CN117396227A - siRNA递送载体 - Google Patents
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Abstract
提供了6,7‑二羟基香豆素鏻两亲物与带负电荷的剂的复合物。所述复合物自组装成纳米颗粒或非病毒载体，以促进所述带负电荷的剂的递送。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。因此，本发明提供了一种将这种带负电荷的剂递送至靶细胞的方法，并且特别是促进了治疗剂或诊断剂穿过质膜的递送，以及一种通过递送治疗剂或诊断剂进行治疗或诊断的方法。所述6,7‑二羟基香豆素鏻两亲物可以是Mito‑Esc，并且带负电荷的剂可以是核酸，诸如siRNA。此外，所述6,7‑二羟基香豆素鏻两亲物被认为在治疗癌症中是有效的。
Description
技术领域
本发明提供用于核酸的新型递送载体，诸如质粒DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA和信使RNA，以改善它们用于预防或治疗各种疾病和/或病症的用途。此外，本发明提供了一种治疗癌症，诸如乳腺癌的新方法。
背景技术
核酸已经成为包括免疫疗法在内的癌症治疗的有希望的治疗候选物。核酸是不同种类的DNA或RNA，诸如质粒、mRNA、ASO、siRNA、miRNA、小活化RNA(saRNA)、适体、基因编辑gRNA以及免疫调节DNA/RNA。核酸疗法具有从改变(上调或下调)基因表达到调节免疫反应的多种功能。核酸的高特异性、多功能性、可重复的批间生产和可调节的免疫原性使它们成为癌症免疫疗法的良好候选物。
例如，小干扰RNA(siRNA)作为新的和有用的治疗剂出现，以治疗多种医学病状。美国FDA批准的第一种此类治疗是药物patisiran(ONPATTROTM)，该药物已被开发用于治疗成年患者中由遗传性甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性(hATTR)引起的外周神经疾病(多发性神经病)，该疾病是一种罕见的、使人虚弱且通常致命的遗传疾病，其特征在于外周神经、心脏和其他器官中异常淀粉样蛋白的积聚。FDA批准的siRNA治疗的另一个实例是GIVALAARITM(givosiran)，其用于治疗患有急性肝性卟啉病的成年患者，这是一种导致在血红素(有助于结合血液中的氧)产生期间形成的毒性卟啉分子积聚的遗传疾病。其他siRNA疗法也在开发和临床评估中。
虽然siRNA具有巨大的治疗潜力，但挑战仍然存在，因为将裸露或包封的核酸引入载体以与生物流体结合会遇到许多生理障碍，这些障碍会改变siRNA的细胞生物分布和细胞内生物利用度。在施用后，未修饰的DNA和RNA在到达靶细胞表面之前，在生物液体中被胞外和胞内酶快速降解。这影响了它们的活性和与细胞的相互作用，从而损害了核酸的治疗效果。此外，由于核酸的亲水性质和高分子量，其细胞摄取非常有限。可被细胞吸收的一小部分通常被内化为囊泡(即内体)，后者随后转化为溶酶体。核酸在溶酶体内的积累和随后的消化阻止了它们到达它们的细胞质或细胞核靶，并且是它们效力的一个重要障碍。例如，siRNA的有限稳定性、其免疫原性和将siRNA治疗剂递送到细胞内所需靶位点的挑战(即运送siRNA穿过质膜进入细胞质的困难)都是siRNA功效的障碍。已经研究了许多策略来增加核酸的细胞内生物利用度。这些技术主要涉及修饰核酸的化学结构或将遗传物质封装到载体(病毒或非病毒)中。这些载体应该足够小以被细胞吸收，并且具有靶向部分或过量正电荷以促进细胞结合和随后的吸收。总的来说，尽管病毒载体可以达到更高程度的转运效率，但是对于这种载体的安全性和可扩展性的限制仍然存在担忧。因此，尽管治疗效果较低，但优选非病毒载体。融合脂质或肽或膜去稳定聚合物的掺入可用于促进遗传物质从内体/溶酶体逃逸到细胞质中。当使用pDNA时，也可以使用核归巢序列标记来增加表达效率。最后，这些复合物应该具有中等的稳定性；足够坚固以将核酸运送到靶位点，但是在它们的靶亚细胞区室/细胞器处与它们分离。例如，由于RNA分子内存在带负电荷的磷酸基团，向靶位点的细胞内递送需要存在递送载体。然而，在治疗组合物中包含递送载体可能限制活性RNA剂的治疗潜力。
一般来说，非病毒载体将是合成颗粒以及永久带电的基于季铵的阳离子脂质(PCCL)或阳离子聚合物(PCCP)，并在转染后产生siRNA复合物，但通常需要包含可质子化胺基团的pH反应性脂质来降低毒性。在这方面，三苯基鏻(TPP)束缚的基于聚合物的递送系统由于其优越的安全性和转染能力而作为基于铵的系统的无毒替代品日益受到重视。此外，由于两亲性和离域正电荷，TPP锚定的分子表现出增强的生物相容性、膜融合、细胞摄取以及线粒体靶向性。
仍然需要能够提供高转染效率的无毒核酸递送载体。
本发明提供了一种基于鏻两亲物的新型核酸递送方法。优选地，所述的鏻两亲物具有形成聚集体的能力，并且随后通过形成鏻-siRNA复合物将核酸(诸如siRNA)递送至靶细胞。根据本发明的示例性鏻两亲物是三苯基磷鎓阳离子(TPP+)偶联的七叶亭(esculetin)(本文称为“米托-七叶亭(Mito-Esculetin)”或“Mito-Esc”，这两个术语在本文中可互换使用)。
Mito-Esc的分子结构由通过8-碳脂肪链连接到亲水性6,7-二羟基香豆素分子的亲脂性TPP阳离子组成。因此，Mito-Esc是一种两亲性分子，由在同一分子中具有相反表面、疏水和亲水基团的结构组成。
US9580452描述了使用米托-七叶亭治疗动脉粥样硬化。PCT申请号IB2020/061043描述了使用米托-七叶亭治疗伤口、牛皮癣和脱发。然而，这些公开内容中没有一个表明米托-七叶亭可用作核酸递送载体，优选用作siRNA递送载体，也没有表明米托-七叶亭可用于治疗癌症，诸如乳腺癌。
此外，最近证实，线粒体靶向的七叶亭(Mito-Esc)通过减轻氧化剂诱导的内皮功能障碍而极大地缓解了动脉粥样硬化疾病进展。从而显示Mito-Esc在改善氧化剂介导的细胞异常的同时引起乳腺癌细胞的优先死亡。在这个背景下，本发明利用TPP阳离子的疏水性和6,7-二羟基香豆素的亲水性来形成自组装纳米颗粒并用作有效的核酸递送载体，诸如siRNA递送载体。
发明内容
作为深入研究的结果，本发明人发现6,7-二羟基香豆素鏻两亲物与带负电荷的剂一起形成复合物。带负电荷的治疗剂可以是治疗剂或诊断剂。带负电荷的剂可以是核酸，例如质粒DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA(SiRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA和信使RNA(mRNA)。更具体地说是siRNA或mRNA，其目的在于治疗或诊断特定的疾病或病症。
此外，本发明人发现6,7-二羟基香豆素鏻两亲物与带负电荷的剂的复合物一起自组装成纳米颗粒或非病毒载体。因此，本发明提供了一种将带负电荷的剂递送至靶细胞的方法，并且特别是将剂递送穿过质膜的方法。
任选地，在本发明的复合物和纳米颗粒中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合物和纳米颗粒是式I化合物：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
优选地，X是C6至C10碳链，并且R是氢。
在一个实施方案中，在本发明的复合物和纳米颗粒中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是与6,7-二羟基香豆素部分共价偶联的三苯基鏻阳离子。更具体地，复合物和纳米颗粒是式II化合物：
其中，
X是C1至C30碳链，优选C6至C10碳链；
Z是带负电荷的剂或卤化物；并且
R是氢。
在一些实施方案中，式I或II的化合物的复合物和纳米颗粒是式III化合物：
Z是带负电荷的剂或卤化物。
进一步的研究还显示，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物或其药学上可接受的盐可用于治疗或诊断癌症。因此，本发明还提供了用于治疗癌症，特别是乳腺癌的6,7-二羟基香豆素鏻两亲物或其药学上可接受的盐，以及用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用6,7-二羟基香豆素鏻两亲物或其药学上可接受的盐。
根据以下详细描述，本发明的上述方面和实施方案以及其他方面、目的、特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1：Mito-Esc剂量依赖性和时间依赖性地诱导乳腺癌细胞死亡，而不影响正常细胞活力。(A)用不同浓度的Mito-Esc(1.25-7.5μM)处理MDA-MB-231乳腺癌细胞。在24小时和48小时时通过台盼蓝染料排斥测定测量细胞活力(B)与A相同，除了用亲本Esc(5-50μM)处理细胞。(C)与A相同，除了用Mito-Esc(5-50μM)处理MCF10A(正常乳腺上皮)细胞。(*，与对照有显著差异(P<0.05)。ns；与对照无显著差异)。
图2：(A)DLS：Mito-Esc纳米颗粒的尺寸分布：(B)Mito-Esc纳米颗粒的SEM图像：Mito-Esc纳米颗粒的扫描电子显微照片(比例尺100nm)；(C)Mito-ESC纳米颗粒TEM图像：Mito-Esc纳米颗粒的透射电子显微照片(TEM)，样品用钼酸铵(比例尺200nm)负染。(D)和(E)Mito-Esc的结合能力：Mito-Esc、米托-异东莨菪素(Mito-isoscopoletin)和辛基TPP在不同P+/P-比例下形成的siRNA脂复合物的琼脂糖凝胶电泳测定。
图3：MitoEsc施用逆转乳腺癌进展SCID小鼠模型：(A)每组的代表性肿瘤如图所示；(B)图描绘了终止日以mm3为计的平均肿瘤体积±SEM；(C)图显示肿瘤重量；(D)在三个单独的肿瘤切片中计算平均坏死指数。数据代表四只动物的平均值±SE。
图4：Mito-Esc/siMnSOD复合物通过消耗MnSOD水平加剧Mito-Esc诱导的乳腺癌细胞死亡。(A)将MDA-MB-231细胞与Mito-Esc/siMnSOD(40nM)复合物或与lipofectamine-2000/siMnSOD复合物一起温育48小时，并且通过台盼蓝染料排斥测定测量细胞活力。(B)MDA-MB-231细胞用siMnSOD(40nM)以所指示递送系统转染48小时，并且通过免疫印迹测量MnSOD蛋白水平。括号指示标准化为GAPDH(加载对照)的MnSOD的相对表达。(*，与对照有显著差异(P<0.05)。ns；与对照无显著差异。)
图5：使用共焦成像通过用Mito-Esc检测Cy-5siRNA的细胞内递送。将MDA-MB-231细胞用Cy-5标记的siRNA(40nM)用所指示递送系统转染24小时使用共焦显微镜评估转染效率。细胞质中的Cy-5荧光显示为蓝色(比例尺10X)。
图6：使用共焦成像比较Cy-5siRNA的细胞内递送。使用不同的递送机制用Cy-5标记的siRNA转染MCF-10A细胞。使用共焦显微镜评估转染效率。细胞质中的Cy-5荧光显示为蓝色。
具体实施方式
如本文所用，除非另有明确说明，否则适用以下定义。应该理解的是，除非有相反的明确说明，单数形式“一个/种”和“所”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。
本发明中的“烷基”是指直链或支链烃基，并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正辛基等。
“烯基”是指直链和支链烃基和至少一个双键，并且包括但不限于乙烯基、3-丁烯1-基、2-乙烯基丁基、3-己烯-1-基等。
“炔基”是指直链和支链烃基和至少一个三键，并且包括但不限于乙炔基、3-丁炔-1-基、丙炔基、2-丁炔-1-基、3-戊炔-1-基等。
“芳基”是指具有单个环(例如苯基)、多个环(例如联苯基)或多个稠环的芳族碳环基团，其中至少一个是芳族的(例如，1,2,3,4-四氢萘基、萘基、蒽基或菲基)，其可以被例如卤素、低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、三氟甲基、低级酰氧基、芳基、杂芳基和羟基单取代、二取代或三取代。优选的芳基是苯基。
“杂原子”是指除碳或氢以外的任何元素的原子。优选地，杂原子是氮、氧和硫。
“环烷基”是指具有3个至8个碳原子的单环或多环烃基，例如环丙基、环庚基、环辛基、环癸基、环丁基、金刚烷基、降蒎烷基(norpinanyl)、萘烷基(decalinyl)、降冰片基(norbornyl)、环己基和环戊基。
本发明中的术语“卤化物”是指氟化物、溴化物、氯化物和碘化物。
“杂芳基”是指含有至少一个且最多四个选自氮、氧或硫的杂原子的5元、6元或7元环的一个或多个芳族环系统。这种杂芳基包括例如噻吩基、呋喃基、噻唑基、三唑基、咪唑基、(异)噁唑基、噁二唑基、四唑基、吡啶基、噻二唑基、噁二唑基、噁噻二唑基、噻三唑基、嘧啶基、(异)喹啉基、萘啶基、邻苯二甲酰亚胺基、苯并咪唑基和苯并噁唑基。
如本文所用的“治疗有效量”是指有效缓解目标疾病或病症的治疗剂的量。
如本文所用的“患者”是指任何人类或非人类动物(例如，灵长类、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等)。如本文所用，术语“治疗”是指尽可能快地治愈疾病和/或病症，并且防止进展成严重疾病。
本发明基于令人惊讶的发现，即6,7-二羟基香豆素鏻两亲物可以与带负电荷的剂自聚集，以形成载体或纳米颗粒，所述载体或纳米颗粒特别适合于促进将剂递送至靶细胞(例如癌细胞)中。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。优选地，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是与6,7-二羟基香豆素部分共价偶联的三苯基鏻阳离子。优选的6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是辛基标记的七叶亭(米托七叶亭)。此外，研究还证实，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物可用于治疗和诊断癌症，特别是乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肝癌。更具体地，在乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌中。
在一个方面，本发明提供了6,7-二羟基香豆素鏻两亲物与带负电荷的剂的复合物。
带负电荷的剂可以是核酸，例如质粒DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA和信使RNA(mRNA)。然而，所需要的是所述剂具有负电荷，因此其将与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物结合。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，治疗剂旨在递送至靶细胞的细胞质，从而在靶细胞的细胞质内发挥其预期的治疗效果。在一些实施方案中，治疗剂将是带负电荷的抗癌剂、siRNA或mRNA。siRNA可有效用于治疗或诊断任何疾病或病症，例如治疗或诊断癌症、外周神经疾病、急性肝卟啉病等。在一些实施方案中，siRNA可用于治疗乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肝癌。更具体地，乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌。
替代地，治疗剂可以是RNA疫苗，例如针对病毒(例如冠状病毒)的RNA疫苗。
在一个实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合物是式I化合物
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
在另一个实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物可以是与6,7-二羟基香豆素部分共价偶联的三苯基鏻阳离子。更具体地，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合物是式II化合物：
其中，
X是C1至C30碳链，优选C6至C10碳链；
Z是带负电荷的剂或卤化物；并且
R是氢、一个或多个取代的烷基、一个或多个取代的芳基或一个或多个取代的杂原子。优选地，R是氢。
在一个实施方案中，带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。优选地，Z是带负电荷的治疗剂。
在一个实施方案中，X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代。优选地，X是辛烯基。
在一些实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是米托-七叶亭。更具体地，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合物是式III化合物：
Z是带负电荷的剂或卤化物。
US9580452描述了根据式I、II和III的化合物的合成方法，特别是米托-七叶亭的合成方法。
任选地，所述复合物包含与RNA治疗剂(例如siRNA)组合的米托-七叶亭。
令人惊讶地发现，本发明的复合物可以自组装成纳米颗粒或非病毒载体。这些纳米颗粒特别适用于将治疗剂或诊断剂递送给患者，并且特别适用于将带负电荷的治疗剂递送到靶细胞的细胞质中。
因此，除了上述复合物之外，本发明还提供了包含6,7-二羟基香豆素鏻两亲物的纳米颗粒。
纳米颗粒优选包含带负电荷的剂。带负电荷的剂可以是核酸，例如质粒DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA和信使RNA(mRNA)。然而，所需要的是所述剂具有负电荷，因此其将与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物结合。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，治疗剂旨在递送至靶细胞的细胞质，从而在靶细胞的细胞质内发挥其预期的治疗效果。在一些实施方案中，治疗剂将是带负电荷的抗癌剂、siRNA或mRNA。siRNA可有效用于治疗或诊断任何疾病或病症，例如治疗或诊断癌症、外周神经疾病、急性肝卟啉病等。在一些实施方案中，siRNA可用于治疗乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肝癌。更具体地，乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌。替代地，治疗剂可以是RNA疫苗，例如针对病毒(例如冠状病毒)的RNA疫苗。在一些实施方案中，剂是siRNA。siRNA可以用于治疗或诊断任何特定的疾病或病症。
在一些实施方案中，纳米颗粒可以具有100nm至200nm的尺寸，例如150nm至180nm，优选大约160-170nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒可以具有30mV至40mV的表面电荷。
在一些实施方案中，纳米颗粒可以具有30mV或更大的表面电荷。
本发明进一步提供了包含根据本发明的纳米颗粒或复合物的组合物。任选地，所述组合物是水溶液或悬浮液。
在一些实施方案中，根据本发明的组合物呈药学上可接受的形式。
在某些实施方案中，药物组合物被配制用于口服或肠胃外施用。在一些实施方案中，药物组合物以口服剂型施用。优选地，口服剂型呈片剂、胶囊、分散片、小袋、喷雾剂、液体、溶液、悬浮液、乳液等的形式。如果口服剂型是片剂，所述片剂可以是任何合适的形状，诸如圆形、球形或椭圆形。片剂可以具有单片或多层结构。在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以通过使用本领域熟知的常规药学上可接受的赋形剂的常规方法来获得。适用于片剂制备的药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于稀释剂(例如，磷酸氢钙、碳酸钙、乳糖、葡萄糖、微晶纤维素、纤维素粉末、硅化微晶纤维素、硅酸钙、淀粉、预胶化淀粉或多元醇，诸如甘露醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇和蔗糖)、粘合剂(例如，淀粉、预胶化淀粉、羧甲基纤维素、纤维素钠、微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚维酮或它们的组合)、崩解剂(例如，交联纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮(交联聚维酮)、淀粉羟乙酸钠、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone/povidone))、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠(cross-linked sodium carboxymethylcellulose/croscarmellosesodium)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、黄原胶、藻酸或大豆多糖)、湿润剂(例如，聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠或硬脂酸甘油酯)或润滑剂(例如，十二烷基硫酸钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂基富马酸钠、硬脂酸、山嵛酸甘油酯(glyceryl behenate)、氢化植物油或硬脂酸锌)。如此制备的片剂可以是未包衣的或包衣的，用于改变它们的崩解和随后活性成分的肠吸收，或用于改善它们的稳定性和/或外观。在这两种情况下，可以使用本领域公知的常规包衣剂和方法。
在某些实施方案中，肠胃外施用可以与药学上可接受的肠胃外媒介物一起配制成溶液、悬浮液、乳液、颗粒、粉末或冻干粉末，或者单独提供。这种媒介物的实例是水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液以及大约1-10％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物，诸如不挥发油。媒介物或冻干粉末可含有维持等渗性(例如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如，缓冲液和防腐剂)的添加剂。通过已知或合适的技术对制剂进行灭菌。在一些实施方案中，肠胃外制剂可包含普通赋形剂，包括但不限于无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物来源的油、氢化萘等。根据已知的方法，可以通过使用合适的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备注射用水或油悬浮液。肠胃外施用途径包括但不限于皮下途径、肌内途径、静脉内途径、鞘内途径或腹膜内途径。
本发明的制剂可以通过现有技术中已知或另外描述的方法，例如在Remington’sPharmaceutical Sciences中公开的方法来制备。
任选地，本发明的复合物或纳米颗粒可用于治疗或诊断癌症。优选地，例如，用于治疗乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肝癌。更具体地，在乳腺癌中，诸如三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌。
本发明还提供了递送带负电荷的剂的方法，其中所述剂与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合。任选地，如上所述，剂和6,7-二羟基香豆素鏻两亲物的复合物呈纳米颗粒的形式。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。优选地，本发明提供了递送带负电荷的治疗剂的方法，其中所述剂与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合。更优选地，治疗剂和6,7-二羟基香豆素鏻两亲物的复合物呈纳米颗粒的形式。
本发明进一步提供了一种细胞内递送带负电荷的剂的方法，所述方法包括施用有效量的与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合的所述剂。任选地，如上所述，剂和6,7-二羟基香豆素鏻两亲物的复合物呈纳米颗粒的形式。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。优选地，发明提供了一种细胞内递送带负电荷的治疗剂的方法，所述方法包括施用有效量的与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合的所述治疗剂。更优选地，复合物呈纳米颗粒的形式。
在上述方法中，带负电荷的剂与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合，并且所述复合物可以进一步组装成纳米颗粒或非病毒载体的形式。带负电荷的剂可以是核酸，例如质粒DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA和信使RNA(mRNA)。然而，所需要的是所述剂具有负电荷，因此其将与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物结合。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，治疗剂旨在递送至靶细胞的细胞质，从而在靶细胞的细胞质内发挥其预期的治疗效果。在一些实施方案中，治疗剂将是带负电荷的抗癌剂：siRNA或mRNA。siRNA可有效用于治疗或诊断任何疾病或病症，例如治疗或诊断癌症、外周神经疾病、急性肝卟啉病等。在一些实施方案中，siRNA可用于治疗乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肝癌。更具体地，在乳腺癌中，诸如三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌。替代地，治疗剂可以是RNA疫苗，例如针对病毒(例如冠状病毒)的RNA疫苗。在一些实施方案中，剂是siRNA。siRNA可以针对治疗或诊断任何特定的疾病或病症。例如，siRNA可以有效地靶向癌症，以触发其特定的细胞死亡和/或防止细胞生长和这些细胞的分裂。例如，siRNA可以特异性靶向乳腺癌细胞。
因此，本发明还提供了一种治疗或改善癌症进展的方法，其中所述方法包括向患者施用药学上可接受的组合物，该组合物包含6,7-二羟基香豆素鏻两亲物的纳米颗粒和带负电荷的治疗剂。
在一个实施方案中，所述6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是Mito-Esc，并且所述治疗剂是对癌症治疗有效的siRNA。
在另一方面，本发明提供了用于治疗或诊断癌症的6,7-二羟基香豆素鏻两亲物或其药学上可接受的盐。任选地，癌症是乳腺癌。
用于治疗或诊断癌症的6,7-二羟基香豆素鏻两亲物可以是式I化合物：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
在另一个实施方案中，用于治疗或诊断癌症的6,7-二羟基香豆素鏻两亲物可以是与6,7-二羟基香豆素部分共价偶联的三苯基鏻阳离子。更具体地，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是式II化合物：
其中，
X是C1至C30碳链，优选C6至C10碳链；
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子。优选地，R是氢。
在一个实施方案中，X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代。优选地，X是辛烯基。
在一个实施方案中，带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。任选地，Z是溴化物阴离子。任选地，Z是带负电荷的治疗剂，例如适于靶向治疗的癌症的siRNA。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。
在一些实施方案中，用于治疗癌症的6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是式III的Mito-Esc：
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根。
在另一方面，本发明提供了治疗或诊断癌症的方法，所述癌症例如乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肝癌。更具体地说，一种治疗乳腺癌(诸如三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌)的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的式I化合物，其中所述化合物是式II化合物：
其中，
X是C1至C30碳链，优选C6至C10碳链；
Z是带负电荷的治疗剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子。优选地，R是氢。
在一个实施方案中，X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代。优选地，X是辛烯基。
任选地，Z是溴化物阴离子。任选地，Z是带负电荷的治疗剂，例如适于靶向治疗癌症的siRNA。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。
优选地，式I或式II的化合物是式III的Mito-Esc：
其中Z是带负电荷的剂或卤化物。
在一个方面，本公开涉及6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物。
在另一方面，本公开涉及包含6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物的纳米颗粒。
在本公开的一个实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是式IV化合物：
其中，
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
在另一个实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是与式V的6,7-二羟基香豆素部分共价偶联的三苯基鏻阳离子：
其中，
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
在另一个实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物是式VI的辛基标记的七叶亭(米托-七叶亭/Mito-Esc)
在另一个实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物由式I化合物表示：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
在另一个实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物由式II化合物表示：
其中，
X是C1至C30碳链，优选C6至C10碳链；
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根；和
R是氢、一个或多个取代的烷基、一个或多个取代的芳基或一个或多个取代的杂原子。优选地，R是氢。
在另一个实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物由式III化合物表示：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子，所述带负电荷的抗衡离子选自甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根。
在一个优选的实施方案中，Z是选自治疗剂、诊断剂和核酸的带负电荷的剂。
在又一个实施方案中，带负电荷的剂可以是核酸，例如质粒DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA(SiRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA和信使RNA(mRNA)。然而，所需要的是所述剂具有负电荷，因此其将与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物结合。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，治疗剂旨在递送至靶细胞的细胞质，从而在靶细胞的细胞质内发挥其预期的治疗效果。在一些实施方案中，治疗剂将是带负电荷的抗癌剂、siRNA或mRNA。siRNA可有效用于治疗或诊断任何疾病或病症，例如治疗或诊断癌症、外周神经疾病、急性肝卟啉病等。在一些实施方案中，siRNA可用于治疗乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肝癌。更具体地，乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌。
替代地，治疗剂可以是RNA疫苗，例如针对病毒(例如冠状病毒)的RNA疫苗。在一些实施方案中，剂是siRNA。siRNA可以针对治疗或诊断任何特定的疾病或病症。例如，siRNA可以有效地靶向癌症，以触发其特定的细胞死亡和/或防止细胞生长和这些细胞的分裂。例如，siRNA可以特异性靶向乳腺癌细胞。
在一个优选的实施方案中，6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物是Mito-Esc和siRNA的复合物，其中Mito-Esc由式VI化合物表示：
在另一个优选的实施方案中，包含6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物的纳米颗粒是包含Mito-Esc和siRNA的复合物的纳米颗粒，其中Mito-Esc由式VI化合物表示：
任选地，本公开的复合物或纳米颗粒可用于治疗或诊断癌症。优选地，例如，用于治疗乳腺癌、宫颈癌、肺癌和肝癌。更具体地，在乳腺癌中，诸如三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌。
本公开还提供了包含根据本公开的方面的纳米颗粒或复合物的药物组合物。
本公开还提供了治疗或改善癌症进展的方法，其中所述方法包括向患者施用包含纳米颗粒或6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的治疗剂的复合物的药物组合物。
在某些实施方案中，药物组合物被配制用于口服或肠胃外施用。在一些实施方案中，药物组合物以口服剂型施用。优选地，口服剂型呈片剂、胶囊、分散片、小袋、喷雾剂、液体、溶液、悬浮液、乳液等的形式。如果口服剂型是片剂，所述片剂可以是任何合适的形状，诸如圆形、球形或椭圆形。片剂可以具有单片或多层结构。在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以通过使用本领域熟知的常规药学上可接受的赋形剂的常规方法来获得。适用于片剂制备的药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于稀释剂(例如，磷酸氢钙、碳酸钙、乳糖、葡萄糖、微晶纤维素、纤维素粉末、硅化微晶纤维素、硅酸钙、淀粉、预胶化淀粉或多元醇，诸如甘露醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇和蔗糖)、粘合剂(例如，淀粉、预胶化淀粉、羧甲基纤维素、纤维素钠、微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚维酮或它们的组合)、崩解剂(例如，交联纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮(交联聚维酮)、淀粉羟乙酸钠、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone/povidone))、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠(cross-linked sodium carboxymethylcellulose/croscarmellosesodium)、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、黄原胶、藻酸或大豆多糖)、湿润剂(例如，聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠或硬脂酸甘油酯)或润滑剂(例如，十二烷基硫酸钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂基富马酸钠、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、氢化植物油或硬脂酸锌)。如此制备的片剂可以是未包衣的或包衣的，用于改变它们的崩解和随后活性成分的肠吸收，或用于改善它们的稳定性和/或外观。在这两种情况下，可以使用本领域公知的常规包衣剂和方法。
在某些实施方案中，肠胃外施用可以与药学上可接受的肠胃外媒介物一起配制成溶液、悬浮液、乳液、颗粒、粉末或冻干粉末，或者单独提供。这种媒介物的实例是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液以及大约1-10％的人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物，诸如不挥发油。媒介物或冻干粉末可含有维持等渗性(例如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如，缓冲液和防腐剂)的添加剂。通过已知或合适的技术对制剂进行灭菌。在一些实施方案中，肠胃外制剂可包含普通赋形剂，包括但不限于无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物来源的油、氢化萘等。根据已知的方法，可以通过使用合适的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备注射用水或油悬浮液。肠胃外施用途径包括但不限于皮下途径、肌内途径、静脉内途径、鞘内途径或腹膜内途径。
本发明的制剂可以通过现有技术中已知或另外描述的方法，例如在Remington’sPharmaceutical Sciences中公开的方法来制备。
本发明还提供了递送带负电荷的剂的方法，其中所述剂与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合。任选地，如上所述，剂和6,7-二羟基香豆素鏻两亲物的复合物呈纳米颗粒的形式。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。优选地，本发明提供了递送带负电荷的治疗剂的方法，其中所述剂与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合。更优选地，治疗剂和6,7-二羟基香豆素鏻两亲物的复合物呈纳米颗粒的形式。
本发明进一步提供了一种细胞内递送带负电荷的剂的方法，所述方法包括施用有效量的与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合的所述剂。任选地，如上所述，剂和6,7-二羟基香豆素鏻两亲物的复合物呈纳米颗粒的形式。所述带负电荷的剂可以是治疗剂或诊断剂。优选地，发明提供了一种细胞内递送带负电荷的治疗剂的方法，所述方法包括施用有效量的与6,7-二羟基香豆素鏻两亲物复合的所述治疗剂。更优选地，复合物呈纳米颗粒的形式。
下面通过参考以下实施例来说明本发明。然而，本领域技术人员将会理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是对本发明的说明，因为在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些实施方案和原理进行无数的变化、修改、应用和扩展。
实施例
实施例1：化合物的合成
根据以下合成方案进行米托-七叶亭和对照TPP分子的合成。
方案2：A)合成(8-(6,7-二甲氧基-2-氧代-2H-色烯-4-基)辛基)三苯基鏻
B)合成辛基三苯基鏻:
合成1-(6-羟基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙-1-酮(2)的程序：
在氮气气氛下，将芝麻酚(5.6g，40mmol)在乙酸酐(20mL)中的溶液冷却至0℃。向溶液中缓慢添加三氟化硼/乙醚复合物(10mL)，然后将混合物在90℃下搅拌3小时。将所得混合物添加到饱和乙酸钠水溶液(50mL)中，并且在室温下搅拌。通过过滤去除形成的固体，在减压下蒸发溶剂，并且将残余固体悬浮在甲醇中，从而洗涤，然后通过过滤收集并干燥，以获得2(5.850g，80％)。
合成8-羟基-6H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]色烯-6-酮(3)的程序：
在氮气气氛下向2(5g，1当量)在碳酸二乙酯(80mL)中的溶液中添加氢化钠(2.66g，4当量)，并且将混合物在0℃下搅拌30min。将所得溶液在100℃下加热3h，然后冷却至0℃，并且小心添加50％水性MeOH(10mL)。在用乙醚(3×100mL)萃取后，用2N盐酸将反应混合物酸化至pH 2，并且过滤沉淀的固体并在真空下干燥，以获得3(4.9g，85％)。
合成三氟甲磺酸6-氧代-6H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]色烯-8-基酯(4)的程序：
在0℃下在10分钟内将三氟甲磺酸酐(4.3mL，1.3当量)逐滴添加到3(4g，1当量)和三乙胺(3.5mL，1.3当量)在无水二氯甲烷(30mL)中的溶液中。然后将混合物在室温下搅拌12h。此后，用50％乙醚∶己烷稀释混合物，并且通过短硅胶垫过滤，将滤液浓缩成残余物，将其通过快速色谱法纯化，以得到对应的产物4(4.6g，70％)。
合成8-(8-溴辛-1-炔-1-基)-6H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]色烯-6-酮(5)的程序：
在高真空下火焰干燥圆底烧瓶。冷却后，添加香豆素4(1.0g，1当量)、PdCl2(PPh3)2(207mg，0.1当量)、CuI(56mg，0.1当量)、乙腈(10mL)、三乙胺(0.61mL，1.5当量)和8-溴辛烯(0.838g，1.5当量)。将反应混合物在60℃下搅拌过夜。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物冷却，用乙酸乙酯(20mL)稀释，并且通过短硅胶床过滤。将滤液浓缩成残余物，将其用快速色谱法纯化，以得到对应的产物5(0.790g，70％)。
合成8-(8-溴辛基)-6H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]色烯-6-酮(6)的程序：
使充分搅拌的香豆素5(0.7g)在甲醇中的混合物以1mL/min、40℃和40巴的压力通过装有10％ Pd/C的H-Cube反应器。在反应完成后，在减压下蒸发溶剂，以得到对应的产物6(0.641g，90％)。
合成4-(8-溴辛基)-6,7-二羟基-2H-色烯-2-酮(7)的程序：
将8-(8-溴辛基)-6H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]色烯-6-酮6(0.6g，1.0当量)溶解在50mL圆底烧瓶中的干燥DCM(15mL)中，并且将混合物冷却至-78℃。缓慢逐滴添加BBr3(1.0M在DCM中，4eq当量)。使反应物升温至室温并搅拌12h。添加MeOH(2mL)，随后再搅拌15分钟，并且在真空下去除溶剂。将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，以得到呈黄色固体状的7(0.425g，73％)。
合成(8-(6,7-二羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)辛基)三苯基鏻(8)的程序：
向化合物7(0.2g，1当量)在无水DMF(6ml)中的搅拌溶液中添加三苯基膦(0.156g，1.1当量)并将所得混合物在氮气气氛下加热至120℃保持12h。在反应完成后，在减压下完全蒸馏出DMF，以获得粗产物。用己烷和乙醚洗涤粗产物几次，以得到呈黄色固体状的8(0.240g，80％)。
合成4-(8-溴辛基)-6,7-二甲氧基-2H-色烯-2-酮(9)的程序：
向化合物7(0.2g，1当量)在10ml无水丙酮中的溶液中添加K2CO3(0.302g,4当量)和MeI(0.308g，4当量)。将上述混合物在室温下搅拌6h。在TLC显示反应完成后，过滤反应混合物并在真空下通过蒸发去除溶剂以得到粗产物，随后进行色谱法，以得到呈黄色固体状的9(0.165g，76％)。
合成(8-(6,7-二甲氧基-2-氧代-2H-色烯-4-基)辛基)三苯基鏻(10)的程序：
向化合物9(0.120g，1当量)在无水DMF(6ml)中的溶液中添加三苯基膦(0.087g，1.1当量)并将所得混合物在氮气气氛下加热至120℃保持12h。在反应完成后，在减压下完全蒸馏出DMF，以获得粗产物。用己烷和乙醚洗涤粗产物几次，以得到呈黄色固体状的10(0.127g，72％)。
合成辛基三苯基鏻(12)的程序：
向化合物11(0.2g，1当量)在无水DMF(6ml)中的溶液中添加三苯基膦(0.298g，1.1当量)并将所得混合物在氮气气氛下加热至120℃保持12h。在反应完成后，在减压下完全蒸馏出DMF，以获得粗产物。用乙酸乙酯和乙醚洗涤粗产物几次，以得到呈无色液体状的12(0.277g，71％)。
所有化合物都通过1H NMR光谱得到确认。
实施例2-4的材料和方法
细胞培养：
使MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞系，ATCC)和MCF-10A细胞(正常乳腺上皮细胞，ATCC)在含有10％ FBS、1％(v/v)丙酮酸钠(100mM)、碳酸氢钠(26mM)、L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle's medium；DMEM)中生长。将细胞在37℃下在5％ CO2和95％空气的环境湿度中维持在培养箱中。
透射电子显微镜(TEM)：
在Tecnai T12显微镜(FEI)上在120kV下进行透射电子显微镜研究，并且使用SISCCD照相机拍摄图像；样品用钼酸铵在200目或400目涂碳铜网(Ted Pella,Inc.)上进行负性染色。在记录显微照片之前，将栅格风干。
扫描电子显微镜(SEM)：
在Carl Zeiss SIGMA HD场发射扫描电子显微镜上进行Mito-Esc纳米颗粒的场发射扫描电子显微镜(FESEM)分析。
Mito-Esc纳米颗粒的尺寸和表面电荷测量：
通过光子相关光谱和Zetasizer 3000HSA(Malvern,UK)上的电泳迁移率来测量Mito-Esc纳米颗粒的尺寸(流体动力学直径)和表面电荷(ζ电势)。在去离子水中测量所述尺寸，其中样品折射率为1.33，粘度为0.88cP，温度为25℃。一式三份地测量所述尺寸。使用以下参数测量ζ电势：粘度，0.88cP；介电常数，78.5；以及温度，25℃。
琼脂糖凝胶电泳阻滞测定：
用琼脂糖凝胶(1.5％w/v)在tris-乙酸盐-EDTA缓冲液(40mM)中进行凝胶电泳，添加一滴溴化乙锭(EtBr储备溶液的浓度：0.625mg/ml在H2O中)，在100V下进行30分钟。通过以所述的P+/P-比率将siRNA与Mito-Esc、米托-异东莨菪素和辛基TPP阳离子复合来制备siRNA脂复合物。在添加到孔中之前，将样品在室温下温育30分钟。siRNA带在365nm的UV照射下是可见的。
Mito-Esc和Mito-Esc/siRNA复合物的细胞毒性：
为了评估Mito-Esc或Mito-Esc脂复合物与siMnSOD的细胞毒性，使用了台盼蓝染料排斥测定。简言之，将细胞以3×104个细胞/孔的密度接种在12孔板中并在转染前培养过夜。用0.5mL新鲜的无血清DMEM替换培养基。将siMnSOD(40nM)与用于对照的lipofectamine-2000或与在无血清DMEM培养基中的2.5μM Mito-Esc复合30分钟，然后添加到板中。将细胞温育48小时，并且在实验结束时，将细胞用胰蛋白酶消化，以800g离心2min并重悬于1mL新鲜培养基中。将细胞悬浮液(10μl)与等量的台盼蓝混合并使用自动细胞计数器(Countess,Life Technologies)计数。
蛋白质印迹：
在处理结束时，在含有蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物-2、3的RIPA缓冲液中裂解细胞沉淀。通过SDS-PAGE解析蛋白质，并且将其印迹到硝酸纤维素膜上并用5％牛血清白蛋白封闭，洗涤并与一级抗体(1:1000)在4℃下一起温育过夜然后洗涤膜并与抗兔/小鼠IgG辣根过氧化物酶连接的二级抗体(1:5000)一起温育1h。在用化学发光系统(Bio-Rad)显影之前，将ECL试剂(Amersham GE)涂在膜上。
MnSOD siRNA转染：
以3×104个细胞/孔的密度在12孔板中培养细胞(使用前一天含有盖玻片)。简而言之，荧光siRNA或siMnSOD(40nM)与作为阳性对照的lipofectamine-2000或与在无血清DMEM培养基中的Mito-Esc(2.5μM)复合30分钟，然后添加到板中。在将细胞与siRNA复合物温育6h后，去除培养基，并且用1mL含有10％ FBS的新鲜DMEM培养基替换，并且将细胞进一步温育24h。
共焦显微成像：
简而言之，将MDA-MB-231细胞以3×104个细胞/孔的密度接种在12孔板中的盖玻片上的1mL完全DMEM中并培养12h。将荧光(Cy-5)siRNA与lipofectamine-2000(阳性对照)或与Mito-Esc(2.5μM)或亲本七叶亭(2.5μM)或与不同的阳离子脂质在无血清DMEM培养基中复合30min，然后添加到板中。将这些脂复合物添加到细胞中并温育6h。之后，将细胞用PBS洗涤两次并用4％多聚甲醛固定15min。最后，安装载玻片并使用共焦显微镜对细胞成像。如上所述制备具有Mito-Esc脂复合物的荧光标记的siRNA并与MDA-MB-231细胞一起温育24h。用DAPI对细胞进行染色，以对细胞核进行染色。将细胞固定并在共焦显微镜下观察(Olympus,Tokyo,Japan)。
实施例2：Mito-Esc对乳腺癌细胞活力的影响
用Mito-Esc和Esc处理MDA-MB-231乳腺癌细胞和MCF-10A(正常乳腺上皮细胞)。虽然Mito-Esc在1.5-7.5μM范围内显著导致MDA-MB-231细胞的剂量依赖性细胞死亡，但亲本七叶亭(Esc)在50μM范围内诱导细胞毒性(图1A和图1B)。
有趣的是，Mito-Esc在任何所指示浓度(5-50μM)下都没有在正常乳腺上皮细胞(诸如MCF-10A细胞)中表现出任何明显的毒性(图1C)。从而显示Mito-Esc优先在癌细胞中诱导抗增殖作用。发现与MCF-10A细胞相比，Mito-Esc在MDA-MB-231乳腺癌细胞的线粒体部分中积累显著更多。乳腺癌细胞中Mito-Esc积累的增加诱导了线粒体超氧化物产生的增加，这反过来使线粒体膜电位去极化，导致乳腺癌细胞死亡。
据信癌细胞中Mito-Esc摄取的增强；包括乳腺癌细胞，可能是由于与正常细胞相比，癌细胞具有更高的超极化膜电位(ΨIM)。离域阳离子(DLC)很容易渗透到癌细胞的细胞内区室中。此外，与正常细胞(约-140mV)相比，癌细胞的超极化线粒体膜电位(约-220mV)导致DLC在线粒体部分中更高的积累。这种现象在siRNA疗法中非常重要，以最大化抗增殖效果，与抗癌相关的SiRNA结合，优先诱导癌细胞中的细胞毒性。
因此，与正常细胞相比，Mito-Esc在癌细胞中积累更多，从而在明显较低的浓度下优先导致癌细胞死亡。
实施例3：Mito-Esc对不同癌细胞系中的活力的影响：
通过用Mito-Esc(0.5-100μM)处理24小时，测定Mito-Esc对不同癌细胞系HeLa(子宫颈)、HepG2(肝脏)、MCF-7(ER+ve乳腺)、A549(肺)、DU-145(前列腺)癌细胞和MCF-10A(正常乳腺上皮细胞)的细胞毒性，并且通过磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B)测定测定细胞活力。
尽管如表1中所示，Mito-Esc显著引起HeLa(子宫颈)、HepG2(肝脏)、MCF-7(ER+ve乳腺)、A549(肺)细胞的剂量依赖性细胞死亡，但其在正常乳腺上皮细胞(诸如MCF-10A细胞)中未显示任何显著的毒性。从而显示Mito-Esc优先在癌细胞中诱导抗增殖作用。
表1
实施例4：Mito-Esc自组装成纳米颗粒：
探索了Mito-Esc的自组装特性。使用动态光散射(DLS)测量Mito-Esc的水溶液(1％ EtOH)的粒径。Mito-Esc形成尺寸为166±30nm并且表面电荷为33±0.4mV的纳米尺寸颗粒(图2A)。通过扫描和透射电镜分别研究了Mito-Esc的自组装纳米颗粒的尺寸和形貌。Mito-Esc形成<200nm的球形纳米颗粒(图2B和图2C)。这个发现指示Mito-Esc可以在水溶液中实现自组装结构。
实施例5：体内原位肿瘤模型：
将MDA-MB-231细胞接种到SCID小鼠的乳腺脂肪垫中：实验使用6周龄雌性SCID小鼠。最初，通过在1.5mL微量离心管中预混合10μL每种组分A和组分B并在室温下温育5分钟来制备10nM Qtracker标记溶液(Qtracker细胞标记试剂盒，Invitrogen Q25071MP)。将这种混合物添加到0.2mL新鲜的完全生长培养基中并涡旋30秒，并且添加到含有MDA-MB-231细胞的75-cm2组织培养瓶中，并且在37℃、5％ CO2培养箱中温育过夜。收集亚汇合的标记细胞并计数。
将细胞(1×106个)悬浮在0.1ml无血清培养基中。向其中添加0.1ml基质胶并轻轻混合以获得均匀的细胞悬浮液。用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(50μL/20g小鼠)麻醉SCID小鼠，并且将上述1×106个Q-Tracker标记的MDA-MB-231细胞原位植入每只小鼠的第4对乳房脂肪垫中并在接种细胞后缝合脂肪垫。切口部位每天用聚维酮碘包扎以防止感染，直至切口愈合。检查小鼠以观察肿瘤的发展，并且一旦肿瘤体积达到≥300mm3，就开始治疗。将小鼠称重并分成4组(每组4只)，并且腹膜内(i.p)施用七叶亭(6mg/kg.bd.wt)或米托-七叶亭(3和6mg/kg.bd.wt)两周。处死当天，用游标卡尺测量肿瘤体积。使用颈椎脱臼法麻醉并处死小鼠。小心地切除肿瘤，称重并保存在液氮中以用于进一步的组织病理学分析。
实施例6：Mito-Esc作为有效的siRNA递送载体：
用于琼脂糖凝胶电泳阻滞测定的Mito-Esc/siRNA复合作用：
根据期望的最终P+:P-电荷比，以不同浓度制备Mito-Esc纳米颗粒溶液。制备二十微升Mito-Esc/siRNA复合物的溶液以在每种溶液中保持恒定量的siRNA(1μg在10μL中)，并且根据P+:P-电荷比改变Mito-Esc的量。将制备的混合物轻轻涡旋5分钟并在室温下温育30分钟以形成复合物。将1μg siRNA与2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、14μgMito-Esc复合，分别得到1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1的P+:P-电荷比。
Mito-Esc结合siRNA的效率：
通过琼脂糖凝胶电泳检测Mito-Esc结合siRNA的效率。此外，为了评估氢键在形成稳定的siRNA复合物中的重要性，通过用甲基保护二羟基来合成米托-异东莨菪素。辛基TPP阳离子用作阴性对照。
在早期的发现中，发现只有Mito-Esc能够以4:1至7:1的P+/P-电荷比结合siRNA，这反过来延缓了siRNA迁移(图2D)。相比之下，米托-异东莨菪素和辛基TPP不结合siRNA，如它们甚至在7:1P+/P-电荷比下也不能延迟siRNA迁移所证明。这些结果指示，Mito-Esc中二羟基取代的存在促进了自组装纳米颗粒的形成以及与siRNA形成稳定的复合物。
然而，在进一步的实验中，我们现在发现Mito-Esc以及米托-异东莨菪素分别以4:1至7:1和6:1至7:1的P+/P-电荷比结合siRNA，从而延缓siRNA迁移(图2E)。相比之下，辛基TPP再次没有结合siRNA，如它甚至在7:1的P+/P-电荷比下也不能阻止siRNA迁移所证明。这些结果指示氢键不参与形成稳定的siRNA复合物。
在MDA-MB-231乳腺癌细胞中测试了Mito-Esc作为siRNA递送载体的效率。用定制的MnSOD siRNA序列形成脂复合物。需要注意的是，乳腺癌细胞中MnSOD水平的减少会引起抗增殖作用。将MDA-MB-231细胞在含有减少的血清(约2％)的Opti-MEM培养基中用脂复合物处理6小时，之后，用含有血清的培养基(10％血清)替换培养基，再处理48小时，并且通过台盼蓝染料排斥法测量细胞活力。同时，siMnSOD也与lipofectamine-2000(阳性对照)复合。发现与siMnSOD复合的Mito-Esc在MDA-MB-231细胞中诱导94％的细胞死亡，而Lipofectamine-2000和siMnSOD复合物诱导66％的细胞死亡(图3A)。
此外，通过免疫印迹，Mito-Esc/siMnSOD复合物和lipofectamine-2000/siMnSOD复合物的基因沉默效率显著降低MnSOD蛋白水平至相似的程度。相比之下，无论是亲本七叶亭还是辛基TPP阳离子复合物都不能降低MnSOD的表达(图3B)。这些结果表明，Mito-Esc不仅优先诱导乳腺癌细胞死亡，而且具有与siRNA形成稳定复合物的所有结构要求。因此，Mito-Esc成功地递送了治疗性siRNA，并且最大化了乳腺癌细胞中的细胞毒性潜力，从而证明Mito-Esc作为有效的siRNA递送载体。
通过使用荧光标记的Cy-5siRNA的共焦成像技术进一步验证MDA-MB-231和MCF-10A细胞中siRNA与Mito-Esc聚集体的细胞内递送。与图3中所示的结果一致，如同Lipofectamine-2000，Mito-Esc显著引起Cy-5siRNA的细胞内递送(图4；蓝色荧光)。值得注意的是，在非癌性乳腺上皮细胞系MCF-10A中，Mi-to-Esc介导的siRNA递送的效率低于Lipofectamine-2000，从而指示Mito-Esc的潜在癌细胞选择性siRNA递送(图5)。相反，亲本七叶亭、米托-异七叶亭和辛基TPP不能在细胞内递送Cy-5siRNA，可能是因为它们不能与siRNA形成稳定的复合物。这些结果证实了Mito-Esc作为有效的siRNA传递载体。
Claims (55)
1.一种6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物。
2.如权利要求1所述的复合物，其中所述6,7-二羟基香豆素鏻两亲物选自：
其中，
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
3.如权利要求1所述的复合物，其中所述复合物是式I化合物：
其中，
Z是带负电荷的剂；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
4.如权利要求1所述的复合物，其中所述复合物是式II化合物：
其中，
X是C1至C30碳链；
Z是带负电荷的剂；并且
R是氢、一个或多个取代的烷基、一个或多个取代的芳基或一个或多个取代的杂原子。
5.如权利要求1所述的复合物，其中所述复合物是式III化合物：
其中，
Z是带负电荷的剂。
6.如权利要求1至5所述的复合物，其中所述带负电荷的剂选自治疗剂、诊断剂或核酸。
7.如权利要求6所述的复合物，其中所述核酸选自小干扰RNA(SiRNA)和信使RNA(mRNA)。
8.如权利要求1至7所述的复合物，其中所述复合物呈纳米颗粒的形式。
9.一种治疗、改善或诊断癌症的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求1至7所述的复合物。
10.如权利要求1至7所述的复合物，其用于治疗或诊断癌症。
11.一种药物组合物，其包含如权利要求1至7所述的复合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
12.一种药物组合物，其包含Mito-Esc和siRNA与药学上可接受的载体或赋形剂的复合物，其中Mito-Esc由式VI化合物表示：
13.如权利要求11至12所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
14.一种细胞内递送带负电荷的剂的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求1至7所述的复合物。
15.一种细胞内递送带负电荷的剂的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求11至12所述的药物组合物。
16.一种Mito-Esc和siRNA的复合物，其中Mito-Esc由式VI化合物表示：
17.一种纳米颗粒，其包含6,7-二羟基香豆素鏻两亲物和带负电荷的剂的复合物。
18.如权利要求17所述的纳米颗粒，其中所述6,7-二羟基香豆素鏻两亲物选自式IV、V或IV的化合物：
其中，
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
19.如权利要求17所述的纳米颗粒，其包含式I化合物的复合物：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
20.如权利要求17所述的纳米颗粒，其包含式II化合物的复合物：
其中，
X是C1至C30碳链；
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子；并且
R是氢、一个或多个取代的烷基、一个或多个取代的芳基或一个或多个取代的杂原子。
21.如权利要求17所述的纳米颗粒，其包含式III化合物的复合物：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子。
22.如权利要求17至21所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的剂选自治疗剂、诊断剂或核酸。
23.如权利要求22所述的纳米颗粒，其中所述核酸选自小干扰RNA(SiRNA)和信使RNA(mRNA)。
24.如权利要求17至21所述的纳米颗粒，其中所述带负电荷的抗衡离子选自卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根。
25.如权利要求17至24所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有100nm至200nm的尺寸。
26.如权利要求17至24所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有30mV至40mV的表面电荷。
27.一种治疗、改善或诊断癌症的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求17至26所述的纳米颗粒。
28.如权利要求17至26所述的纳米颗粒，其用于治疗或诊断癌症。
29.一种药物组合物，其包含如权利要求17至26所述的纳米颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂。
30.一种药物组合物，其包含纳米颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂，其中所述纳米颗粒包含Mito-Esc和siRNA的复合物，并且其中Mito-Esc由式VI化合物表示：
31.如权利要求29至30所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
32.一种细胞内递送带负电荷的剂的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求17至26所述的纳米颗粒。
33.一种细胞内递送带负电荷的剂的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求29至30所述的药物组合物。
34.一种纳米颗粒，其包含Mito-Esc和siRNA的复合物，其中Mito-Esc由式VI化合物表示：
35.一种式I化合物：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S。
36.一种式II化合物：
其中，
X是C1至C30碳链；
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子；并且
R是氢、一个或多个取代的烷基、一个或多个取代的芳基或一个或多个取代的杂原子。
37.一种式III化合物：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子。
38.如权利要求35至37所述的化合物，其中所述带负电荷的剂选自治疗剂、诊断剂或核酸。
39.如权利要求38所述的化合物，其中核酸选自小干扰RNA(SiRNA)和信使RNA(mRNA)。
40.如权利要求35至37所述的化合物，其中所述带负电荷的抗衡离子选自甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根。
41.一种治疗、改善或诊断癌症的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求35至40所述的化合物。
42.如权利要求35至40所述的化合物，其用于治疗或诊断癌症。
43.一种药物组合物，其包含如权利要求35至40所述的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
44.一种药物组合物，其包含式III化合物：
其中，Z是siRNA；
以及药学上可接受的载体或赋形剂。
45.如权利要求43至44所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
46.一种细胞内递送带负电荷的剂的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求35至40所述的化合物。
47.一种细胞内递送带负电荷的剂的方法，其中所述方法包括施用有效量的如权利要求43至44所述的药物组合物。
48.一种式III化合物：
其中，
Z是siRNA。
49.一种式I化合物，
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子；
R是氢、取代的烷基、取代的芳基或取代的杂原子；
R1是芳基、环烷基或杂芳基；
X是包括一个或多个双键或三键的C1至C30碳链，未被取代或被烷基、烯基或炔基侧链取代，或
–(CH2)p-R2-(CH2)n-，或
–(CH2)2-R2-(CH2)2-R2-(CH2)m-；
其中，
p是2或3，n是3至6的整数，并且m是2至4的整数；并且
R2是O、NH或S；
其用于治疗癌症。
50.一种式II化合物：
其中X是C1至C30碳链；
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子；并且
R是氢，
其用于治疗癌症。
51.一种式III化合物：
其中，
Z是带负电荷的剂或带负电荷的抗衡离子；
其用于治疗癌症。
52.如权利要求49至51所述的化合物，其中所述带负电荷的剂选自治疗剂、诊断剂或核酸。
53.如权利要求52所述的化合物，其中核酸选自小干扰RNA(SiRNA)和信使RNA(mRNA)。
54.如权利要求49至51所述的化合物，其中所述带负电荷的抗衡离子选自卤化物、甲磺酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、酒石酸根、苹果酸根、乙酸根和三氟乙酸根。
55.如权利要求49至51所述的化合物，其中癌症选自乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、三阴性乳腺癌和ER+ve乳腺癌。
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