CN117402253A - 一种抗哇巴因的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米抗体技术领域，具体涉及一种抗哇巴因的纳米抗体及应用。本发明所述抗哇巴因的纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其核苷酸序列见SEQ ID NO.2，该抗体对哇巴因具有较好的亲和力，能够中和与拮抗哇巴因药理活性，并结合ELISA方法检测溶液中哇巴因含量。本发明为构建轻量化、热稳定与检测灵敏性高的哇巴因抗体提供了方法；为深入挖掘内源性哇巴因的新生物学功能提供研究工具。

Description

一种抗哇巴因的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于纳米抗体技术领域，具体涉及一种抗哇巴因的纳米抗体及应用。
背景技术
哇巴因(Ouabain)是强心甾类化合物的一种，广泛的存在于洋地黄类植物中，具有很高的药用价值。1785年英国民间医生Wellington用甾体类植物药洋地黄水煎液治疗水肿效果显著，引起医学界广泛关注。上个世纪中叶，欧美制药企业竞相开发强心甾类药物，最著名的是地高辛制剂，对多种心血管疾病有独特疗效，历经数十年仍为临床充血性心力衰竭等心脏疾病治疗的重要药物。作为强心甾化合物，哇巴因也能够用于心脏衰竭、心律不齐的治疗。在生物学机制上，哇巴因主要通过抑制细胞膜上Na+/K+-ATPase发挥作用。哇巴因抑制Na+/K+-ATPase使得细胞内的Na+水平上升，Na+水平上升抑制纳钙交换体的活性，使得细胞内的Ca2+浓度上升，激活Ca2+相关的信号通路，发挥增强心肌收缩能力和治疗心脏衰竭的作用。目前很多国家包括美、法、德等停止哇巴因的临床使用，主要原因在于哇巴因治疗窗口窄，治疗剂量与中毒剂量接近，一旦超剂量使用极其容易中毒。但也有科学家认为哇巴因可以通过口服等方式，降低毒性，用于治疗心绞痛和心肌梗死。20世纪末，美国Hamlyn JM教授在Nature杂志发表研究论文，证明人体存在内源性哇巴因，研究人员在300L的人体混合血浆中，通过质谱检测并纯化出这种特殊的物质。Hamlyn JM教授还发现内源性哇巴因化学结构与植物或者蟾蜍来源的哇巴因结构相似，以及它们是通过肾上腺分泌进入代谢循环，在调节动脉压、心脏以及肾脏功能中发挥重要作用。进一步研究发现，哇巴因与免疫、肿瘤、病毒感染等疾病发生和进展关系密切，提示其可能存在心血管系统之外的新生物学功能。要证实这一猜想，需要对哇巴因在体内过程有着更清晰的认识，对哇巴因进行准确的定量，并研发能够封闭哇巴因的新型抗体。
自1975年杂交瘤技术诞生以来，单克隆抗体药物被广泛地应用于多种疾病的诊断与治疗，成为当今研究热潮之一。该技术在肿瘤治疗诊断、分子检测等领域取得重要进展。在肿瘤治疗方面，传统单抗能靶向肿瘤细胞对其产生杀伤作用，甚至能够导致肿瘤细胞发生程序性坏死。在诊断方面，抗体标记放射性同位素或荧光素在PET检测和疾病影像学中发挥重要作用。单克隆抗体具有靶向特异性，制备工艺成熟，易于标记等优势。但随着应用领域的扩展，单克隆抗体的缺点也愈发明显。首先，单克隆抗体的分子量较大，导致其在体内外不稳定；其次单克隆抗体免疫原性强，可能给机体带来较为严重的排斥反应。此外，单克隆抗体在分子成像应用时信号背景过高，在疾病临床中应用具有一定的局限性。因此，目前掀起了开发新型抗体的浪潮，最具代表性的就是小分子抗体主要包括Fab片段、单链抗体、纳米抗体等。
纳米抗体(nanobody，Nb)是新型小分子抗体一种，起初是1993年HamersCasterman等人在骆驼体内发现的重链抗体可变区序列。进一步研究发现，在骆驼血清中天然存在两种结构的抗体。一种抗体为具有两条重链和两条轻链的常规四聚体抗体，另一种是缺失两条轻链仅有重链的重链抗体。重链抗体的可变区构成单链抗体，其缺乏轻链也没有典型的恒定重链CH1结构域，相对分子质量为15kDa左右，为常规抗体的1/10，分子体积约为4.8nm*2.2nm。这是一种特殊并天然存在的小分子抗体，是迄今为止发现最小的具有生物活性的功能性片段。在骆驼或鲨鱼中，这些重链抗体仅通过单个可变区可识别抗原从而拥有生物活性。因此，Nb是最小的完整性抗原结合域。这种新型抗体存在于骆驼、软骨鱼等动物的体内，其结构与生理功能与单克隆抗体相似，具有极大的应用前景。Nb比起单克隆抗体乃至其它抗体具有独特优势，其亲和力高、稳定性好、更容易实现在微生物体内的可溶性表达，极大地降低了生产周期与生产成本，在多种疾病的精准诊断、靶向治疗、食品安全监测等领域具有广阔的应用空间。
本发明旨在为构建轻量化、高亲和力哇巴因Nb，为建立热稳定且高灵敏性哇巴因检测方法提供了材料；为深入挖掘内源性哇巴因的新生物学功能提供研究工具。
发明内容
本发明的目的是利用基因工程的方法研制分子量小、结合能力强与性质稳定的新型哇巴因Nb，基于哇巴因Nb建立ELISA免疫检测法检测哇巴因含量，为相关研究提供工具。
为了实现以上目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明提供一种抗哇巴因的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：EVQLLQSGGLAQPGGSLRLTCTASIGAVYVMGWYRQPPGKQRELVASITSAGITNYTDS VKSRFIISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAPLRGRDDYGGFDWGQGTQVTVSS。
SEQ ID NO.1中，1-23是所述纳米抗体的框架区FR1的氨基酸为：EVQLLQSGGLAQPGGSLRLTCTA(SEQ ID NO.3)；24－40是所述纳米抗体的框架区FR2的氨基酸为：MGWYRQPPGKQRELVAS(SEQ ID NO.4)；41－78是所述纳米抗体的框架区FR3的氨基酸为：NYTDSVKSRFIISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC(SEQ ID NO.5)；79－89是所述纳米抗体的框架区FR4的氨基酸为：WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO.6)；90－96是所述纳米抗体的互补决定区CDR1的氨基酸为：SIGAVYV(SEQ ID NO.7)；97－103是所述纳米抗体的互补决定区CDR2的氨基酸为ITSAGIT(SEQ ID NO.8)；104－117是所述纳米抗体的互补决定区CDR3的氨基酸为NAPLRGRDDYGGFD(SEQ ID NO.9)。
本发明还提供所述的纳米抗体的编码基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示：GAAGTTCAGCTGCTGCAATCCGGTGGTCTGGCACAACCGGGTGGTTCCCTGCGCCTGACCTGTACGGCTTCTATTGGTGCGGTTTACGTTATGGGTTGGTATCGCCAACCACCTGGCAAACAGCGTGAACTGGTTGCATCCATCACCAGCGCGGGTATTACTAATTATACCGACAGCGTGAAGTCTCGTTTCATCATCAGCCGCGATAATACTAAAAACACCGTTTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCTGAAGATACGGCGGTTTATTATTGTAACGCTCCGCTGCGTGGTCGTGACGATTATGGTGGTTTCGATTGGGGTCAAGGTACTCAAGTTACTGTAAGCAGC。
本发明提供一种包含所述抗哇哇巴因的纳米抗体的基因的重组质粒。
本发明提供一种包含所述重组质粒的表达宿主细胞。
本发明还提供了所述抗哇巴因的纳米抗体的制备方法，其特征在于，将重组质粒转化至BL-21基因工程菌,诱导后通过His-tag Purification resin进行初步纯化，然后通过AKTA离子交换进行进一步精纯而制得。
本发明提供了所述抗哇巴因的纳米抗体在制备ELISA方法检测哇巴因的制剂中的应用。本发明提供一种检测所述的哇巴因的试剂盒，所述试剂盒基于竞争ELISA法检测哇巴因，所述试剂盒以SEQ ID NO.1所示的纳米抗体为检测抗体。
本发明提供一种检测哇巴因的方法，包括以下步骤：
(1)抗体浓度的优化：加入浓度为20ng/ml的哇巴因-OVA 100μL至吸附96孔ELISA板，过夜包被；弃掉孔内液体，用PBST洗涤5遍，加入100μL的OVA室温封闭1h；弃掉孔内液体，用PBST洗涤5遍，加入一系列浓度的生物素化的哇巴因纳米抗体室温孵育2h；弃掉孔内液体，用PBST洗涤5遍，加入100μL链霉素-HRP，室温孵育1h；弃掉孔内液体，用PBST洗涤5遍，加入100μLTMB显色液体，37℃孵育10min后，加入50μL显色终止液。酶标仪于450nM处检测吸光度；选取最佳的抗体浓度用于后续的检测实验。
(2)竞争ELISA检测方法：加入浓度为20ng/mL的哇巴因-OVA 100μL至高吸附96孔ELISA板，过夜包被；弃掉孔内液体，用PBST洗涤5遍，加入100μL的OVA室温封闭1h；弃掉孔内液体，用PBST洗涤5遍，对于标准品组，加入浓度为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.6ng/mL的哇巴因各100μL。对于空白对照组(B0)加入100μL的PBS。对于检测组加入100μL的待测血清样本。在每个样品孔中加入FITC标记的哇巴因纳米抗体，室温孵育2h；弃掉孔内液体，用PBST洗涤5遍，加入100μL链霉素-HRP，室温孵育1h；弃掉孔内液体，用PBST洗涤5遍，加入100μL TMB显色液体，37℃孵育10min后，加入50μL显色终止液。酶标仪于450nM处检测吸光度；所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个空白(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值；以哇巴因浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为哇巴因浓度的对数值，求得反对数值即为测定样本中哇巴因浓度C。
本发明提供一种能够用哇巴因纳米抗体在体外显著发挥中和与拮抗哇巴因药理活性功能的应用。
本发明公开以下技术效果:
本发明制备抗原免疫羊驼并监测免疫反应，分离纯化免疫羊驼淋巴细胞提取其总RNA。基于噬菌体展示技术构建出库容量较大的噬菌体文库，文库经过DNA测序以及数据库分析，具备良好的多样性与插入率，符合筛选纳米抗体的要求。通过抗原哇巴因-OVA富集文库，经过三轮固相生物淘选后，有效富集文库中阳性克隆。采用间接ELISA方法多轮筛选获得多条克隆序列与哇巴因抗原存在较强的信号反应。将筛选出的克隆序列原核表达并纯化，获得较高纯度抗体蛋白，通过MST测定抗体蛋白与哇巴因的结合能力。筛选获得高亲和力的哇巴因纳米抗体，并验证其在体外的生物活性，结果表明本发明所述哇巴因纳米抗体能够发挥中和与拮抗哇巴因药理活性作用。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明获得的纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力较高、生产成本较低可实现大量表达等优势。可被应用于生物样品哇巴因含量的检测，以及作为中和抗体拮抗哇巴因药理活性功能。并且本发明制备小分子纳米抗体的方法具有普适性，可用于靶向其他小分子物质纳米抗体的筛选与制备，具有较高的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：哇巴因与OVA偶联产物SDS-PAGE电泳分析
图2：免疫羊驼血清效价检测
图3：VHH片段巢式PCR扩增产物琼脂糖凝胶分析。左图泳道1：第一轮PCR扩增产物；右图泳道1：第二轮PCR扩增产物。
图4：噬菌体文库构建产物琼脂糖凝胶分析。左图展示50℃下15、30、60、120min载体酶切产物琼脂糖凝胶分析；右图泳道1-3分别为：胶回收酶切产物、载体酶切产物、阴性对照。
图5：文库菌落库容估算原始文库稀释104，105，106倍100μL菌落(菌落代表独立克隆)。
图6：文库多样性与序列特征分析。噬菌体文库随机克隆氨基酸序列比对分析文库多样性与在IMGT数据库中特征序列分析。
图7：ELISA检测噬菌体文库富集效果.
图8：ELISA检测单克隆表达产物筛选阳性克隆。间接ELISA对单克隆表达产物分析，以空白对照5倍以上数值0.75为分界线选定阳性克隆与阴性克隆。
图9：纳米抗体原核蛋白表达与纯化。FT指穿流液，泳道1-8对应离子交换柱收集组分批次。
图10：MST检测哇巴因与纳米抗体亲和力。
图11：哇巴因纳米抗体降低哇巴因导致的细胞毒性。不同浓度哇巴因纳米抗体对1μM与2μM哇巴因处理24h与48h的细胞存活保护作用。
图12：哇巴因纳米抗体拮抗哇巴因导致的Ca2+浓度增加。细胞Ca2+流式位移与量化图结果表明与NC组与单独哇巴因组相比，哇巴因纳米抗体组与哇巴因孵育组处理细胞Ca2+浓度得到明显抑制。实验独立重复3次，*P<0.05；#P<0.05；具有统计学意义。
图13基于哇巴因纳米抗体建立的竞争结合ELISA标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
实施例1抗原制备与羊驼免疫
1.1实验材料与动物
哇巴因与购自MCE公司；BSA蛋白分别购自碧云天生物公司与美国Sigma Aldrich公司；考马斯亮蓝染液购自碧云天生物技术公司；碳化二亚胺与OVA蛋白购自美国SigmaAldrich公司；淋巴细胞分离液购自翌圣生物科技公司；透析袋购自上海生工生物工程公司；羊驼由深圳康体生命公司负责培育，编号1607。
1.2实验方法
1.2.1哇巴因与载体蛋白OVA偶联
本发明采用碳化二亚胺法将哇巴因化合物与OVA蛋白载体偶联，将5mg哇巴因和5mg的BSA溶解在0.5mL的TE buffer中；哇巴因与BSA在37℃下边震荡边逐滴加入碳化二亚胺溶液，摇床中反应2h；将溶液放入透析袋透析3d，取少量透析产物并通过SDS-PAGE蛋白电泳对偶联产物进行检测，其余的冻于-20℃冰箱保存供后续使用。
1.2.2SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色
按照配方表中的比例成分制备SDS-PAGE胶，根据目的蛋白分子量配制合适浓度(8％～15％)的蛋白分离胶，待下层胶凝固完全，配制5％浓度的浓缩胶插入10或15孔的胶孔梳进行固定；凝胶在蛋白电泳后切掉浓缩胶，用去离子水稍微润洗一下，小心倒掉液体，加入约20mL的快速考马斯亮蓝染色液水平摇床匀速摇晃，染色30min；最后回收考马斯亮蓝染液，用去离子水在摇床上摇动脱色漂洗胶块。每隔10min，更换新的去离子水漂洗3遍，脱色2h。
1.2.3抗原免疫羊驼
本发明将抗原与BSA载体蛋白偶联制备成抗原免疫空白羊驼，动物免疫方案如下表所示。
每次免疫羊驼后采血，监测免疫反应。共进行六轮免疫，在最后一次抗原注射后10天，采集50mL免疫羊驼外周血。
1.2.4分离羊驼外周血单核淋巴B细胞
将采集到的外周血液按照1：2的体积比例与PBS混合，用巴氏吸管吹吸混匀。取适量的淋巴细胞分离液加入50mL离心管中，将外周血稀释液在25℃下，缓慢加入离心管中并吹打均匀，1000g离心10min。吸取淋巴细胞，将细胞悬液每5管加入1支50mL离心管内，用PBS补至50mL。将离心管颠倒混匀，在25℃下1000g离心10min，弃上清。将预冷的PBS加入离心管内，吹吸重悬淋巴细胞，在4℃下2500g离心10min，弃上清。用PBS吹吸重悬淋巴细胞，对其进行细胞计数，调节悬液浓度至5×106个/mL。将细胞悬液以每管1mL的体积，最后分装至1.5mL RNase-Free离心管内，在4℃下1000g离心10min，除去上清；提取得到的外周血单核细胞用于后续的实验。
1.3实验结果
采用碳化二亚胺法将哇巴因与OVA偶联。随后将OVA与哇巴因-OVA偶联物进行SDS-PAGE电泳分析。如图1所示，对照样本OVA在44kDa附近有明显条带，与OVA的理论分子量44kDa一致。哇巴因-OVA偶联物相比于对照样本OVA，在44kDa分子量附近有明显滞后条带，此外，在44kDa分子量以上有明显的多条带产物，因此初步判断哇巴因-OVA偶联物制备成功。
通过间接ELISA法检测免疫羊驼血清效价，如图2所示相比于未经免疫的羊驼，第一次免疫后羊驼抗原血清效价水平提高到103倍，第三次免疫后血清效价水平提高到104倍，第五次免疫后血清效价水平达到105倍。这一结果表明，抗原在羊驼体内产生较强的免疫反应。实施例2纳米抗体噬菌体展示文库构建与筛选
2.1实验材料
辅助噬菌体VCSM13购自北京宝科维食安生物公司；Sif Ⅰ酶购自维森特生物技术公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自美国Thermo Fisher公司；DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司；Fast pfu高保真扩增酶购自北京全式金生物技术公司；PCR扩增预混液购自擎科生物技术公司；DNA Marker购自通用生物公司；cDNA逆转录试剂盒购自日本Toyobo公司。
2.2实验方法
2.2.1cDNA的合成和巢式PCR扩增
将RNA作为模板，通过逆转录获得cDNA库。其中逆转录10μL体系所用RNA的量为500ng，按下表所示配制逆转录体系：
将第一轮cDNA为模板，巢式PCR大量扩增出重链可变区VHH基因，按下表所示配制PCR体系：
将体系配制完成，置于PCR仪中扩增，反应程序如下所示：
特异性扩增引物如下：
为了增加文库的容量，本发明以第一轮胶回收产物为PCR模版，进行巢式PCR扩增，按照下表条件所示，进行第二轮PCR反应：
将体系配制完成，置于PCR仪中扩增，第二轮PCR反应程序如下：
特异性扩增引物如下：
2.2.2噬菌体文库构建
本发明采用pComb3xss噬菌粒载体作为噬菌体文库构建的载体，首先，将载体及巢式PCR产物同时用限制性内切酶Sfi I酶切(酶切位点分别位于载体282bp与1954bp)。
配制20μL反应体系如下：
载体与片段同时在50℃酶切60min后琼脂糖电泳，回收酶切载体及片段，用于连接反应。本发明采用T4连接酶进行连接，取20ng酶切的载体和8ng酶切的插入片段(摩尔比为1：4)进行连接，按下表配制连接体系：
随后酶连体系在22℃下连接30min，连接完成后转化至TG1感受态37℃恒温培养箱过夜培养。
2.2.3噬菌体超感染扩增与滴度测定
本发明采用VCSM13辅助噬菌体进行超感染，将文库平板克隆全部刮下，用10mL 2×TY培养基稀释冻存，取100μL菌液加入一个装有2×TY液体培养的锥形瓶中，恒温摇床摇至细菌生长对数期OD600＝0.3～0.5。按照VCSM13辅助噬菌体：菌液＝1：100的体积比例，加入辅助噬菌体，37℃恒温培养箱中静置30min。将菌液移至50mL离心管在4℃下2700rpm离心10min。将离心沉淀重悬，加至250mL 2×TY+100mg/mL氨苄青霉素+50mg/mL卡纳霉素液体培养基中。设置水平摇床参数37℃，225rpm摇晃培养过夜16h。将培养物收集，在4℃下20000g离心30min。将上清加入1/4体积的PEG8000/NaCl，颠倒混匀，冰浴不少于30min。在4℃下4000rpm离心30min，弃上清。将噬菌体沉淀加入1mL PBS溶液重悬并置于1.5mL Eppendorf管中，在4℃下20000g离心1min，收集离心上清,取少量用于噬菌体滴度的测定，其余冻存于-80℃冰箱保存。
本发明采用双层琼脂法测定噬菌体滴度，用LB培养基稀释噬菌体至10-1至10- 10pfu，分别取各稀释度噬菌体1μL于TG1菌液100μL混匀，37℃静置20min后，分别加入3mL顶层琼脂，混匀后倾倒于LB固体培养基平板，37℃过夜培养，计数空斑并计算噬菌体滴度。2.2.4噬菌体文库生物淘选
按照结合、洗涤、洗脱、扩增循环的方式，对文库进行生物淘选。使用生物工程公司的20×ELISA包被缓冲液提前与哇巴因-OVA混合，在96孔酶标板孔中每孔加入100μL。三轮包被浓度依次为30μg/mL、15μg/mL和7μg/mL，在4℃下过夜包被，PBST洗涤5遍。提前配制5％浓度BSA每孔加入100μL封闭，PBST洗涤5遍。配制噬菌体滴度10-11pfu(噬菌体：菌体量＝50：1)每孔加入100μL噬菌体，水平摇床孵育2h，PBST洗涤5遍。弃去板中液体，每孔加入100μL甘氨酸洗脱15min后加入Tris-HCl中和pH值，结束洗脱。回收洗脱液配制噬菌体滴度10-11pfu侵染TG1大肠杆菌，检测滴度并计算富集系数。将感染后的细菌涂布平板，收集所有菌落，根据富集滴度判断是否进行下一轮筛选。
2.2.5噬菌体文库筛选阳性克隆
本发明采用间接ELISA的方法，在富集文库中筛选阳性克隆，挑选三轮富集过后的超感染菌板克隆加入至96孔板中，用VCSM13辅助噬菌体侵染14h，离心后将100μL的上清液转移至一个预先5μg/mL哇巴因-OVA包被的96孔板中，37℃孵育45min。用PBST洗板6次，加入(5000：1)HRP标记的抗M13单克隆抗体，100μL/孔，水平摇床室温孵育45min。再用PBST洗涤3次，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育10min。待溶液逐渐变蓝出现明显深浅变化，加入2mM的稀硫酸，50μL/孔，终止显色反应，立即用酶标仪读取OD450值。将高于阴性对照5倍的孔进行测序，得到最终的纳米抗体序列，其编码针对哇巴因的纳米抗体。
2.3实验结果
2.3.1巢式PCR扩增VHH片段
本发明采用巢式PCR的方式扩增VHH基因，如图3所示将上文提取的总RNA逆转录，获得cDNA。用两对特异性引物两轮PCR扩增VHH基因片段。将首轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1可见一个约700bp大小的DNA条带，胶回收目标条带，作为下一轮PCR的模板。将第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得到一个约400bp大小DNA条带，胶回收目标条带产物供后续构建重组质粒。两轮PCR扩增产物条带大小均符合预期DNA片段大小，可用于噬菌体文库构建。
2.3.2噬菌体文库构建
如图4所示，构建文库需要将扩增后VHH片段产物与噬菌粒载体pComb3xss酶切，两者均采用Sfi I酶进行单酶切。首先将对载体酶切效率进行条件优化，将载体在不同条件下的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。可见50℃下酶切60min显示清晰载体酶切条带分别1700bp与3200bp大小，符合预期载体酶切条带大小，达到较好的酶切效果。按照前述酶切反应条件，同时酶切载体和VHH片段，在琼脂糖凝胶上显示清晰的酶切后载体与VHH片段条带，符合预期条带大小。
2.3.3噬菌体文库质量分析
如图5所示，经梯度稀释平板克隆计数估算该文库中含有约1×108个菌落。因此本发明构建的文库菌落库容为1×108cfu，符合筛选纳米抗体库容标准，可进行后续纳米抗体筛选工作。
在梯度稀释平板随机挑选20个单克隆菌落，通过DNA测序与生物软件翻译氨基酸序列进行比对。如图6上图所示20条氨基酸序列具显差异性，尤其在不同序列的CDR3区域呈现高度差异性，CDR3作为抗原决定区，其高度的差异性表明它们可能会识别不同抗原表位。因此，本发明初步判断所构建文库多样性为100％。同时本发明随机挑选1条氨基酸序列提交至IGMT数据库分析。如图6下图分析显示，该序列与来自Vigucna IGHV3S53*1序列显示高度的同源性，表明该序列符合数据库中已有纳米抗体序列的基本特征。综上表明，本发明所构建的纳米抗体文库具有较高插入率和较好的多样性，纳米抗体文库构建成功且质量良好，可进行后续生物淘选工作。
实施例3纳米抗体生物淘选与表达应用
3.1实验材料
甘油购自美国Sigma公司；DMEM培养基、胰酶细胞消化液、青霉素链霉素购自维森特生物技术公司；无血清细胞冻存液购自新赛美生物科技公司；HRP标记兔二抗、HRP标记鼠二抗购自中国Bioworld公司；Trizol试剂购自上海生工生物工程公司；T4 DNA连接酶购自美国Thermo Fisher公司；DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司；Fast Pfu高保真扩增酶购自北京全式金生物技术公司；限制性内切酶购自美国Thermo Fisher公司；RIPA裂解液(强)、RIPA裂解液(弱)购自碧云天生物技术公司；PCR扩增预混液、DL5000 DNAMarker、琼脂糖购自擎科生物技术公司；cDNA逆转录试剂盒购自日本Toyobo公司。
3.2实验方法
3.2.1噬菌体文库生物淘选
按照结合、洗涤、洗脱、扩增循环的方式，对文库进行生物淘选。使用生物工程公司的20×ELISA包被缓冲液提前与哇巴因-OVA混合，在96孔酶标板孔中每孔加入100μL。三轮包被浓度依次为30μg/mL、15μg/mL和7μg/mL，在4℃下过夜包被，PBST洗涤5遍。提前配制5％浓度BSA每孔加入100μL封闭，PBST洗涤5遍。配制噬菌体滴度10-11pfu(噬菌体：菌体量＝50：1)每孔加入100μL噬菌体，水平摇床孵育2h，PBST洗涤5遍。弃去板中液体，每孔加入100μL甘氨酸洗脱15min后加入Tris-Hcl中和pH值，结束洗脱。回收洗脱液配制噬菌体滴度10-11pfu侵染TG1大肠杆菌，检测滴度并计算富集系数。将感染后的细菌涂布平板，收集所有菌落，根据富集滴度判断是否进行下一轮筛选。
3.2.2噬菌体文库筛选阳性克隆
本发明采用间接ELISA的方法，在富集文库中筛选阳性克隆，挑选三轮富集过后的超感染菌板克隆加入至96孔板中，用VCSM13辅助噬菌体侵染14h，离心后将100μL的上清液转移至一个预先5μg/mL哇巴因-OVA包被的96孔板中，37℃孵育45min。用PBST洗板6次，加入(5000：1)HRP标记的抗M13单克隆抗体，100μL/孔，水平摇床室温孵育45min。再用PBST洗涤3次，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃孵育10min。待溶液逐渐变蓝出现明显深浅变化，加入2mM的稀硫酸，50μL/孔，终止显色反应，立即用酶标仪读取OD450值。将高于阴性对照5倍的孔进行测序，得到最终的纳米抗体序列，其编码针对哇巴因的纳米抗体。
3.2.3阳性序列对比分析
将阳性克隆导入MEGA软件序列比对，比对后进行分子进化树分析。分析后将候选纳米抗体序列上传至IMGT数据库，进行序列分析。
3.2.4纳米抗体表达载体的构建
本发明将pET-32a作为表达载体，酶切位点选择为BamH I与Xho I，将阳性克隆扩增的PCR产物进行琼脂糖电泳。以阳性克隆为模板，使用特异性的引物扩增VHH片段。
PCR扩增体系如下表所示：
反应体系如下表；
特异性扩增引物序列如下表：
将pET-32a质粒和上述胶回收产物使用BamH I与Xho I酶切，在37℃条件下酶切30min后琼脂糖电泳检测，胶回收酶切片段，测定浓度，酶切体系如下表所示：
将酶切后的载体和片段以摩尔比1：4进行连接，连接反应的体系如下表所示，
22℃连接30min后，转化至BL21(DE3)感受态细胞，翌日取阳性克隆进行测序。
3.2.5纳米抗体的原核表达
将含有重组质粒的菌液按照1：50的体积比例加入100mL LB+卡纳霉素液体培养基，37℃摇床中振荡培养至OD600≈0.6。向培养物中分别加入0、0.1、10mM浓度的IPTG在不同温度时间下诱导。SDS-PAGE电泳分析蛋白表达，优化诱导条件。在4℃下8000rpm离心15min，弃上清。加入PBS溶液将细菌沉淀重悬，超声破碎细菌裂解蛋白，超声破碎仪具体程序为超声3s，暂停9s，共45min。将破碎后的溶液在4℃下13000rpm离心30min，收集上清，置于4℃，沉淀放于-20℃冻存。
3.2.6纳米抗体的蛋白纯化
将每4mL细菌裂解液上清加入1mL已混合均匀的50％ His-tag BeyoGold，混合细菌裂解液上清和50％ His-tag BeyoGold。在4℃下缓慢振荡孵育60min。在空柱管中加入裂解液和His-tag Purification resin的混合物。在重力作用下，使柱内液体流出并收集。加入1-2个柱体积的非变性裂解液，共5次，然后加入1-2个柱体积的非变性洗涤液，共5次。每次用一个柱体积的非变性洗脱液洗脱目的蛋白3-5次。将每次的洗脱液分别收集到不同的Eppendorf管中。根据需求采用Milipore的蛋白浓缩管，选用3kDa规格浓缩管使得样品浓缩至适当的体积。将样品加入浓缩管25℃下3000g离心30min收集上清，测定浓度。根据蛋白纯度需要，将蛋白用AKTA pure蛋白纯化仪进一步纯化，使用Superdex 75凝胶色谱柱或离子交换柱进行分离纯化，缓冲液体系为0.02M Tris-HCl,1M NaCl，pH 8.0(根据等电点调整平衡液buffer)。根据仪器压力设定系统流速为0.5-1mL/min，预平衡色谱柱后使用Sampleloop进行上样，使用自动组分收集器收集不同时间的流出组分。SDS-PAGE电泳分析检测不同组分蛋白，将蛋白组分冻于-80℃冰箱保存。
3.2.7蛋白的荧光标记
本发明通过微量热泳动(MST)技术检测抗体蛋白和抗原的亲和力，该方法需要配体分子或者受体蛋白至少一个有荧光标记。本发明选择Monolith RED-NHS二代蛋白标记试剂盒对目标抗体进行标记。
(一)蛋白标记
在1.5mL Eppendorf管中，加入7μL RED-NHS二代染料与7μLNHS标记缓冲液，吹吸混匀获得终浓度为300μM的染料溶液。另取新1.5mL Eppendorf管，加入90μL蛋白样品(浓度10μM)。取10μL的上述染料溶液加入到蛋白样品中，吹吸混匀获得100μL染料蛋白溶液，在室温避光环境下孵育30min，蛋白纯化参见实验方法4.3.3。
(二)标记效率的测定
按照如下公式计算标记效率：
标记效率(DOL)计算公式如下：
3.2.8MST检测抗体蛋白与哇巴因的亲和力
首先梯度稀释哇巴因溶液，配制含有0.05％吐温-80的PBS溶液，用该溶液将哇巴因稀释至1μM，并吸取10μL加入一个0.2mL的PCR管中，并将该PCR管标记为1号PCR管依次编号直至16号。在2号至16号PCR管中加入10μL含有0.05％吐温-80的PBS溶液，梯度稀释1号PCR管至16号PCR管，使后一管的哇巴因配体浓度恰好为前一管的一半。将待测标记好的Nb蛋白稀释至10nM浓度，在每一个PCR管中加入10μL标记好的Nb蛋白溶液，用移液器充分吹打混匀。使每一个PCR管的待测抗体蛋白浓度均为5nM。在PCR管加入等体积的标记好的抗体蛋白，吸入毛细管，通过MST检测抗体与配体的亲和能力。使用专用毛细管吸取上述PCR管内的液体，注意不要吸取到气泡。上机设置参数，检测纳米抗体与哇巴因亲和力。
3.3实验结果
3.3.1噬菌体文库生物淘选富集
在原始文库构建完成后，本发明将对噬菌体文库共进行3轮生物淘选，第一轮淘选，包被抗原哇巴因-OVA浓度为30μg/mL；第二轮淘选，包被抗原浓度为15μg/mL；第三轮淘选，包被抗原浓度为7μg/mL。结果如表1所示，第三轮淘选相比于第一轮阳性克隆数量富集1000倍，回收率得到明显的提高，并且对于噬菌体的投入洗脱比例，第二轮和第三轮淘选趋近稳定，进一步表明阳性克隆得到显著富集。
表1：噬菌体富集参数
为进一步评估文库富集效果，通过间接ELISA方法检测每轮富集淘选过程抗原与抗体结合信号的变化。如图7所示，在淘选前原始文库对OVA与抗原哇巴因-OVA的结合信号较低，经过3轮富集，文库与哇巴因-OVA结合信号显著增强，与OVA的结合信号强度相比增加8倍，表明在文库中与哇巴因-OVA特异性结合的阳性克隆得到有效的富集。综合淘选回收率与间接ELISA检测结果分析，表明Nb文库富集效果良好，为后续筛选获得哇巴因Nb提供保障。
3.3.2阳性克隆筛选鉴定
本发明通过间接ELISA的方法筛选阳性克隆。从富集文库中挑选单克隆多轮筛选，间接ELISA检测单克隆的外周质表达产物。如图8所示，选取空白对照OD450数值5倍以上的指标为分界线，最终挑选多个阳性克隆进行DNA测序与数据库分析。
3.3.3纳米抗体的原核表达
本发明构建原核表达重组质粒，当构建完成并经测序验证后，将重组质粒转入宿主菌在37℃下，用100mM的IPTG诱导4h，超声破碎菌液后收集上清后经过镍柱纯化与离子交换纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析。如图9所示，可见重组蛋白产物均在14kDa附近有明显条带，符合重组蛋白理论分子量大小，表明重组蛋白表达成功。
3.3.4MST测定纳米抗体与哇巴因亲和能力
本发明对抗体蛋白进行表达，并通过镍柱亲和层析对抗体蛋白进行纯化。通过Monolith RED-NHS二代蛋白标记试剂盒对抗体蛋白进行标记核酸染料。使用MST测定候选Nb蛋白和哇巴因之间的亲和力。如图10所示，MST通过测定蛋白与小分子反应产生的荧光变化从而在较短时间实现亲和力测定，结果显示蛋白荧光分布均匀，表明荧光蛋白标记效果良好，并测得Nb与哇巴因存在结合能力。其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示并命名为G2-Nb。
实施例4纳米抗体体外中和哇巴因药理活性作用
4.1实验材料
实验材料参见3.1
4.2实验方法
4.2.1细胞培养与传代
细胞的培养，采用含有10％血清和青霉素的DMEM培养液，将细胞置于37℃，5％浓度CO2的细胞培养箱中培养。在细胞生长密度达到皿中80％-90％时，用无菌PBS溶液对细胞进行洗涤，用适当体积的胰蛋白酶对其进行消化，置于细胞培养箱2min，加入培养基终止消化，将其置于15mL离心试管中800g离心3min。将上清移除加入新培养基，吹吸重悬细胞，再将1/3的悬浮液均匀分布在已加有新培养基的培养皿中，放置37℃，5％浓度CO2的细胞培养箱培养。
4.2.2提取细胞蛋白
选择生长状态较好的细胞，加药或者转染后，将其放入离心管内。用无菌PBS清洗两次，添加适量的RIPA裂解液。充分振荡混合，冰浴裂解，间隔10min振荡一次，共3次，用12000rpm，离心10min，取上清液保存。
4.2.3BCA法测定蛋白浓度
将BCA工作液与A、B两种溶液按照50：1的体积比例进行混合，配制每个样品的工作液200μL。每个样品取2μL，再用PBS补满到10μL，再与200μL BCA工作液充分混匀。将此溶液置于37℃培养30min，用比色光度法测量其OD560吸光度，并由其标准曲线计算其含量。
4.2.4MTT法测定哇巴因对细胞存活率
通过MTT(噻唑蓝)，检测细胞存活率。当6孔板细胞中细胞密度达到80％-90％时，对细胞进行消化处理，1000rpm离心5min，留下细胞沉淀，加入1mL培养液再悬浮，并用细胞计数板进行细胞计数。将100μL细胞悬浮液添加到96酶标板上，1×104细胞/孔，并将无菌的PBS添加到细胞孔的周围。在96孔板上培养12-24h，当细胞生长密度达到60％-80％，此时可加入药物对细胞进行处理。在遮光条件下将MTT配制成5mg/mL的浓度，并取15μL加入到细胞孔中，在细胞培养箱中放置4h。弃去96孔板中溶液，在每孔加入150μL DMSO，并将96孔板放置水平摇床室温振荡10min。在490nm波长处用酶标仪检测各孔的吸光度，计算出细胞生存率。
细胞存活率计算公式：细胞存活率＝[(OD实验组-OD零处理组)/(OD对照组-OD零处理组)]*100％。4.2.5流式细胞术检测细胞内Ca2+水平
在12孔细胞培养皿中培养细胞，当细胞生长密度达到60％-80％时，加药处理细胞。在避光条件下将处理过的细胞弃去培养基，并用预热的HBSS冲洗细胞3次消除培养基中的酯酶等物质，降低其对离子探针的降解。加入1-5μM的Fluo4-AM工作液，使细胞完全被工作溶液所覆盖，于恒温条件下在细胞培养箱中孵育40min。弃去Fluo4-AM工作液，用HBSS洗涤细胞3次，将培养皿中的Fluo4-AM工作液完全清除，然后添加1mL HBSS，室温孵育20-30min，以保障AM体在细胞中被彻底脱酯化。将细胞用胰蛋白酶完全消化下来，2500rpm，离心5min，用HBSS洗涤细胞3次，最后再用400μL的HBSS将细胞重悬，移至流式管内，选择BL1/FITC通道进行测定。
4.2.6竞争结合法ELISA检测内源性哇巴因
具体步骤见发明内容。
4.3实验结果
4.3.1哇巴因纳米抗体降低哇巴因诱导的细胞毒性
高浓度哇巴因会引起细胞凋亡，为研究哇巴因Nb的药理作用效果，本研究使用哇巴因和哇巴因Nb处理Hela细胞，通过MTT法检测哇巴因与抗体蛋白对细胞存活率影响。如图11所示，分别用1μM与2μM的哇巴因处理Hela细胞48h与24h，此时细胞经哇巴因处理后存活率降为原来一半。因此，选择此哇巴因浓度，提前与三个浓度(0.5、1、2μM)哇巴因Nb孵育30min后处理细胞。MTT结果显示，不同浓度的哇巴因Nb与对照哇巴因组相比，均起到一定的中和效果，降低哇巴因对细胞的毒性，提高了Hela细胞的存活率。以上结果表明，本研究制备的哇巴因Nb可以在体外中和掉一定浓度的哇巴因起到降低其毒性的作用。4.3.2哇巴因纳米抗体拮抗哇巴因导致的Ca2+浓度增加
哇巴因能够通过抑制Na+/K+-ATPase引起细胞内K+减少，Na+聚集，使细胞膜去极化，激活Ca2+通道并形成Na+-Ca2+交换，引起Ca2+浓度增高，最终引发内质网中Ca2+的释放。为进一步验证哇巴因Nb的生物活性，使用哇巴因Nb中和哇巴因单体，检测Hela细胞中的Ca2+浓度。如图12所示，250nM浓度哇巴因组相比于对照组Ca2+浓度显著增高。将哇巴因Nb(5μM)与哇巴因孵育后，处理细胞并检测Ca2+浓度，结果发现Ca2+浓度明显降低。
以上结果表明，哇巴因Nb在细胞发挥了显著的作用，能够拮抗哇巴因导致的Ca2+浓度增加。4.3.3竞争结合法ELISA检测内源性哇巴因
将抗原固定化，确定抗体工作浓度为1μg/mL附近，选取最佳的抗体浓度用于后续的检测实验。基于氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的抗体G2-Nb建立的竞争ELISA标准曲线图如图13、表2所示，可以观察到曲线线性相关性较好，根据回收率等参数综合判定检测范围10-500ng/mL。将标准品空白OD450值平均值记为B0，将不同药物浓度下的OD450以及样品待测孔的平均值记为B，计算不同药物浓度或者样品孔B/B0比值以及每组平行数据的标准差。以标准品浓度的对数值为横坐标，B/B0比值为纵坐标，绘制标准曲线。根据样品孔平均吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为哇巴因浓度的对数值，求得反对数即为测定样品中的哇巴因浓度。
表2哇巴因检测回收率数据
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Claims (5)

1.一种抗哇巴因的纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述抗哇巴因的纳米抗体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求1所述抗哇巴因的纳米抗体的编码基因。
4.权利要求1所述抗哇巴因的纳米抗体的制备方法，其特征在于，将重组质粒转化至BL-21基因工程菌,诱导后通过His-tag Purification resin进行初步纯化，然后通过AKTA离子交换进行进一步精纯。
5.权利要求1所述抗哇巴因的纳米抗体在制备ELISA方法检测哇巴因的制剂中的应用。
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