干处理。
S3、序列鉴定
鱼类胶原免疫调节十肽结构测定使用美国赛默飞世尔科技有限公司的Q-Exactive Plus质谱仪进行LC-MS/MS分析。首先称取适量沙丁鱼鱼鳞胶原蛋白肽(＜1KD)经C18除盐柱进行除盐，过柱(Acclaim PepMap C18)上样量为3μL，在柱温40℃，柱流量300nL/min的条件下，以60min的梯度分离样品。设置流动相A液为0.1％甲酸溶液，B液为0.1％甲酸-乙腈溶液。色谱参数：电喷雾电压2kV，梯度从2％的B相起始，在47分钟以非线性梯度升高到35％，1分钟内升高到100％，保持12分钟。质谱采用ESI正负离子扫描，质谱仪在数据依赖采集模式下运行，MS和MS/MS采集间自动切换。MS主扫描范围、分辨率、AGC目标和停留时间分别为(m/z):200-2000、70,000、3e6和50ms。二次扫描分辨率、AGC目标和最大注入时间分别为:17,500、1e5和45ms。此外，碰撞能量为28；动态排除时间是30s.串联质谱原始文件经过软件PEAKS Studio version 10.6(Bioinformatics Solutions Inc.,Waterloo,Canada)对鱼类胶原免疫调节十肽进行的定性定量分析，获得多条不重复多肽序列。本步骤一共获取了2914多肽序列，数目较多。
S4、预筛选
根据免疫调节活性肽具有肽链短、一般由2～10个氨基酸组成的特点，先筛选出肽链短且由2～10个氨基酸组成的多肽序列，然后再将选取的多肽序列根据条件(-10lgP＞20，Mass＜1000，Length＜10.)进一步筛选，得到486条多肽序列，数目仍然较多。
将二次筛选出的多肽序列导入Bioware网站的PeptideRanker程序(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)进行生物活性预测，生物活性的概率得分从0到1，序列越有可能具有生物活性，则得分越高。因此对肽进行排名，并选择可能性评分大于0.75的序列。然后再利用在线软件http://pepcalc.com/对潜在功能活性肽片段的水溶性进行预测，选择水溶性好的肽段进行进一步筛选，以便于更好地发挥生物活性。
本步骤中一共筛选出了84条多肽序列，参见表1所示。
表1鱼鳞胶原多肽的水溶性及生物活性预测
S5、虚拟筛选
通过软件将步骤S4筛选出的多肽序列与受体进行分子对接，筛选出与受体结合能力强的多肽序列。具体地，用Discovery Studio 2019构建活性肽的3D结构作为配体，并通过CHARMM力场进行能量最小化。TLR4(PDB ID：5IJD)晶体结构从RCSB PDB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/)下载，然后使用Discovery Studio 2019软件脱水和加氢，去除蛋白多构象，进行优化和能量最小化以产生几何稳定的结构。使用软件DockLigand模块中的LibDock方案进行分子对接，以筛选与TLR4紧密结合的多肽。结合位点是根据软件预测法在蛋白空腔中寻找有潜力活性位点并结合文献检索结果定义的。在算法过程中，采用半柔性对接，TLR4受体设置为刚性，肽为柔性，每个肽输出包含20个构象和相应的分数，其他参数为默认值。LibdockScore是对能量、几何形状、化学环境综合评价的参数。LibdockScore越高，证明小分子与受体结合的活性越高，越方便其发生相互作用。反之，越低相互作用越差。以软件特有的打分函数“LibdockScore”作为评价标准，筛选分子对接亲和力最强的20个多肽进行合成，参见表2。
表2鱼鳞胶原多肽的分子对接得分前20
良好的水溶性和无毒性是筛选市售生物活性肽的重要标准。使用DiscoveryStudio 2019软件中的毒性预测工具预测多肽的毒性和ADMET性质。并使用TOPKAT模型预测Ames致突变性、发育毒性潜力和皮肤致敏性。最后将研究筛选得到的活性肽导入https://biochemia.uwm.edu.pl/en/biopep-uwm-2/年的BIOPEP数据库进行新颖性检查(Minkiewicz，Iwaniak，&Darewicz，2019年)，对未被报道的活性肽进行下一步研究。结果参见表3。
表3鱼鳞胶原多肽毒性和ADMET预测
S6、多肽合成
采用固相合成法合成虚拟筛选得到的20个无毒多肽，并通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)质谱(LC-MS/MS)联用对其纯度进行测定/验证，合成的多肽纯度≥98％，在-20℃干燥条件下储存备用，即得鱼类胶原免疫调节十肽。如图1所示，这条多肽的氨基酸序列被确定为Pro-Gly-Pro-Asp-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Met(PGPDGPPGPM)，分子量为936.4011Da。在这种新型肽中由十个氨基酸组成，其中有八个都是疏水性氨基酸。疏水性是蛋白质的重要物理性质。一些研究表明，疏水值可以有效地促进肽的免疫调节活性。这可能是由于肽和细胞膜的相互作用增加，从而改善了免疫调节。这条新型十肽富含疏水性氨基酸，这特性可能有助于免疫调节活性。
对鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM的构效关系进行研究，具体地，使用AutoDock将TLR4与PGPDGPPGPM进行分子对接，PGPDGPPGPM配体进行柔性设置，其他参数默认，Vina程序进行分子对接，分析PGPDGPPGPM与TLR4的构效关系。
如图2～5所示，PGPDGPPGPM与TLR4中的氨基酸Pro43、Phe42、Pro112、Arg86、Thr112、Lys136、Phe160、His158、Tyr183、Pro64、Arg68形成了氢键相互作用、疏水相互作用及电荷相互作用。其中肽PGPDGPPGPM分别与Tyr183、Thr112、Lys136、Arg68形成常规氢键。TLR4中的His158通过碳氢键与PGPDGPPGPM结合。此外，Pro43、Phe42、Pro112、Pro64、Phe160、His158、Arg86、Lys136与PGPDGPPGPM形成疏水相互作用，在PGPDGPPGPM与TLR4的Arg68、Arg86之间观察到有吸引力的电荷。
对鱼类胶原免疫调节十肽PGPDGPPGPM分子动力学模拟，MD模拟已被用于确定基于分子对接的结合亲和力预测的准确性。在分子对接的基础上使用Desmond/Maestrononcommercial version 2022.1软件对TLR4(5IJD)和鱼类胶原免疫调节十肽进一步研究了分子动力学模拟。分子动力学模拟使用牛顿的经典运动方程，通过计算原子随时间的变化运动，与分子对接策略相反，分子对接策略给出了蛋白质活性结合区域中活性分子的静态图像并预测配体结合状态。预测配体结合方式的模拟实验是在生理背景下进行的。利用TLR4的蛋白质制备向导，配体-蛋白质结合复合物首先进行预处理，然后再进行优化和最小化。将蛋白质-配体复合物连接到预设的TIP3P水模型中的斜方框上，添加0.15M氯化钠溶液平衡体系。考虑到压力，时间尺度和原子数量，在最小化和放松系统后，使用300K和1bar的等温等压系统进行100ns的分子动力学模拟。每100ps记录一次轨迹坐标。使用Desmond的模拟交互图进行分子动力学分析，从而进一步探索鱼类胶原免疫调节十肽与TLR4结合的机制。
在模拟过程中，蛋白的RMSD稳定在同时配体经过波动之后最终的RMSD稳定在/>左右。这说明二者相对初始构象有了一定程度的波动，说明二者的初始构象具有一定程度的稳定性，经过动力学模拟之后，在原有基础上形成了更稳定的结合构象。
如图7和图8所示，蛋白和小分子的RMSF值的波动属于正常范围。因此，我们认为该蛋白-小分子复合体经过动力学模拟之后形成了更为稳定的构象。
如图9和图10所示，在模拟过程中，蛋白和小分子形成了多组作用力，例如TYR183的氢键形成频率分别为83％和54％，总形成频率高达137％，说明二者结合过程中，TYR183氨基酸发挥了至关重要的作用，除此之外还形成了多个疏水作用和水桥帮助二者的结合。
综上所述，该PGPDGPPGPM小分子和蛋白通过动力学模拟在原有结合构象上进行优化，使该构象更加稳定，该构象下二者具有较高亲和力。
为了验证本发明鱼类胶原免疫调节十肽的体外活性，进行了如下实验。实验分为正常组、LPS组(1μg/mL)、地塞米松处理组(50μg/mL)、鱼类胶原免疫调节十肽处理组(50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL)，每组均设6个复孔。
实验一：巨噬细胞RAW264.7细胞活力的测定
巨噬细胞RAW264.7细胞活力通过MTS测定法检测。取对数生长期RAW264.7细胞，用DMEM培养基配置成1×105个/mL细胞悬浮液100μL，接种在96孔板上，于37℃培养箱中孵育24小时。将样品用DMEM培养液溶解，并加入96孔板中再孵育24小时。弃去上清液，向每个孔中加入20μL MTS/PMS工作液。在37℃培养箱中避光孵育1-4小时后,用酶标仪检测490nm处的吸光度。巨噬细胞活力的测定公式如下：
通过MTS法探究PGPDGPPGPM对RAW264.7细胞活力的影响，如图11所示，与正常组相比，不同浓度PGPDGPPGPM对RAW264.7细胞活力产生了一定的影响，且均无细胞毒性。此外，当其质量浓度为25～200μg/mL时，显著促进细胞生长。因此，选择50、100、200μg/mL 3个质量浓度进行后续实验，进一步探究其免疫作用。
实验二：NO含量测定
同上述培养方法相同，待细胞生长至70％-80％时，以1×105个/mL细胞密度种板至细胞贴壁生长稳定后，分组干预,置于培养箱中继续恒温培养24h。吸取50μL上清液分别转移到一个新的96孔板中，每孔依次加入50μL的GriessⅠ和GriessⅡ溶液，充分混匀后，用酶标仪检测540nm下的吸光度值。代入标准曲线，计算出NO的浓度。
由图12可知，与对照组相比，LPS组的NO分泌显著升高。添加不同质量浓度PGPDGPPGPM均能显著降低巨噬细胞上清液中NO含量，且呈浓度依赖性，其中200μg/mLNO含量可达到与正常组NO释放水平无显著差异，且与阳性组地塞米松(50μg/mL)处理效果相当。由此表明，PGPDGPPGPM可以有效降低炎症细胞模型中的NO分泌，通过抗炎作用实现对机体的免疫调节。
实验三：细胞因子分泌测定
同上述培养方法相同，按实验分组干预后，收集细胞培养上清液，根据试剂盒说明书使用ELISA试剂盒检测细胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)含量。
IL-6具有多种生物学功能，可以参与免疫调节。由图13可知，与对照组相比，LPS组显著增加了RAW264.7细胞IL-6的释放量(P<0.01)，经不同浓度的PGPDGPPGPM处理后，显著降低LPS诱导的巨噬细胞上清的IL-6分泌量。研究表明，PGPDGPPGPM可以有效降低炎症细胞模型中IL-6的分泌，从而发挥免疫调节作用。
由图14可知，与对照组相比，LPS组显著增加了RAW264.7细胞IL-1β的释放量(P<0.01)，经不同浓度的PGPDGPPGPM处理后，显著降低LPS诱导的巨噬细胞上清的IL-1β分泌量，且呈一定的剂量依赖性。研究表明，PGPDGPPGPM可以有效降低炎症细胞模型中IL-1β的分泌，从而发挥免疫调节作用。
由图15可知，与对照组相比，LPS组显著增加了RAW264.7细胞TNF-α的释放量(P<0.01)，经不同浓度的PGPDGPPGPM处理后，巨噬细胞上清液的IL-1β分泌量显著降低，且呈一定的剂量依赖性。研究表明，PGPDGPPGPM可以有效降低炎症细胞模型中IL-1β的分泌，从而发挥免疫调节作用。
斑马鱼作为新兴的模式生物，其免疫系统高度保守，免疫细胞类型和形态与人类相似。因此为了验证本发明鱼类胶原免疫调节十肽的体内活性，选择斑马鱼作为体内模型进行了如下实验。
实验一：对巨噬细胞吞噬功能的保护作用的测定
随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品，阳性对照百令胶囊15.0μg/mL浓度，同时设置正常对照组，每孔容量为20mL。各实验组均静脉注射荧光微球。28℃处理4天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下，用Image-J图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼荧光微球残留数目，以该指标的统计学分析结果评价PGPDGPPGPM对巨噬细胞吞噬效果的影响。
由图16可知，与模型组相比，经不同浓度的PGPDGPPGPM处理后，斑马鱼体内荧光微球残留数目显著减少(p＜0.01)，表明PGPDGPPGPM能够促进巨噬细胞吞噬，减少免疫低下的斑马鱼的荧光微球残留数量。
实验二：对T淋巴细胞数量减少的保护作用的测定
随机选取受精后3天(3dpf)转基因T细胞红色荧光品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品，阳性对照百令胶囊15.0μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液建立斑马鱼T细胞减少症模型。28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼T细胞荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价PGPDGPPGPM对T细胞数量的影响。
由图17可知，与空白对照组相比，模型组斑马鱼头部T细胞数目明显减少，经不同浓度的PGPDGPPGPM处理后，斑马鱼头部T细胞数目显著增加(p＜0.01)，表明PGPDGPPGPM能够一定程度上增加免疫低下的斑马鱼的T细胞数目。
实验三：对中性粒细胞的影响
随机选取受精后3天(3dpf)转基因巨噬细胞绿色荧光斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。水溶给予样品，阳性对照百令胶囊15.0μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液建立斑马鱼巨噬细胞减少症模型。28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，观察并统计斑马鱼全身中性粒细胞数目。
由图18可知，与空白对照组相比，模型组斑马鱼尾部中性粒细胞数目明显减少，经不同浓度的PGPDGPPGPM处理后，斑马鱼尾部中性粒细胞数目有所增加，表明PGPDGPPGPM能够一定程度上增加免疫低下的斑马鱼的中性粒细胞数目。
综上，本发明还公开了上述鱼类胶原免疫调节十肽在下述至少一种情况中的应用：
(1)在促进巨噬细胞增殖中的应用；
(2)在制备巨噬细胞增殖促进剂中的应用；
(3)在抑制巨噬细胞受刺激后NO释放、IL-6、TNF-α及IL-1β分泌量中的应用；
(4)在制备巨噬细胞受刺激后NO释放、IL-6、TNF-α及IL-1β分泌抑制剂中的应用；
(5)在制备调节生物免疫力的抗炎药物中的应用；
(6)在制备调节生物免疫力的食品配料中的应用；
(7)在制备巨噬细胞吞噬能力促进剂中的应用；
(8)在提升T细胞数量中的应用；
(9)在提升中性粒细胞数量中的应用。
其中，所述鱼类胶原免疫调节十肽的浓度为50～500μg/mL。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种鱼类胶原免疫调节十肽，其特征在于，其氨基酸序列为：PGPDGPPGPM。
2.如权利要求1所述的鱼类胶原免疫调节十肽，其特征在于：其分子量为936.4011Da。
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