CN117384893A - N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及转化制备氨基葡萄糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明属于生物催化技术领域，通过异源表达技术和金属螯合亲和层析技术表达并纯化分散泛菌Pantoea dispersa中N‑乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，为工业上获得Pd‑nagA酶提供了来源，并验证了该基因编码的N‑乙酰葡萄糖脱乙酰酶具有明确的GlcNAc转化酶活性。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，尤其涉及N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及转化制备氨基葡萄糖的方法。
背景技术
氨基葡萄糖(GlcN)又称葡萄糖胺，其分子式为C6H13NO5，是一种葡萄糖分子的侧链被氨基取代的单糖，在自然界中广泛存在并被广泛应用于食品和医疗等领域。在保健食品和食品防腐领域，GlcN可作为提高人类骨质密度的营养补充剂，并对食品中常见的多种菌均有明显的抗菌作用。在医疗保健领域，GlcN可以帮助修复和维护受损的软骨，并能刺激软骨细胞的生长；此外，实验表明GlcN可提高肝脏主要抗氧化酶的活性，并降低AST、ALT以及丙二醛(MDA)的含量。
随着人们对GlcN的了解程度增加，其需求量快速增长，所以迫切需要商业制备GlcN的方法。GlcN是由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)作为底物，通过GlcNAc的侧链乙酰键的脱除来制备得到的。传统的制备GlcN方法是以虾蟹的壳作为原材料，通过酸水解法制备，但存在耗时长、可能存在过敏原及环境污染等不足。微生物全细胞发酵法生产GlcN是通过定向改造体内氨基葡萄糖有关代谢酶系，敲除微生物体内分解代谢GlcN的酶系来实现其在微生物体内的积累，最终达到增产的目的。然而，GlcN本身的积累对工程菌有一定毒性的，从而制约了微生物全细胞发酵法的商业化应用；此外，由于GlcNAc和GlcN的强极性特性，难以从布满盐离子的微生物培养液分离出来，得到的产物纯度有待考量。
与酸水解法和微生物全细胞发酵法制备GlcN相比，单酶催化GlcNAc底物转化得到GlcN则具有避免由虾蟹壳水解带来的过敏原、安全性好和产物纯度较高等优点。单酶催化GlcNAc底物生成GlcN是由N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(N-acetylglucosaminedeacetylase,nagA)发挥作用的，通过催化底物的乙酰基断裂生成产物和醋酸。中国专利申请CN 110951708 A公开了一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用；也有相关文献报道了Escherichia coli(GenBank:ACI86720.1)、Bacillus subtilis(GenBank:AOR99870.1)、Vibrio cholerae(GenBank:MUK01244.1)、Thermotoga maritima(GenBank:AKE30469.1)、Cyclobacterium qasimii(GenBank:WP_020891027)、Cyclobacteriummarinum(GenBank:WP_149392827)、Thermococcus kodakaraensis(GenBank:AB125969.1)和Thermococcus sp.(GenBank:ASA78499.1)等GlcNAc脱乙酰酶基因，并进行了表达和催化性能相关研究，但尚难以实现商业化制备和应用。因此，出于开发新酶资源及加快酶资源产业化应用的目的，迫切需要加强N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其催化转化方面的研究。
发明内容
在前期研究(具体内容可参见中国专利申请202311174985.5)筛选得到分散泛菌Pantoea dispersa DJL-B(于2022年4月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62372)的基础上，本发明进一步筛选得到源自分散泛菌Pantoea dispersaDJL-B的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因(简称为Pd-nagA)，采用原核蛋白的异源表达技术和金属螯合亲和层析技术(Ni-NTA)实现了Pd-nagA在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶表达和纯化，为工业上获得Pd-nagA酶提供了来源，并验证了该基因编码的N-乙酰葡萄糖脱乙酰酶具有明确的GlcNAc转化酶活性。此外，本发明率先发现金属离子Co2+对源自分散泛菌的Pd-nagA酶的酶活具有明显的促进作用，并通过基因定点突变技术验证了Pd-nagA酶的关键催化氨基酸位点以及金属离子配位残基，为工业上由Pd-nagA单酶催化GlcNAc制备GlcN提供有效思路。基于上述发现，从而完成本发明。
原核蛋白的异源表达是将插入外源基因的质粒导入例如大肠杆菌的工程菌中进行稳定遗传和转录表达目的蛋白；大致的实验步骤：首先将目的基因从微生物全基因组中通过PCR的方法获得，将目的基因片段与pGEM-T载体用T4连接酶过夜连接完成TA克隆，TA连接产物热激转化DH5α宿主菌，平板活化涂布后进行蓝白班筛选，将测序正确的阳性克隆子与pET-28a表达载体分别进行双酶切和琼脂糖凝胶电泳纯化，将带有相同粘性末端的片段和pET-28a表达载体用T4 DNA连接酶连接后热激转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，最后加入一定浓度的诱导剂IPTG使得大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌大量表达目的蛋白，最后获得带有组氨酸标签(His-tag)的重组目的蛋白质。His-tag重组蛋白质的纯化是采用Ni-NTA纯化方法进行的。由于6×His重组蛋白能够特异性的Ni2+结合，而Ni2+被螯合在侧链NTA柱上，当含有His-tag的重组蛋白液流经Ni-NTA柱时，与杂蛋白不同，重组蛋白被挂在柱子上不会被洗涤液洗涤下来，洗涤数次除杂蛋白后再用含有咪唑的洗脱液过柱，咪唑是与组氨酸竞争结合Ni2+原子的，与Ni2+的结合能力大于His-tag重组酶，此时His-tag蛋白会被洗脱收集下来，以此实现对重组蛋白的浓缩和纯化。
定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。突变某一个氨基酸位点前，要首先设计带有突变位点引物，随后采用合适的PCR程序完成全质粒在体外的扩增，得到的产物经过特异性识别Dam+位点的DpnI酶消化模板质粒，体系保留的突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行多拷贝，最后通过一定浓度的IPTG诱导表达获得想要的突变酶。
一个方面，本发明提供一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，其氨基酸序列为：MYALVNGRIFTGDEVLDNHVVVIDGGVIARVCPREALESAIPQQDMAGAFIAPGFIDLQLNGCGGVQFNDDLAALSIETLETMQRANVKSGCTSFLPTLITSSDALMKRAVETMRAYLAKHQHQALGLHLEGPWLNKAKKGTHNPELIRLPDPALVNFLCDNADVITKVTLAPEQAGGDVIRQLCDAGIIVSAGHSNATFNEAKAGIRAGVSFATHLYNAMAAFSGREPGLIGALFDSPDVYCGIIADGLHVNYANVRNAKRIKGDKLVLVTDATAPAGASIDQFIFAGKTIYYRDGLCVDENGTLSGSALTMIEAVQNSVEHCGIALDEALRMATLYPARAMGVDKQFGSVTAGKVANLTVFTRDYQITKTFVNGENVLSE，即SEQ ID NO：1。
优选地，所述的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，由源自分散泛菌Pantoea dispersaDJL-B的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因编码得到；所述分散泛菌Pantoea dispersa DJL-B保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62372。
此外，所述的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶在转化制备氨基葡萄糖中的应用。
另一方面，本发明还提供一种转化制备氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：配制含N-乙酰氨基葡萄糖底物和Co2+的缓冲溶液，加入所述的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶或含所述的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的粗酶液进行催化转化，得到氨基葡萄糖。
优选地，所述Co2+的浓度为2.5-10mmol/L。
更优选地，所述Co2+的浓度为5mmol/L。
优选地，所述N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为3-7g/L。
更优选地，所述N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为5g/L。
优选地，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液，其pH为7.2-8.0。
优选地，所述催化转化的温度为40-48℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明通过异源表达技术和金属螯合亲和层析技术表达并纯化分散泛菌Pantoea dispersa DJL-B中N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，为工业上获得Pd-nagA酶提供了来源，并验证了该基因编码的N-乙酰葡萄糖脱乙酰酶具有明确的GlcNAc转化酶活性。
(2)本发明率先发现金属离子Co2+对源自分散泛菌的Pd-nagA酶的酶活具有明显的促进作用，并通过基因定点突变技术验证了Pd-nagA酶的关键催化氨基酸位点以及金属离子配位残基，为工业上由Pd-nagA单酶催化GlcNAc制备GlcN提供有效思路。
附图说明
图1Pd-nagA酶的异源表达和纯化SDS-PAGE图谱；其中，1A为Pd-nagA酶在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达后破碎上清液条带的验证结果图；1B为Pd-nagA酶的His标签纯化验证结果图。
图2Pd-nagA酶与GlcNAc反应0.5～14小时的薄层色谱图及GlcN产量图；其中，2A为薄层色谱图；2B为GlcN产量图。
图3Pd-nagA酶的最适pH值、最适温度、pH稳定性和热稳定性图；其中，3A为Pd-nagA酶的最适pH值图；3B为Pd-nagA酶的最适温度图；3C为Pd-nagA酶的pH稳定性图；3D为Pd-nagA酶的热稳定性图。
图4不同添加剂对Pd-nagA酶活性的影响结果图；其中，4A为去污剂类添加剂；4B为还原剂类添加剂；4C为辅酶类添加剂。
图5不同菌株来源的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的催化原理示意图及系统发育树关系图；其中，5A为催化原理示意图；5B为系统发育树关系图。
图6Pd-nagA酶与4种相似度高的脱乙酰酶的多序列比对分析图。
图7Pd-nagA酶与GlcNAc的对接分析结果图；其中，7A为Pd-nagA酶与GlcNAc的Autodock-Vina对接结果图；7B为D273残基与底物的位置关系以及水分子参与催化机制示意图。
图8Pd-nagA酶D273位点的定点突变的测序及验证结果图；其中，8A为部分测序结果图；8B为PCR验证、双酶切验证以及诱导表达SDS-PAGE图。
图9Pd-nagA酶(突变前)与D273位点突变型酶转化GlcNAc生成GlcN量的对比图。
图10不同金属离子及不同浓度Co2+对Pd-nagA酶活的影响结果图；其中，10A为不同金属离子对酶活影响结果图；10B为不同浓度Co2+对酶活影响结果图。
图11突变位点E131A和H195A的突变质粒测序结果图；其中，11A为E131A突变序列与原始序列测序对比图；11B为H195A突变序列与原始序列测序对比图。
图12使用Pymol显示Pd-nagA酶与GlcNAc的对接结果图。
图13 H195A和E131A突变对GlcNAc催化转化为GlcN的影响结果图。
分散泛菌Pantoea dispersaDJL-B于2022年4月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62372，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间为2022年4月11日。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所涉及的材料均为常规市售产品，或可通过保藏中心、本领域的常规技术手段获得。本发明中，如未明确指出，百分含量为质量百分含量；M指mol/L，mM指mmol/L。
实施例1来源于分散泛菌Pd-nagA酶的异源表达和纯化
将分散泛菌Pantoea dispersa DJL-B进行过夜活化后采用试剂盒提取全基因组，用Pd-nagA的特异性正向全长引物nagA-FF(CGGAATTCATGTACGCATTAGTTAACGGCCG，即SEQ IDNO：2)和反向全长引物nagA-FR(TAAAGCGGCCGCTTACTCGCTGAGGACGTTGTCTC，即SEQ ID NO：3)进行PCR反应获得目的Pd-nagA基因片段，将带有A尾的Pd-nagA基因进行琼脂糖凝胶电泳纯化后，切胶回收Pd-nagA片段将其与pGEM-T载体连接后转化EcoliDH5α，完成TA克隆。筛选白色的阳性克隆菌落，经过测序验证后提取质粒分别与pET-28a(+)空载体进行NotI和EcoRI限制性核酸内切酶消化3.5h，将带有酶切位点的Pd-nagA基因片段与线性化pET-28a(+)通过T4DNA连接酶16℃过夜连接；连接产物通过热激法转化E coli BL21(DE3)。进行诱导表达实验，阳性克隆子在含有卡那霉素抗性的LB培养基中培养至OD至0.6后，加入终浓度为0.1mM的IPTG后在28℃下过夜诱导。将诱导后的重组细胞6000rpm离心10min以去除上清培养基成分，向菌体沉淀中加入含有0.1％曲拉通X-100和0.2mM苯甲磺酰氟的PBS缓冲液，于超声波细胞破碎仪中破碎20min(破碎条件：250W，工作2s，间隔6s，温度28℃)。将破碎的细胞10000rpm离心，沉淀为包涵体部分，上清液为可溶性重组蛋白Pd-nagA，重组蛋白的表达情况通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。将破碎后的上清液(含有可溶性蛋白His-tag蛋白)用Ni-NTA琼脂糖柱进行金属离子螯合亲和层析纯化，获得大量的纯化蛋白。SDS-PAGE结果证明Pd-nagA酶(GenBank:QZY92211.1)是以可溶形式表达的，SDS-PAGE显示分子量大小在45kDa附近，如图1A所示，与Pd-nagA的理论分子质量40.687kDa相差不大。通过采用金属离子螯合亲和层析法纯化带有His标签Pd-nagA重组蛋白，采用碧云天生产的BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐还原螯合型)进行纯化，目标蛋白能够被咪唑成功洗脱下来，如图1B所示。
实施例2重组Pd-nagA酶的活性验证以及酶学性质表征
纯化的重组Pd-nagA酶活性的测定是通过将5g/L的GlcNAc完全溶于0.01mol/LPBS缓冲液作为底物；取1mL含GlcNAc底物的PBS缓冲液与100μL纯化Pd-nagA酶，分别在37℃预热5分钟后混合，在40℃的摇床中以120rpm进行反应0.5～14小时。反应完毕后取1μL反应液进行薄层层析法分析；同时取10μL反应液加入100μL OPA试剂(5mg OPA，5μLβ-巯基乙醇和10μL无水乙醇溶于10mL碳酸钠缓冲液，pH 10.5)，采用OPA衍生法测定衍生后产物在330nm处的吸光度。Pd-nagA酶能够催化底物GlcNAc断开乙酰基团，生成产物GlcN。薄层色谱图显示在底物GlcNAc浓度为5g/L，反应温度为37℃的PBS(pH＝7.4)缓冲液反应时，GlcN的生产量由低到高再逐渐降低，如图2A所示；GlcN的产量在7h时达到最大值，以此作为零界点，8～14小时产量逐渐降低，如图2B所示。
(1)Pd-nagA酶的最适pH值、最适温度、pH稳定性和温度稳定性参数测定
纯化后的重组Pd-nagA酶的相对酶活随着缓冲液pH值的增加先增后减，在pH值为9时达到最大，随着pH值的增加至10时，活性开始降低，如图3A所示；酶最适温度在45℃，如图3B所示。酶的pH稳定性测定是将Pd-nagA酶与pH4～8的Na2PO4-柠檬酸缓冲液和pH9～10的硼砂-NaOH缓冲液预混在一起，于4℃放置24小时后，置于40℃反应7h。酶的热稳定性的测定是将Pd-nagA酶放置在4～80℃的环境下处理15～60分钟后，置于40℃反应7h。重组Pd-nagA酶在强酸和强碱环境下孵育1小时后活性会大大降低，中性条件保持下稳定；研究表明强酸或者强碱环境可能会引起酶分子内氨基酸残基电离状态改变，进而影响酶的三维结构，如图3C所示。该酶在50℃下处理15～60min仍然能够保持40％左右的活性；反应温度过高或者过低都可能导致酶的构象和空间结构发生变化，60℃处理时，Pd-nagA酶活性显著下降，如图3D所示。
(2)不同添加剂对Pd-nagA酶活性影响测定
考察了14种化合物对Pd-nagA酶活的影响，结果如图4所示。吐温(Tween)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)和十二烷基硫酸钠(SDS)等属于去污剂类；β-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)和甘油(Glycerol)属于还原剂类；还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)等属于辅酶家族。结果显示，Tween20、Tween60和Tween80(2.5％(v/v)分别会使酶活降低至58.1％、67.5％、71.25％，相比于吐温，TritonX-100对酶的活性影响相对较少；0.1M～0.5M的尿素对酶活影响不大；SDS是一种阴离子表面活性剂，Pd-nagA酶反应体系中0.5mM和1mM的SDS均会使酶活降低约40％。在研究GSSG与GSH对Pd-nagA酶活的影响时发现，随着GSSG浓度由低到高(0.1mM～1mM)，酶活性由高变低；而随着GSH浓度增加(0.1mM～1mM)，酶活性由低变高，但相对于对照都是酶活降低。NADH和NAD+对酶活的影响最为明显，随着浓度由1mM～10mM的增加，Pd-nagA活性陡然下降；NAD+是酸性的化合物，经过实验验证发现10mM的NAD+溶于水后测定得到的pH值为2～3，高酸性的pH值可能是抑制酶活的根本原因。此外，由于NADH在碱性条件下稳定，在酸性条件下则容易分解，Pd-nagA催化生成GlcN的同时还产生了醋酸，使得体系pH值下降，NADH分解产生NAD+反过来对酶活发生抑制作用。
实施例3不同微生物来源的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的序列对比分析
本发明根据文献报道收集了来自不同菌株的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，这些酶明确了对GlcNAc这种底物具有催化断开乙酰键的功能，如图5A所示；这11种酶的系统发育树关系如图5B所示。其中，属于热球菌目(Thermococcales)的包括：来自Pyrococcushorikoshii strain OT3的Dacph(GenBank:PH_RS02325)、Thermococcus sp.strain 5-4的TSDac(GenBank:ASA78499.1)和Thermococcus kodakarensis strain的TKDac(GenBank:AB125969.1)；属于Cyclebacterium的包括：来自Cyclobacterium qasimii strain的CqCBMA(GenBank:WP_020891027)、Cyclobacterium marinum strain的CmCBDA(GenBank:WP_149392827.1)和Cyclobacterium marinum strain DSM 745的CMDac(GenBank:AEL28463.1)；从图5B可知，来源于大肠杆菌的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(GenBank：ACI86720.1)与Pd-nagA的相似度相对较高。
结合图5，将与Pd-nagA酶相似度大于等于30的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶进行ClustalX2序列比对，比对结果如图6所示。研究结果发现五种酶有很多共同的氨基酸残基(如E131、H195和D273)，推测这些氨基酸参与了底物GlcNAc的催化反应；D273号位点的氨基酸在酰胺水解酶超家族都保守，且其充当与水分子氢键结合的位点，催化底物酰胺键部位，发挥重要作用。此外，根据Phyre2网站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)的突变氨基酸敏感度分析发现，无论用什么氨基酸替代D273，都会对酶活有影响。
实施例4Pd-nagA蛋白质建模与配体相互作用
重组Pd-nagA酶与GlcNAc的分子对接进一步发现D273号氨基酸位于底物活性位点附近，如图7所示，结合多序列比对分析结果，认为在273号位置非常保守的天冬氨酸残基很有可能是酶的关键催化位点。这个推测被定点突变(SDM)加以验证，其中D273氨基酸残基被替换成了丙氨酸。经过菌液PCR、突变质粒PCR和双酶切验证，初步判断突变质粒D273A被成功构建出来，进一步生工测序结果(如图8A所示)与野生型Pd-nagA酶比较，胸腺嘧啶被成功替换为胞嘧啶(atc→agc)，构建出D273A突变型质粒。热激转化至E coli BL21(DE3)感受态细胞中，经过0.1mM IPTG过夜诱导，得到的突变酶经过酶活检测发现其活性完全丧失，如图9所示。D273A突变酶的0.1mM IPTG诱导表达SDS-PAGE图，如图8B所示。
273号天冬氨酸残基在很多酰胺酶中都非常保守，它在蛋白中可能扮演两种角色，一种是催化开始，作为一般碱从环境中的水分子中抽出氢质子，失去氢质子从而被激活的水分子亲核攻击GlcNAc底物的羰基碳原子促使断键；另一种是催化结束，作为一般酸提供氢质子给产物GlcN促使其离开活性区域。突变酶整体失活的原因很可能是因为丙氨酸打破了这种“去质子”和“加质子”反应的平衡，导致酶催化活性丧失。
实施例5Pd-nagA酶转化制备氨基葡萄糖及Co2+对Pd-nagA酶活性的影响
Pd-nagA酶转化制备氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：配制含5g/LN-乙酰氨基葡萄糖底物和5mMCo2+的PBS缓冲溶液(pH7.4)，加入0.12mgN-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶于45℃进行催化转化，得到氨基葡萄糖。
在考察不同金属离子对Pd-nagA酶活性影响时，意外发现二价钴离子对Pd-nagA酶的活性具有显著促进作用(p≤0.0001)，如图10A所示，使用Prism软件分析，与对照组相比，“****”代表p≤0.0001。进一步地，本发明还考察了不同浓度Co2+对酶活的影响，发现在0.1-5mM范围内随着钴离子的浓度增加，Pd-nagA酶活是逐渐增加的，在5mM的Co2+浓度时，相对酶活达到最大值(约为纯水对照的1.16倍)；当Co2+的浓度继续增加时，相对酶活呈略微下降趋势，如图10B所示。
在明确了Co2+对Pd-nagA酶活具有促进作用后，本发明进一步探讨参与Co2+的金属配位残基。在相关文献分析的基础上，结合分子对接结合结果发现：H195和E131氨基酸残基很可能参与了Pd-nagA酶中金属离子配位，如图12所示。从图6可知，H195和E131氨基酸残基在不同来源的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶中都高度保守，因此，本发明通过基因定点突变H195和E131进行进一步地验证。
通过突变PCR成功构建出pET-28a(+)-Pd_nagA-H195A和pET-28a(+)-Pd_nagA-E131A突变质粒，测序结果如图11所示；经过诱导表达和活性验证发现H195A和E131A突变体活性大大降低(相同反应条件下与未突变Pd-nagA酶相比GlcN产量分别损失6倍和11.4倍)，如图13所示，注：Control表示未突变Pd-nagA酶的GlcN产量；5mM Co2+和5mM EDTA，表示在Pd-nagA酶反应体系中分别加入终浓度为5mM的Co2+和EDTA；10mMCo2+treatment，表示先用5mM EDTA处理未突变Pd-nagA酶，然后加入10mM Co2+激活组；E131A，表示E131A突变体Pd-nagA酶的GlcN生产量；5mM和10mM Co2+of E131A，表示向E131A突变体酶中分别添加5mM和10mM Co2+对GlcN产量的影响；H195A，表示H195A突变体Pd-nagA酶的GlcN生产量；5mM和10mMCo2+of H195A，表示分别向H195A突变酶添加5mM和10mM Co2+对GlcN产量的影响；10mM Co2+treatment of E131A和H195A，分别表示5mM EDTA处理E131A和H195A突变体Pd-nagA酶后，在反应体系中加入10mM Co2+激活组。实验结果验证了Co2+配位键对酶活的影响是正相关的，突变Pd-nagA酶的H195和E131残基，导致Co2+无法正确的锚定在活性位点，进而无法发挥Co2+促进Pd-nagA酶的酶活的效能。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，其特征在于：由源自分散泛菌Pantoea dispersa DJL-B的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因编码得到；所述分散泛菌Pantoea dispersa DJL-B保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62372。
3.根据权利要求1或2所述的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶在转化制备氨基葡萄糖中的应用。
4.一种转化制备氨基葡萄糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：配制含N-乙酰氨基葡萄糖底物和Co2+的缓冲溶液，加入权利要求1或2所述的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶或含权利要求1或2所述的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的粗酶液进行催化转化，得到氨基葡萄糖。
5.根据权利要求4所述的转化制备氨基葡萄糖的方法，其特征在于：所述Co2+的浓度为2.5-10mmol/L。
6.根据权利要求5所述的转化制备氨基葡萄糖的方法，其特征在于：所述Co2+的浓度为5mmol/L。
7.根据权利要求4或5所述的转化制备氨基葡萄糖的方法，其特征在于：所述N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为3-7g/L。
8.根据权利要求7所述的转化制备氨基葡萄糖的方法，其特征在于：所述N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为5g/L。
9.根据权利要求4或5所述的转化制备氨基葡萄糖的方法，其特征在于：所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液，其pH为7.2-8.0。
10.根据权利要求4或5所述的转化制备氨基葡萄糖的方法，其特征在于：所述催化转化的温度为40-48℃。
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