CN117327742A - 一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，包括步骤：选取靶序列、设计TALENs识别位点，合成识别TALENs识别位点的核酸酶序列；构建TALENs表达模块载体，合成组装新合成莱茵衣藻基因组；质粒转化莱茵衣藻，筛选、功能验证转化的莱茵衣藻，实现新合成基因组替换野生型基因组和同质化。该技术方法基于莱SDRs在莱茵衣藻叶绿体基因组分布均匀的特点，通过设计合成不含TALEN识别位点且包含TALENs表达模块的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组，转化莱茵衣藻后，新合成基因组免于被TALENs切割，而被TALENs切割成片段的野生型基因组被降解，实现了莱茵衣藻叶绿体中新合成基因组将野生型基因组序列替换。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法。
背景技术
将人工合成DNA组装成较大的DNA片段甚至是全基因组后，需要用这些合成的序列替换掉原有的野生型序列，并保持原有细胞的存活。对于拥有小型基因组的病毒如Poliovirus，合成的基因组cDNA可通过RNA聚合酶转录成病毒RNA，然后就可以体外在细胞提取液中进行翻译和复制，组装成一个有功能的病毒颗粒。对于基因组较大的原核生物和真核生物，基因组替换的过程要困难许多。对于在酵母中组装完成的基因组(Mycoplasmagenitalium、Mycoplasmamycoides和JCVI-syn3.0最小基因组)，可以通过原生质体融合来实现酵母和其他生物间基因组的快速转移。而对于酵母自身基因组的合成，则采用了基于同源重组的逐步替换的方法。对于酵母以外的生物，直接依赖于自身的同源重组系统并不能够满足快速进行基因组替换的需求。
C.reinhardtii叶绿体基因组最显著的特征为含有自身含量～20％的重复DNA序列，大多数基因间区域由多种类型的短散布重复序列(short dispersed repeats(SDRs))组成，通过比对C.reinhardtii叶绿体基因组与其他叶绿体基因组的序列相似性及DNA重复性，发现尽管一些SDRs可能来自于其他基因组片段，但大部分的SDRs并非来自现存的编码序列。在包括陆生植物和绿藻在内的绿色植物中，已测序的叶绿体基因组中只有小球藻具有大量的SDRs，但令人惊讶的是，小球藻和C.reinhardtii的SDRs之间几乎没有序列相似性，表明SDRs扩增可能有共同的机制，但在序列上保持独立。SDRs在C.reinhardtii叶绿体基因组中均匀分布，引发了对其起源和功能问题的探索。莱茵衣藻叶绿体中包含80-100个拷贝的基因组，新合成的基因组如何有效且快速地替换天然野生型基因组仍旧是一个很大的挑战。
因此，现有技术仍有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，通过利用TALENs(transcription activator-likeeffectornucleases，转录激活因子样效应子核酸酶)技术转化莱茵衣藻叶绿体基因组，旨在解决如何有效快速地实现将新合成莱茵衣藻叶绿体基因组替换野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的问题。
具体地，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，包括：
步骤S1、选取莱茵衣藻叶绿体基因组中短散布重复序列SDRs作为TALENs靶序列，设计TALENs识别位点；
步骤S2、设计识别所述TALENs识别位点的核酸酶蛋白质序列，合成得到编码所述核酸酶的核苷酸序列；
步骤S3、构建TALENs表达模块载体；
步骤S4、合成组装新合成莱茵衣藻基因组，所述新合成莱茵衣藻基因组包括不含所述TALENs识别位点的莱茵衣藻叶绿体基因组、所述TALENs表达模块、抗性筛选标记和PCR水印标签；
步骤S5、将所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组转入大肠杆菌中扩繁质粒，将所述质粒转化进入野生型莱茵衣藻叶绿体中；
步骤S6、筛选、功能验证转化的莱茵衣藻细胞，实现新合成莱茵衣藻叶绿体基因组对野生型莱茵衣藻叶绿体的替换和同质化。
可选地，所述步骤S1中，所述TALENs靶序列长度为49-51bp；
可选地，所述步骤S1中，所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
可选地，所述步骤S1中，所述TALENs识别位点包括TALENs左臂识别位点和TALENs右臂识别位点，所述TALENs左臂识别位点或所述TALENs右臂识别位点的序列长度为16-17bp，所述TALENs左臂位点和所述TALENs右臂识别位点之间的间隔序列长度为14bp。
可选地，当所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列时，所诉TALENs左臂识别位点为2-18位核苷酸，记为1L；所述TALENs右臂识别位点为33-49位核苷酸，记为1R；
当所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列时，所述TALENs左臂识别位点为4-20位核苷酸，记为2L；所述TALENs右臂识别位点为35-50位核苷酸，记为2R。
可选地，所述步骤S2中，所述核酸酶包括识别所述TALENs识别位点的TAL效应蛋白和Fok I限制性核酸內切酶；
其中，识别1L的所述核酸酶为由SEQ ID NO.7所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-1L，所述TALEN-1L包括TAL效应蛋白TAL-1L和Fok I限制性核酸內切酶；
识别1R的所述核酸酶由SEQ ID NO.8所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-1R，所述TALEN-1R包括TAL效应蛋白TAL-1R和Fok I限制性核酸內切酶；
识别2L的所述核酸酶为由SEQ ID NO.9所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-2L，所述TALEN-2L包括TAL效应蛋白TAL-2L和Fok I限制性核酸內切酶；
识别2R的所述核酸酶由SEQ ID NO.10所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-2R，所述TALEN-2R包括TAL效应蛋白TAL-2R和Fok I限制性核酸內切酶。
可选地，所述步骤S3中,，所述TALENs表达模块包括启动子atpA、所述SEQ ID NO.7核苷酸序列的ORF、连接片段IEE、所述SEQ ID NO.8核苷酸序列的ORF和rbcL3’终止子；
或者，所述TALENs表达模块载体包括启动子atpA、所述SEQ ID NO.9核苷酸序列的ORF、连接片段IEE、所述SEQ ID NO.10核苷酸序列的ORF和rbcL3’终止子。
可选地，所述步骤S4中，所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组全长为194,336bp。
可选地，所述步骤S4中，所述抗性筛选标记包括aadA、aphVIII和cat。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，该技术方法基于短散布重复序列SDRs在莱茵衣藻叶绿体基因组分布均匀的特点，通过设计合成不含TALEN识别位点且包含TALENs表达模块的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组，质粒转化入莱茵衣藻叶绿体后，新合成基因组免于被TALENs切割，而被TALENs切割成片段的野生型基因组被降解，实现了在转化的莱茵衣藻叶绿体中新合成基因组将野生型基因组序列替换并同质化的目的，本发明所提供的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法对新合成基因组替换原有野生型基因组具有着重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例中所设计构建的TALENs表达模块载体的质粒图。
具体实施方式
本发明提供一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
发明人想到利用TELENs基因编辑技术，组装合成的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组中删除了TALENs识别位点，且同时插入识别天然基因组短散布重复序列(SDRs)并进行剪切的TALENs，在新合成莱茵衣藻叶绿体基因组转化入莱茵衣藻叶绿体以后，表达的核酸酶中TAL效应蛋白可与识别位点DNA结合，Fok I限制性核酸內切酶在识别的SDRs位点对DNA链进行切割，而新合成莱茵衣藻叶绿体基因组中由于不含这些被识别的短散布重复序列(SDRs)而免于被切割，但会对野生型基因组进行持续的切割，切割成片段的野生型基因组最终会被自身核酸酶降解，因而实现了新合成莱茵衣藻叶绿体基因组高效替换野生型莱茵衣藻叶绿体基因组序列并同质化的目的。
本发明实施例提供一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，包括以下步骤：
S1、选取莱茵衣藻叶绿体基因组中短散布重复序列SDRs作为TALENs靶序列，设计TALENs识别位点；
S2、设计识别所述TALENs识别位点的核酸酶蛋白质序列，合成得到编码所述核酸酶的核苷酸序列；
S3、构建TALENs表达模块载体；
S4、合成组装新合成莱茵衣藻基因组，所述新合成莱茵衣藻基因组包括不含所述TALENs识别位点的莱茵衣藻叶绿体基因组、所述TALENs表达模块、抗性筛选标记和PCR水印标签；
S5、将所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组转入大肠杆菌中扩繁质粒，将所述质粒转化进入野生型莱茵衣藻叶绿体中；
S6、筛选、功能验证转化的莱茵衣藻细胞，实现新合成莱茵衣藻叶绿体基因组对野生型莱茵衣藻叶绿体的替换和同质化。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述TALENs靶序列长度为49-51bp；
在一些实施方式中，步骤S1中，所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.1和/或SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述TALENs识别位点包括TALENs左臂识别位点和TALENs右臂识别位点，所述TALENs左臂识别位点或所述TALENs右臂识别位点的序列长度为16-17bp，所述TALENs左臂位点和所述TALENs右臂识别位点之间的间隔序列长度为14bp。
在一些实施方式中，当所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列时，所诉TALENs左臂识别位点为2-18位核苷酸，记为1L；所述TALENs右臂识别位点为33-49位核苷酸，记为1R；
当所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列时，所述TALENs左臂识别位点为4-20位核苷酸，记为2L；所述TALENs右臂识别位点为35-50位核苷酸，记为2R。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述核酸酶包括识别所述TALENs识别位点的TAL效应蛋白和Fok I限制性核酸內切酶；
其中，识别1L的所述核酸酶为由SEQ ID NO.7所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-1L，所述TALEN-1L包括TAL效应蛋白TAL-1L和Fok I限制性核酸內切酶；
识别1R的所述核酸酶由SEQ ID NO.8所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-1R，所述TALEN-1R包括TAL效应蛋白TAL-1R和Fok I限制性核酸內切酶；
识别2L的所述核酸酶为由SEQ ID NO.9所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-2L，所述TALEN-2L包括TAL效应蛋白TAL-2L和Fok I限制性核酸內切酶；
识别2R的所述核酸酶由SEQ ID NO.10所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-2R，所述TALEN-2R包括TAL效应蛋白TAL-2R和Fok I限制性核酸內切酶。
在一些实施方式中，所述步骤S3中，所述TALENs表达模块包括启动子atpA、所述SEQ ID NO.7核苷酸序列的ORF、连接片段IEE、所述SEQ ID NO.8核苷酸序列的ORF和rbcL3’终止子；
或者，所述TALENs表达模块载体包括启动子atpA、所述SEQ ID NO.9核苷酸序列的ORF、连接片段IEE、所述SEQ ID NO.10核苷酸序列的ORF和rbcL3’终止子。
在一些实施方式中，所述步骤S4中，所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组全长为194,336bp。新合成莱茵衣藻叶绿体基因组全长为194,336bp具体包括：186,890bp的不含TALENs模块的合成叶绿体基因组(删除TALENs识别位点的莱茵衣藻叶绿体基因组、aadA、aphVIII和cat抗性筛选标记、和PCR水印标签)，以及两个分别包含TALENs左臂右臂模块的片段，atpA-1L-IEE、atpA-1R-IEE或者为atpA-2L-IEE、atpA-2R-IEE。
在一些实施方式中，所述步骤S4中，所述抗性筛选标记包括aadA、aphVIII和cat。
下面以具体的实施例对本发明的方案作进一步的说明。
实施例1
1.选取TALENs靶序列和设计TALENs识别位点
利用Blast比对软件，让莱茵衣藻叶绿体基因组与其自身进行比较，选取长度约为50bp的在莱茵衣藻叶绿体基因组上重复出现的片段，定位TALENs识别位点，本发明中选取的两处片段序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
根据此两段序列，设计第一处TALENs左臂识别位点为1L：TATGTAAACCCCTTCGG，
右臂识别位点为1R：TCGCAGTATATAAATAT；
设计第二处TALENs左臂识别位点为2L：TGGCAGTGGTACCGCCA，
右臂识别位点为2R：CTTCGGAGTATGTAAA。
2.设计核酸酶蛋白质序列，合成核苷酸序列
根据TALENs识别位点的序列，设计核酸酶蛋白质序列，分别如蛋白质序列SEQ IDNO.3-SEQ ID NO.6所示。核酸酶蛋白质分别记为TALEN-1L、TALEN-1R、TALEN-2L、TALEN-2R。
将设计的TALEN蛋白序列转为DNA序列，根据莱茵衣藻叶绿体基因组进行密码子优化，然后委托序列合成公司进行合成。编码核酸酶蛋白质序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.7-SEQ ID NO.10所示，分别记为TALEN-1L-Dna、TALEN-1R-Dna、TALEN-2L-Dna、TALEN-2R-Dna。
3.设计构建TALENs表达模块载体
TALENs表达模块载体的质粒如图1所示，启动子atpA加上表达TALEN-1L的SEQ IDNO.7核苷酸序列的ORF、连接片段IEE、表达TALEN-1R的SEQ ID NO.8核苷酸序列的ORF，然后加上rbcL3’终止子。利用莱茵衣藻中的多基因表达模式可以在莱茵衣藻叶绿体中表达两个基因，在表达模式中加入抗性筛选标记aada，aada基因使用psaA基因的启动子和终止子。或者质粒为启动子atpA加上表达TALEN-2L的SEQ ID NO.9核苷酸序列ORF，加上连接片段IEE，加上表达TALEN-2R的SEQ ID NO.10核苷酸序列ORF，然后加上rbcL3’终止子。
利用莱茵衣藻中的多基因表达模式在莱茵衣藻叶绿体中表达两个基因，同时，在表达模式中加入抗性筛选标记aada，其中，aada基因使用psaA基因的启动子和终止子。
4.设计、合成组装新合成莱茵衣藻叶绿体基因组
设计新合成莱茵衣藻叶绿体基因组：
从NCBI下载野生型莱茵衣藻叶绿体基因组序列(NC_005353.1)，大小为205,503bp。在野生型叶绿体基因组序列的基础上对其进行设计，包括删除莱茵衣藻叶绿体基因组中TALENs识别位点，使新合成的基因组不被TALENs识别，免于被切割；插入TALENs表达模块，插入aadA、aphVIII和cat抗性筛选标记，添加PCR水印标签。最终，设计合成的莱茵衣藻叶绿体基因组全长为194,336bp，其中，不含TALENs模块的合成叶绿体基因组全长为186,890bp(包括不含TALENs识别位点的莱茵衣藻叶绿体基因序列，aadA、aphVIII和cat抗性筛选标记，PCR水印标签)，两个分别包含TALENs左臂或右臂模块的片段，atpA-1L-IEE、atpA-1R-IEE或者为atpA-2L-IEE、atpA-2R-IEE，每个片段长度为3723bp。
构建质粒的具体步骤如下：
(1)一级片段的化学合成
将设计得到的不含TALENs模块的合成叶绿体基因组186,890bp莱茵衣藻叶绿体基因组序列，分成65个一级片段进行合成，每个片段长2880bp，两端各带有ApaI限制性酶切位点，可以通过直接酶切合成质粒得到用于组装的片段，两两片段之间依次有80bp的同源臂。包含TALENs左臂或右臂模块的片段长度为3723bp，与不含TALENs模块的合成叶绿体基因组的片段F35和F36有80bp同源臂，组装到片段F35和F36之间。所有一级片段委托商业公司合成，且序列均经过测序和酶切确认。
(2)二级片段质粒组装
鉴于新合成莱茵衣藻叶绿体基因组一级片段数目较多，为了确保组装效率，利用酵母将65个一级片段先组装成14个二级片段质粒，每个质粒约14kb。
14个二级片段质粒在BY4741背景菌株(商业化菌株，购于辉诺生物医药科技有限公司，货号：A226)进行组装，每个二级片段质粒包括4-5个叶绿体基因组一级片段、1个酵母细菌穿梭质粒骨架，其中pRS416(商业化质粒，购于ACD，货号：518681-C2)作为二级片段质粒的载体，URA3基因提供营养缺陷型筛选标记，具体组装过程如下：
(i)片段准备：通过酶切的方法得到合成的一级片段，通过PCR扩增的方法得到酵母细菌穿梭质粒骨架，将酶切产物及PCR扩增产物回收备用；
(ii)转化：将上述回收产物共转化到BY4741酵母细胞中，用SC-URA平板筛选阳性克隆；
(iii)鉴定：随机挑选单克隆进行酵母菌落PCR初筛和基因组复筛，最终经全部junction引物验证。
所有14个二级片段质粒均按照上述方法步骤组装完成。
(3)三级片段质粒的组装
三级片段质粒1的组装
三级片段质粒1在BY4741背景菌株(商业化菌株，购于辉诺生物医药科技有限公司，货号：A226)进行组装，共7个片段，包括4个上述二级片段质粒的叶绿体基因组合成片段、1个BAC片段、URA3筛选基因和A10-F46桥接片段。其中BAC作为三级片段质粒1的载体，URA3基因提供营养缺陷型筛选标记，A10-F46桥接片段用于在片段A10和片段A10之间插入I-SceI酶切位点。具体组装过程如下：
(i)片段准备：通过酶切的方法得到合成片段A1-5、A6-10、F46-50和F50-53，通过PCR扩增的方法得到BAC片段、URA3筛选基因和A10-F46桥接片段，将酶切产物及PCR扩增产物回收备用。其中BAC片段来源于质粒pBeloBAC11(商业化质粒，购于普如汀生物技术(北京)有限公司，货号：pBeloBAC11)，所用扩增引物如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.16所示。
(ii)转化：将上述回收产物共转化到BY4741酵母细胞中，用SC-URA平板筛选阳性克隆。
(iii)鉴定：随机挑选单克隆进行酵母菌落PCR初筛和基因组复筛，最终经全部junction引物验证。
三级片段质粒2的组装
三级片段质粒2在BY4742背景菌株(商业化菌株，购于北京兴华越洋生物科技有限公司，货号NRR01120)进行组装，共7个片段，包括6个上述二级片段质粒的叶绿体基因组合成片段和pRS415(商业化质粒，购于普如汀生物技术(北京)有限公司，货号：pRS415)载体片段。过程与三级片段质粒1的组装类似，除了使用SC-LEU平板筛选阳性克隆。经全部junction引物验证，成功在BY4742细胞中组装了三级片段质粒2。所用扩增引物如SEQ IDNO.17-SEQ ID NO.18所示。
三级片段质粒3的组装
三级片段质粒3在BY4741背景菌株进行组装，共8个片段，包括7个上述二级片段质粒的叶绿体基因组合成片段和pRS411(商业化质粒，购于普如汀生物技术(北京)有限公司，货号：BioVector Number:87474)载体片段，过程与三级片段质粒1的组装类似，除了使用SC-MET平板筛选阳性克隆。经全部junction引物验证，成功在BY4741细胞中组装了三级片段质粒。所用扩增引物如SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示。
(4)3个三级片段质粒利用酵母杂交到一个酵母细胞中
得到三个三级片段质粒的酵母菌株后，还需要进行两轮杂交过程将其合并到一个酵母菌株中，具体过程如下：
将包含三级片段质粒2的酵母菌株中的Met基因利用同源交换原理敲除，用kanMX片段替换基因组上的Met基因，kanMX片段及替换位置上下游序列见SEQ ID NO.21。以pFA6-kanMX4(商业化质粒，购于上海雅吉生物科技有限公司，货号：YC-14391RJ)为模板进行PCR扩增得到kanMX，引物序列如SEQ ID NO.22-SEQ ID NO.23所示。
将25μLPCR产物转化到三级片段质粒中(BY4742背景)，SC-LEU+G418筛选；将转化的板子影印到G418的板子上，挑在两种板子上都能长的单克隆，进行PCR验证，验证正确的菌株作为三级片段质粒2进行后续实验。
将上述含有三级片段质粒2和三级片段质粒3的酵母菌株进行杂交，通过SC-LEU-MET平板筛选同时含有三级片段质粒2(LEU2)和三级片段质粒3(MET17)的二倍体酵母菌株。随机从SC-LEU-MET平板上挑选二倍体酵母菌株(#1，#2)进行产孢和分孢过程得到单倍体酵母。
将YPD平板分别影印到SC-LEU、SC-MET和SC-URA平板上，SC-LEU和SC-MET用于筛选同时含有三级片段质粒2和三级片段质粒3的单倍体酵母菌，SC-URA平板用于确保得到的单倍体不会在SC-URA平板上生长，以进行后续三个三级片段质粒的杂交。最终，得到了同时含有三级片段质粒2和三级片段质粒3的单倍体酵母菌。
上述筛选得到的单倍体酵母菌的交配型是未知的。为了后续能够与三级片段质粒1进行杂交，需要从中挑选交配型为alpha的单倍体酵母菌株。SZU-JDY19(保藏号：CCTCC M20221034)和SZU-JDY20(保藏号：CCTCC M 20221033)的交配型分别为a和alpha，与其进行杂交的单倍体菌株只有成功杂交成二倍体才能够在SD平板上生长。将上述YPD分孢的平板分别与SZU-JDY19和SZU-JDY20进行杂交，然后影印到SD平板上，与SZU-JDY19杂交后能在SD平板上生长，与SZU-JDY20杂交后不能在SD平板上生长，说明其交配型为alpha，通过这种方法成功筛选到了目的菌株。
将上述筛选到的酵母分别与含有三级片段质粒1的酵母菌进行杂交，通过SC-LEU-MET-URA平板筛选同时含有3个三级片段质粒的酵母菌，从平板上挑选单克隆进行后续实验。
(5)组装莱茵衣藻叶绿体基因组
三个三级片段质粒中两两各有一个同源片段，三级片段质粒1和三级片段质粒2上都含有片段A10，三级片段质粒2和三级片段质粒3都有片段F23，三级片段质粒3和三级片段质粒1都含有片段F46，且在同源片段的一端都含有I-SceI切割位点。I-SceI是来源于酿酒酵母线粒体内含子编码的一种核酸内切酶，能够特异性识别约18bp的序列，并在识别位点产生一个双链断裂缺口进而激活酵母细胞的同源重组修复机制。通过诱导I-SceI在酵母细胞中的表达，将三级片段质粒1、2、3进行线性化，借助酵母细胞的同源重组修复系统，实现以三级片段质粒1的BAC载体为载体的完整的叶绿体基因组的组装。
将SZU-ZLP012质粒(保藏号：CCTCC M 20221031)(带有I-SceI核酸内切酶和HIS3营养缺陷筛选标记基因)转化到上一步得到的同时含有3个三级片段质粒的酵母中，用SC-URA-LEU-MET-HIS平板筛选得到同时含有3个三级片段质粒和SZU-ZLP012质粒的酵母菌。挑选单克隆划线到SC-URA-HIS+半乳糖的平板上，利用半乳糖诱导I-SceI的表达。挑选单克隆进行酵母菌落PCR初筛和全junction PCR复筛，最终得到了含有新合成莱茵衣藻叶绿体基因组的正确菌株。
5.质粒转化莱茵衣藻
上述步骤3验证正确的质粒，转入大肠杆菌，利用大肠杆菌扩繁该质粒，之后提质粒，得到能用于叶绿体转化的高浓度的质粒。
该质粒转化莱茵衣藻的方法如下：
首先，莱菌衣藻CC-125在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1～2×106细胞/mL，室温(20-25℃)离心收集；用TAP液体培养基重悬，调整细胞浓度至2×l08细胞/mL；吸取300μL悬浮液涂布于TAP固体平板培养基，22℃光照培养箱(光照条件为90μE/m2/s)中培养1-2天以形成细胞层。
之后，所述衣藻细胞在无菌条件下用基因枪(Bio-Rad)轰击。使用伯乐台式基因枪PDS-1000/He，具体步骤如下：
取50μL金粉悬浮液(60μg/mL)，加入5μg(1μg/μL)上述合成的环状质粒和50μL2MCaCl2、20μL 0.1M亚精胺，通过涡轮振荡器振荡1-3分钟以混合；8000rpm离心10秒，弃上清；用无水乙醇清洗，振荡，再8000rpm离心10秒，弃上清，共5次；最后用60μL无水乙醇重悬沉淀。
每次轰击取10μL，轰击参数如下：真空度25inches-Hg，轰击距离9cm，每孤轰击3次，22℃光照培养箱恢复培养12小时，然后转移到筛选平板上继续培养(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至绿色单克隆长出。
上述筛选平板培养基中含有150μg/mL的壮观霉素，如果藻细胞能在筛选平板上长出单克隆藻落，说明质粒已经转入叶绿体中。
6.筛选、功能验证
首先通过连续继代培养15-20代后，再进行分子检测以及功能验证。
(1)检测抗性筛选片段：以转基因衣藻的总DNA为模板，按aadA、aphVIII、cat基因序列设计一对引物，通过PCR扩增出aadA、aphVIII、cat基因片段，这表明含aadA、aphVIII、cat基因的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组已经转到莱茵衣藻的叶绿体中。
(2)删除TALEN识别位置的检测：以转基因衣藻的总DNA为模板，按照合成序列中删除位置的上下游序列设计PCR引物，扩增出产物，送测序公司测序。
(3)水印PCR的检测：以转基因衣藻的总DNA为模板，以水印PCR标签为引物，转基因衣藻能够扩增出基因条带，野生型衣藻完全扩增不出条带。
通过上面的鉴定，确认新合成莱茵衣藻叶绿体基因组替换野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的莱茵衣藻构建完成。
TALENs的切割效率验证
对于将TALENs融合入新合成莱茵衣藻叶绿体基因组的转化株，由于新合成莱茵衣藻叶绿体基因组不含TALENs识别位点而不会被TALENs切割，可以行驶叶绿体的功能，检测在使用新合成叶绿体基因组转化莱茵衣藻时，转化一株不含TALENs序列的新合成基因组，后期对比检测两种情况下转化子的同质化时间。含有TALENs表达模块的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组因会对原野生型莱茵衣藻叶绿体基因组进行持续的切割，因此更容易达到同质化状态。
对比例1
1.选取TALENs靶序列和设计TALENs识别位点
该步骤和实施例1中步骤1相同。
2.设计核酸酶蛋白质序列，合成核苷酸序列
该步骤和实施例1中步骤2相同。
3.设计构建TALENs表达模块载体
将上述的TALENs表达模块直接构建用于转化莱茵衣藻叶绿体的表达载体，具体为：
将上述表达模块直接插入莱茵衣藻表达质粒p322(购于衣藻中心https://www.chlamycollection.org/)略做改动，封闭了载体上一个多余的BamH1酶切位点。将上述构建的TALENs表达模块用BamHI切下，插入用BamH1切开的莱茵衣藻表达质粒p322中，即在TALENs的表达模块上加入莱茵衣藻叶绿体基因组上的上下游同源臂，利用同源重组将TALENs表达模块插入莱茵衣藻叶绿体基因组中。
4.设计、合成组装新合成莱茵衣藻叶绿体基因组
该步骤和实施例1中步骤4相同。
5.质粒转化莱茵衣藻
该步骤和实施例1中步骤5相同。
6.筛选、功能验证
因TALENs表达后会对莱茵衣藻的叶绿体造成损伤，因此采用避光培养，连续继代培养15-20代后，再进行分子检测以及功能验证。
(1)检测抗性筛选片段：以转基因衣藻的总DNA为模板，按aadA基因序列设计一对引物，通过PCR扩增出aadA基因片段，这表明含aadA基因的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组已经转到莱茵衣藻的叶绿体中。
(2)检测1L、1R、2L、2R片段：以转基因衣藻的总DNA为模板，按1L、1R、2L、2R基因序列设计一对引物，通过PCR扩增出1L、1R、2L、2R基因片段，这表明含1L、1R、2L、2R片段基因的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组已经转到莱茵衣藻的叶绿体中。
TALENs的切割效率验证
对于直接转入TALENs的藻株，由于在同质化培养过程中，TALENs会对基因组进行持续的切割，造成叶绿体基因组的持续损伤，最终会使所有的叶绿体基因组降解，使莱茵衣藻变成完全异养的藻株。因此前期同质化未完成之前，可以扩增TALENs识别序列，测序，检测TALENs的切割效率，后期同化作用完成以后，可以用DAPI染色，在荧光显微镜下观察叶绿体基因组是否已经完全降解，形成一株没有叶绿体基因组的莱茵衣藻藻株。
综上所述，本发明提供了一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，该技术方法基于莱SDRs在莱茵衣藻叶绿体基因组分布均匀的特点，通过设计合成不含TALEN识别位点且包含TALENs表达模块的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组，质粒转化入莱茵衣藻叶绿体后，新合成基因组免于被TALENs切割，而被TALENs切割成片段的野生型基因组被降解，达到了在转化的莱茵衣藻叶绿体中使新合成基因组将野生型基因组序列替换和同质化的目的，本发明所提供的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法对新合成基因组替换原有野生型基因组具有重要意义。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，包括：
步骤S1、选取莱茵衣藻叶绿体基因组中短散布重复序列SDRs作为TALENs靶序列，设计TALENs识别位点；
步骤S2、设计识别所述TALENs识别位点的核酸酶蛋白质序列，合成得到编码所述核酸酶的核苷酸序列；
步骤S3、构建TALENs表达模块载体；
步骤S4、合成组装新合成莱茵衣藻基因组，所述新合成莱茵衣藻基因组包括不含所述TALENs识别位点的莱茵衣藻叶绿体基因组、所述TALENs表达模块、抗性筛选标记和PCR水印标签；
步骤S5、将所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组转入大肠杆菌中扩繁质粒，将所述质粒转化进入野生型莱茵衣藻叶绿体中；
步骤S6、筛选、功能验证转化的莱茵衣藻细胞，实现新合成莱茵衣藻叶绿体基因组对野生型莱茵衣藻叶绿体的替换和同质化。
2.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，步骤S1中，所述TALENs靶序列长度为49-51bp。
3.根据权利要求2所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，步骤S1中，所述TALENs识别位点包括TALENs左臂识别位点和TALENs右臂识别位点，所述TALENs左臂识别位点或所述TALENs右臂识别位点的序列长度为16-17bp，所述TALENs左臂位点和所述TALENs右臂识别位点之间的间隔序列长度为14bp。
5.根据权利要求1～4任一所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，当所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列时，所述TALENs左臂识别位点为2-18位核苷酸，记为1L；所述TALENs右臂识别位点为33-49位核苷酸，记为1R；
当所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列时，所述TALENs左臂识别位点为4-20位核苷酸，记为2L；所述TALENs右臂识别位点为35-50位核苷酸，记为2R。
6.根据权利要求1或5所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，步骤S2中，所述核酸酶包括识别所述TALENs识别位点的TAL效应蛋白和Fok I限制性核酸內切酶；
其中，识别1L的所述核酸酶为由SEQ ID NO.7所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-1L，所述TALEN-1L包括TAL效应蛋白TAL-1L和Fok I限制性核酸內切酶；
识别1R的所述核酸酶由SEQ ID NO.8所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-1R，所述TALEN-1R包括TAL效应蛋白TAL-1R和Fok I限制性核酸內切酶；
识别2L的所述核酸酶为由SEQ ID NO.9所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-2L，所述TALEN-2L包括TAL效应蛋白TAL-2L和Fok I限制性核酸內切酶；
识别2R的所述核酸酶由SEQ ID NO.10所示核苷酸序列编码的蛋白质TALEN-2R，所述TALEN-2R包括TAL效应蛋白TAL-2R和Fok I限制性核酸內切酶。
7.根据权利要求1或6所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述TALENs表达模块包括启动子atpA、所述SEQ ID NO.7核苷酸序列的ORF、连接片段IEE、所述SEQ ID NO.8核苷酸序列的ORF和rbcL3’终止子；
或者，所述TALENs表达模块载体包括启动子atpA、所述SEQ ID NO.9核苷酸序列的ORF、连接片段IEE、所述SEQ ID NO.10核苷酸序列的ORF和rbcL3’终止子。
8.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组全长为194,336bp。
9.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述抗性筛选标记包括aadA、aphVIII和cat。
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2023
- 2023-10-12 CN CN202311319287.XA patent/CN117327742A/zh active Pending
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