CN117343862A - 一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，每100mL菌剂包含以下组分：产黄纤维单胞菌发酵液2mL、弗氏柠檬酸杆菌发酵液10mL、蒸馏水88mL和添加剂10份。本发明提供的微生物液体菌剂，包含产黄纤维单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌两种微生物，具有组成简单的优点。这两种微生物在以纤维素类生物质为碳源时，产黄纤维单胞菌能够降解秸秆产生乙酸为弗氏柠檬酸杆菌提供能源，这一菌种间的互作提高了秸秆降解效率，具有实用性高的优点。以本发明提供的微生物液体菌剂为催化剂，MFCs能够利用秸秆产电，且产电性能优于现有技术，增加了本发明的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂。
背景技术
农业废弃物作为纤维素类生物质是最丰富的可再生资源之一，一直深受研究者们的广泛关注和研究。近年来，随着能源消费结构改善和各类替代原料的应用，加上农业废弃物综合利用成本高、经济性差、产业化程度低等原因，开始出现了地区性、季节性、结构性的农业废弃物过剩，不仅浪费资源、污染环境，还严重威胁交通运输安全。农业废弃物综合利用技术的开发研究势在必行。微生物燃料电池(Microbial fuel cells，MFCs)作为一种新型绿色能源技术，可以以微生物作为催化剂直接将有机物中的化学能转化为电能。MFCs的这一特点体现出其在处理农业废弃物方面的巨大科研潜力和应用价值，受到研究者们的青睐和深入研究。此外，MFCs利用农业废弃物产电后产生的残渣是很好的肥料，可作为有机肥料还田，提高农业废弃物资源的利用效率。因此，利用MFCs处理农业废弃物的应用研究已成为一个热门话题。
各种未被纯培养的混合培养物已被广泛用作MFCs的催化剂，将纤维素类生物质中的化学能转化为电能，然而由于这些未被纯培养的混合培养物菌种的未知性和微生物相互作用机制不明确，导致这些混合培养物的能量转换效率难以进一步优化，而混合培养物的生物群落结构也容易因周围环境变化而改变。因此，开发同时具有纤维素降解能力和电化学活性的纯培养物受到研究者们的青睐。但是到目前为止，只有阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)和粪纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)同时被报道具有纤维素降解活性和电化学活性双重功能，然而这些纯培养菌株以纤维素类生物质为碳源时的产电性能也较低。此外，纯培养菌株以纤维素类生物质为碳源产电的研究也未见报道。因此开发能够利用纤维素类生物质产电的新菌种是国内外的重要发展趋势之一。
微生物在以纤维素类生物质为碳源进行生长时，能够代谢如乙酸、丙酸等小分子有机物，而这些代谢产物能否被其他电化学活性微生物所利用是提高MFCs产电性能和纤维素类生物质降解效率的关键因素之一。因此，二元共培养产电体系的构建受到研究者的关注。目前仅有解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)和硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)以及吉氏纤维素菌(Cellulomonas gilvus)和硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)构建的二元产电体系能够利用纤维素产电，但是产电性能较低。因此，构建高效降解农业秸秆的二元产电体系，并以此研发相应的微生物菌剂是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，该微生物液体菌剂有效成分包含产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)两种微生物，组成简单，产电性能更优，同时避免了菌种太复杂不利于工程实施的难题。
产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)现已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号JCM18109。
弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)现已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号XM-114。
此外，对比例中使用的菌种：
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)现已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号DSM36。
粪纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)现已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号JCM1341。
为实现上述目的，本发明是采用以下技术方案实现的：
一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，每100mL菌剂包含以下组分：产黄纤维单胞菌发酵液2mL、弗氏柠檬酸杆菌发酵液10mL、蒸馏水88mL和添加剂10份。
进一步地，所述产黄纤维单胞菌发酵液中产黄纤维单胞菌的含量达到2×107CFU/mL以上。
进一步地，所述弗氏柠檬酸杆菌发酵液中弗氏柠檬酸杆菌的含量达到2×108CFU/mL以上。
进一步地，所述添加剂包括氯化钾、氯化铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、微量元素和维生素。
进一步地，所述微量元素包括MnCl2·4H2O、FeSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、ZnCl2、NiCl2、N(CH2COOH)3、CuSO4·5H2O、Na2SeO4、H3BO3、Na2MoO4和Na2WO4·6H2O。
进一步地，所述维生素包括叶酸、维生素B6、核黄素、生物素、维生素B1、烟酸、泛酸钙、维生素B12、对氨基苯甲酸和硫辛酸。
进一步地，所述产黄纤维单胞菌发酵液的制备方法为：按照1％的接种量，将产黄纤维单胞菌种子液接种至产黄纤维单胞菌发酵培养基中，厌氧发酵，控制发酵温度为37±1℃，当发酵液中的活菌数达到2×107CFU/mL时，停止发酵。
进一步地，所述弗氏柠檬酸杆菌发酵液的制备方法为：按照1％的接种量，将弗氏柠檬酸杆菌种子液接种至弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基中，厌氧发酵，控制发酵温度为37±1℃，当发酵液中的活菌数达到2×108CFU/mL时，停止发酵。
进一步地，所述产黄纤维单胞菌发酵培养基包括：羧甲基纤维素钠4g、氯化钾0.1g、氯化铵1.5g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁0.1g、氯化钙0.1g、微量元素5mL和维生素10mL，蒸馏水1000mL(于121℃条件下灭菌20min)。
进一步地，所述弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基包括：乙酸钠1.64g、氯化钾0.1g、氯化铵1.5g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁0.1g、氯化钙0.1g、微量元素5mL和维生素10mL，蒸馏水1000mL(于121℃条件下灭菌20min)。
本发明还提供了上述微生物液体菌剂利用玉米秸秆和小麦秸秆在MFCs中的产电性能。
本发明的有益效果如下：
1、本发明提供的微生物液体菌剂，包含产黄纤维单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌两种微生物，具有组成简单的优点。通过本发明的实验可以看出，这两种微生物在以纤维素类生物质为碳源时，产黄纤维单胞菌能够降解秸秆产生乙酸为弗氏柠檬酸杆菌提供能源，这一菌种间的互作提高了秸秆降解效率，具有实用性高的优点。
2、以本发明提供的微生物液体菌剂为催化剂，MFCs能够利用秸秆产电，且产电性能优于现有技术，主要原因为产黄纤维单胞菌能够分泌电子传递介体核黄素，利用微生物与电极间电子传递，提高MFCs的产电性能，增加了本发明的实用性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，每100mL菌剂包含以下组分：产黄纤维单胞菌发酵液2mL、弗氏柠檬酸杆菌发酵液10mL、蒸馏水88mL和添加剂1份。
作为本发明的一种可选技术方案：产黄纤维单胞菌发酵液中产黄纤维单胞菌的含量达到2×107CFU/mL以上。
作为本发明的一种可选技术方案：弗氏柠檬酸杆菌发酵液中弗氏柠檬酸杆菌的含量达到2×108CFU/mL以上。
作为本发明的一种可选技术方案：添加剂包括氯化钾0.01g、氯化铵0.15g、磷酸二氢钾0.06g、硫酸镁0.01g、氯化钙0.01g、微量元素0.5mL和维生素1mL。
作为本发明的一种可选技术方案：微量元素包括MnCl2·4H2O：0.1g、FeSO4·7H2O：0.5g、CoCl2·6H2O：0.17g、ZnCl2：0.1g、NiCl2：0.05g、N(CH2COOH)3：1.5g、CuSO4·5H2O：0.03g、Na2SeO4：0.1g、H3BO3：0.005g、Na2MoO4：0.09g和Na2WO4·6H2O：0.02g，蒸馏水1000mL。
作为本发明的一种可选技术方案：维生素包括叶酸0.002g、维生素B6：0.01g、核黄素0.005g、生物素0.002g、维生素B1：0.005g、烟酸0.005g、泛酸钙0.005g、维生素B12：0.0001g、对氨基苯甲酸0.005g和硫辛酸0.005g，蒸馏水1000mL。
作为本发明的一种可选技术方案：产黄纤维单胞菌发酵液的制备方法为：按照1％的接种量，将产黄纤维单胞菌种子液接种至产黄纤维单胞菌发酵培养基中，厌氧发酵，控制发酵温度为37±1℃，当发酵液中的活菌数达到2×107CFU/mL时，停止发酵。
作为本发明的一种可选技术方案：弗氏柠檬酸杆菌发酵液的制备方法为：按照1％的接种量，将弗氏柠檬酸杆菌种子液接种至弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基中，厌氧发酵，控制发酵温度为37±1℃，当发酵液中的活菌数达到2×108CFU/mL时，停止发酵。
作为本发明的一种可选技术方案：产黄纤维单胞菌发酵培养基包括：羧甲基纤维素钠4g、氯化钾0.1g、氯化铵1.5g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁0.1g、氯化钙0.1g、微量元素5mL和维生素10mL，蒸馏水1000mL(于121℃条件下灭菌20min)。
作为本发明的一种可选技术方案：弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基包括：乙酸钠1.64g、氯化钾0.1g、氯化铵1.5g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁0.1g、氯化钙0.1g、微量元素5mL和维生素10mL，蒸馏水1000mL(于121℃条件下灭菌20min)。
对比例1
与实施例1的区别在于未添加产黄纤维单胞菌发酵液。
对比例2
与实施例1的区别在于未添加弗氏柠檬酸杆菌发酵液。
对比例3
与实施例1的区别在于将产黄纤维单胞菌替换为多粘类芽孢杆菌。
对比例4
与实施例1的区别在于将产黄纤维单胞菌替换为粪纤维单胞菌。
实验组1微生物液体菌剂以羧甲基纤维素钠为碳源的产电性能
实验例1.1
取100mL实施例1液体菌剂和羧甲基纤维素钠0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为687mV，最大输出功率密度为712mW/m2。
实验例1.2
取100mL实施例1液体菌剂，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为0mV，最大输出功率密度为0mW/m2。
实验例1.3
取100mL对比例1液体菌剂和羧甲基纤维素钠0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为0mV，最大输出功率密度为0mW/m2。
实验例1.4
取100mL对比例2液体菌剂和羧甲基纤维素钠0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为82mV，最大输出功率密度为10.04mW/m2。
实验例1.5
取100mL对比例3液体菌剂和羧甲基纤维素钠0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为0mV，最大输出功率密度为0mW/m2。
实验例1.6
取100mL对比例4液体菌剂和羧甲基纤维素钠0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为456mV，最大输出功率密度为492mW/m2。
实验例1.1-1.6微生物液体菌剂以羧甲基纤维素钠为碳源的产电性能如下表：
| 实验组1 | 微生物液体菌剂 | 碳源 | 输出电压 | 输出功率密度 |
| 实验例1.1 | 实施例1液体菌剂100mL | 羧甲基纤维素钠0.4g | 687mV | 712mW/m2 |
| 实验例1.2 | 实施例1液体菌剂100mL | 0g | 0mV | 0mW/m2 |
| 实验例1.3 | 对比例1液体菌剂100mL | 羧甲基纤维素钠0.4g | 0mV | 0mW/m2 |
| 实验例1.4 | 对比例2液体菌剂100mL | 羧甲基纤维素钠0.4g | 82mV | 10.04mW/m2 |
| 实验例1.5 | 对比例3液体菌剂100mL | 羧甲基纤维素钠0.4g | 0mV | 0mW/m2 |
| 实验例1.6 | 对比例4液体菌剂100mL | 羧甲基纤维素钠0.4g | 456mV | 492mW/m2 |
通过上述对比发现实验例1.1中的实施例1液体菌剂以羧甲基纤维素钠为碳源的产电性能较高，实验例1.2-1.6的产电性能均低于实验例1.1。
实验组2微生物液体菌剂以玉米秸秆为碳源的产电性能
玉米秸秆处理方法如下：
取摘去果实的整株玉米，经粉碎机粉碎后，过40目筛，获得直径小于0.5mm的玉米秸秆粉末，于MFCs阳极室中用作微生物液体菌剂的碳源。
实验例2.1
取100mL实施例1液体菌剂和上述玉米秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为648mV，最大输出功率密度为676mW/m2。
实验例2.2
取100mL对比例1液体菌剂和上述玉米秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为144mV，最大输出功率密度为66mW/m2。
实验例2.3
取100mL对比例2液体菌剂和上述玉米秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为50mV，最大输出功率密度为6.54mW/m2。
实验例2.4
取100mL对比例3液体菌剂和上述玉米秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为90mV，最大输出功率密度为51mW/m2。
实验例2.5
取100mL对比例4液体菌剂和上述玉米秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为412mV，最大输出功率密度为450mW/m2。
实验例2.1-2.5微生物液体菌剂以玉米秸秆为碳源的产电性能如下表：
通过上述对比发现实验例2.1中的实施例1液体菌剂以玉米秸秆为碳源的产电性能较高，实验例2.2-1.5的产电性能均低于实验例2.1。
实验组3微生物液体菌剂以小麦秸秆为碳源的产电性能
小麦秸秆处理方法如下：
取摘去果实的整株小麦，经粉碎机粉碎后，过40目筛，获得直径小于0.5mm的小麦秸秆粉末，于MFCs阳极室中用作微生物液体菌剂的碳源。
实验例3.1
取100mL实施例1液体菌剂和上述小麦秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为413mV，最大输出功率密度为285mW/m2。
实验例3.2
取100mL对比例1液体菌剂和上述小麦秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为50mV，最大输出功率密度为6.9mW/m2。
实验例3.3
取100mL对比例2液体菌剂和上述小麦秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为63mV，最大输出功率密度为5.8mW/m2。
实验例3.4
取100mL对比例3液体菌剂和上述小麦秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为41mV，最大输出功率密度为5.2mW/m2。
实验例3.5
取100mL对比例4液体菌剂和上述小麦秸秆粉末0.4g，于121℃条件下灭菌20min后，添加到MFCs阳极室，于30±1℃条件下运行MFCs，使用电化学工作站每10分钟记录一次输出电压，并计算MFCs的功率密度，最大输出电压为329mV，最大输出功率密度为196mW/m2。
实验例3.1-3.5微生物液体菌剂以小麦秸秆为碳源的产电性能如下表：
| 实验组3 | 微生物液体菌剂 | 碳源 | 输出电压 | 输出功率密度 |
| 实验例3.1 | 实施例1液体菌剂100mL | 小麦秸秆粉末0.4g | 413mV | 285mW/m2 |
| 实验例3.2 | 对比例1液体菌剂100mL | 小麦秸秆粉末0.4g | 50mV | 6.9mW/m2 |
| 实验例3.3 | 对比例2液体菌剂100mL | 小麦秸秆粉末0.4g | 63mV | 5.8mW/m2 |
| 实验例3.4 | 对比例3液体菌剂100mL | 小麦秸秆粉末0.4g | 41mV | 5.2mW/m2 |
| 实验例3.5 | 对比例4液体菌剂100mL | 小麦秸秆粉末0.4g | 329mV | 196mW/m2 |
通过上述对比发现实验例3.1中的实施例1液体菌剂以小麦秸秆为碳源的产电性能较高，实验例3.2-3.5的产电性能均低于实验例3.1。
综上所述：本发明提供的微生物液体菌剂，包含产黄纤维单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌两种微生物，这两种微生物在以纤维素类生物质为碳源时，产黄纤维单胞菌能够降解秸秆产生乙酸为弗氏柠檬酸杆菌提供能源，这一菌种间的互作提高了秸秆降解效率。以本发明提供的微生物液体菌剂为催化剂，MFCs能够利用秸秆产电，且产电性能优于现有技术，主要原因为产黄纤维单胞菌能够分泌电子传递介体核黄素，利用微生物与电极间电子传递，提高MFCs的产电性能。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：每100mL菌剂包含以下组分：产黄纤维单胞菌发酵液2mL、弗氏柠檬酸杆菌发酵液10mL、蒸馏水88mL和添加剂10份。
2.根据权利要求1所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述产黄纤维单胞菌发酵液中产黄纤维单胞菌的含量达到2×107CFU/mL以上。
3.根据权利要求1所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述弗氏柠檬酸杆菌发酵液中弗氏柠檬酸杆菌的含量达到2×108CFU/mL以上。
4.根据权利要求1所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述添加剂包括氯化钾、氯化铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、微量元素和维生素。
5.根据权利要求4所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述微量元素包括MnCl2·4H2O、FeSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、ZnCl2、NiCl2、N(CH2COOH)3、CuSO4·5H2O、Na2SeO4、H3BO3、Na2MoO4和Na2WO4·6H2O。
6.根据权利要求4所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述维生素包括叶酸、维生素B6、核黄素、生物素、维生素B1、烟酸、泛酸钙、维生素B12、对氨基苯甲酸和硫辛酸。
7.根据权利要求1所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述产黄纤维单胞菌发酵液的制备方法为：按照1％的接种量，将产黄纤维单胞菌种子液接种至产黄纤维单胞菌发酵培养基中，厌氧发酵，控制发酵温度为37±1℃，当发酵液中的活菌数达到2×107CFU/mL时，停止发酵。
8.根据权利要求7所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述产黄纤维单胞菌发酵培养基包括：羧甲基纤维素钠、氯化钾、氯化铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、微量元素和维生素，蒸馏水1000mL。
9.根据权利要求1所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述弗氏柠檬酸杆菌发酵液的制备方法为：按照1％的接种量，将弗氏柠檬酸杆菌种子液接种至弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基中，厌氧发酵，控制发酵温度为37±1℃，当发酵液中的活菌数达到2×108CFU/mL时，停止发酵。
10.根据权利要求9所述的一种利用纤维素类生物质产电的微生物液体菌剂，其特征在于：所述弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基包括：乙酸钠、氯化钾、氯化铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、微量元素和维生素，蒸馏水1000mL。
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