CN117377766A - 用于治疗镰状细胞病的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗镰状细胞病的降低RIOK3的表达的核糖核苷酸药剂。

Description

用于治疗镰状细胞病的组合物和方法

相关申请交叉引用

本国际申请要求2021年5月13日提交的美国临时专利申请第63/188,320号和2021年5月14日提交的美国临时专利申请第63/188,843号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

参考以电子方式提交的序列表

根据EFS网络法律框架和37 CFR§§1.821-825(参见MPEP§2442.03(a))，与本申请同时提交了符合ASCII的文本文件形式的序列表(标题为“3000093-006977_Sequence_Listing_ST25”，创建于2022年5月4日，且大小为6,000字节)，所述序列表的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及降低由RIOK3基因编码的丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶RIO3的表达的核糖核苷酸药剂。该核糖核苷酸药剂特异性地靶向RIOK3 mRNA，防止其被翻译，降低丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶RIO3的表达，并随后降低其生物功能，并且可用作患有镰状细胞病及其并发症的患者的治疗剂。

背景技术

血红蛋白是红细胞中的氧转运金属蛋白，其包含四个蛋白亚基，这四个蛋白亚基包含两个α-珠蛋白亚基和两个β-珠蛋白亚基。α-血红蛋白由HBA1和HBA2基因编码。β-血红蛋白由HBB基因编码。在人类中，ε-珠蛋白在胚胎期期间表达，并且γ-珠蛋白在胎儿期期间表达。出生后，γ-珠蛋白表达降低，并且β-珠蛋白增加。Hardison《冷泉港医学展望(Cold Spring Harb Perspect Med)》(2012)2:a011627。

胎儿红细胞(RBC)(其含有HbF(α₂γ₂))对氧的亲和力高于成人RBC(其含有血红蛋白A(HbA；α₂β₂)，并且这有利于氧从母体转移到胎儿循环。从产生γ珠蛋白到产生β珠蛋白的转换在子宫内开始并且导致胎儿RBC群体中HbF的线性下降，使得出生时50％至95％的HbF水平在出生后六个月下降到<5％。Colombo等人《英国血液杂志(Br J Haematol)》(1976)32:79–87。

镰状细胞病(SCD)是一组遗传性红细胞病症，其特征在于在缺氧时形成“镰刀”形状的红细胞具有缩短的寿命，并且从而导致红细胞持续短缺。SCD的临床并发症包括急性和慢性疼痛、感染、急性胸部综合征、中风、多器官衰竭和过早死亡。疾病控制和预防中心“镰状细胞病(Sickle Cell Disease，SCD)”(2021)。

在患有镰状细胞病的患者中，血红蛋白中的β-珠蛋白亚基中的至少一个被血红蛋白S取代，要么以纯合方式遗传(HbSS，镰状细胞贫血)，要么遗传了另一个异常的β-珠蛋白亚基。HbSS是SCD最严重的形式，其次是HbS-β零地中海贫血，然而并发症会继续发生在其他形式的疾病中，如HbSC或HbS-β加性地中海贫血等。美国国家医学图书馆(MedlinePlus)“镰状细胞病(Sickle Cell Disease)”(2021)。在本领域中存在对治疗β-血红蛋白病的需要。

发明内容

本发明提供了降低RIOK3的表达的核糖核苷酸药剂。所述核糖核苷酸药剂可以是反义寡核苷酸、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、任选不对称iRNA(aiRNA)、微小RNA、迷你RNA、lncRNA、核酶或其组合。

在一个实施例中，所述核糖核苷酸药剂可以是短发夹RNA(shRNA)。所述shRNA可以包含SEQ ID NO:3的正向序列和/或SEQ ID NO:4的反向序列。

在一个实施例中，所述核糖核苷酸药剂可进一步降低BLC11A的表达。所述核糖核苷酸药剂可进一步降低LRF的表达。所述核糖核苷酸药剂可进一步增加POGZ的表达。

在一个实施例中，所述核糖核苷酸药剂可进一步增加血红蛋白γ、任选HBG1、HGB2或两者的表达。

在一个实施例中，所述核糖核苷酸药剂可进一步降低血红蛋白β(HBB)的表达。

在一个实施例中，所述核糖核苷酸药剂可以靶向SEQ ID NO:1的mRNA序列。所述核糖核苷酸药剂可以靶向SEQ ID NO:2的mRNA序列。所述靶标可以进一步包含处于SEQ IDNO:2的3'和/或5'位处的1-20个核糖核苷酸的侧翼序列。

在一个实施例中，组合物可包含本文所述的核糖核苷酸药剂。所述组合物可以是药物组合物。所述组合物可以进一步包含佐剂、载剂、缓冲剂、抗氧化剂、润湿剂、润滑剂、胶凝剂、增稠剂、粘合剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、稀释剂、稳定剂、填充剂、赋形剂或其组合。

在一个实施例中，微粒可以包含本文所述的核糖核苷酸药剂。所述微粒可以是微球、微胶囊、纳米球、纳米胶囊或纳米颗粒。所述微粒可以包含脂质载剂。

在一个实施例中，组合物可包含有包含本文所述的核糖核苷酸药剂的微粒。

在一个实施例中，载体可包含编码本文所述的核糖核苷酸药剂的多核苷酸。所述载体可以是表达载体。所述载体可以是病毒载体。所述病毒载体可以是逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。所述病毒载体可以是慢病毒载体。

在一个实施例中，慢病毒载体可包含编码本文所述的核糖核苷酸药剂的多核苷酸。

在一个实施例中，所述载体可以进一步包含启动子。所述载体可以进一步包含红系特异性启动子。所述红系特异性启动子可以是α-血影蛋白启动子、锚蛋白-1启动子、γ-珠蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。所述启动子可以是III型RNA聚合酶III启动子。所述启动子可以是U6或H1启动子。所述启动子可以是tRNA或CMV启动子。

在一个实施例中，所述载体可以包含增强子，例如红系特异性增强子。

在一个实施例中，宿主细胞可包含载体，所述载体包含编码本文所述的核糖核苷酸药剂的核酸序列。

在一个实施例中，用于治疗患者的镰状细胞病的方法可包含施用有效量的本文所述的核糖核苷酸药剂。所述镰状细胞病可以是血红蛋白SS病、血红蛋白SC病、血红蛋白SB+(β)地中海贫血、血红蛋白SB 0(β-零)地中海贫血、血红蛋白SD、血红蛋白SE或血红蛋白SO。所述镰状细胞病可以是镰状细胞贫血(SS)、镰状血红蛋白-C病(SC)、镰状β-加性地中海贫血或镰状β-零地中海贫血。

在一个实施例中，用于治疗患者的镰状细胞病的并发症的方法可包含施用有效量的本文所述的核糖核苷酸药剂。所述镰状细胞病的并发症可以是镰状细胞危象、血管闭塞性危象、急性胸部综合征、再生障碍性危象、溶血性危象、指炎、急性胸部综合征、癫痫发作、中风、局部缺血、短暂性脑缺血发作、缺血性结肠炎或其组合。

在一个实施例中，用于促进细胞中的β-珠蛋白合成的方法可包含施用有效量的本文所述的核糖核苷酸药剂。

在一个实施例中，用于治疗患者的镰状细胞病的方法包含施用有效量的本文所述的核糖核苷酸药剂、本文所述的组合物、本文所述的微粒、本文所述的载体或其组合。

在一个实施例中，用于治疗患者的镰状细胞病的并发症的方法包含施用有效量的本文所述的核糖核苷酸药剂、本文所述的组合物、本文所述的微粒、本文所述的载体或其组合。

在一个实施例中，用于促进细胞中的β-珠蛋白合成的方法包含施用有效量的本文所述的核糖核苷酸药剂、本文所述的组合物、本文所述的微粒、本文所述的载体或其组合。

在一个实施例中，用于治疗有需要的患者的镰状细胞病的离体方法包含(a)从患有镰状细胞病的患者获得造血干细胞和祖细胞，任选地原血细胞(造血干细胞)；(b)向所述造血干细胞和祖细胞施用有效量的本文所述的核糖核苷酸药剂、本文所述的组合物、本文所述的微粒、本文所述的载体或其组合，以用所述核糖核苷酸药剂转染所述细胞；以及(c)将所述转染的造血干细胞和祖细胞返回给所述患者。向所述造血干细胞和祖细胞施用有效量的本文所述的核糖核苷酸药剂、本文所述的组合物、本文所述的微粒、本文所述的载体或其组合持续足以允许所述造血干细胞和祖细胞转染的时间。所述造血干细胞和祖细胞可以是CD34+。所述造血干细胞和祖细胞可以是原血细胞(造血干细胞)。

在一个实施例中，分离的核苷酸可以包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

在一个实施例中，分离的核苷酸可以包含SEQ ID NO:4的核酸序列。

在一个实施例中，分离的核苷酸可以包含SEQ ID NO:5的核酸序列。

在一个实施例中，分离的慢病毒载体可以包含shRNA，所述shRNA包含有包含SEQID NO:3的核酸序列的正向序列和包含SEQ ID NO:4的核酸序列的反向序列。

在一个实施例中，分离的核酸可以包含SEQ ID NO:1的核糖核苷酸序列。载体可以包含编码SEQ ID NO:1的核糖核苷酸序列的核酸。所述载体可以是表达载体。所述载体可以是病毒载体，任选地逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。

在一个实施例中，分离的核酸可以包含SEQ ID NO:2的核糖核苷酸序列。载体可以包含编码SEQ ID NO:2的核糖核苷酸序列的核酸。所述载体可以是表达载体。所述载体可以是病毒载体，任选地逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。

附图说明

图1描绘了根据SMART分析的人RIOK3结构域结构。

图2A-C描绘了根据BioGPS数据库，RIOK3在早期成人红系细胞中表达。

图3描绘了RIOK3的表达局限于Bloodspot数据库中发育中的红系细胞(4个探针中的3个)。

图4描绘了预期RIOK3具有多个转录变体，这可能是由于转录、翻译或翻译后水平的调节。为了增加胎儿血红蛋白的表达，优选RIOK3的敲除被引导至3'-UTR的特定区。例如，本发明人发现靶向外显子6或10或不同位置处的3'-UTR不会导致胎儿珠蛋白上调。

图5描绘了RIOK3敲除导致胎儿血红蛋白(γ-亚基)、HBG1和HBG2表达的显著上调。血红蛋白β(HBB)表达降低。CD34+造血干细胞和祖细胞衍生的成红细胞在培养的第2天用对照慢病毒载体(ShNC)或靶向3'-UTR的RIOK3特异性慢病毒载体(ShR3)转导，并在培养的第17天通过高效液相色谱(HPLC)分析血红蛋白β(HBB)、血红蛋白α(HBA)、血红蛋白γ-1(HBG1)和血红蛋白γ-2(HBG2)水平(上图)。通过将HBG1+HBG2值除以总β-珠蛋白(HBB+HBG1+HBG2)值来计算HbF％(下图)。数据显示，在敲除RIOK3后，与对照相比，胎儿β-珠蛋白HBG1和HBG2的水平显著增加。

图6描绘了shRNA敲除后RIOK3、BCL11A、和LRFRNA表达的降低。CD34+造血干细胞和祖细胞衍生的成红细胞在培养的第2天用对照shRNA慢病毒载体(ShNC)或靶向3'-UTR的RIOK3特异性慢病毒载体(ShR3)转导，并在培养的第12天通过Q-PCR分析BCLI IA和LRF表达。RIOK3编码丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶RIO3。BCL11A编码B细胞淋巴瘤/白血病11A。LRF编码淋巴瘤/白血病相关因子

图7描绘了在原代人红系祖细胞中敲除RIOK3后，RIOK3、BCL11A和LRF蛋白水平的显著降低。CD34+造血干细胞和祖细胞衍生的成红细胞在培养的第2天用对照shRNA慢病毒载体(ShNC)或靶向3'-UTR的RIOK3特异性慢病毒载体(ShR3)转导，并在培养的第12天通过蛋白质印迹分析BCLI IA和LRF蛋白水平。

图8描绘了细胞离心分析显示，在培养的第15天，用对照shRNA(ShNC)转导的细胞与用靶向3'-UTR的RIOK3特异性shRNA (ShR3)转导的细胞之间没有形态学差异。

具体实施方式

在进一步描述本公开之前，应当理解，本公开不限于下面描述的本公开的特定实施例，因为可以对特定实施例进行变化，并且这些变化仍然落入所附权利要求的范围内。还应当理解，所采用的术语是为了描述特定实施例，而不旨在进行限制。相反，本公开的范围将由所附权利要求来确定。

在本说明书和所附权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a、an)”、和“所述(the)”包括复数指称。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

本文所用的“有效量”广泛地指当向患者施用来治疗疾病时，足以实现对疾病的此种治疗的化合物、抗体、抗原或细胞的量。有效量可以是有效疾病预防的量，和/或有效预防的量。有效量可以是有效降低、有效预防体征/症状发生、降低体征/症状发生的严重程度、消除体征/症状发生、减缓体征/症状发生的发展、预防体征/症状发生的发展和/或有效预防体征/症状发生的量。“有效量”可以根据疾病及其严重程度以及要治疗的患者的年龄、体重、病史、易感性和先存状况而变化。对于本发明的目的，术语“有效量”与“治疗有效量”同义。

本文所用的“宿主细胞”广泛地指用核酸分子转染的特定受试细胞以及此种细胞的后代或潜在后代。由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中，子代可能与用核酸分子转染的亲代细胞不同。

本文所用的“哺乳动物”广泛地指任何和所有哺乳动物纲的恒温脊椎动物，其特征在于皮肤上覆盖有毛发，并且雌性动物具有用于哺育幼仔的产奶乳腺。哺乳动物包括但不限于人类、家畜和农场动物以及动物园、运动或宠物。哺乳动物的实例包括但不限于羊驼、犰狳、水豚、猫、骆驼、黑猩猩、龙猫、牛、狗、沙鼠、山羊、大猩猩、豚鼠、仓鼠、马、人、狐猴、美洲驼、小鼠、非人类灵长类动物、猪、大鼠、绵羊、鼩鼱、松鼠和貘。哺乳动物包括但不限于牛、犬、马、猫、鼠、绵羊、猪、灵长类和啮齿类物种。哺乳动物还包括华盛顿特区史密森尼学会国家自然历史博物馆保存的世界哺乳动物物种中列出的任何和所有哺乳动物。类似地，术语“受试者”或“患者”包括人类和兽医受试者和/或患者。

“短干扰RNA”(siRNA)，在本文中也称为“小干扰RNA”，是一种用于抑制靶基因的表达的药剂。这些是用于诱导RNAi的效应分子，通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)导致转录后基因沉默。除了可以化学合成的siRNA之外，还可以获得用于转录后基因沉默的潜在效应分子形式的各种其他系统，包括短发夹RNA(shrna)、长dsRNA、短时间RNA和微小RNA(miRNAs)。这些效应分子或者被加工成siRNA，如在shRNA的情况下，或者直接帮助基因沉默，如在miRNA的情况下。因此，本发明囊括使用shRNA以及任何其他合适形式的RNA通过RNAi实现转录后基因沉默。使用shRNA比使用化学合成的siRNA具有的优势在于对靶基因的抑制通常是长期和稳定的。siRNA可以化学合成，可以通过体外转录产生，或者可以在宿主细胞内由表达的shRNA产生。

本文所用由核糖核苷酸药剂诱导的“基因沉默”广泛地指细胞中靶基因的mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％的未引入RNA干扰的细胞中发现的mRNA水平。在一个实施例中，通过本文所述的核糖核苷酸药剂，mRNA水平降低了至少约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。

本文所用的“抑制靶基因表达”或“抑制标记基因表达”广泛地指靶基因或靶基因编码的蛋白质的表达或蛋白质活性或水平的任何降低。与未被RNA干扰剂靶向的靶基因的表达或由靶基因编码的蛋白质的活性或水平相比，降低可以是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。

本文所用的“基本上不含”广泛地指特定组分以小于1％，优选小于0.1％或0.01％的量存在。更优选地，术语“基本上不含”广泛地指特定组分以小于0.001％的量存在。取决于组成，所述量可以表示为w/w或w/v。

本文所用的“治疗”广泛地指治疗性治疗和疾病预防性或预防措施两者。需要治疗的那些患者包括已经患有病症的那些患者以及要预防病症的那些患者。本文所用的术语“治疗”广泛地指治疗疾病，阻止或减少疾病或其临床症状的发展，和/或缓解疾病，使疾病或其临床症状消退。疗法囊括预防、治疗、补救、减少、缓解和/或减轻疾病、疾病的体征和/或症状。疗法囊括缓解患有持续疾病体征和/或症状的患者的体征和/或症状。疗法还囊括“疾病预防法”。出于疗法目的，术语“减少”广泛地指体征和/或症状的临床显著减少。疗法包括治疗复发或再现性体征和/或症状。疗法囊括但不限于在任何时候排除体征和/或症状的出现，以及减少现有体征和/或症状和消除现有体征和/或症状。疗法包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。例如，治疗包括治疗或预防体征和/或症状的复发或再现。

通过下调RIOK3治疗镰状细胞病

RIO激酶3(是丝氨酸/苏氨酸激酶和右开放阅读框(RIO)激酶家族的成员)在β-珠蛋白(HBB)合成的负调节中作为具有锌指结构域的转录因子Pogo转座因子(POGZ)的下游效应子发挥作用。本发明人惊讶地发现，下调RIOK3的表达导致随后下调BCL11A和LRF的表达以及上调POGZ的表达。参见例如图7。通过施用核糖核苷酸药剂下调RIOK3的表达也导致血红蛋白γ-1(HBG1)和血红蛋白γ-2(HBG2)的表达上调以及血红蛋白β(HBB)的表达下调。HBG1和HBG2的上调可能会降低镰状细胞病的严重程度。在患有镰状细胞病的患者的临床过程中，胎儿血红蛋白升高，特别是胎儿血红蛋白的遗传持久性(HPFH)，已显示出保护作用。那些遗传了突变(例如，胎儿血红蛋白突变，导致HbF(HPFH)持续升高)的患者免受镰状细胞病的并发症的影响。还出乎意料的是，施用本文所述的核糖核苷酸药剂还降低了镰状细胞病的并发症的发生率和/或严重程度以及对疟疾的易感性。

表1：序列

核糖核苷酸药剂

本文所述的降低RIOK3的核糖核苷酸药剂可以是反义寡核苷酸、shRNA、小干扰RNA(siRNA)、任选不对称iRNA(aiRNA)、微小RNA、迷你RNA、lncRNA、核酶或其组合。

本文所述的核糖核苷酸药剂可通过任何合适的方式递送，包括但不限于病毒载体、胶束、脂质递送、聚合物组合物或其组合。Song和Yang《美国医学科学杂志(N Am J Med Sci)》(2010)2(12):598–601。核糖核苷酸药剂可由载体，任选病毒载体中的多核苷酸编码。例如，病毒载体，任选慢病毒载体，可包含编码本文所述核糖核苷酸药剂的多核苷酸，其优选由红系特异性启动子(例如，α-血影蛋白启动子、锚蛋白-1启动子、γ-珠蛋白启动子、β-珠蛋白启动子)驱动，任选与一种或多种增强子组合，例如一种或多种红系特异性增强子。

本发明人惊讶地发现，为了增加胎儿血红蛋白的表达，优选的是RIOK3的敲除被引导至3'-UTR处的特定区(SEQ ID NO:2)。例如，本发明人发现靶向外显子6或10或不同位置处的3'-UTR不会导致胎儿珠蛋白上调。

本文所述的核糖核苷酸药剂可以例如靶向RIOK3 mRNA的3'UTR序列，优选SEQ IDNO:2的核糖核苷酸序列，或包括处于SEQ ID NO:2的核糖核苷酸序列的3'或5'位处的1-20个核糖核苷酸的SEQ ID NO:2的核糖核苷酸序列。本文所述的核糖核苷酸药剂可靶向包含处于SEQ ID NO:2的序列3'位处的1-20个核糖核苷酸的核糖核苷酸序列和SEQ ID NO:2的核糖核苷酸序列。本文所述的核糖核苷酸药剂可靶向包含处于SEQ ID NO:2的序列5'位处的1-20个核糖核苷酸的核糖核苷酸序列和SEQ ID NO:2的核糖核苷酸序列。5'和3'位处的这些区可被描述为SEQ ID NO:2的“侧翼序列”。例如，侧翼序列可以包含处于SEQ ID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)5'和/或3'位处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

本文所述的核糖核苷酸药剂可结合并任选切割靶序列RIOK3，任选SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)。

RNAi

细胞利用RNA干扰(RNAi)途径来调节许多基因的活性。RNAi，也称为转录后基因沉默(PTGS)，是指其中RNA分子抑制基因表达的生物过程。本文所用的“RNA干扰剂”是通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶基因表达的任何药剂。此种RNA干扰剂包括但不限于核酸分子，包括与靶基因或其片段同源的RNA分子、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶基因表达的小分子。

RNAi是一种过程，通过所述过程，与靶基因相同或高度相似的序列的RNA的表达或引入导致从所述靶基因转录的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或PTGS，从而抑制靶基因的表达。此过程在植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞中已经进行了描述。RNAi也可以通过引入核酸分子、例如合成siRNAs或RNA干扰剂来起始，以抑制靶基因的表达或使其沉默。

本文所述的RNAi药剂可结合并任选切割靶序列RIOK3，任选SEQ ID NO:1，优选SEQID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)。

shRNA

核糖核苷酸药剂可以是siRNA，是小发夹(也称为茎环)RNA(shRNA)。这些shRNA由短的(例如，19至25个核苷酸)反义股，随后是5至9个核苷酸环和互补的有义股构成。替代地，有义股可以在核苷酸环结构之前，并且反义股可以在其后。这些shRNA可能包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中。例如，shRNA可以通过红系特异性启动子结合红系特异性增强子驱动的慢病毒载体递送给患者。

shRNA可以包含：

正向序列(SEQ ID NO:3)：

5'-CCGGGCTCAGCATTGAGAGAATAAACTCGAGTTTATTCTCTCAATGCTGAGCTTTTTG-3'

反向序列(SEQ ID NO:4)：

5'-AATTCAAAAAGCTCAGCATTGAGAGAATAAACTCGAGTTTATTCTCTCAATGCTGAGC-3'

shRNA可以包含SEQ ID NO:3的正向序列和SEQ ID NO:4的反向序列，使用包含U6启动子的无复制能力的慢病毒系统(例如，pLKO.1系统)来驱动shRNA的转录。U6启动子优选用于转录shRNA，因为它是PolIII依赖性的，RNA不是聚腺苷酸化的，且因此发夹能更有效地产生。

shRNA构建体可包含在慢病毒系统中由红系特异性启动子驱动的包含SEQ ID NO:3的正向序列和SEQ ID NO:4的反向序列的shRNA，可用于降低RIOK3表达的方法中。shRNA构建体可用于转染从患有镰状细胞病的患者分离的自体CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)。shRNA构建体降低RIOK3的表达，且因此降低血红蛋白-β的表达，同时增加血红蛋白-γ的表达。将经转染的HSPC返回给患者，从而治疗镰状细胞病和/或其并发症。

反义寡核苷酸

核糖核苷酸药剂可以是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸是相对短的核酸，其与编码RIOK3、任选SEQ ID NO:1的mRNA的编码股(有义股)互补(或反义)。优选地，核糖核苷酸药剂靶向编码RIOK3的mRNA的子区段，优选SEQ ID NO:2。反义寡核苷酸可以是基于RNA的、基于DNA的或RNA/DNA混杂体。此外，反义寡核苷酸可以被修饰以增加它们的稳定性。

不受理论的束缚，这些相对短的寡核苷酸与mRNA的结合被认为诱导双股RNA的延伸，从而引发内源RNA酶对信息的降解。此外，有时寡核苷酸被特别设计成结合在编码序列的启动子附近，并且在这些情况下，反义寡核苷酸可能另外干扰mRNA的翻译。不管反义寡核苷酸发挥作用的具体机制如何，将它们施用于细胞或组织使得能够降解编码RIOK3的mRNA。因此，反义寡核苷酸降低RIOK3的表达和/或活性。RIOK3的表达/活性的此种降低导致血红蛋白β(HBB)表达的降低和血红蛋白γ(HBG1、HBG2)表达的增加。具体而言，优选的是核糖核苷酸药物被引导至3'-UTR(SEQ ID NO:2)处的特定区，因为靶向外显子6或10或不同位置处的3'-UTR不会导致胎儿珠蛋白上调。

本文所述的核糖核苷酸药剂可进一步降低BCL11A的表达。核糖核苷酸药剂可进一步降低LRF的表达。核糖核苷酸药剂可进一步增加POGZ的表达。

在一个实施例中，核糖核苷酸药剂可进一步增加血红蛋白γ、任选HBG1、HGB2或两者的表达。

反义寡核苷酸可以是单股或双股的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或经修饰版本。寡核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链处进行修饰，例如，以改善分子的稳定性、杂交和血清半衰期。寡核苷酸可包括其他附加基团，包括但不限于肽(例如，用于靶向宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的药剂(参见，例如，Letsinger等人(1989)《美国国家科 学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》86:6553–6556；Lemaitre等人(1987)《美国国家 科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)》84:648–652；WO 88/09810)或血脑屏障(参见，例如，WO 89/10134)、杂交触发裂解剂(参见，例如，Krol等人，1988，《生物技术(BioTechniques)》6:958-976)或嵌入剂(参见例如,Zon,1988,《药物研究(Pharm.Res.)》5:539-549)。为此，寡核苷酸可以与另一个分子缀合。

本文所述的反义寡核苷酸可以通过本领域已知的标准方法合成，例如，通过使用自动化DNA合成仪(如自Biosearch，Applied Biosystems商购获得)。例如，硫代磷酸寡核苷酸可以通过Stein等人(1988,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》16:3209)的方法合成，甲基膦酸酯寡核苷酸可以通过使用受控多孔玻璃聚合物支持物来制备。Sarin等人(1988)《美国国家科学院院报》85:7448-7451。

已经开发了许多方法用于向细胞递送反义DNA或RNA例如，可以将反义分子直接注射到组织位点，或者可以全身施用经设计以靶向所需细胞的经修饰的反义分子(例如，与特异性结合靶细胞表面上表达的受体或抗原的肽或抗体连接的反义分子)。

另一种方法利用重组DNA构建体，其中反义寡核苷酸置于强pol III或pol II启动子的控制之下，以获得足以抑制内源mRNAs翻译的细胞内反义浓度。例如，可以在体内引入载体，使其被细胞摄取并引导反义RNA的转录。载体可以保持游离基因或变成染色体整合的，并且仍然被转录以产生所需反义RNA。合适的载体可以通过本领域标准的重组DNA技术方法来构建。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的其他载体，用于在哺乳动物细胞中复制和表达。编码反义RNA的序列的表达可以通过本领域已知的在哺乳动物，优选人类细胞中起作用的任何启动子进行。合适的启动子可以是诱导型或组成型的。合适的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon(1981)《自然(Nature)》290:304-310)，包含在劳斯氏肉瘤病毒的3'长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人,1980,《细胞(Cell)》22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,1981,《美国国家科学院院报》78:1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人,1982,《自然》296:39-42)或其组合。任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体都可用于制备可直接被引入组织位点中的重组DNA构建体。可以使用选择性地感染所需组织的病毒载体，在这种情况下，可以通过另一种途径(例如，全身地)完成施用。本文所述的反义寡核苷酸可通过靶向SEQ ID NO:1，优选SEQ IDNO:2来降低RIOK3。

反义寡核苷酸可以包含SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2的核糖核苷酸序列的有义链的反义链。包括药物组合物在内的组合物可以包含反义寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2。微粒，包括包含微粒的脂质，可以包含反义寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2。例如，反义寡核苷酸可以结合至SEQ ID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)，导致mRNA的降解。

小干扰RNA

核糖核苷酸药剂可以是小干扰RNA(siRNA或RNAi)分子。RNAi构建体包含可特异性阻断靶基因的表达的双股RNA。“RNA干扰”或“RNAi”是一个最初应用于双股RNA(dsRNA)以特定且转录后方式阻断基因表达的现象的术语。RNAi提供了在体外或在体内抑制基因表达的有用方法。RNAi构建体包括但不限于小干扰RNA(SiRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、短发夹RNA(shRNA)和其他可以在体内切割以形成SiRNA的RNA物种。本文的RNAi构建体还包括表达载体(“RNAi表达载体”)，其能够产生在细胞中形成dsRNA或发夹RNA的转录物和/或可在体内产生siRNA的转录物。此外，iRNA可以是不对称iRNA(aiRNA)。美国专利第9,328,345号。iRNA药剂可以与编码RIOK3、任选SEQ ID NO:1的mRNA的编码股(有义股)互补(或反义)。优选地，iRNA药剂靶向编码RIOK3的mRNA的子区段，优选SEQ ID NO:2。

RNAi表达载体表达(转录)RNA，所述RNA在表达构建体的细胞中产生siRNA部分。此种载体包括转录单位，所述转录单位包含以下的装配体(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件(例如启动子、操纵子或增强子)，其可操作地连接到(2)被转录以产生双股RNA(在细胞中退火以形成siRNA的两个RNA部分，或可被加工成siRNA的单个发夹RNA)的“编码”序列，和(3)适当的转录起始和终止序列。启动子和其他调节元件的选择通常根据预期的宿主细胞而变化。

RNAi构建体含有在细胞生理条件下与要抑制的基因的mRNA转录物的至少一部分的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(即，编码RIOK3的多核苷酸序列)。双股RNA只需与天然RNA足够相似，就具有介导RNAi的能力。因此，本发明的优点是能够耐受由于遗传突变、菌株多态性或进化分歧而可能预期的序列变异。靶序列与RNAi构建体序列之间耐受的核苷酸错配数量不大于5个碱基对中的1个、或10个碱基对中的1个、或20个碱基对中的1个或50个碱基对中的1个。siRNA双链体中心的错配是最关键的，并且可能基本上消除靶RNA的切割。相反，与靶RNA互补的siRNA股的3'末端处的核苷酸对靶识别的特异性没有显著贡献。

RNAi构建体的产生可以通过化学合成方法或重组核酸技术来进行。经处理的细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录，或者经克隆的RNA聚合酶可用于体外转录。RNAi构建体可以包括对磷酸-糖主链或核苷的修饰，例如，以降低对细胞核酸酶的易感性，改善生物利用度，改善配方特征，和/或改变其他药物代谢动力学性质。例如，天然RNA的磷酸二酯键可以经修饰以包括氮或硫杂原子中的至少一者。可定制RNA结构的修饰，以允许特异性遗传抑制，同时避免对dsRNA的一般反应。同样地，碱基可以经修饰以阻断腺苷脱氨酶的活性。RNAi构建体可通过酶促或部分/全部有机合成来产生，任何经修饰的核糖核苷酸可通过体外酶促或有机合成来引入。

小干扰RNA(siRNA)可为约19至30个核苷酸长，甚至更优选为21至23个核苷酸长，例如，其长度对应于核酸酶“分切”较长双股RNA产生的片段。siRNA被理解为募集核酸酶复合物，并通过与特异性序列配对将复合物导向至靶mRNA。因此，靶mRNA被蛋白质复合物中的核酸酶降解。在一个特定的实施例中，21至23个核苷酸的siRNA分子包含3'羟基。例如，siRNA可为约19、20、21、22、23、23、25、26、27、28、29或30个核苷酸长。siRNA可为约21、22或23个核苷酸长。例如，siRNA可以靶向并任选地切割SEQ ID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)。siRNA可以结合到SEQ ID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)，导致mRNA的降解。

RNAi构建体可以是短发夹结构(shRNA)的形式。shRNA可以外源合成，或者可以通过在体内从RNA聚合酶III启动子转录而形成。制造和使用用于哺乳动物细胞中的基因沉默的此种发夹RNA的实例描述于例如Paddison等人,《基因与发育(Genes Dev)》,2002,16:948-58；McCaffrey等人,《自然》,2002,418:38-9；Yu等人,《美国国家科学院院报》,2002,99:6047-52)。通常，此种shRNA在细胞或动物中经工程改造以确保所需基因的持续和稳定抑制。siRNA可以通过加工细胞中的发夹RNA来产生。Moore等人《分子与细胞生物学方法 (Methods Mol Biol)》.(2010)629:141–158。

质粒可用于递送双股RNA，例如，作为转录产物。在此种实施例中，质粒经设计以包括RNAi构建体的有义股和反义股中每一者的“编码序列”。编码序列可以是相同的序列，例如，侧翼为反向启动子，或者可以是两个独立的序列，每一者都在单独启动子的转录控制下。编码序列被转录后，互补的RNA会转录碱基对以形成双股RNA。本文所述的iRNA可通过靶向SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2来降低RIOK3。

核酶

降低RIOK3表达的核糖核苷酸试剂可以是核酶。经设计用于催化切割mRNA转录物的核酶分子也可用于防止mRNA的翻译。参见,例如,WO 90/11364；Sarver等人,1990,《科学(Science)》247:1222-1225和美国专利第5,093,246号。虽然可以使用在位点特异性识别序列处切割mRNA的核酶来破坏特定mRNA，但优选的是使用锤头状核酶。锤头状核酶在与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区决定的位置处切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有以下两个碱基的序列：5'-UG-3'。锤头状核酶的构建和生产是本领域众所周知的，并且更全面地描述于Haseloff和Gerlach,1988,《自然》,334:585-591。

本文所述的核酶抑制剂还可以包括RNA内切核糖核酸酶(“Cech型核酶”)，如天然存在于嗜热四膜虫中的RNA内切核糖核酸酶(称为IVS或L-19IVS RNA)，并且已经在本领域中进行了描述。Zaug,等人,1984,《科学》,224:574-578；Zaug和Cech,1986,《科学》,231:470-475；Zaug,等人,1986,《自然》,324:429-433；WO 88/04300；Been和Cech,1986,《细胞(Cell)》,47:207-216。Cech型核酶具有8碱基对活性位点，所述活性位点与靶RNA序列杂交，然后发生靶RNA的切割。靶向8碱基对活性位点序列的Cech型核酶可用于本文所述的方法和组合物中。例如，靶向包含在SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2内的8碱基对拉伸序列的Cech型核酶。

如同在反义方法中一样，核酶可以由经修饰的寡核苷酸构成(例如，用于改善稳定性、靶向性、血清半衰期)，并且可以在体外或在体内递送至细胞。优选的递送方法涉及使用在强组成型pol III或pol II启动子控制下“编码”核酶的DNA构建体，使得经转染的细胞将产生足够量的核酶来破坏靶向信息并抑制翻译。由于核酶是催化性的，实现效率可能需要较低的细胞内浓度。本文所述的核酶可以通过靶向SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2来降低RIOK3。例如，本文所述的核酶可以结合至RIOK3 mRNA，优选SEQ ID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)并切割mRNA，导致转录物降解和RIOK3表达的降低。

微小RNA

降低RIOK3的核糖核苷酸药剂可以是微小RNA。微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA，其在调节基因表达中起重要作用。大多数miRNA从DNA序列转录成初级miRNA，并加工成前体miRNA，并且最后成为成熟的miRNA。在大多数情况下，miRNA与靶mRNA的3'非翻译区(3'UTR)相互作用，以诱导mRNA降解和翻译抑制。然而，还报道了miRNA与其他区(包括5′UTR)、编码序列和基因启动子的相互作用。在特定条件下，miRNA也可以激活翻译或调节转录。本文所述的微小RNA可以通过靶向SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2来减少RIOK3。本文描述的微小RNA可以结合到并任选切割SEQ ID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)。通过结合到并任选切割SEQ ID NO:2(GCTCAGCATTGAGAGAATAAA)，微小RNA引起mRNA的降解，降低RIOK3的表达。

lncRNA

减少RIOK3的核糖核苷酸药剂可以是长的非编码RNA(lncRNA)。LncRNA代表从基因组产生的最大一组非编码RNA。LncRNA通常被描述为长度＞200个核苷酸的转录物，缺乏编码蛋白质的潜力。在最新的GENCODE V30版本中，人类基因组中有16,193个带注释的lncRNA。Robinson等人.《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》《基因调节机 制(Gene Regul Mech)》(2020)1863(4):194419。本文所述的lncRNA可通过靶向SEQ ID NO:1，优选SEQ ID NO:2来减少RIOK3。

杂交条件

核糖核苷酸药剂可与RIOK3 mRNA(例如，SEQ ID NO:1的核糖核酸序列)杂交，优选特异性地与SEQ ID NO:2的核糖核酸序列杂交。例如，反义核糖核苷酸药剂可包含SEQ IDNO:1的核糖核酸序列的反义链，优选特异性地包含SEQ ID NO:2的核糖核酸序列的反义链。

退火条件可包含在约65℃至75℃之间的温度下，任选在约70℃下，将组合加热约1至10分钟，任选约5分钟。加热后，经过1至60分钟的进程，任选约30分钟，将温度降至约40℃与50℃之间的温度，任选约45℃。达到第二温度后，将混合物保持在约40℃与50℃之间(任选约45℃)持续约60至240分钟(任选约120分钟)。混合物可进一步搅拌约1至10分钟，任选约5分钟。这可以在约40℃与50℃之间(任选约45℃)的温度下进行。然后将反应容器在约40℃与50℃之间(任选约45℃)的温度下孵育约1至30分钟(任选约15分钟)。退火条件可进一步包含洗涤，例如在约50℃至65℃下，在高度严格的条件下，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤一次或多次，例如在约45℃下，在3x SSC中与过滤器结合的核酸杂交，然后在20℃下在1x SSC中洗涤一次或多次。另一种洗涤缓冲液可包含150mM LiCl、1％Triton、1mM EDTA、5mM DTT、20mM Tris pH 7.5。可用于退火反应的其他洗涤缓冲液包括但不限于包含20mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM LiCl、0.1％ LiDS、1mM EDTA、5mM DTT的洗涤缓冲液；包含20mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM LiCl、1mM EDTA的洗涤缓冲液；和包含20mM Tris-HCl、pH 7.5、200mMLiCl、1mM EDTA的低盐严格洗涤缓冲液；洗涤缓冲液可包含0mM LiCl、1％ Triton、1mMEDTA、5mM DTT、20mM Tris pH 7.5。

可以使用本领域已知的其他严格杂交条件。参见，例如Ausubel等人.[编辑](1989)《分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)》,第I卷，Green Publishing Associates公司和John Wiley&Sons公司，纽约，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页。

基因编辑

除了本文所述的核糖核苷酸药剂之外，通过破坏编码RIOK3蛋白的遗传序列，可以实现通过抑制RIOK3表达和/或酶活性来抑制RIOK3介导的细胞信号传导。一种有效的靶向基因切割方法是CRISPR系统。例如，可以从患者体内取出造血干细胞(HSC)，使用本文所述的CRISPR方法进行处理以降低RIOK3的表达，然后将经修饰的HSC返回给患者。CRISPR药剂可以特异性地靶向SEQ ID NO:1的核糖核酸序列，优选特异性地靶向SEQ ID NO:2的核糖核酸序列。

术语CRISPR是成簇的有规则间隔的短回文重复序列的缩写，最初是指原核生物DNA中含有短的重复碱基序列的片段，最初发现于细菌和古细菌中。在回文重复序列中，核苷酸序列在两个方向上都是相同的。每次重复之后是来自先前暴露于外源DNA(例如，病毒的DNA)的间隔物DNA的短片段。Cas(CRISPR相关联的)基因的小簇位于CRISPR序列旁边。后来认识到，CRISPR/Cas系统是一种原核免疫系统，它赋予对外来遗传因子特别是病毒来源的遗传因子的抗性，从而提供了一种获得性免疫的形式。拥有间隔物序列的RNA有助于Cas(CRISPR相关联的)蛋白识别和切割外源DNA。其他RNA引导的Cas蛋白切割外来RNA。CRISPR发现于约50％的经测序的细菌基因组和近90％的经测序的古细菌中，并且最近CRISPR/Cas系统已经调改用于真核细胞中的靶向基因编辑。参见例如，Ledford(2016),《自然》531(7593):156–9；美国专利第8,697,359；8,771,945；8,871,445；和11,005,799号。

CRISPR/Cas系统的简单版本CRISPR/Cas9已经修改以编辑基因组。通过将与合成指导RNA(gRNA)复合的Cas9核酸酶递送到细胞中，通常通过用编码Cas9核酸酶和gRNA的一种或多种表达载体来转染细胞，细胞的基因组可以在预选的位置处被切割，使得靶基因(例如，RIOK3基因)能够被去除和/或被新的编码序列取代。

在这种情况下，可以将携带RIOK3特异性gRNA编码序列的表达载体(例如，病毒载体)引入其中内源RIOK3基因将被敲除的细胞(例如，红系细胞或红系祖细胞)。同一表达载体任选地还携带CRISPR/Cas9核酸酶或等同物的编码序列。在替代形式中，可使用单独的表达载体来引入CRISPR/Cas9核酸酶编码序列，用于其在靶细胞中的表达。在一些情况下，使用多于一种(例如，两种)不同的gRNA来确保靶基因组序列的去除和/或替换(例如，编码RIOK3蛋白的一种)。优选地，CRISPR/Cas9系统可用于靶向SEQ ID NO:1，更优选SEQ ID NO:2的核糖核苷酸序列。

RIOK3功能测定

RIOK3介导的细胞信号传导的抑制剂因其能够消除RIOK3信号传导的下游效应而为有用的，特别是作为患有镰状细胞病及其并发症的患者的治疗剂。可以在体外或体内进行用于证实抑制剂的此种抑制作用的测定。体外测定通常涉及将经培养的细胞暴露于抑制剂，并且监测这些细胞中随后的生物和生化变化。例如，在暴露于足够浓度的抑制剂达适当的时间后，通过免疫测定，诸如蛋白质印迹和原位免疫染色等，检查合适的细胞(诸如能够表达胎儿β-珠蛋白的细胞，例如红系细胞或它们的祖细胞)的胎儿β-珠蛋白合成速率的任何潜在变化。还可以监测由于RIOK3信号传导(例如MDA5蛋白的磷酸化和BCL11A蛋白的表达以及LRF表达)的进一步下游变化，以提供受抑制的经由RIOK3的信号传导的指示。当观察到由任何一个前述参数指示的RIOK3介导的信号传导减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多时，检测到抑制作用。

本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂对胎儿β-珠蛋白合成的增强作用也可在体内测定中得到证实。例如，可以将本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂注射到患有镰状细胞病并因此表现出β-珠蛋白表达和/或活性不足的动物体内。注射方法可以是皮下、肌内、静脉内、腹膜内或其组合。随后通过各种方法(诸如测量循环系统中血红蛋白的水平或红细胞的数量，并与患有类似疾病或病况但未给予抑制剂的对照组动物进行比较)监测疾病发展的变化，。本公开的实例部分提供了一些示例性体内测定的详细描述。当在测试组中确定对血红蛋白水平或红细胞数量的积极作用时，检测到抑制作用。优选地，积极作用是至少10％的增加；更优选地，增加是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高。

组成

本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂可被配制成组合物。本文所述的包含抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的组合物可以是药物组合物。包括药物组合物在内的组合物可以包含佐剂、载剂、缓冲剂、抗氧化剂、润湿剂、润滑剂、胶凝剂、增稠剂、粘合剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、稀释剂、稳定剂、填充剂、赋形剂或其组合。

本文所述的组合物可以配制成包含抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂和药学上可接受的载剂的药物组合物。药学上可接受的载剂包括但不限于赋形剂、润滑剂、乳化剂、稳定剂、溶剂、稀释剂、缓冲剂、媒剂或其组合。

药学上可接受的载剂是本领域众所周知的，并且包括例如水溶液，诸如水或生理缓冲盐水或其他溶剂或媒剂诸如乙二醇、甘油、油类诸如橄榄油或可注射的有机酯。药学上可接受的载剂可以是液体，包括但不限于水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。药物载剂可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、硅胶或尿素。此外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。例如，糖和/或氨基酸可以共混到药物组合物中。药物组合物可包含水、甘油、磷脂或其混合物。合适的药物载剂的其他实例描述于Remington的《药物科学(Pharmaceutical Sciences)》(Alfonso Gennaro编,Krieger Publishing公司(1997)；Remington的《药学的科学和实践(The Science and Practice of Pharmacy)》,21^st编(Lippincott、Williams和Wilkins(2005)；《现代药剂学(Modern Pharmaceutics)》,第121卷(Gilbert Banker和ChristopherRhodes,CRC出版社(2002))。

药物载剂可以是固体或液体。固体形式的制剂包括例如粉末、片剂、可分散颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂。固体载剂可以是一种或多种物质，其也可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂或片剂崩解剂；它也可以是封装材料。

药物组合物可包括抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的活性化合物与作为载剂的包封材料的制剂，从而提供其中抑制剂(有或没有其他载剂)被载剂包围，使得所述载剂因此与所述化合物缔合的胶囊。以类似的方式，也可以包括扁囊剂。片剂、粉剂、扁囊剂和胶囊可用作适于口服施用的固体剂型。

液体药物组合物包括例如适于口服或胃肠外施用的溶液、悬浮液和适于口服施用的乳液。活性组分(例如，抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂)的无菌水溶液或活性组分在包含水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适合胃肠外施用的液体组合物的实例。组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，人pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去污剂等。

组合物的单次或多次施用可以根据治疗医生选择的剂量水平和模式进行。在任何情况下，药物制剂都应提供足以在治疗上或疾病预防上有效抑制患者的由RIOK3介导的细胞信号传导的数量的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂。

微粒/纳米颗粒递送

本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂可被包封在微粒和/或纳米颗粒内，分散在形成微粒和/或纳米颗粒的聚合物基质内，与微粒和/或纳米颗粒的表面共价或非共价缔合或其组合。

术语“微球”是本领域公认的，并且包括基本上球形的胶体结构，例如，由生物相容性聚合物诸如本发明的组合物形成，具有在约一或更大至多约1,000微米(μm)范围内的尺寸。一般来说，“微胶囊”也是本领域公认的术语，与微球体不同，因为微胶囊通常被某种类型的物质(诸如聚合物制剂)覆盖。术语“微粒”也是本领域公认的，并且包括微球和微胶囊，以及可能不容易归入上述两类中任一者的结构，所有这些结构的平均尺寸小于约1,000微米。微粒可以是球形或非球形的，并且可以具有任何规则或不规则的形状。如果这些结构的直径小于约一微米，则可以使用对应的本领域公认的术语“纳米球”、“纳米胶囊”和“纳米颗粒”(其包括纳米球和纳米胶囊)。在某些实施例中，例如当通过动态光散射(DLS)、透射电子显微镜、扫描电子显微镜或另一种方法测量时，纳米球、纳米胶囊和纳米颗粒具有约500nm、200nm、100nm、50nm、10nm或1nm的平均直径。在一些实施例中，颗粒的平均直径为约200nm至约600nm，例如，约200nm至约500nm。

包含微粒或纳米颗粒的组合物可以包括一定粒度范围内的颗粒。在某些实施例中，粒度分布可以是均匀的，例如，在平均体积直径的小于约20％的标准偏差内，并且在其他实施例中，仍然更均匀，例如，在中值体积直径的约10％、8％、5％、3％或2％内。

微粒和/或纳米颗粒(颗粒)可用于本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的体内和/或体外递送。

颗粒还可以包括抗原和/或佐剂(例如，增强免疫反应的分子，诸如吡喃葡萄糖脂质佐剂(GLA)、CpG寡脱氧核苷酸(例如，A类或B类)、聚(I:C)、氢氧化铝和Pam3CSK4)。

在一些实施例中，包含抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的颗粒可含有小于80％、小于75％、小于70％、小于60％、小于50％重量、小于40％重量、小于30％重量、小于20％重量、小于15％重量、小于10％重量、小于5％重量、小于1％重量、小于0.5％重量或小于0.1％重量的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂，但大于0％。

包含抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的颗粒可含有大于0.1重量％、大于0.5重量％、大于1重量％、大于5重量％、大于10重量％、大于15重量％、大于20重量％、大于30重量％、大于40重量％、大于50重量％、大于60重量％、大于70重量％、大于75重量％或大于80重量％的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂，但小于100％。

包含抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的组合物可进一步包含至少一种药物活性剂。装载百分比取决于多种因素，包括要包封的药物活性剂、用于制备颗粒的聚合物和/或用于制备颗粒的方法。

例如，递送方法可包含含有本文所述的核糖核苷酸药剂和阳离子聚合物的纳米颗粒、含有本文所述的核糖核苷酸药剂和阳离子/可离子化脂质的脂质纳米颗粒以及其他疏水性部分(例如，胆固醇)。此外，可使用碱基、糖和接头修饰来制备本文所述的核糖核苷酸药剂，以递送给患者。Kaczmarek等人.《基因组医学(Genome Medicine)》(2017)9:60；Roberts等人.《自然评论Nature Reviews》(2020)19:673–694。

施用途径

包含本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的组合物可以皮下、肌内、静脉内、腹膜内、胸膜内、膀胱内、鞘内、局部、口服、直肠、阴道、鼻内施用，或根据需要的条件通过一种途径施用。包含本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的组合物可以输注到受试者体内。包含本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的组合物可以通过胃肠外施用来施用。一种施用途径是静脉注射。

核酸、载体和宿主细胞

本发明还提供了一种编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的分离的核酸分子。编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的核酸分子。核酸可以以全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。可以通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCI显带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术)，从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化来分离核酸。参见Ausubel,等人(201l)《分子生物学现代方法》John Wiley&Sons公司。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。核酸可以是cDNA分子。本文所述的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。具体来说，简并密码子取代可通过产生例如其中一个或多个所选择的密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。Batzer,等人(1991)《核酸研究(NucleicAcid Res.)》19:5081；Ohtsuka,等人(1985)J.《生物化学杂志(Biol.Chem.)》260:2605-08；Rossolini,等人(1994)《分子与细胞探测(Mol.Cell.Probes)》8:91-98.

镰状细胞病及其并发症的治疗

本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂可用于治疗镰状细胞病(SCD)。SCD是一组遗传性红细胞病症，包括但不限于血红蛋白SS病、血红蛋白SC病、血红蛋白SB+(β)地中海贫血、血红蛋白SB 0(β-零)地中海贫血、血红蛋白SD、血红蛋白SE和血红蛋白SO。

最常见的镰状细胞病是镰状细胞贫血(SS)、镰状血红蛋白-C病(SC)、镰状β-加性地中海贫血和镰状β-零地中海贫血。

镰状细胞贫血(SS)：当孩子从父母每人遗传了一个替换β珠蛋白基因(镰状细胞基因)时，这个孩子就患有镰状细胞贫血(SS)。具有高镰状细胞贫血频率的群体是非洲和印度后裔的那些。

镰状血红蛋白-C病(SC)：患有镰状血红蛋白-C病(SC)的个体遗传了两个异常的β-珠蛋白基因拷贝；镰状突变的一个拷贝和C突变的一个拷贝。镰状血红蛋白-C病可能引起与镰状细胞贫血相似的症状，但由于血细胞计数水平较高，贫血程度较轻。具有高镰状血红蛋白-C病频率的群体是西非、地中海和中东后裔的那些。

镰状β-加性地中海贫血：患有镰状β地中海贫血(SB)病的个体在两种β珠蛋白基因中也含有取代。疾病的严重程度根据正常β珠蛋白的产生量变化。当不产生β珠蛋白时，症状几乎与镰状细胞贫血相同，严重的病例需要长期输血。具有高镰状β地中海贫血频率的群体是地中海和加勒比海地区的后裔那些。

镰状血红蛋白-D病：通过研究，已经发现血红蛋白D(其是β珠蛋白基因的不同取代物)与镰状血红蛋白基因相互作用。患有镰状血红蛋白D病(SD)的个体具有中度严重的贫血和偶尔的疼痛发作。具有高镰状血红蛋白D病频率的群体是亚洲和拉丁美洲后裔的那些。

镰状血红蛋白-O病：血红蛋白O，β珠蛋白基因中的另一种取代类型，也与镰状血红蛋白相互作用。患有镰状血红蛋白-O病(SO)的个体可能会出现镰状细胞贫血的症状。具有高镰状血红蛋白-O病频率的群体是阿拉伯人、北非人和东地中海后裔的那些。

本发明人惊讶地发现，本文所述的抑制RIOK3表达的核糖核苷酸药剂可用于治疗镰状细胞病(SCD)。不希望受理论的约束，本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂降低RIOK3的表达，导致β-血红蛋白(HBB)表达的降低和γ-血红蛋白(HBG1、HBG2)表达的增加。

镰状细胞病并发症—镰状细胞危象

本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂可用于预防镰状细胞病(SCD)的并发症。如果胎儿血红蛋白的水平增加，则SCD的并发症减少，包括但不限于血管闭塞性危象、急性胸部综合征、再生障碍性危象、溶血性危象、指炎、癫痫发作、中风、局部缺血、短暂性脑缺血发作、缺血性结肠炎或其组合。

术语“镰状细胞危象”或“镰状危象”可用于描述发生在患有镰状细胞病(SCD)的患者中的若干种独立的急性病况。SCD导致贫血和危象，这些危象可能有许多类型，包括血管闭塞性危象、再生障碍性危象、隔离危象、溶血性危象等。大多数镰状细胞危象会持续五到七天，并且包括需要止痛药和通常的住院治疗。虽然感染、脱水和酸中毒(所有这些都有利于镰刀型)可以充当触发因素，但在大多数情况下，没有确定诱发原因。Kumar等人(2009)Robbins和Cotran《疾病病理学基础(Pathologic Basis of Disease)》,专业版：专家咨询-在线(《罗宾斯病理学(Robbins Pathology)》)Elsevier Health.Kindle编。

本文所述的抑制RIOK3表达的核糖核苷酸药剂可用于治疗镰状细胞疾病(SCD)，优选治疗镰状细胞贫血的并发症，包括但不限于镰状细胞危象、血管闭塞性危象、再生障碍性危象、溶血性危象、指炎、急性胸部综合征、癫痫发作、中风、局部缺血、短暂性脑缺血发作、缺血性结肠炎或其组合。

疟疾的治疗

表达γ-血红蛋白(也称为血红蛋白F)的婴儿对由恶性疟原虫感染引起的疟疾的发展表现出抗性。Pasvol等人.《柳叶刀(Lancet)》(1976)1(7972):1269–72。虽然机制尚不清楚，但γ血红蛋白(血红蛋白F)表达的增加可能保护免受疟疾感染。因此，本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂可用于治疗疟疾的方法中，包括预防疟疾。

用于基因递送的载体

为了递送至细胞或生物体，可将编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的多核苷酸并入载体中。用于此类目的的载体的实例包括能够引导核酸在靶细胞中表达的表达质粒。载体可以是病毒载体系统，其中多核苷酸被并入能够转染靶细胞的病毒基因组中。在一个实施例中，编码多核苷酸可以与表达和控制序列可操作地连接，所述表达和控制序列可以引导多肽或寡核苷酸在所需靶宿主细胞中的表达。因此，可以在合适的条件下在靶细胞中实现多肽或寡核苷酸抑制剂的表达。

基因递送系统

用于表达本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的病毒载体系统包括但不限于天然存在的或重组的病毒载体系统。取决于特定应用，合适的病毒载体包括可复制型、复制不足型和条件复制型病毒载体。例如，病毒载体可以来自人或牛腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、小鼠微小病毒(MVM)、HIV、辛德比斯病毒和逆转录病毒(包括但不限于劳斯肉瘤病毒和慢病毒)以及MoMLV的基因组。通常，感兴趣的编码序列(例如，编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂)被插入此类载体中，以使得能够包装基因构建体，通常与伴随的病毒DNA一起包装，随后感染敏感的宿主细胞并表达感兴趣的编码序列。

基因递送系统可以是用于将编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的多核苷酸序列递送至靶细胞的任何手段。核酸可通过合适的连接部分如DNA连接部分(例如，经包被的凹坑的内陷和核内体的内化)(Wu等人.,《生物化学杂志》.263:14621-14624(1988)；WO 92/06180)或通过超声微泡递送系统(Lan HY等人,《美国肾脏病学会杂志(J.AmSoc.Nephrol.)》14:1535-1548)，与细胞受体配体缀合，以促进摄取。例如，核酸可以通过聚赖氨酸部分与去唾液酸血清类黏蛋白连接，所述去唾液酸血清类黏蛋白是肝细胞的去唾液酸糖蛋白受体的配体。

类似地，用于包装包括本发明的核酸的基因构建体的病毒包膜可以通过添加受体配体或受体特异性抗体进行修饰，以允许受体介导的细胞内吞作用进入特异性细胞。参见例如WO 93/20221、WO 93/14188和WO 94/06923。编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的DNA构建体可与病毒蛋白诸如腺病毒颗粒连接，以促进内吞作用(Curiel等人,《美国国家科学院院报》88:8850-8854(1991))、微管抑制剂(WO/9406922)、模拟流感病毒血球凝集素的合成肽(Plank等人.,《生物化学杂志》269:12918-12924(1994))以及核定位信号诸如SV40 T抗原(WO93/19768)。

逆转录病毒载体也可用于将本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的编码序列引入靶细胞或患者。逆转录病毒载体是通过对逆转录病毒进行遗传操作而产生的。逆转录病毒的病毒基因组是RNA。感染后，此基因组RNA被逆转录成DNA拷贝，所述拷贝以高度的稳定性和效率整合到转导细胞的染色体DNA中。经整合的DNA拷贝被称为前病毒，并且正如任何其他基因一样由子细胞遗传。野生型逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有三个基因：gag、pol和env基因，其侧翼是两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA引导的DNA聚合酶(逆转录酶)；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5'和3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和聚腺苷酸化。与5'LTR相邻的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效包封至颗粒(Psi位点)所需要的序列。参见,Mulligan,在：《基因表达的实验操作(Experimental Manipulation of Gene Expression)》,Inouye(编),155-173(1983)；Mann等人,Cell33:153-159(1983)；Cone和Mulligan,《美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academy of Sciences,U.S.A.)》,81:6349-6353(1984))。

逆转录病毒载体的设计是本领域已知的。简言之，如果病毒基因组中缺失了衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒体)所需要的序列，则结果是顺式作用缺陷，这种缺陷阻止基因组RNA的衣壳化。然而，产生的突变体仍然能够引导所有病毒体蛋白的合成。这些序列已被删除的逆转录病毒基因组以及含有稳定整合到染色体中的突变基因组的细胞系在本领域是众所周知的，并且用于构建逆转录病毒载体。本领域描述了逆转录病毒载体的制备及其用途。欧洲专利申请0178220；美国专利4,405,712；Gilboa《生物技术(Biotechniques)》4:504-512(1986)；Mann等人,《细胞(Cell)》33:153-159(1983)；Cone和Mulligan《美国国家科学院院报》81:6349-6353(1984)；Eglitis等人《生物技术》6:608-614(1988)；Miller等人《生物技术》7:981-990(1989)；Miller(1992)见前文；Mulligan(1993),见前文；和WO 92/07943。

逆转录病毒载体颗粒是通过将所需核苷酸序列重组插入逆转录病毒载体，并使用包装细胞系将载体与逆转录病毒衣壳蛋白包装在一起而制备的。所得逆转录病毒载体颗粒不能在宿主细胞中复制，但能够作为含有所需核苷酸序列的前病毒序列整合到宿主细胞基因组中。结果，患者能够产生例如本发明的多肽或多核苷酸抑制剂，并因此将靶细胞(例如，红系细胞)恢复为正常表型。

用于制备逆转录病毒载体颗粒的包装细胞系通常是重组哺乳动物组织培养细胞系，其产生包装所需的必要病毒结构蛋白，但不能产生感染性病毒体。另一方面，所用的有缺陷的逆转录病毒载体缺乏这些结构基因，但编码包装所需的剩余蛋白质。为了制备包装细胞系，可以构建其中包装位点已被删除的所需逆转录病毒的感染性克隆。包含此构建体的细胞将表达所有的结构性病毒蛋白，但引入的DNA将不能被包装。替代地，可以通过用编码合适的核和包膜蛋白的一种或多种表达质粒转化细胞系来产生包装细胞系。在这些细胞中，gag、pol和env基因可以来自相同或不同的逆转录病毒。

许多适用于本发明的包装细胞系在现有技术中可用。这些细胞系的实例包括Crip、GPE86、PA317和PG13(参见Miller等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》65:2220-2224(1991))。其他包装细胞系的实例描述于Cone和Mulligan《美国国家科学院院报》81:6349-6353(1984)；Danos和Mulligan《美国国家科学院院报》85:6460-6464(1988)；Eglitis等人.(1988),见上文；和Miller(1990),见上文。

可以使用能够生产具有嵌合包膜蛋白的逆转录病毒载体颗粒的包装细胞系。替代地，双嗜性或异嗜性包膜蛋白(如PA317和GPX包装细胞系产生的包膜蛋白)可用于包装逆转录病毒载体。

组合物的施用

可使用本领域已知的任何递送方法将包含本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂或编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的多核苷酸序列的组合物递送至靶组织或器官。本文所述的组合物可以经配制用于皮下、肌内、静脉内或腹膜内注射，或用于口服或局部施用。

本文所述的组合物可以施用于细胞。细胞可以作为组织的一部分提供，诸如作为循环系统一部分的红细胞，或者作为分离的细胞提供，例如在组织培养中。细胞可以在体内、离体或在体外提供。例如，可以从患者取出造血干细胞(HSC),用本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂处理以改变血红蛋白谱，然后，可以将经修饰的HSC重新引入患者体内。HSC可以是同种异体的或自体的。

本文所述的组合物可通过多种方法在体内或离体引入感兴趣的组织中。可通过此类方法诸如显微注射、磷酸钙沉淀、脂质体融合、超声、电穿孔、基因枪法或其组合将编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的核酸或本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂引入细胞。编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的核酸或本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂可被感兴趣的组织直接摄取，例如，当靶细胞是红细胞时，静脉注射是合适的。

本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂可以离体施用于从患者移植的细胞或组织，然后返回给患者。治疗性基因构建体的离体施用的实例包括Nolta等人.,《美国国家科学院院报》93(6):2414-9(1996)；Koc等人.,《放射肿瘤学研究(Seminars in Oncology)》23(1):46-65(1996)；Raper等人.,《外科学年鉴(Annals of Surgery)》223(2):116-26(1996)；Dalesandro等人.,《胸心外科杂志(J.Thorac.Cardi.Surg.)》,11(2):416-22(1996)；和Makarov等人.,《美国国家科学院院报》93(1):402-6(1996)。

制剂的有效剂量将根据许多不同的因素而变化，包括施用方式、目标位点、患者的生理状态和其他施用的药物。因此，需要调整治疗剂量以优化安全性和有效性。在确定要施用的载体的有效量时，医生应评估所用的特定核酸、所诊断的疾病状态；患者的年龄、体重和总体状况、循环血浆水平、载体毒性、疾病进展和抗载体抗体的产生。剂量的大小也将取决于伴随特定载体施用的任何不利副作用的存在、性质和程度。

剂量通常可在约0.01与约100μg/kg体重之间，优选在约0.1与约50μg/kg体重之间的范围内，或在每次注射约10⁸-10¹⁰或10¹²颗粒的范围内。一般而言，对于典型的70kg患者，来自载体的裸核酸的剂量当量为约1g至100g，并且计算包括逆转录病毒颗粒的载体的剂量，以产生当量的编码本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的核酸。

试剂盒

本发明还提供了用于抑制RIOK3信号传导和治疗镰状细胞病的试剂盒。试剂盒通常包括容器，所述容器含有(1)具有有效量的本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂的药物组合物，和(2)含有如何分配药物组合物的说明的信息材料，包括可被治疗的患者类型的描述(例如，患有镰状细胞病或β-地中海贫血的人类患者)、施用方案(例如，剂量和频率)和施用途径等。在一些情况下，试剂盒中包括第二容器，以提供包含有效量的第二种RIOK3抑制剂的第二种药物组合物。

实例

实例1

敲除RIOK3RNA增加γ-血红蛋白的表达并降低β-血红蛋白的表达

定量PCR显示shRNA敲除后RIOK3 RNA水平降低。CD34+造血干细胞和祖细胞衍生的成红细胞在培养的第2天用对照shRNA慢病毒载体(shNC)或RIOK3特异性慢病毒载体(shRIOK3；SEQ ID NOS:3和4)转导，并且在培养的第12天通过Q-PCR分析RIOK3的表达。数据显示RIOK3shRNA有效靶向并减少RIOK3 RNA。

RIOK3敲除导致胎儿β-珠蛋白表达上调。CD34+造血干细胞和祖细胞衍生的成红细胞在培养的第2天用对照shRNA慢病毒载体(shNC)或RIOK3特异性慢病毒载体(shRIOK3)转导，并在培养的第11天通过高效液相色谱(HPLC)来分析珠蛋白(HBB、HBA、HBG1和HBG2)水平。％HbF是通过将HBG1+HBG2值除以总β-珠蛋白(HBB+HBG1+HBG2)值计算的。数据显示，在敲除RIOK3后，与对照相比，胎儿β-珠蛋白HBG1和HBG2的水平显著增加。

RIOK3敲除导致BCL11A和LRF表达下调。CD34+造血干细胞和祖细胞衍生的成红细胞在培养的第2天用对照shRNA慢病毒载体(shNC)或RIOK3特异性慢病毒载体(shRIOK3)转导，并在培养的第12天通过Q-PCR分析BCL11A和LRF表达。数据显示，在敲除RIOK3后，胎儿血红蛋白阻遏物BCL11A和LRF在转录水平上显著降低。

RIOK3敲除导致红系祖细胞中的BCL11A和LRF蛋白表达下调。CD34+造血干细胞和祖细胞衍生的成红细胞在培养的第2天用对照shRNA慢病毒载体(shNC)或RIOK3特异性慢病毒载体(shRIOK3)转导，并在培养的第12天通过蛋白质印迹分析BCL11A和LRF蛋白水平。数据显示，与对照相比，敲除RIOK3后，BCL11A和LRF蛋白水平显著降低。

在原代CD34+衍生的红系细胞中敲除的RIOK3。在培养的第15天，细胞涂片没有显示出用对照shRNA转导的细胞与用RIOK3特异性shRNA转导的细胞之间的形态学差异。CD34+造血干细胞和祖细胞衍生的成红细胞在培养的第2天用对照shRNA慢病毒载体(shNC)或RIOK3特异性慢病毒载体(shRIOK3)转导，并在载玻片上旋转，并且用HEMA3手工染色系统染色。

综上，数据表明本文所述的抑制RIOK3的核糖核苷酸药剂可用于降低RIOK3的表达，并随后降低β-血红蛋白(HBB)的表达，并且增加γ-血红蛋白的表达。

本说明书中引用的所有参考文献都通过引用方式并入本文，就好像每个参考文献都被具体和单独地指出通过引用并入一样。任何参考文献的引用都是为了其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本公开由于先前发明而无权先于此种参考文献。

应当理解，上述元件中的每一者或者两个或更多个元件一起也可以在不同于上述类型的其他类型的方法中找到有用的应用。无需进一步分析，前述内容将如此充分地揭示本公开的要点，以至于其他人可以通过应用现有知识，在不省略从现有技术的观点来看公平地构成所附权利要求中阐述的本公开的一般或特定方面的必要特征的情况下，容易地将其适用于各种应用。前述实施例仅以实例的方式给出；本公开的范围仅受以下权利要求的限制。

序列表

<110> 美国卫生及公众服务部代表 (THE UNITED STATES OF AMERICA, ASREPRESENTED BY THE

SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES)

Gudmundsdottir, Bjorg

Tisdale, John Fitzgerald

Tumburu, Laxminath

<120> 用于治疗镰状细胞病的组合物和方法

<130> 3000093-006977

<160> 5

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 3574

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<400> 1

agttccggac gcggccgccg ccgtcgccgc catctgtcac ctccactccg gcatcagcag 60

ccagtcgccc gtgtcccgcc tgtctcctcg gcggagcctg ctgcccgtcc tgccacctct 120

ctgctctgtt cttgtctctg ccttcattcc cgaatggatc tggtaggagt ggcatcgcct 180

gagcccggga cggcagcggc ctggggaccc agcaagtgtc catgggctat tcctcaaaat 240

acaatatctt gttctttggc tgatgtaatg agtgaacagc tggccaaaga attgcagtta 300

gaagaagaag ctgccgtttt tcctgaagtt gctgttgctg aaggaccatt tattactgga 360

gaaaacattg atacttccag tgaccttatg ctggctcaga tgctacagat ggaatatgac 420

agagaatatg atgcacagct taggcgtgaa gaaaaaaaat tcaatggaga tagcaaagtt 480

tccatttcct ttgaaaatta tcgaaaagtg catccttatg aagacagcga tagctctgaa 540

gatgaggttg actggcagga tactcgtgat gatccctaca gaccagcaaa accggttccc 600

actcctaaaa agggctttat tggaaaagga aaagatatca ccaccaaaca tgatgaagta 660

gtatgtggga gaaagaacac agcaagaatg gaaaattttg cacctgagtt tcaggtagga 720

gatggaattg gaatggattt aaaactatca aaccatgttt tcaatgcttt aaaacaacat 780

gcctactcag aagaacgtcg aagtgcccgc ctacatgaga aaaaggagca ttctacagca 840

gaaaaagcag ttgatcctaa gacacgttta cttatgtata aaatggtcaa ctctggaatg 900

ttggagacaa tcactggctg tattagtaca ggaaaggagt ctgttgtctt tcatgcatat 960

ggagggagca tggaggatga aaaggaagat agtaaagtta tacctacaga atgtgccatc 1020

aaggtattta aaacaaccct taatgaattt aagaatcgtg acaaatatat taaagatgat 1080

ttcaggttta aagatcgctt cagtaaacta aatccacgta agatcatccg catgtgggca 1140

gaaaaagaaa tgcacaatct cgcaagaatg cagagagctg gaattccttg tccaacagtt 1200

gtactactga agaaacacat tttagttatg tcttttattg gccatgatca agttccagcc 1260

cctaaattaa aagaagtaaa gctcaatagt gaagaaatga aagaagccta ctatcaaact 1320

cttcatttga tgcggcagtt atatcatgaa tgtacgcttg tccatgctga cctcagtgag 1380

tataacatgc tgtggcatgc tggaaaggtc tggttgatcg atgtcagtca gtcagtagaa 1440

cctacccacc ctcacggcct ggagttcttg ttccgggact gcaggaatgt ctcgcagttt 1500

ttccagaaag gaggagtcaa ggaagccctt agtgaacgag aactcttcaa tgctgtttca 1560

ggcttaaaca tcacagcaga taatgaagct gattttttag ctgagataga agctttggag 1620

aaaatgaatg aagatcacgt tcagaagaat ggaaggaaag ctgcttcatt tttgaaagat 1680

gatggagacc caccactact atatgatgaa tagcactaat acccactgct tcagtgttaa 1740

cacagcagtg attgtcagct gccaatagca aatgaagtta tgggtgactt gaaataccaa 1800

aacctgagga gtgggcaatg gtgcttctgt gcttttcccc cttgtaaccc atgtgccaga 1860

tgtgtggaat ttttagctca gcattgagag aataaaatgt cactacctct catcttatga 1920

acaggataat ataattcttt aacagctata ggttatctgg ctgaagtaga cctaatttta 1980

tgtgacttgt ggtgtaaaat gtcttgatga taatttttaa aacttgggta acacttccaa 2040

atatgggagg aaaggacaga tgtgtttaca agggaggatt ttacaacata cttgctttat 2100

tcacctccct gttttgtgtt gcgtctttcc ttgaatattt tattggccca gagttagcct 2160

ttctcaatta tgtttccaga ctgtggccgt gattctaaag gaaaatgtgt gctctttagt 2220

gggtagaaca aatggaaatt tggtttcaga atggctgaca gaaatcgaca taagtcatgt 2280

aatttttgtt gatatatcat gaaaatgaac agaattcttt ttccatactt atatctaaga 2340

aaaggcatca taggtttctg aaagagataa ctatataaca gctttttaac tatccagtca 2400

actttcagct tttctacatt taggtaaaat ggttaggata taactcatgg tgtggctaat 2460

ctacatttat caataaaatg taaattatct gaaaggacag aatataagat ttaaccatgt 2520

ttgacgtatt ttaatttagt taatgaagca aaattcagtt tatatttcac tagaactgtg 2580

tacttgattg attttcagag aaatatcaca aattagaaat attaaatcta aggatgaaag 2640

gtatatataa aacaatttgg gggccaggca cgatggctca aacctgtaat cccagcactt 2700

tgggagacca aggcgggtgg atcacttgag gtcaggagtt caagaccagc ctgggcaaca 2760

tggcgaaacc ctgtctctac taaaaataca aaaattagcc gggtgtggtg gcacttctct 2820

gtaatctcag cttctcagga ggctgagaca ggagaatcgc ttgaacccgg gaggcagagg 2880

ttgcagtgag ctgagatcat gccactgcac tccggcctag gtgacagagg gaaactccat 2940

ctccaggaaa aaaaaaaaaa aacccaattt ggataccaaa ttaatcaact aatttgagct 3000

atctggcctt actcttagta gtttttagta cgtgctggac accactttta aaaagcaatc 3060

actgtgctag aaaagtatat tggctttgtt aggattaaag ttcattaact tcaatgtaat 3120

catgcctcct attactgaag tcagattgga accactaaag atccaaactt tctgtctggt 3180

aatagaaagt aaaaatctag acatcattta catttgagaa agctgttttt aacattattt 3240

taaaatgcca aatatgttct ttctagaaaa atatttattt ttgtttttgt tggatagctt 3300

ttaattacat ttcagagagg tgtaattttg ggtagatgct cattacattt ttgaaaggtt 3360

tatgattcca aaataaagat ttatatgact ggtgatactg gctttacaga aatttcagag 3420

aactaatttt taaaatcttt agcatttaaa actttttttg ttttgttttc tgacatattc 3480

tgacaaagag cagcaaacca ctgctgtgtg gcattcttgg agtgtgctgt gaatgtgctt 3540

tttaagaaat taaaaagaga tcattttaaa attg 3574

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 2

gctcagcatt gagagaataa a 21

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA正向序列

<400> 3

ccgggctcag cattgagaga ataaactcga gtttattctc tcaatgctga gctttttg 58

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> shRNA反向序列

<400> 4

aattcaaaaa gctcagcatt gagagaataa actcgagttt attctctcaa tgctgagc 58

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸反向序列

<400> 5

tttattctct caatgctgag c 21

Claims (55)

1.一种核糖核苷酸药剂，其降低丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶3(RIOK3)的表达。

2.根据权利要求1所述的核糖核苷酸药剂，其中所述核糖核苷酸药剂是反义寡核苷酸、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、任选不对称iRNA(aiRNA)、微小RNA、迷你RNA、lncRNA、核酶或其组合。

3.根据权利要求1或2所述的核糖核苷酸药剂，其中所述核糖核苷酸药剂是短发夹状RNA(shRNA)。

4.根据权利要求3所述的核糖核苷酸药剂，其中所述shRNA包含有包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向序列。

5.根据权利要求3所述的核糖核苷酸药剂，其中所述shRNA包含有包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的反向序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的核糖核苷酸药剂，其中所述药剂进一步降低B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)的表达。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的核糖核苷酸药剂，其中所述药剂进一步降低淋巴瘤/白血病相关因子(LRF)的表达。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的核糖核苷酸药剂，其中所述药剂进一步增加源自ZNF结构域的Pogo转座因子(POGZ)的表达。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的核糖核苷酸药剂，其中所述药剂进一步增加血红蛋白γ、任选HBG1、HGB2或两者的表达。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的核糖核苷酸药剂，其中所述药剂进一步降低血红蛋白β(HBB)的表达。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的核糖核苷酸药剂，其中所述药剂靶向SEQ IDNO:1的mRNA序列。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的核糖核苷酸药剂，其中所述药剂靶向SEQ IDNO:2的mRNA序列。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的核糖核苷酸药剂，其中所述靶标进一步包含处于SEQ ID NO:2的3'和/或5'位处的1-20个核糖核苷酸的侧翼序列。

14.一种组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的核糖核苷酸药剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

16.根据权利要求14或15所述的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂、载剂、缓冲剂、抗氧化剂、润湿剂、润滑剂、胶凝剂、增稠剂、粘合剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、稀释剂、稳定剂、填充剂、赋形剂或其组合。

17.一种微粒，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的核糖核苷酸药剂。

18.根据权利要求17所述的微粒，其中所述微粒是微球、微胶囊、纳米球、纳米胶囊或纳米颗粒。

19.根据权利要求17所述的微粒，其中所述微粒包含脂质载剂。

20.一种组合物，其包含根据权利要求17所述的微粒。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述微粒包含微球、微胶囊、纳米球、纳米胶囊、纳米颗粒或其组合。

22.一种载体，其包含编码根据权利要求1至13中任一项所述的核糖核苷酸药剂的多核苷酸。

23.根据权利要求22所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

24.根据权利要求23所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。

25.根据权利要求24所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含红系特异性启动子。

27.根据权利要求26所述的载体，其中所述红系特异性启动子是α-血影蛋白启动子、锚蛋白-1启动子、γ-珠蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。

28.根据权利要求22至25中任一项所述的载体，其中所述启动子是III型RNA聚合酶III启动子。

29.根据权利要求28所述的载体，其中所述启动子是U6或H1启动子。

30.根据权利要求22至25中任一项所述的载体，其中所述启动子是tRNA或CMV启动子。

31.根据权利要求22至30中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含增强子或红系特异性增强子。

32.根据权利要求22所述的载体，其中所述载体是表达载体。

33.一种宿主细胞，其包含根据权利要求32所述的载体。

34.一种用于治疗患者的镰状细胞病的方法，其包含施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的核糖核苷酸药剂、根据权利要求14至16中任一项所述的组合物、根据权利要求17至19所述的微粒、根据权利要求22至31所述的载体或其组合。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述镰状细胞病为血红蛋白SS病、血红蛋白SC病、血红蛋白SB+(β)地中海贫血、血红蛋白SB 0(β-零)地中海贫血、血红蛋白SD、血红蛋白SE或血红蛋白SO。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述镰状细胞病是镰状细胞贫血(SS)、镰状血红蛋白-C病(SC)、镰状β-加性地中海贫血或镰状β-零地中海贫血。

37.一种用于治疗患者的镰状细胞病的并发症的方法，其包含施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的核糖核苷酸药剂、根据权利要求14至16中任一项所述的组合物、根据权利要求17至19所述的微粒、根据权利要求22至31所述的载体或其组合。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述镰状细胞病的并发症是镰状细胞危象、血管闭塞性危象、急性胸部综合征、再生障碍性危象、溶血性危象、指炎、急性胸部综合征、癫痫发作、中风、局部缺血、短暂性脑缺血发作、缺血性结肠炎或其组合。

39.一种用于促进细胞中的胎儿β-珠蛋白合成的方法，其包含施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的核糖核苷酸药剂、根据权利要求14至16中任一项所述的组合物、根据权利要求17至19所述的微粒、根据权利要求22至31所述的载体或其组合。

40.一种用于治疗有需要的患者的镰状细胞病的离体方法，其包含

(a)从患有镰状细胞病的患者获得造血干细胞和祖细胞；

(b)向所述造血干细胞和祖细胞施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的核糖核苷酸药剂、根据权利要求14至16中任一项所述的组合物、根据权利要求17至19所述的微粒、根据权利要求22至31所述的载体或其组合，以用所述核糖核苷酸药剂转染所述细胞；以及

(c)将所述转染的造血干细胞和祖细胞返回给所述患者。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述镰状细胞病为血红蛋白SS病、血红蛋白SC病、血红蛋白SB+(β)地中海贫血、血红蛋白SB 0(β-零)地中海贫血、血红蛋白SD、血红蛋白SE或血红蛋白SO。

42.根据权利要求40所述的方法，其中所述镰状细胞病是镰状细胞贫血(SS)、镰状血红蛋白-C病(SC)、镰状β-加性地中海贫血或镰状β-零地中海贫血。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述向所述造血干细胞和祖细胞施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的核糖核苷酸药剂、根据权利要求14至16中任一项所述的组合物、根据权利要求17至19所述的微粒、根据权利要求22至31所述的载体或其组合持续足以允许所述造血干细胞和祖细胞转染的时间。

44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述核糖核苷酸药剂降低所述造血干细胞和祖细胞中的丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶3(RIOK3)的表达。

45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述核糖核苷酸药剂进一步降低所述造血干细胞和祖细胞中的B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)的表达。

46.根据权利要求40至45中任一项所述的方法，其中所述核糖核苷酸药剂进一步降低所述造血干细胞和祖细胞中的淋巴瘤/白血病相关因子(LRF)的表达。

47.根据权利要求40至46中任一项所述的方法，其中所述核糖核苷酸药剂进一步增加所述造血干细胞和祖细胞中的源自ZNF结构域的Pogo转座因子(POGZ)的表达。

48.根据权利要求40至47中任一项所述的方法，其中所述核糖核苷酸药剂进一步增加所述造血干细胞和祖细胞中的血红蛋白γ、任选HBG1、HGB2或两者的表达。

49.根据权利要求40至48中任一项所述的方法，其中所述核糖核苷酸药剂进一步降低所述造血干细胞和祖细胞中的血红蛋白β(HBB)的表达。

50.根据权利要求40至49中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞和祖细胞是CD34+。

51.根据权利要求40至50中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞和祖细胞是原血细胞。

52.一种分离的核苷酸，其包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

53.一种分离的核苷酸，其包含SEQ ID NO:4的核酸序列。

54.一种分离的shRNA，其包含有包含SEQ ID NO:3的核酸序列的正向序列和包含SEQID NO:4的核酸序列的反向序列。

55.一种分离的慢病毒载体，其包含根据权利要求54所述的shRNA。