CN117363556A - 一种多细胞混合培养工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多细胞混合培养工艺，涉及细胞混合培养技术领域，包括以下具体步骤：步骤一、提前准备多种不同的细胞，分别放入不同的冻存管中，然后放入液氮环境中低温保存，备用；步骤二、准备消毒后的细胞培养设备，并将其放置在无菌操作台上，待用。本发明通过将盒盖罩在无菌培养盒顶端，隔绝培养皿内部培养的细胞与外界环境的接触，以保证无菌性，并通过从无菌培养盒底部操作玻片转动组件和培养皿升降组件，使培养皿中培养的细胞能够粘贴在玻片上，完成细胞的转移，整个过程中都是在无菌培养盒和盒盖之间形成的无菌空间中进行的，能够降低对外界环境的要求，从而能够有助于推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞混合培养技术领域，具体为一种多细胞混合培养工艺。
背景技术
在基因治疗研究中为研究转染外源基因的细胞对机体其他细胞的影响,目前生物学研究中常将不同种类的细胞在一起联合培养,以模拟基因治疗在体内的作用环境。传统的方法是使用TRANSWELL培养瓶,利用生物半透膜将不同细胞隔开分别培养,该方法具有培养瓶价格过于昂贵、半透膜之间存在一定浓度差不利于细胞间相互作用、TRANSWELL培养瓶结构复杂、瓶口相对较小,细胞收集困难等缺点。
目前现有技术中为了克服上述问题，多采用细胞爬片法进行多细胞的混合培养，通过先在不同的培养基中对不同的细胞进行单独培养，再将玻片放在其中一个培养基中，利用细胞贴壁的特性，让该培养基中的细胞贴在玻片上，最后通过将贴附有细胞的玻片转移到另一个培养基中，使得不同的细胞能够在同一个培养基中进行混合培养。该操作虽然能够解决上述问题，但是利用培养皿培养细胞容易被污染，所以需要在无菌环境中才能够完成，可见该方法对环境的要求较高，不利于推广使用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种多细胞混合培养工艺，通过将盒盖罩在无菌培养盒顶端，隔绝培养皿内部培养的细胞与外界环境的接触，以保证无菌性，并通过从无菌培养盒底部操作玻片转动组件和培养皿升降组件，使培养皿中培养的细胞能够粘贴在玻片上，完成细胞的转移，整个过程中都是在无菌培养盒和盒盖之间形成的无菌空间中进行的，能够降低对外界环境的要求，从而能够有助于推广使用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种多细胞混合培养工艺，包括以下具体步骤：
步骤一、提前准备多种不同的细胞，分别放入不同的冻存管中，然后放入液氮环境中低温保存，备用；
步骤二、准备消毒后的细胞培养设备，并将其放置在无菌操作台上，待用；
步骤三、制备细胞培养用的培养基，并将制得的培养基均分成多份，然后将多份培养基分别放入步骤二中细胞培养设备内部；
步骤四、取出步骤一中低温保存的细胞，经过解冻后，将细胞冻存悬液转移到离心管中，加入5毫升培养液，轻轻吹打混匀，接着混匀后的细胞悬液经离心机离心处理后，弃上活液，然后向保留下来的细胞沉淀液中加入培养液，再次混匀后转移到细胞培养设备内部的培养基中进行培养；
步骤五、利用细胞爬片法将细胞培养设备中的不同细胞集中到同一个培养基中，继续培养，定期通过显微镜观察培养结果并记录。
优选的，在步骤二中的细胞培养设备包括无菌培养盒，所述无菌培养盒顶端盖有盒盖，所述无菌培养盒底部固定有环形板，所述无菌培养盒内部设有多个培养皿，步骤三中的多份培养基分别被放入不同的培养皿内部，用于对不同的细胞进行单独培养；
所述培养皿顶部设有玻片，用于实行细胞爬片法。
优选的，在步骤五中细胞爬片法的操作过程如下所示：将玻片清洗消毒后置于培养皿中的培养基正上方，使玻片底部能够与培养基顶部接触，待该培养基中的细胞贴到玻片上之后，将玻片从培养皿内部取出，并将玻片转移到另一个培养基中继续培养，重复上述步骤直至将多个培养皿中的细胞集中到同一个培养皿中，使多种细胞在同一个培养基中继续培养，达到混合培养的目的。
优选的，所述细胞培养设备还包括安装在培养皿底部的培养皿升降组件，用于控制培养皿升降组件在无菌培养盒内部上下移动；
所述培养皿升降组件包括安装在每个培养皿底部的托盘，所述托盘套在培养皿底部外端，所述托盘底部中间位置通过轴承活动连接有螺纹杆，所述螺纹杆底端贯穿无菌培养盒并延伸处无菌培养盒底部，所述螺纹杆外壁与无菌培养盒通过螺纹连接。
优选的，所述螺纹杆远离托盘的一端固定有转盘；
所述托盘底部固定有多个第一弹簧，所述第一弹簧远离托盘的一端与无菌培养盒内部底端固定连接。
优选的，所述细胞培养设备还包括设在玻片顶部的玻片转动组件，用于带动玻片在不同的培养皿顶部转动；
所述玻片转动组件包括设在无菌培养盒内部中间的竖杆，所述竖杆底端通过转轴活动连接有底座，所述转轴贯穿底座，所述转轴底端固定有第一把手，所述底座底端贯穿无菌培养盒底部并延伸入环形板内部，所述底座外壁与无菌培养盒和环形板固定在一起，所述竖杆顶端一侧固定有横杆，所述横杆远离竖杆的一端卡接有球头，所述球头底部固定有第一连杆，所述第一连杆远离球头的一端固定有连接板，所述连接板位于玻片顶部，所述连接板朝向玻片的一面粘接有方形粘胶，所述玻片通过方形粘胶粘接在连接板底部。
优选的，所述横杆远离转轴的一端内部开设有用于容纳球头的球形槽，所述球头在球形槽内部转动，所述横杆一侧螺纹连接有螺栓，所述螺栓一端穿过横杆并与球头外壁相接触，用于固定球头的位置。
优选的，所述竖杆底端开设有三个等间距分布的限位孔，所述竖杆底端一侧插接有插销，所述插销插接在其中一个限位孔内部，用于固定竖杆和底座之间的位置；
所述插销底部固定有第二连杆，所述第二连杆远离插销的一端穿过底座并延伸出底座底端，所述第二连杆底端固定有第二把手，所述第二连杆外部套有第二弹簧，所述第二弹簧顶端与插销顶部固定连接，所述第二弹簧底端与底座内部固定连接。
与现有技术相比，本发明提供了一种多细胞混合培养工艺，具备以下有益效果：
1、通过对无菌培养盒、盒盖、培养皿和玻片分别进行消毒，再将盒盖罩在无菌培养盒顶端，隔绝培养皿内部培养的细胞与外界环境的接触，以保证无菌性，并通过从无菌培养盒底部操作玻片转动组件和培养皿升降组件，利用玻片转动组件带动玻片转动、利用培养皿升降组件带动培养皿上下移动，使培养皿中培养的细胞能够粘贴在玻片上，完成细胞的转移，整个过程中都是在无菌培养盒和盒盖之间形成的无菌空间中进行的，能够降低对外界环境的要求，从而能够有助于推广使用。
2、通过在底座内部设置能够上下移动的插销，再将插销插接在不同的限位孔内部，用于固定竖杆和底座之间的位置，防止竖杆自发转动，以保证玻片能够停留在每个培养皿的正上方。
附图说明
图1为本发明的细胞培养设备的示意图；
图2为本发明细胞培养设备中培养皿与无菌培养盒的俯视图；
图3为本发明细胞培养设备中无菌培养盒的剖视图；
图4为本发明细胞培养设备中第一连杆和球头与横杆的结构示意图；
图5为本发明细胞培养设备中竖杆、横杆、底座的剖视图；
图6为本发明的图5中A的放大图；
图7为本发明细胞培养设备中限位孔与竖杆的仰视图；
图中：
1无菌培养盒、2盒盖、3环形板、4培养皿、5玻片；
6培养皿升降组件、61托盘、62弹簧、63螺纹杆、64转盘；
7玻片转动组件、71竖杆、72底座、73转轴、74横杆、75球形槽、76球头、77第一连杆、78连接板、79方形粘胶、710螺栓、711第一把手、712限位孔、713插销、714第二弹簧、715第二连杆、716第二把手。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。
本发明提供了一种多细胞混合培养工艺，包括以下具体步骤：
步骤一、提前准备多种不同的细胞，分别放入不同的冻存管中，然后放入液氮环境中低温保存，备用；
步骤二、准备消毒后的细胞培养设备，如图1所示，并将其放置在无菌操作台上，待用；
其中，如图1-7所示，所示该细胞培养设备包括无菌培养盒1，无菌培养盒1顶端盖有盒盖2，无菌培养盒1底部固定有环形板3，无菌培养盒1内部设有多个培养皿4，培养皿4顶部设有玻片5；细胞培养设备还包括安装在培养皿4底部的培养皿升降组件6，用于控制培养皿升降组件6在无菌培养盒1内部上下移动；
具体的，如图2和3所示，培养皿升降组件6包括安装在每个培养皿4底部的托盘61，托盘61套在培养皿4底部外端，托盘61底部中间位置通过轴承活动连接有螺纹杆63，螺纹杆63底端贯穿无菌培养盒1并延伸处无菌培养盒1底部，螺纹杆63外壁与无菌培养盒1通过螺纹连接，而且在螺纹杆63远离托盘61的一端固定有转盘64，通过从无菌培养盒1底部转动转盘64，就能够利用转盘64推动托盘61带动培养皿4在无菌培养盒1内部上下移动，以调节培养皿4在无菌培养盒1内部的高度，使得位于培养皿4正上方的玻片5底部能够与培养皿4内部的培养基相接触，以方便细胞贴附在玻片5的底部；
而且，为保证培养皿4上下移动过程中的稳定性，如图3所示，在托盘61底部固定有多个第一弹簧62，第一弹簧62远离托盘61的一端与无菌培养盒1内部底端固定连接，螺纹杆63在带动培养皿4和托盘61上下移动的同时会对第一弹簧62进行拉伸或者压缩，以增大托盘61移动过程中的阻力，使得操作者能够缓慢转动螺纹杆63，让托盘61能够稳定缓慢升降。
此外，在细胞粘贴到玻片5底部之后，需要将其移动到另一个培养皿4内部，因此，为了能够方便移动玻片5，如图2-7所示，细胞培养设备还包括设在玻片5顶部的玻片转动组件7，用于带动玻片5在不同的培养皿4顶部转动；玻片转动组件7包括设在无菌培养盒1内部中间的竖杆71，竖杆71底端通过转轴73活动连接有底座72，转轴73贯穿底座72，转轴73底端固定有第一把手711，底座72底端贯穿无菌培养盒1底部并延伸入环形板3内部，底座72外壁与无菌培养盒1和环形板3固定在一起，竖杆71顶端一侧固定有横杆74，横杆74远离竖杆71的一端卡接有球头76，球头76底部固定有第一连杆77，第一连杆77远离球头76的一端固定有连接板78，连接板78位于玻片5顶部，连接板78朝向玻片5的一面粘接有方形粘胶79，玻片5通过方形粘胶79粘接在连接板78底部；
在将玻片5从一个培养皿4顶部移动到另一个培养皿4顶部时，只需从无菌培养盒1底部转动第一把手711，就能够利用第一把手711带动转轴73和竖杆71在无菌培养盒1内部转动，并通过竖杆71带动横杆74、球头76、第一连杆77、连接板78和粘接在连接板78底部的玻片5转动，从而能够将玻片5转移到另一个培养皿4上方；
而且在竖杆71转动之后，为了能够固定竖杆71的位置，如图5-7所示，在竖杆71底端开设有三个等间距分布的限位孔712，竖杆71底端一侧插接有插销713，插销713插接在其中一个限位孔712内部，用于固定竖杆71和底座72之间的位置；
因为在插销713的限制下竖杆71的位置固定，所以为了能够在需要转动竖杆71时，需要先将插销713从竖杆71内部抽出，如图6所示，插销713底部固定有第二连杆715，第二连杆715远离插销713的一端穿过底座72并延伸出底座72底端，第二连杆715底端固定有第二把手716，通过从无菌培养盒1底部拉动第二把手716，利用第二把手716带动第二连杆715和插销713向下移动，直至将插销713从竖杆71内部抽出，此时可以随意转动竖杆71；
在将竖杆71转动到指定位置之后，还需重新将插销713插入到竖杆71内部，用于固定竖杆71的位置，所以为了能够自动推动插销713复位，如图6所示，第二连杆715外部套有第二弹簧714，第二弹簧714顶端与插销713顶部固定连接，第二弹簧714底端与底座72内部固定连接，在第二连杆715老带给你插销713下移的同时会压缩第二弹簧714，所以在复位插销713时，只需松开第二把手716，插销713就能够在第二弹簧714自身弹力的作用下自动复位，也就是能够自动插入竖杆71底端的限位孔712中，用于固定竖杆71的位置，也就是能够将玻片5固定在培养皿4的正上方。
步骤四、取出步骤一中低温保存的细胞，经过解冻后，将细胞冻存悬液转移到离心管中，加入5毫升培养液，轻轻吹打混匀，接着混匀后的细胞悬液经离心机离心处理后，弃上活液，然后向保留下来的细胞沉淀液中加入培养液，再次混匀后转移到细胞培养设备内部的培养基中进行培养；
解冻时需要先预热水浴锅至37摄氏度，然后迅速将冻存有细胞的冻存管放置在预热后的水浴锅中，解冻的过程中不断摇动冻存管，直至细胞冻存液完全溶解。
步骤五、利用细胞爬片法将细胞培养设备中的不同细胞集中到同一个培养基中，继续培养，定期通过显微镜观察培养结果并记录；
其中，细胞爬片法的操作过程如下所示：将玻片5清洗消毒后粘贴在方形粘胶79底部，使得玻片5能够位于培养皿4中培养基的正上方，待培养皿4中的培养基培养24小时之后，可以通过从无菌培养盒1底部操作培养皿升降组件6将其中一个培养皿4缓慢上升到玻片5底部，并使玻片5底部能够与培养基顶部接触，在细胞贴壁作用下，与玻片5接触的培养基中的细胞会逐渐贴附到玻片5底部，待该培养基中的细胞贴到玻片5上之后，再次操作培养皿升降组件6就能够将被升起的培养皿4复位，然后再通过操作玻片转动组件7带动玻片5转动，直至将玻片5移动到另一个培养皿4顶部，接着操作该培养皿4底部的螺纹杆63，通过转动螺纹杆63就能够推动螺纹杆63顶端的托盘61和培养皿4移动到玻片5的底部，使得贴附在玻片5底部的细胞能够转移到另一个培养基中继续培养，然后重复上述步骤直至将多个培养皿4中的细胞集中到同一个培养皿4中，使多种细胞在同一个培养基中继续培养，达到混合培养的目的。
在上述过程中，细胞的贴壁与转移的过程中都是在无菌培养盒1和盒盖2之间形成的无菌空间中进行的，能够降低对外界环境的要求，有助于推广使用本发明。
此外，为了能够方便更换玻片5，如图4所示，横杆74远离转轴73的一端内部开设有用于容纳球头76的球形槽75，球头76在球形槽75内部转动，横杆74一侧螺纹连接有螺栓710，螺栓710一端穿过横杆74并与球头76外壁相接触，用于固定球头76的位置，通过拧松螺栓710能够方便转动球头76，将第一连杆77转到横杆74正上方，然后方便人们更换新的玻片5，以便于下次进行细胞培养。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (8)
1.一种多细胞混合培养工艺，其特征在于：包括以下具体步骤：
步骤一、提前准备多种不同的细胞，分别放入不同的冻存管中，然后放入液氮环境中低温保存，备用；
步骤二、准备消毒后的细胞培养设备，并将其放置在无菌操作台上，待用；
步骤三、制备细胞培养用的培养基，并将制得的培养基均分成多份，然后将多份培养基分别放入步骤二中细胞培养设备内部；
步骤四、取出步骤一中低温保存的细胞，经过解冻后，将细胞冻存悬液转移到离心管中，加入5毫升培养液，轻轻吹打混匀，接着混匀后的细胞悬液经离心机离心处理后，弃上活液，然后向保留下来的细胞沉淀液中加入培养液，再次混匀后转移到细胞培养设备内部的培养基中进行培养；
步骤五、利用细胞爬片法将细胞培养设备中的不同细胞集中到同一个培养基中，继续培养，定期通过显微镜观察培养结果并记录。
2.根据权利要求1所述的一种多细胞混合培养工艺，其特征在于：在步骤二中的细胞培养设备包括无菌培养盒(1)，所述无菌培养盒(1)顶端盖有盒盖(2)，所述无菌培养盒(1)底部固定有环形板(3)，所述无菌培养盒(1)内部设有多个培养皿(4)，步骤三中的多份培养基分别被放入不同的培养皿(4)内部，用于对不同的细胞进行单独培养；
所述培养皿(4)顶部设有玻片(5)，用于实行细胞爬片法。
3.根据权利要求2所述的一种多细胞混合培养工艺，其特征在于：在步骤五中细胞爬片法的操作过程如下所示：将玻片(5)清洗消毒后置于培养皿(4)中的培养基正上方，使玻片(5)底部能够与培养基顶部接触，待该培养基中的细胞贴到玻片(5)上之后，将玻片(5)从培养皿(4)内部取出，并将玻片(5)转移到另一个培养基中继续培养，重复上述步骤直至将多个培养皿(4)中的细胞集中到同一个培养皿(4)中，使多种细胞在同一个培养基中继续培养，达到混合培养的目的。
4.根据权利要求2所述的一种多细胞混合培养工艺，其特征在于：所述细胞培养设备还包括安装在培养皿(4)底部的培养皿升降组件(6)，用于控制培养皿升降组件(6)在无菌培养盒(1)内部上下移动；
所述培养皿升降组件(6)包括安装在每个培养皿(4)底部的托盘(61)，所述托盘(61)套在培养皿(4)底部外端，所述托盘(61)底部中间位置通过轴承活动连接有螺纹杆(63)，所述螺纹杆(63)底端贯穿无菌培养盒(1)并延伸处无菌培养盒(1)底部，所述螺纹杆(63)外壁与无菌培养盒(1)通过螺纹连接。
5.根据权利要求4所述的一种多细胞混合培养工艺，其特征在于：所述螺纹杆(63)远离托盘(61)的一端固定有转盘(64)；
所述托盘(61)底部固定有多个第一弹簧(62)，所述第一弹簧(62)远离托盘(61)的一端与无菌培养盒(1)内部底端固定连接。
6.根据权利要求2所述的一种多细胞混合培养工艺，其特征在于：所述细胞培养设备还包括设在玻片(5)顶部的玻片转动组件(7)，用于带动玻片(5)在不同的培养皿(4)顶部转动；
所述玻片转动组件(7)包括设在无菌培养盒(1)内部中间的竖杆(71)，所述竖杆(71)底端通过转轴(73)活动连接有底座(72)，所述转轴(73)贯穿底座(72)，所述转轴(73)底端固定有第一把手(711)，所述底座(72)底端贯穿无菌培养盒(1)底部并延伸入环形板(3)内部，所述底座(72)外壁与无菌培养盒(1)和环形板(3)固定在一起，所述竖杆(71)顶端一侧固定有横杆(74)，所述横杆(74)远离竖杆(71)的一端卡接有球头(76)，所述球头(76)底部固定有第一连杆(77)，所述第一连杆(77)远离球头(76)的一端固定有连接板(78)，所述连接板(78)位于玻片(5)顶部，所述连接板(78)朝向玻片(5)的一面粘接有方形粘胶(79)，所述玻片(5)通过方形粘胶(79)粘接在连接板(78)底部。
7.根据权利要求6所述的一种多细胞混合培养工艺，其特征在于：所述横杆(74)远离转轴(73)的一端内部开设有用于容纳球头(76)的球形槽(75)，所述球头(76)在球形槽(75)内部转动，所述横杆(74)一侧螺纹连接有螺栓(710)，所述螺栓(710)一端穿过横杆(74)并与球头(76)外壁相接触，用于固定球头(76)的位置。
8.根据权利要求6所述的一种多细胞混合培养工艺，其特征在于：所述竖杆(71)底端开设有三个等间距分布的限位孔(712)，所述竖杆(71)底端一侧插接有插销(713)，所述插销(713)插接在其中一个限位孔(712)内部，用于固定竖杆(71)和底座(72)之间的位置；
所述插销(713)底部固定有第二连杆(715)，所述第二连杆(715)远离插销(713)的一端穿过底座(72)并延伸出底座(72)底端，所述第二连杆(715)底端固定有第二把手(716)，所述第二连杆(715)外部套有第二弹簧(714)，所述第二弹簧(714)顶端与插销(713)顶部固定连接，所述第二弹簧(714)底端与底座(72)内部固定连接。
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Cited By (1)
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2023
- 2023-10-10 CN CN202311303932.9A patent/CN117363556A/zh active Pending
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