CN117356559A - 一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用 - Google Patents
一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117356559A CN117356559A CN202311514202.3A CN202311514202A CN117356559A CN 117356559 A CN117356559 A CN 117356559A CN 202311514202 A CN202311514202 A CN 202311514202A CN 117356559 A CN117356559 A CN 117356559A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mmol
- ion
- cryopreservation
- rat embryo
- rat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 117
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 60
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims abstract description 31
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 31
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 18
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 30
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 28
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 28
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 22
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 22
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 21
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 16
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 15
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 15
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 15
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 15
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 15
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 claims description 15
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 claims description 15
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 claims description 15
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 claims description 6
- -1 lactate ion Chemical class 0.000 claims description 6
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims description 6
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 11
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 115
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 16
- 239000000306 component Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 8
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 8
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 4
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 3
- 229960003390 magnesium sulfate Drugs 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 208000009701 Embryo Loss Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 231100000557 embryo loss Toxicity 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
- C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
- C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了提供一种大鼠胚胎冻存预处理液，其组成为基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、抗生素适量，并且，本发明还提供了一种包含前述的大鼠胚胎冻存预处理液的大鼠胚胎冻存‑复苏体系。本发明能够突破大鼠种质资源保存的瓶颈，配套使用的大鼠胚胎冻存‑复苏体系的应用可以使得大鼠胚胎的冻存‑复苏，及随后的人工辅助生殖得以顺利进行，尤其是针对纯合基因型的大鼠资源，将自然繁殖所需的数月时间大大减少为一个月内即可获得SPF级的后代，可快速获得特定基因型或基因修饰后的大鼠资源。
Description
技术领域
本发明属于生物保种技术领域，具体涉及一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用。
背景技术
随着各种基因编辑技术的飞速发展，特别是在实验动物行业中出现了各种珍贵的基因修饰品系，保存这些品系的生物保种技术也被广泛应用，探寻更高效成功率的保种技术值得更深入的研究。冷冻技术主要包括慢速冷冻技术和玻璃化冷冻技术，慢速冷冻技术的低成活率限制了该方法在生物保种技术中的应用。
1985年，Rall和Fahy提出玻璃化冷冻技术之后，玻璃化冷冻技术已经被广泛应用于各种实验动物的胚胎冷冻中。玻璃化冷冻技术(Vitrification)是指在室温将胚胎放置高浓度的冷冻保护剂中快速转入液氮中，而冷冻保护剂由液态形成一种类似玻璃的非结构状态，保持着正常的离子分布减少了对冻存胚胎的损伤。玻璃化冷冻技术中高浓度冷冻保护剂和快速的冷冻速度是两个关键步骤。浓度很高的冷冻保护剂具有一定的毒性，可能对胚胎造成一定的损伤，寻找毒性低的冷冻保护剂是提高冷冻效果的办法之一。冷冻胚胎最终放置-196℃的液氮中，温度跨度很大，低温损伤冰晶的形成都是在这个过程中造成的，一般形成于-5℃到-80℃。
大鼠可用于多种疾病模型的研究，结合目前基因修饰技术在科研上的广泛应用，对基因修饰大鼠的保种需求越来越多。但与小鼠不同的是，因大鼠精子的特殊性，无法通过精子冻存-复苏的方法获得具有较高活力的精子用于人工辅助生殖，商品化基因修饰大鼠的保种，尤其是纯合基因型的保种，更多的需要依赖于胚胎冻存-复苏的方法。但是，与小鼠的EFS20/40或DAP213法不同，目前市面上缺少配套的大鼠胚胎冻存-复苏试剂，因此，研制出一种毒性低、冰晶形成少的大鼠胚胎冻存-复苏试剂，具有广泛的市场应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
第一个方面，本发明提供一种大鼠胚胎冻存预处理液，其组成为基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5g/L、抗生素适量。
在一些实例中，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
在一些实例中，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25 mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
第二个方面，本发明提供一种大鼠胚胎冻存-复苏体系，所述冻存-复苏体系包括大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液和大鼠胚胎复苏液，其中：
所述大鼠胚胎冻存预处理液如第一个方面所述；
所述大鼠胚胎冻存保护液的组成为：基础培养基，蔗糖、聚乙烯醇、丙二醇、乙二醇、Percoll®培养基、抗生素；
所述大鼠胚胎复苏液的组成为：基础培养基、聚乙烯醇、蔗糖、抗生素。
在一些实例中，所述大鼠胚胎冻存保护液含有：蔗糖0.3～0.4 mol/L、丙二醇90～150 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、乙二醇 250～400 mL/L、Percoll®培养基120～250mL/L、抗生素适量。
在一些实例中，所述大鼠胚胎复苏液中含有：蔗糖0.3～0.4 mol/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L，抗生素适量。
在一些实例中，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
在一些实例中，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25 mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
在一些实例中，所述大鼠胚胎冻存预处理液的组成为：基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、抗生素适量；
所述大鼠胚胎冻存保护液的组成为：基础培养基，蔗糖0.3～0.4 mol/L、丙二醇90～150 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、乙二醇 250～400 mL/L、Percoll®培养基120～250mL/L、抗生素适量；
所述大鼠胚胎复苏液的组成为：基础培养基，蔗糖0.3～0.4 mol/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L，抗生素适量；
所述基础培养基的组成均为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5 mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
第三个方面，本发明第二个方面所述的冻存-复苏体系在保存大鼠胚胎中的应用。
本发明的有益效果是：
由于大鼠在多种疾病模型中的重要作用，本发明突破大鼠种质资源保存的瓶颈，配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系的应用可以使得大鼠胚胎的冻存-复苏，及随后的人工辅助生殖得以顺利进行，尤其是针对纯合基因型的大鼠资源，将自然繁殖所需的数月时间大大减少为一个月内即可获得SPF级的后代，可快速获得特定基因型或基因修饰后的大鼠资源。
另外本发明配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系使得高存活效率的大鼠胚胎冻存-复苏技术得以实现，继而使得大鼠种质超低温冷冻保存后的人工辅助生殖能够顺利进行，为大鼠种质资源保存提供保障。
具体实施方式
第一个方面，本发明提供一种大鼠胚胎冻存预处理液，其组成为基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5g/L、抗生素适量。
在一些实例中，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
在一些实例中，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25 mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
第二个方面，本发明提供一种大鼠胚胎冻存-复苏体系，所述冻存-复苏体系包括大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液和大鼠胚胎复苏液，其中：
所述大鼠胚胎冻存预处理液如第一个方面所述；
所述大鼠胚胎冻存保护液的组成为：基础培养基，蔗糖、聚乙烯醇、丙二醇、乙二醇、Percoll®培养基、抗生素；
所述大鼠胚胎复苏液的组成为：基础培养基、聚乙烯醇、蔗糖、抗生素。
在一些实例中，所述大鼠胚胎冻存保护液含有：蔗糖0.3～0.4 mol/L、丙二醇90～150 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、乙二醇 250～400 mL/L、Percoll®培养基120～250mL/L、抗生素适量。
在一些实例中，所述大鼠胚胎复苏液中含有：蔗糖0.3～0.4 mol/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L，抗生素适量。
在一些实例中，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
在一些实例中，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25 mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
在一些实例中，所述大鼠胚胎冻存预处理液的组成为：基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、抗生素适量；
所述大鼠胚胎冻存保护液的组成为：基础培养基，蔗糖0.3～0.4 mol/L、丙二醇90～150 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、乙二醇 250～400 mL/L、Percoll®培养基120～250mL/L、抗生素适量；
所述大鼠胚胎复苏液的组成为：基础培养基，蔗糖0.3～0.4 mol/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L，抗生素适量；
所述基础培养基的组成均为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5 mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
上述的大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液和大鼠胚胎复苏液中，抗生素作用在于抑制操作中无意引入微生物对细胞的生长造成不利影响。在严格无菌的条件下，抗生素的用量可以低至0。抗生素优选抑菌效果好，对细胞基本无毒害作用的抗生物，其用量可以根据已有的文献或教科书确定。在一些实例中，抗生素优选为青霉素和链霉素，更佳的，青霉素的用量为0.04～0.08 mg/mL，链霉素的用量为0.04～0.06mg/mL。
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
本发明各实施例和对比例中使用的大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液、大鼠胚胎复苏液的配置如下：
大鼠胚胎冻存预处理液组成如下：氯化钠101.61 mmol/L，氯化钾4.69 mmol/L，氯化钙 5.14 mmol/L，磷酸二氢钾0.40 mmol/L，硫酸镁0.20 mmol/L，碳酸氢钠25.00 mmol/L，丙酮酸钠 0.30 mmol/L，葡萄糖 2.78 mmol/L，乳酸钠18.36 mmol/L，丙二醇100 mL/L，聚乙烯醇1 g/L，青霉素 0.06 mg/mL，链霉素0.05 mg/ml。其中氯化钠，氯化钾，氯化钙，磷酸二氢钾，硫酸镁，碳酸氢钠，丙酮酸钠，葡萄糖，乳酸钠为基础培养基成分，其作用是为大鼠胚胎细胞提供基础的生存环境。青霉素，链霉素为抗生素，其共同作用为防止操作过程中引入微生物导致大鼠胚胎死亡。聚乙烯醇可减少大鼠胚胎在冻存过程中受到的机械损伤，同时促进细胞内外渗透压平衡。丙二醇可减少冻存过程中细胞内冰晶的形成，减少超低温保存对大鼠胚胎造成的损伤。
大鼠胚胎冻存保护液组成如下：氯化钠101.61 mmol/L，氯化钾4.69 mmol/L，氯化钙 5.14 mmol/L，磷酸二氢钾0.40 mmol/L，硫酸镁0.20 mmol/L，碳酸氢钠25.00 mmol/L，丙酮酸钠 0.30 mmol/L，葡萄糖 2.78 mmol/L，蔗糖 0.35 mol/L，乳酸钠18.36 mmol/L，丙二醇100mL/L，聚乙烯醇1 g/L，乙二醇 300 mL/L，Percoll®（是一种商品化的低黏度密度梯度培养基）200 mL/L，青霉素 0.06 mg/mL，链霉素0.05 mg/ml。其中氯化钠，氯化钾，氯化钙，磷酸二氢钾，硫酸镁，碳酸氢钠，丙酮酸钠，葡萄糖，乳酸钠为基础培养基成分，其作用是为大鼠胚胎细胞提供基础的生存环境。青霉素，链霉素为抗生素，其共同作用为防止操作过程中引入微生物导致大鼠胚胎死亡。聚乙烯醇可减少大鼠胚胎在冻存过程中受到的机械损伤，同时促进细胞内外渗透压平衡。乙二醇，丙二醇可减少冻存过程中细胞内冰晶的形成，减少超低温保存对大鼠胚胎造成的损伤。蔗糖用于调节冻存保护液的渗透压。Percoll®用于减少冻存培养液中冰晶的形成。
大鼠胚胎复苏液组成如下：氯化钠101.61 mmol/L，氯化钾4.69 mmol/L，氯化钙5.14 mmol/L，磷酸二氢钾0.40 mmol/L，硫酸镁 0.20 mmol/L，碳酸氢钠25.00 mmol/L，丙酮酸钠 0.30 mmol/L，葡萄糖 2.78 mmol/L，蔗糖 0.35 mol/L，乳酸钠18.36 mmol/L，聚乙烯醇1 g/L，青霉素 0.06 mg/mL，链霉素0.05 mg/ml。其中氯化钠，氯化钾，氯化钙，磷酸二氢钾，硫酸镁，碳酸氢钠，丙酮酸钠，葡萄糖，乳酸钠为基础培养基成分，其作用是为大鼠胚胎细胞提供基础的生存环境。青霉素，链霉素为抗生素，其共同作用为防止操作过程中引入微生物导致大鼠胚胎死亡。聚乙烯醇可减少大鼠胚胎在冻存过程中受到的机械损伤，同时促进细胞内外渗透压平衡。蔗糖用于调节复苏液的渗透压。
实施例1
使用本发明的大鼠胚胎冻存-复苏体系对SD品系野生型大鼠胚胎进行冻存及复苏实验，具体操作步骤如下：
1）以超纯水为溶剂，分别配制大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液、大鼠胚胎复苏液，充分混匀后，用0.22微米的病毒过滤器过滤，分别做好标记。
2）将待冷冻的大鼠胚胎移入100 μL大鼠胚胎冻存预处理液中，10 min后将大鼠胚胎转移到提前经过0 ℃ 预冷的含有100 μL大鼠胚胎冻存保护液的冻存管内，静置5 min后将冻存管放入液氮中保存。
3）将冻存管从液氮中取出，室温放置，观察管内剩余少量液氮时立刻从二氧化碳培养箱中取出37 ℃ 预热的大鼠胚胎复苏液，打开冻存管盖，立刻加入500 μL 大鼠胚胎复苏液，同时将冻存管放置在37 ℃热台上，静置10 s后用1000 μL移液枪轻柔吹打，液体转移至60 mm培养皿中，之后再吸取300 μL 大鼠胚胎复苏液润洗冻存管壁和管底，减少冻存管内的胚胎丢失，将两次大鼠胚胎复苏液合并，在显微镜下取出存活的大鼠胚胎用于胚胎移植。
实施例2
使用本发明的大鼠胚胎冻存-复苏体系对SD品系基因修饰大鼠胚胎进行冻存及复苏实验，具体实验操作与实施例1相同。
实施例3
使用本发明的大鼠胚胎冻存-复苏体系对Long Evans品系基因修饰大鼠胚胎进行冻存及复苏实验，具体实验操作与实施例1相同。
实施例4
使用本发明的大鼠胚胎冻存-复苏体系对F344品系基因修饰大鼠胚胎进行冻存及复苏实验，具体实验操作与实施例1相同。
对比例1
本对比例使用小鼠冻存常用的EFS20/40体系对SD品系野生型大鼠胚胎进行冻存及复苏，具体实验操作与实施例1相同。
对比例2
本对比例中仅使用前文所述的大鼠胚胎冻存保护液对SD品系野生型大鼠胚胎进行冻存及复苏，其余具体实验操作与实施例1相同。
对比例3
本对比例中仅使用前文所述的大鼠胚胎冻存保护液及大鼠胚胎复苏液对SD品系野生型大鼠胚胎进行冻存及复苏，其余具体实验操作与实施例1相同。
对比例4
本对比例将大鼠胚胎冻存预处理液中的丙二醇替换成相同浓度的乙二醇，随后对SD品系野生型大鼠胚胎进行冻存及复苏，其余具体实验操作与实施例1相同。
对比例5
本对比例将大鼠胚胎冻存保护液的Percoll®替换成相同浓度的Ficoll®，随后对SD品系野生型大鼠胚胎进行冻存及复苏，其余具体实验操作与实施例1相同。
实施例1～4对比例1～5的实验结果如表1所示。
表1 各分组胚胎冻存效率
从表1中的实施例1配套使用本发明中的大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液、大鼠胚胎复苏液可同时提高大鼠胚胎冻存后的存活率和移植后出生率，即进一步明显提高大鼠胚胎冻存的效率。
实施例1-4可以看出，本发明中配套使用的大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液及大鼠胚胎复苏液能够在不同品系的大鼠中达到相似的提高大鼠胚胎冻存效率的效果。
对比例2相比于对比例1，单独使用本发明中的大鼠胚胎冻存保护液可提高大鼠胚胎冻存后移植出生率，即提升了大鼠胚胎冻存的效率；
对比例4与实施例1相比，在大鼠胚胎冻存预处理液中选择丙二醇效果明显优于乙二醇，说明本发明中选择的关键添加物能达到提高大鼠胚胎冻存效率的效果；
对比例5与实施例1相比，在大鼠胚胎冻存保护液中选择Percoll®培养基的效果明显优于Ficoll®，说明本发明中选择的关键添加物能达到提高大鼠胚胎冻存效率的效果。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种大鼠胚胎冻存预处理液，其组成为基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、抗生素适量。
2.根据权利要求1所述的大鼠胚胎冻存预处理液，其特征在于，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
3.根据权利要求2所述的大鼠胚胎冻存预处理液，其特征在于，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5 mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25 mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
4.一种大鼠胚胎冻存-复苏体系，其特征在于，所述冻存-复苏体系包括大鼠胚胎冻存预处理液、大鼠胚胎冻存保护液和大鼠胚胎复苏液，其中：
所述大鼠胚胎冻存预处理液如权利要求1～3任一项所述；
所述大鼠胚胎冻存保护液的组成为：基础培养基，蔗糖、聚乙烯醇、丙二醇、乙二醇、Percoll®培养基、抗生素；
所述大鼠胚胎复苏液的组成为：基础培养基、聚乙烯醇、蔗糖、抗生素。
5.根据权利要求4所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述大鼠胚胎冻存保护液含有：蔗糖0.3～0.4 mol/L、丙二醇90～150 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、乙二醇 250～400mL/L、Percoll®培养基120～250 mL/L、抗生素适量。
6.根据权利要求4所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述大鼠胚胎复苏液中含有：蔗糖0.3～0.4 mol/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L，抗生素适量。
7.根据权利要求4～6任一项所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述基础培养基的组分包括：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、磷酸二氢根离子、硫酸根离子、碳酸氢根离子、丙酮酸根离子、乳酸根离子、葡萄糖。
8.根据权利要求7所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述基础培养基的组成为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5 mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25 mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
9.根据权利要求7所述的冻存-复苏体系，其特征在于，所述大鼠胚胎冻存预处理液的组成为：基础培养基，丙二醇95～110 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、抗生素适量；
所述大鼠胚胎冻存保护液的组成为：基础培养基，蔗糖0.3～0.4 mol/L、丙二醇90～150 mL/L、聚乙烯醇0.8～1.5 g/L、乙二醇 250～400 mL/L、Percoll®培养基120～250 mL/L、抗生素适量；
所述大鼠胚胎复苏液的组成为：基础培养基，蔗糖0.3～0.4 mol/L、聚乙烯醇0.8～1.5g/L，抗生素适量；
所述基础培养基的组成均为：氯化钠95～105 mmol/L，氯化钾4～5 mmol/L，氯化钙5～6 mmol/L，磷酸二氢钾0.3～0.5 mmol/L，硫酸镁 0.2～0.3 mmol/L，碳酸氢钠24～25mmol/L，丙酮酸钠 0.3～0.4 mmol/L，乳酸钠17.5～19.0 mmol/L，葡萄糖2～3.5 mmol/L。
10.权利要求4～9任一项所述的冻存-复苏体系在保存大鼠胚胎中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311514202.3A CN117356559A (zh) | 2023-11-14 | 2023-11-14 | 一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311514202.3A CN117356559A (zh) | 2023-11-14 | 2023-11-14 | 一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117356559A true CN117356559A (zh) | 2024-01-09 |
Family
ID=89402336
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311514202.3A Pending CN117356559A (zh) | 2023-11-14 | 2023-11-14 | 一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117356559A (zh) |
-
2023
- 2023-11-14 CN CN202311514202.3A patent/CN117356559A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Condello et al. | Cryopreservation of apple in vitro axillary buds using droplet-vitrification | |
| CN104663649B (zh) | 人类卵母细胞冷冻保护剂 | |
| CN106755250B (zh) | 一种雨生红球藻绿色细胞保藏以及虾青素诱导的规模化生产方法 | |
| JP2003517276A (ja) | 体外受精のための系及び連続的培養液 | |
| CN107142241B (zh) | 一种提高猪卵母细胞体外成熟质量和发育潜力的培养液及其培养方法 | |
| CN111789104A (zh) | 一种冷冻保存液在干细胞冻存中的应用 | |
| JP5470597B2 (ja) | 希少糖ｄ−アロースを利用した細胞・組織・臓器保存液及び該液を用いる保存方法 | |
| CN110100813B (zh) | 一种羊胚胎玻璃化冷冻保存液配方及冷冻方法 | |
| CN115708506A (zh) | 一种马氏珠母贝精子低温保存方法 | |
| Aljaser | Cryopreservation methods and frontiers in the art of freezing life in animal models | |
| Chen et al. | Cryopreservation of tissues and organs: present, bottlenecks, and future | |
| CN111849872B (zh) | 一种非治疗不孕的提高解冻后猪精子体外受精效果的方法 | |
| CN117356559A (zh) | 一种配套使用的大鼠胚胎冻存-复苏体系及其应用 | |
| Anthony et al. | Pluronic F-68 increases the post-thaw growth of cryopreserved plant cells | |
| Fahy | Vitrification as an approach to organ cryopreservation: past, present, and future | |
| CN114214201B (zh) | 一种海洋微拟球藻长期稳定保存的方法 | |
| CN114431222A (zh) | 一种用于人神经干细胞的细胞冻存液 | |
| Chen et al. | Cryopreservation of woody species | |
| Fki et al. | In vitro cryopreservation of date palm caulogenic meristems | |
| CN108117993B (zh) | 一种反硝化菌的保藏方法 | |
| JP6857874B2 (ja) | マウス精子の冷蔵保存液及び保存方法 | |
| KR100838699B1 (ko) | 낙엽송 체세포배를 이용한 초저온저장 기술 및 배발생조직유도방법 | |
| CN117247896A (zh) | 一种提高大鼠体外受精效率的培养液组合及方法 | |
| CN111286485B (zh) | 辛酰化Ghrelin在体外抑制卵丘细胞复合体cAMP和MAPK分泌中的应用 | |
| CN111466294B (zh) | 一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |