CN117412781A - 用固定的细胞外囊泡进行生物材料功能化的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种将细胞外囊泡固定在细胞外基质材料中的方法，提供用于改善在体外和体内的细胞外囊泡滞留。细胞外基质材料(诸如胶原)与位于细胞外囊泡表面上的配体的化学物质功能化。在一个实施例中，胶原被二苯并环辛炔功能化，且细胞外囊泡被叠氮化物标签功能化。细胞外囊泡通过二苯并环辛炔和叠氮化物标签的点击反应固定在胶原内。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2021年5月10日提交的申请号为63/186,470的美国临时申请的权益，该申请通过引用并入本文中。
技术领域
本申请大体上涉及使用细胞外囊泡(EVs)进行的组织工程。更具体地，本申请涉及一种将EVs固定在细胞外基质(诸如胶原)中的方法以增加EVs在组织工程和再生医学应用中的保留和生物活性。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)可以从多种组织获得，并已经在许多应用中证明出强大的功效。越来越多的证据表明，MSCs的治疗益处在很大程度上是通过旁分泌机制经由MSC分泌组，并且特别是以携带EVs装载物的形式(诸如核苷酸、脂质、酶、信号转导蛋白、免疫调节细胞因子和生长因子)来实现的。MSC来源的EVs的治疗功效已经在多种损伤修复模型中得到充分证明，通过包括但不限于诱导细胞增殖和迁移、血管生成以及抗凋亡和抗炎作用等机制实现。此外，与使用活细胞的疗法相比，基于EV的疗法不太可能引发不良的免疫反应，免于外来细胞不受控制的生长的影响，并且不受基于活细胞的疗法的物流和监管问题的影响。
纳米级EVs代表了一种独特的细胞衍生物，反映了MSCs对组织工程的治疗潜力。然而，全身施用的EVs经历快速清除，并且通常没有集中的靶向给药，因此降低了它们在治疗性再生疗法中的有效性。因此，有利地，应开发一种固定EVs的方法以实现EVs的受控递送和延长滞留，从而可以在其他治疗应用中长期支持组织再生和修复。
发明内容
本申请的实施例是一种将EVs固定在诸如胶原的基质材料中的方法。在一个实施例中，所述方法将带有代谢掺入的叠氮化物配体的MSC来源的EVs的化学选择性固定在二苯并环辛炔修饰的胶原水凝胶中，从而能够实现长期的EV空间保留。叠氮化物-EVs表现出与非标记的EV对应物相当的形态和功能特性，并且当EVs固定在胶原水凝胶植入物中时，与使用10倍高剂量的非固定EVs相比，其引起更强的宿主细胞浸润、血管生成和免疫调节反应，包括血管向内生长和巨噬细胞募集。固定的EVs能够实现广泛的应用，以在空间上促进与组织工程和再生医学应用相关的血管化和宿主整合。
附图说明
图1示出根据一个实施例的EV固定方法的流程图。
图2示出EV标记的示意图。
图3示出各种材料的EV固定的示意图。
图4示出细胞外基质材料功能化的流程图。
图5示出功能化的胶原相比于对照胶原的示意图。
图6示出EV保留随时间变化的示意图。
图7是描述细胞浓度的示意图。
图8是描绘血红蛋白浓度的示意图。
图9是描述细胞浓度的示意图。
图10是描绘荧光强度的示意图。
图11是描绘荧光强度的示意图。
图12是描绘荧光强度的示意图。
具体实施方式
根据本申请实施例公开一种通过将代谢标记的EVs(extracellular vesicles，细胞外囊泡)和细胞外基质材料的点击反应相结合来产生固定的EVs的方法。在一个示例性实施例中，使用聚糖代谢工程形成的叠氮化物标记的间充质干细胞来源的EVs(MSC-EVs)，与使用胺反应化学法形成的二苯并环辛炔(DBCO)标记的胶原相结合。更具体地，该方法利用叠氮化物与DBCO的点击反应将叠氮化物-EVs固定在带有补充DBCO配体的生物材料(诸如胶原水凝胶)中。图1示出根据一个实施例的用于产生带有表面叠氮化物修饰的EVs的方法的示意图，该表面叠氮化物修饰允许EVs被固定在DBCO标记的胶原中。
叠氮化物和炔烃的点击化学允许生物惰性配体之间的化学选择性偶联，允许生物活性分子的锚定生物材料锚定的递送。点击反应化学配体可以经由代谢的蛋白质工程结合到通过非天然氨基酸翻译掺入或聚糖探针翻译后掺入活细胞及其衍生物中。作为细胞衍生物，EVs可以通过使用叠氮基-单糖探针(诸如四酰基化的N-叠氮基乙酰基甘露糖胺(Ac4ManNAz))进行聚糖代谢工程而标记有叠氮化物配体，这样也能够允许标记的EVs进行体内跟踪和成像。
使用叠氮化物或炔烃修饰的单糖探针的聚糖代谢工程已经在最常见于质膜外表面和细胞外基质(ECM)的标记糖蛋白中证明具有强大的功效。作为被膜包裹的活细胞的囊泡衍生物，EVs的表面还与糖脂和糖蛋白相关的大量聚糖基团修饰。本申请所述的方法可以用于使用EV表面上代谢掺入的叠氮化物配体作为化学手柄进行生物材料功能化，以将EV固定在生物材料内进行组织工程应用。
本方法代表一种平台技术，因为EVs是所有活生物体的通用通信者。此外，叠氮化物与DBCO的点击偶联可以在大多数生物系统中进行，并且由于它们对彼此的高反应性和对大多数天然生物分子的惰性而需要最小的优化。该方法可以用于源自大多数细胞来源的工程化EVs，其中膜蛋白糖基化是通用现象。此外，叠氮化物掺入过程是使用新合成蛋白质的生理翻译后修饰进行的，且叠氮化物标记对细胞和动物的正常生理过程具有最小干扰。因此，表面工程化的EVs保留了其固有的功能。
如图1所示，间充质干细胞来源(MSCs)EVs的叠氮化物标记可以使用唾液酸糖基化的固有细胞代谢途径来进行。在此过程中，使MSCs暴露于叠氮化物-单糖探针(Ac4ManNAz，50μM)。然后，收集并处理所得的MSC条件培养基以用于EV分离，接着进行该方法的其他步骤。
为了证实MSC-EVs的叠氮化物标签，可以用荧光探针(诸如DBCO-Alexa Fluor 488(AF488))进行点击偶联，并通过珠流式细胞术分析，这证明了源自用Ac4ManNAz预处理的细胞的MSC-EVs上特异性的强叠氮化物标记。为了验证作为天然唾液酸替代物的叠氮基-单糖探针的掺入，使Az-EVs与DBCO-AF488偶联，然后用切割聚糖上的末端唾液酸残基的神经氨酸酶预处理，并通过珠流式细胞术分析。图2示出用Ac4ManNAz预处理的MSCs来源的EVs的有效叠氮化物标记的示意图，而源自用DMSO(溶剂)预处理的MSCs的对照EVs中的叠氮化物标记几乎检测不到。此外，图3示出了叠氮化物-EVs上AF488荧光强度的神经氨酸酶剂量依赖性降低，从而证实了唾液酸标记。
为了进行图2-3中描绘的分析，根据以下方法制备CD63抗体偶联的磁珠。首先，根据制造商的说明，使用一步法抗体生物素化试剂盒对抗CD63单克隆抗体进行生物素化。然后，在25℃下，在持续搅拌下，将生物素化的CD63抗体(5μg)与经充分洗涤的0.5mL链霉亲和素包被的磁珠(1×108个珠粒/mL)一起孵育1小时。在4℃下，在持续搅拌下，将EVs与100μLCD63偶联的磁珠一起孵育16小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次，并在与IntellicytHyperCyt自动进样器相连的Accuri C6流式细胞仪上以20,000次事件/处理进行分析。对于神经氨酸酶处理组，在37℃下用0.5、1或2IU/mL神经氨酸酶预处理分离的EV 30分钟，随后在琼脂糖2B柱上纯化EV，接着与磁珠结合。
EVs和靶细胞的膜表面电荷在调节EV内化中起重要作用。叠氮化物代谢标记靶向EV表面蛋白上的末端唾液酸，这些末端唾液酸带负电荷，且在受体-配体信号转导中起重要作用。因此，当使用神经氨酸酶从EV表面去除唾液酸时，观察到EVs的细胞摄取明显减少。这进一步证实了唾液酸在调节EV内化中的关键作用，以及唾液酸标记的代谢叠氮化物标记程序不会干扰EVs的生理功能。
再次参考图1，在此示例性实施例中，胶原被描绘为ECM。天然ECM材料具有指导通信、细胞移植、重塑和新组织形成所需的生物化学和生物物理信号线索，并作为天然和通过工程构建体转运EV的载体。胶原是在大多数哺乳动物组织中发现的高度丰富的ECM组分，并且因此是组织工程中最广泛使用的生物材料组成部分之一。胶原可以制成各种形状和大小，且与组织制造技术的最新进展相兼容。虽然在此实例中将胶原显示为细胞外基质材料，但是也可以使用其他基质材料和生物材料，诸如纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、基质胶、弹性蛋白和脱细胞ECM。基质材料还可以包括其他天然的和合成的生物材料，这些材料可以与叠氮化物反应性环辛炔或膦基偶联。
ECM是一种非细胞三维结构，其存在于几乎所有的组织和器官中。除了作为细胞移植的结构支持外，ECM也是丰富的信号传导源，通过包埋在ECM内的各种生物分子物质(诸如生长因子和EVs)调节细胞活动。因此，单独使用胶原通常不足以模拟在组织再生期间触发所要细胞反应所必需的复杂微环境。在不固定的情况下由水凝胶递送的EV通常导致EV的快速释放和快速清除，这导致不良的治疗效果。因此，本申请方法用DBCO或其他环辛炔试剂调整ECM，使得EV能够固定在ECM内。其他环辛炔试剂可以包括二氟化环辛炔(DIFO)、双芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)和双环壬炔酮(BCN)。替代性地，ECM可以用磷化氢功能化，以使磷化氢与叠氮化物能够进行施陶丁格连接反应(Staudinger ligation reaction)。
使用胺反应的碳化二亚胺化学法，DBCO偶联的可点击胶原(DBCO-胶原)经工程而用于叠氮化物-EVs的后续化学选择性固定。为了实现将DBCO-N-羟基丁二酰亚胺(DBCO-NHS)有效地偶联到胶原(诸如I型胶原)的伯胺上，同时维持胶原的溶解性(防止聚合)，偶联反应用稀释的胶原(0.5mg/mL)在pH 5.0下在MES缓冲液中进行(参见图4)。除了胺反应的碳化二亚胺化学法外，基于材料的生物化学性质，还可以使用其他反应机制，诸如羧基/羰基反应化学法和巯基反应化学法。类似方法可以应用于其他ECM材料和其他环辛炔试剂和磷，以产生叠氮化物反应的ECM材料。
为了确认使用DBCO的功能化，可以将所得的DBCO-胶原与荧光叠氮化物-Cy5一起孵育，以使潜在的叠氮化物与DBCO偶联发生，使用斑点印迹分析和荧光定量来分析。在DBCO-胶原斑点印迹中可以观察到强的Cy5荧光，而未修饰的胶原对照在相同的等蛋白负载条件下显示出检测不到Cy5荧光的水平(参见图5)，证明了使用DBCO对胶原的共价修饰的有效性。
通过图1中描绘的方法的其他细节，可以在一个示例性实施例中执行以下方法步骤。首先，提取间充质干细胞(MSCs)并保存在培养基中。替代性地，在生长培养基中保存的MSCs可以从商业来源获得。在另一个替代性实施例中，EVs可以从任一个具有生物活性的EVs细胞来源获得。然后将MSCs转移到含有50μM Ac4ManNAz或类似的点击反应性代谢标记探针的生长培养基中。例如，四酰基化的N-叠氮基乙酰基半乳糖胺(Ac4GalNAz)和四酰基化的N-叠氮基乙酰基葡萄糖胺(Ac4GlcNAz)是可以用于靶向糖基化的其他叠氮化物。也可以使用靶向氨基酸的叠氮化物探针，诸如L-叠氮基高丙氨酸(AHA)。然后，培养细胞72小时，随后收集培养基。将叠氮化物探针引入细胞培养物中以使用叠氮化物标记EVs。例如，将叠氮化物探针(例如用叠氮基团修饰的单糖或氨基酸)添加到细胞培养基中，其中细胞代谢探针以将叠氮基团从这些探针呈递到EV的表面。
接着，通过尺寸排阻色谱法(SEC)分离由上述产生的条件培养基中的EVs。例如，可以将条件培养基在4℃以2000×g离心10分钟，然后在4℃以10000-14000×g离心30分钟。使上清液通过0.22μm孔径的Millipore过滤器，并使用填充有10mL用磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的过滤基质的1.5cm×12cm微型柱的微型SEC分离EVs。将上清液(1.0mL)装载到该柱上，并通过在柱上运行PBS收集对应于空隙体积峰的五个1mL部分。分离的EVs可以立即使用(24小时内)、放置在-80℃下长期储存、或冻干。
在用点击反应配体标记EVs并将其分离的同时，使DBCO偶联到胶原上形成DBCO-胶原。在此实例中，将牛I型胶原在100mM MES缓冲液(pH5)中稀释至0.5mg/mL，然后在室温(RT)下与含10％ DMSO的200μMDBCO-NHS酯一起孵育3小时。偶联后，用10000道尔顿(dalton)截留分子量(MWCO)的超滤过滤器使用0.1M乙酸溶液将反应混合物充分透析，以去除未偶联的DBCO分子和交换缓冲液。最后，叠氮化物-EVs(Az-EVs)和DBCO-胶原通过点击反应组合。
图6是通过利用125I放射性标记的MSC-EVs比较Az-EVs与非Az-EVs以及比较DBCO-胶原与未修饰的胶原来描绘胶原凝胶中保留的长期EV的示意图。与所有其他125I-EV-胶原组合(12天后<15％)相比，125I-Az-EVs和DBCO-胶原的组合，在胶凝化前在4℃过夜预孵育，导致了优异的长期EV保留率(12天后>60％)(参见图6)。结果还显示，在没有预孵育的情况下，DBCO-胶原凝胶中的Az-EV保留率增加。综上所述，这些结果证明，可点击的DBCO-胶原与Az-EVs的组合使得EV-生物材料的保留率具有优异的稳定性。
图7-8示出了固定EV的胶原凝胶的体内血管生成活性的评价。MSC来源的EVs因其固有的促血管生成功能而众所周知。为了研究通过组合DBCO-胶原与Az-EVs实现的EV保留率增加如何调节体内生物材料血管化，利用了小鼠的皮下塞模型。将不同剂量的Az-EVs(0.1、0.25、0.5和1μg/植入物)与DBCO-胶原(3mg/mL)混合，然后胶凝化并植入C57BL/6小鼠中，并在植入后7天收获构建体用于分析。对照植入物由用非Az-EVs功能化的DBCO-胶原凝胶塞、不含EVs的DBCO-胶原凝胶塞和不含EVs的未修饰胶原凝胶塞组成。与具有10倍高剂量的非Az-EVs(1μg)的DBCO-胶原凝胶塞中最小的血管生成反应相比，在固定有低至0.1μg的Az-EVs的DBCO-胶原凝胶塞中可以通过视觉观察到强的宿主血管向内生长。
为了综合评定体内血管生成反应，将收获的植入物分成两半，一半用于宿主血红蛋白定量，且另一半用于组织学分析。基于H&E染色，与1μg剂量的非Az-EV组相比，在所有Az-EV组(0.1、0.25、0.5和1μg)中均观察到增强的细胞穿透(参见图7，其显示了总细胞穿透的定量)。此外，Az-EVs的功能化剂量依赖性地增加了植入物中宿主血红蛋白的存在(指示宿主血液灌注)，其在0.25μg Az-EVs/DBCO-胶原植入物时达到稳定水平(参见图8，其显示了收获的植入物中血红蛋白的定量)。
如宿主内皮CD31的染色和定量所示，在DBCO-胶原凝胶塞中所有剂量组的Az-EVs中观察到宿主血管向内生长的强诱导(参见图9，其显示了经由内皮CD31染色对宿主血管向内生长的定量)。此外，通过CCR7(M1巨噬细胞)和MMR(M2巨噬细胞)的染色和定量进行巨噬细胞侵袭的评定。DBCO-胶原组中的所有Az-EVs均展现出M1和M2巨噬细胞浸润的显著增加(参见图10，其显示了M1巨噬细胞染色(CCR7)的定量，以及图11，其显示了M2巨噬细胞染色(MMR)的定量)，这被充分证明为促进了血管化。还观察到向植入物的功能性血管生成侵袭，其中0.1μg Az-EVs组显示出显著更高的荧光强度以及完整的功能性血管网络结构形成(参见图12)。还呈现了植入物和附近组织与血管形成之间的联系。
血管化对于生物工程组织的成功植入至关重要。植入的组织依靠足够的新血管形成来递送氧和营养物，以支持长期的组织生存力和功能。这对于厚的或大体积的组织支架尤其重要，其中宿主血管灌注不足或延迟会导致组织缺氧、细胞凋亡和植入物功能受损。因此，在组织工程植入物内实现有效和功能性的血管化对于将其转化为临床疗法至关重要。本文所述的方法产生了通过EV固定功能化的胶原，并显示出改进植入的水凝胶的宿主血管化的强大能力。
化学选择性EV固定技术适用于其他常用的生物材料，诸如纤维蛋白、弹性蛋白和脱细胞ECM，并与用于工程化由多种材料和细胞组成的复杂组织的三维生物制造技术(诸如生物打印)完全兼容。例如，该方法可以用于各种组织工程化和再生应用，诸如促进移植物(细胞和非细胞)血管化，促进缺血后损伤修复，促进伤口愈合和促进组织(诸如骨、肺、肝、肌肉、皮肤、肾、心脏、血管、胰腺、肠和胃)再生。在其他应用中，该方法可以用于与调节宿主对植入的材料/组织构建体和移植的器官的免疫反应相关的应用中，和用于改进移植的器官(包括肝、肺、胰岛、肌肉、皮肤、肾、心脏、血管、肠、胃和骨)的生存力和功能结果。
EV-生物材料功能化平台易于扩展以促进其他组织诸如骨、肌肉和皮肤的再生。除了EV细胞源及其固有的治疗特性之外，EVs还可以被进一步工程化，而不仅以EV表面或腔内的额外外源性EV装载物形式递送蛋白质而且递送核苷酸和药物。这些技术有可能实现特定再生方法的长期调节。此外，由于EV-胶原系统诱导的强的和局部的血管生成反应，该方法是适用于器官型细胞、类器官和组织的有用的包埋和递送载体。
当在本说明书和权利要求中使用时，术语“包含”及其变体意谓包括指定的特征、步骤或整体。这些术语不应被解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。
本发明还可以广泛地存在于说明书中单独提及或指出的部件、元件、步骤、实例和/或特征中，或者共同存在于两个或更多个所述部件、元件、步骤、实例和/或特征的任何和所有组合中。特别地，本文描述的任何实施例中的一个或多个特征可以与本文描述的任何其他实施例中的一个或多个特征组合。
可以结合本公开为本文中提及的任何一个或多个已公布文件中公开的任何特征寻求保护。尽管已经描述了本发明的某些示例性实施例，但是随附权利要求的范围并不旨在仅局限于这些实施例。权利要求将被字面地、有目的地解释，和/或涵盖等效物。
Claims (20)
1.一种用于产生固定的细胞外囊泡的方法，其包括：
使用叠氮化物配体功能化细胞外囊泡；
使用叠氮化物补充试剂功能化细胞外基质材料；
通过所述叠氮化物配体和所述叠氮化物补充试剂之间的点击反应将所述细胞外囊泡固定在所述细胞外基质材料内。
2.根据权利要求1所述的方法，
其中所述叠氮化物补充试剂包括环辛炔试剂；以及
其中所述点击反应包括叠氮化物与环辛炔之间的点击反应。
3.根据权利要求1所述的方法，
其中所述叠氮化物补充试剂包括磷化氢试剂；以及
其中所述点击反应包括叠氮化物与磷化氢之间的施陶丁格反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞外基质材料包括能够与环辛炔或磷化氢试剂偶联的天然的或合成的生物材料。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞外基质材料选自由以下组成的组：胶原、纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、基质胶、弹性蛋白、和其他脱细胞细胞外基质或提取的细胞外基质。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述环辛炔试剂选自由以下组成的组：二苯并环辛炔、二氟环辛炔、双芳基氮杂环辛炔酮和双环壬炔酮。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
从间充质干细胞培养物分离所述细胞外囊泡。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
从具有生物活性细胞外囊泡的培养的细胞源分离所述细胞外囊泡。
9.根据权利要求1所述的方法，其中使用叠氮化物配体功能化细胞外囊泡包括：
通过聚糖代谢工程或氨基酸代谢工程固定所述叠氮化物配体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述聚糖代谢工程和氨基酸代谢工程靶向所述细胞外囊泡的天然途径。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述聚糖代谢工程靶向所述细胞外囊泡的用于唾液酸糖基化或其他糖基化途径的天然途径，并且所述氨基酸代谢工程靶向用于细胞外囊泡蛋白翻译的天然途径。
12.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
从细胞培养物获得所述细胞外囊泡；以及
通过将叠氮化物探针引入到所述细胞培养物中，将所述叠氮化物配体固定到所述细胞外囊泡上。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述叠氮化物探针选自由以下组成的组：四酰基化的N-叠氮基乙酰基甘露糖胺、四酰基化的N-叠氮基乙酰基半乳糖胺、四酰基化的N-叠氮基乙酰基葡萄糖胺和L-叠氮基高丙氨酸。
14.根据权利要求1所述的方法，其中用所述叠氮化物补充试剂功能化细胞外基质材料包括：
通过胺反应性化学法、羧基/羰基反应性化学法或巯基反应性化学法将环辛炔或磷化氢试剂固定到细胞外基质。
15.根据权利要求1所述的方法，其中固定的所述细胞外囊泡用于选自由以下组成的组的应用中：移植物血管化、缺血后损伤修复、伤口愈合、组织再生、对植入的材料和/或器官的免疫反应调节以及移植的器官的生存力和功能改进。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述组织选自由以下组成的组：骨、肺、肝、皮肤、肾、心脏、血管、胰腺、肠和胃。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述器官选自由以下组成的组：肝、肺、胰腺、肌肉、皮肤、肾、心脏、血管、肠、胃和骨。
18.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
将装载物与所述细胞外囊泡结合。
19.一种生物材料，其通过前述权利要求中任一项所述的方法产生。
20.一种生物材料，其包括：
使用叠氮化物功能化的细胞外囊泡；以及
使用叠氮化物补充试剂功能化的细胞外基质材料，其中所述细胞外囊泡通过所述叠氮化物与所述叠氮化物补充试剂之间的偶联而固定到所述细胞外基质材料上。
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