CN1173275A - 细胞质雄性不育大豆及生产大豆杂交种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属植物育种领域及产生杂种大豆植物的方法;其特征是利用控制一个核恢复基因影响不育性。提供了一个细胞质雄性不育大豆植物,通过引入一个位于核恢复基因座位上的显性位点,该细胞质雄性不育大豆即能恢复可育。大豆细胞质雄性不育系的保持,是通过与一个含有可育细胞质基因、核恢复基因座位为隐性位点的雄性可育等位系杂交实现的。以细胞质雄性不育系为母本,与核恢复基因座位为显性恢复位点的雄性不育恢复系杂交,可生产杂种大豆。播种从母本植株上收获的种子,可产生可育的F1植株。

Description

细胞质雄性不育大豆及生产大豆杂交种的方法

本发明涉及植物育种领域，更确切地说，本发明涉及细胞质雄性不育大豆，和利用他们开发所需要的大豆植物。

植物育种的目的是把亲本的各种所需要的性状结合到一个品种或一个杂交种中，对于大田作物来说，这些性状包括抗病、抗虫、耐热、耐旱，早熟，高产，改善整个农艺学品质。许多作物采用机械收获，一些植物特性如发芽，成苗，生长速度，熟期和果实大小的一致性十分重要。植物育种的第一步是分析和确定目前所用种质的问题和弱点，建立育种方案的总目标，并确定具体的育种目标，下一步是筛选具有目标性状的种质，通过选育使目标性状得到表达。

大田作物的选育技术与授粉方式有关。如果一朵花的花粉传到同一植株的同一朵花或另一朵花，该植物属自花授粉。如果花粉是来自不同植株的花，则属异花授粉。在自花授粉的物种中，如大豆和棉花，雄性和雌性器官解剖学上是并列的，在自然授粉过程中，一朵花的雄性生殖器官给同一花的雌性生殖器官授粉。玉米既可自花也可异花授粉。甘蓝植物(Brassica)，一般是自花不育，只能异花授粉。

大豆在分类学上为大豆属(Glycine)，含有两个亚属，即Glycine亚属和soja亚属，在Soja亚属中有两个种：栽培种(Glycine max)和野生种(Glycinesoja)。

大豆是天然自花授粉植物，它能进行异花授粉，但在自然界中不经常发生。一些研究人员报道，昆虫可携带大豆花粉从一个植株到另一个植株，一般估计，在开放种植条件下，不到1％的大豆种子是异花授粉形成的，也就是说在开放种植时，不足1％的大豆种子能产生F1杂种大豆植株，参见Jaycox，“Ecological Relationships between Honey Bees and Soybeans”，American Bee Journal，vol. 110(8)：306-307(1970)。这篇参考和所有在这里引用的参考都是参考文献的一部分。上述事实表明，授粉过程对选育优良品种是十分重要的。

植物育种最关键的一个方面就是控制授粉过程，通过有目的的杂交，使亲本中所需要的性状传给后代。

当今所从事的大规模的商业杂交种生产，需要利用某种可控制或抑制雄性可育的雄性不育系统。一个可靠的控制植物雄性育性的方法也为改进植物育种提供了机会。玉米杂交种的开发就是一例，它依赖于某种雄性不育系统。对于育种家来说，控制雄性育性可有几种选择，如：人工或机械去雄(玉米的拔蓼)，细胞质雄性不育，细胞核雄性不育，杀雄剂等等。雄性不育的许多进展反映于玉米生产中。

杂交玉米种子，是典型地通过人工或机械去雄的雄性不育系统生产的。在田间交错种植两个玉米自交系，在散粉之前去除一个自交系的雄花序(母本)，只要隔离距离足以防止外源玉米花粉传入，去雄的自交系上雌穗只能由另一个自交系(父本)受精，所以，产生的种子是杂交种并将形成杂种植株。

通过利用细胞质雄性不育系(CMS)，可以避免费工费力而有时并不可靠的去雄过程。一个CMS自交系植株的雄性不育性，是细胞质的基因组而不是核基因组因子作用的结果，所以，这一特征在玉米植株中只通过母本遗传，只有母本提供已受精种子的细胞质。CMS植株由另一个非雄性不育的自交系的花粉受精，来自第二个自交系的花粉可能具有使杂种植株雄性可育的基因，也可能不具有这一基因。当种植杂交种时，通常把去雄的可育玉米产生的种子和由CMS产生的同一杂交组合的杂种种子混合种植，以保证授粉有足够的花粉量。

从技术上说，有许多利用细胞核雄性不育的方法。每个方法都有自己的优点和缺点，这些方法利用了一系列不同途径，如导入一个编码细胞毒素物质的基因并与雄性组织专化启动子相连。或利用反义系统，即在识别出对育性起关键作用的基因的基础上，插入其反义系统。(参见Fabinjanski，et al，EPO89/3010153.8公开号329308和PCT申请PCT/CA90/00037，公开号WO90/08828)。

另一个控制雄性育性的机制是利用杀雄剂。杀雄剂不是一个遗传系统，而是一个化学物质的局部应用，这些化学物质影响对雄性育性极为关键的细胞，这些化学物质在植物的生长季节应用，并仅仅在生长季节影响植物的育性(参阅Carlson，Glenn R.，美国专利号：4,936,904)，由于施药时间严格，存在基因型的专一性等问题，使杀雄剂这一途径的应用受到限制。

雄性不育在植物界是一个普遍现象，Duvick(1966)提出，所有的植物至少具有一个雄性不育核基因，Laser et al(1972)指出，在大约140个种中，已公开报道存在细胞质雄性不育，到1988年Kaul发表综述时已发现CMS的种的数量大大增加了。

目前，已经发现好几个类型的雄性不育大豆(Palmer et al.1987)。对隐性单基因控制的细胞核雄性不育(GMS)做了大量的研究和评述(Grayboschet al.1988，Palmer et al，1992)。这些材料已经用于遗传研究和轮回选择等育种方案中。

由于难于获得全部为不育株的群体，加上尚未找到有效的、低成本的传粉途径，GMS还没有广泛用于杂交大豆种子的生产。然而，在几个重要作物中，如玉米、高梁和水稻，已经证明利用CMS系统生产杂交种子是有效的。在大豆中，已有细胞质雄性不育和恢复基因的报道。Davis(美国专利号：4,545,146；美国专利号：4,763,441和美国专利号：4,648,204)公开了若干栽培品种，他们具有雄性不育细胞质和保持雄性不育的两对隐性基因r1r1，r2r2。这个CMS系统可概括为两基因孢子体不育。在CMS细胞质存在的情况下，在Rf1Rf1或Rf2Rf2任何一对显性基因中，只行一个位点是显性的，就能产生有生活力的花粉。还没有人能验证这个系统。例如，用他专利中列出的品种进行适当的杂交，即使存在所需的不正常CMS细胞质和隐性恢复基因也不表达不育性。在Davis的美国专利4545146，第7竖行，第30横行至第9竖行，第63横行中讨论了两基因孢子体不育系统。

在孢子体细胞质不育的恢复机制中，植株本身的基因型(孢子体)决定是否产生正常花粉。

所以，当Rf1和Rf2两个位点均是杂合时，一个孢子体植株产生的所有花粉都是正常的，尽管只有1/4的花粉粒携带两个显性等位基因。在配子体系统中是花粉粒(配子体)本身的基因型决定花粉粒是否正常。一个杂合Rfrf植株产生一半正常、一半败育的花粉，通常称为“半不育”，主要取决于配子体含Rf还是rf。

这里所叙述的发明是一个大豆配子体细胞质雄性不育系，与Davis的系统不同，它只需要一个恢复基因而不是两个恢复基因进行操作，因此更容易用于育种。

本发明的目的是解决前面叙述的CMS大豆系统中存在的问题，提供一个在创造大豆杂交种时更加容易利用的、可不断连续繁殖的雄性不育系。同时，提出了保持不育性的方法，即：用含有现在所叙述的不育细胞质和它的隐性核恢复基因的大豆品系与第二个含有可育细胞质和相应的隐性核恢复基因(与存在于CMS不育系中的隐性核恢复基因相同)的大豆品系杂交。因此，本发明的一个目的是提供一个具有配子体细胞质雄性不育系统的大豆品系。

本发明的另一个目的，是提供一个只需操作一个单基因即可控制不育性的配子体细胞质雄性不育大豆品系。当然，本发明的再一个目的，是提供一个可恢复以上叙述的配子体细胞质雄性不育系的大豆恢复系。

本发明更进一步的目的，是用配子体细胞质雄性不育植株为母本，与雄性可育的父本大豆植株杂交，创造大豆杂交种。母本大豆植株含有不育细胞质成分，同时，对这一细胞质雄性不育遗传成分具有特异作用的核恢复基因为隐性位点。这里所说的父本，在对母本细胞质雄性不育遗传成分具有特异作用的核恢复基因中至少有一个显性位点。杂交大豆种子是从这一杂交的母本上收获的。

本发明的其它目的、特征和优点，通过下面的详细说明将一目了然。然而，应该指出，详细说明和特定实施例，仅是为了便于理解和展示本发明的具体内容。对于那些在本领域技术熟练的人来说，从详细说明中，可以看出，在本发明的精神实质和范畴内，存在各种变化和修饰。

大豆是世界上植物油和蛋白饼粕的主要来源。大豆油可用作烹饪油，人造奶油和色拉调料，大豆油是由饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸组成。它的典型组份是：棕榈酸(11％)，硬脂酸(4％)，油酸(25％)，亚油酸(50％)和亚麻酸(9％)(“Economic Implications of Modified Soybean TraitsSummary Report”，Iowa Soybean Promotion Board & American SoybeanAssociation Special Report92S，1990)。在大豆油用于工业，并进一步加工成油漆、塑料、纤维，去污剂，化妆品和润滑剂的成分后，人们一直在探索改变脂肪酸组份以提高氧化稳定性和营养的问题。大豆油可被裂解、互脂化、硫化、环氧化、聚合、乙氧基化。设计和生产功能和综合化学品质均得到改善的大豆油衍生物是一个快速发展的领域。

大豆也是人和动物的食物来源。大豆被广泛地用作家禽，猪和牛等动物饲料的蛋白质来源。在原豆的加工过程中，除去含纤维的外壳，提出油分，余下的豆粕是碳水化合物和大约50％的蛋白质的混合物。

豆粕可制成豆粉，再加工成浓缩蛋白用作肉类的代用品或特用宠物饲料，供人和动物消费。用大豆生产食用蛋白质，提供了一个有益于健康的，廉价的，可与肉、蛋、奶中的动物蛋白相媲美的蛋白源。

本发明是关于一个大豆雄性不育系，该不育系为细胞质雄性不育，它是一个可以稳定地表达所需要的经济性状的近交系，也可用作亲本生产杂交种，本发明也与已叙述过的恢复系有关。

本发明也指出了产生一个大豆植物的方法：用本发明的雄性不育亲本大豆与第二个大豆亲本杂交，这里所说的第二个大豆亲本，可表述为具有特异于那个不育细胞质的纯合显性或杂合的核恢复基因。这样，任何利用本发明的大豆雄性不育系或恢复系的方法，如自交，回交，杂种生产，与群体杂交等等，均属于本发明的一部分。所有利用本发明的大豆品种和它的雄性恢复系做亲本产生的植物都是本发明的范围。

通过转化产生遗传上改良了的植物组织，要结合本发明所公开的理论和本领域内已知的种种技术和临时采用的应变技术。在大多数情况下，各种应变技术存在于整个过程的各个阶段。应变技术的选择是根据各种可变因素决定的，像用于克隆和导入所需要的重组DNA分子的质粒载体系统和特殊结构的基因，启动子成分以及所使用的上游成分。在本领域技术熟练的人有能力选择和利用适当的替代办法获得成功。表达所需要的结构基因的培养条件和培养细胞在技术上是已知的。大豆可以进行遗传转化，而且在常规控制条件下，可获得含有并能表达所需要的基因的整个再生植株，这在技术上也是已知的。关于植物表达载体，报告基因和遗传转化操作方法的一般叙述，可参阅：Gruber etal.，“Vectors for Plant Trans formation，”刊在Glich et al.，编辑的“ Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology”pp.89-119，CRC Press，1993。另外，GUS基因的表达载体和GUS基因盒可以从CloneTech Laboratories公司(Palo Alto，California)得到。荧光素酶表达载体和荧光素基因盒可以从Pro Mega公司(Madison，Wisconsin)得到。培养植物组织的一般方法参见Maki等人的文章″Procedures for introducing ForeignDNA into Plants″，刊在Glich等人编辑的″Methods in Plant MolecularBiology & Biotechnology″，pp.67-88，CRC版，1993。以及Phillips等人的文章“Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation”，刊在Sprague等人编辑的″Corn & Corn lmprovement 3rd Edition″，(pp.345-387，1993).American Society of Agronomy lnc.表述载体导入植物的方法，包括直接感染或植物细胞与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养。参见Horsch等人文章，Science，227-1229，1985。农杆菌载体系统和农杆菌介导基因转移方法的说明可见前面提到的Gruber等人的文章。

将表达载体导入植物组织的方法还包括(但不限于)直接的基因转移，如微粒载体导入法，DNA注射、电激法等等。更优越的将表达载体导入植物组织的方法是基因枪微粒载体导入法。欧洲专利30749中所叙述的即是一个实施实例。利用本发明的原生质获得的转化植株也属于本发明的范畴。

这里所用的术语“植物”或“植株”，包括植物细胞，植物原生质体，可以再生大豆植株的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物丛，植物中完整无损的细胞或植物的一部分，如胚、花粉、胚珠、花、荚、叶、根、根尖、花药以及诸如此类的植物部分。

品种的进一步繁殖可通过组织培养和再生。大豆各种组织的组织培养和再生已是众所周知并广泛公开了。可供参考的文献如下：Komatsuda，T.etal.，″Genotype X Sucrose Interactions for Somatic Embryogenesis inSoybean″，Crop Sci. 31：333-337(1991)；Stephens，P.A.et al.，“Agronomic Evaluation of Tissue-Culture-Derived Soybean Plants”，Theor. Appl. Genet.(1991) 82：633-635；Komatsuda，T.et al.，“Maturation and Germination of Somatic Embryos as Affected BySucrose and Plant Growth Regulators in Soybeans Glycine gracilisSkvortz and Glycine max(L.)Merr.，″Plant Cell，Tissue and OrganCulture，28：103-113(1992)；Dhir，S.etal.，″Regeneration of FertilePlants from Protoplasts of Soybean(Glycine max L.Merr.)：GenotypicDifferences in Culture Response″，Plant Cell Reports(1992)11：285-289；Pandey，P.et al.，“Plant Regeneration From Leaf and HypocotylExplants of Glycine wightii(W.and A.)VERDC. var longicauda”，JapanJ.Breed.42：1-5(1992)；and Shetty，K.，et al.，″Stimulation of In VitroShoot Organogenesis in Glycine max(Merrill.) by Allantion andAmides，″Plant Science 81：(1992)245-251；以及1991年6月18日授予Collins等人的美国专利5,024,944，和1991年4月16日授予Ranch等人美国专利5,008,200，上述公开发表的文献在这里做为一个整体列为参考文献。

众所周知，在包括大豆在内的大多数植物中，细胞质遗传只能通过母本传递。在这些植物中，花粉不传递细胞质成分。本发明提供一个具有不育细胞质的雄性不育大豆植物，是由含有不育细胞质的大豆品种为母本，与含有特异于该细胞质的配子体细胞质雄性不育遗传成分的大豆为父本杂交，其F1再与父本反复回交得到的。其中细胞质遗传成分是一个不育(S)细胞质。这个雄性不育大豆植物在特异于那个细胞质的核恢复基因座位上有隐性位点rfrf。S细胞质和恢复基因的基因型rfrf相结合赋予植物雄性不育表现型。这个雄性不育表现型可以保持并在创造F1杂种大豆种子时得到进一步开发。

这里所叙述的，具有细胞质基因型S和核恢复基因型rfrf的大豆雄性不育系，可以通过与雄性可育等位系(保持系)杂交来保持，这里所述的雄性可育等位系，其特征可表述为具有可育(正常的)细胞质基因型F和核恢复基因型rfrf，母本(雄性不育系)可称做A系。父本(雄性可育系)可称做B系或保持系。从母本收获的种子遗传从母本获得的细胞质基因型S。该基因型的其余部分，母本和父本基本上是相同的，因此，从母本植株上收获的种子，在遗传上和母本植株本身是相同的，包括细胞质雄性不育性。

在本发明中，恢复的模式是配子体类型。换句话说，是花粉的基因型，即配子体，决定花粉是正常还是不正常。在不育细胞质S存在的条件下，恢复基因座位的基因型为Rfrf时，将产生50％可育花粉和50％不育花粉，或败育花粉。参见Buchert，J.G.(1961)″Thes tate of genome-plasmon interaction inthe restoration of fertility to cytoplasmically pollen-sterilemaize″，Proc.Natl. Acad.Sci USA 47：1426-1440。

本发明进一步提供了一个生产大豆杂交种的方法，其过程是以这里所叙述的雄性不育大豆为母本，以核恢复基因座位为显性位点Rf Rf的恢复系大豆为父本杂交，从母本上收获的种子可用于培育F1杂种大豆。

在本发明的优先实施方案中，细胞质雄性不育植物是以栽培大豆品种(Glycine max)汝南天鹅蛋为母本，与野生豆(Glycine soja)5090035杂交得到的。为方便起见；在本发明中，以下简称栽培豆品种汝南天鹅蛋为167，称野生豆品系035为035。具有特殊不育细胞质遗传成分S的大豆品种167，在特异于该不育细胞质遗传成分的核恢复座位中的显性可育位点RfRf的作用下，表现可育。野生豆(Glycine soja)品系035具有可育细胞质F，在特异于167所携带的特殊不育细胞质的核恢复座位上，含有隐性位点rfrf。另外，野生豆(Glycine soja)品系035含有纯合易位染色体T/T，导致F1因杂合易位而不育百分数高于期望值。自母本收获的种子，再播种至成熟，并用做母本与野生豆(Glycine soja) 035进行一系列回交。在回交后代中选择不育花粉粒百分数高，且染色体为纯合易位(T/T)的后代。继续回交，至少完成五轮。

选出的基因型其细胞质及细胞核为S：(rfrf)(T/T)。最后选出的后代，既可和B系杂交以保持种源，供杂种生产应用，也可以和前述的恢复系大豆杂交。另外，利用与恢复基因紧密连锁的遗传性状，如花色和茸毛色等，可做为田间表现型标记。

应该强调的是，在创造杂交大豆品系时，人工杂交授粉和以昆虫为媒介的杂交授粉都是可以利用的。人工杂交困难，也耗费时间，因此，就商业化生产而言是不可操作的。以昆虫为媒介的杂交授粉，比如利用蜜蜂，更有利于商业化生产。本发明的雄性不育系用做母本，恢复系用做父本。昆虫携带父本的花粉到母本，实现杂交授粉。从母本上收获种子。从技术上讲，已经知道有几种方法可以提高开花的大豆植株对蜜蜂的吸引力，如：开花期间限制雨量或灌水，以增加泌蜜量，选择花大的基因型或存在某种可吸引昆虫的味道，如蜜蜂性诱剂。

本发明的优点在于：本发明的雄性不育大豆可以与其不同的大豆杂交，产生杂种一代(F1)种子和具有优良性状的大豆植株。这些杂种将提高产量，并由于杂种优势和杂种生活力的提高而得到其他益处。本发明的大豆品种也可以用于遗传转化，即将外源基因导入并由本发明的品种予以表达。本发明的优点还在于，只需要操作一个单基因而不是两个或两个以上基因既可控制雄性不育或恢复雄性可育。

实施例1材料和方法

试验始于研究野生豆(G.soja)染色体易位频率和寻找可能存在的、表现出雄性不育细胞质与不育保持基因相互作用的组合。在中国的吉林省公主岭，河南省郑州，江苏省徐州，浙江省杭州，湖南省长沙和福建省泉州选择六个试验点种植试材。这些点的地理分布范围广，覆盖了从北纬25度到44度的广大地区，保证了所选择的试验样本具有广泛的遗传基础。113份栽培豆品种(G.max)和213份野生豆(G.soja)分别选做母本和父本进行杂交。这些试材生育期不同，但均能在上述六个地点之一正常成熟。

不论栽培豆还是野生豆基因型的筛选都力图代表最大的遗传变异。例如：做母本的栽培豆亲本，既有地方品种，也有现代改良品种。父本包括典型的一年生野生豆也包括半野生豆。

在试验期间，共做376个栽培豆×野生豆杂交组合。大部分组合的F1种子种在设于吉林省公主岭的光照控制室中(以下称控光室)，一部分种于河南省郑州。用I₂-KI染色法检查F1植株的花粉育性并计算不育花粉粒百分数。在豆荚中重量低于28毫克者视为是胚珠败育或早期种子败育。结果与讨论

Palmer等(1976，1984)确认，栽培豆与野生豆杂交，F1花粉粒的半不育是由野生豆染色体易位引起的。在栽培豆中，自然发生的易位很罕见。如将栽培豆视为无易位的共同亲本，本试验所利用的213份野生豆中，有59.6％含有易位染色体。这一结果并不令人意外，Delannay等人(1982)用19份从中国收集的野生豆做染色体易位频率试验，结果发现，其中16份(即84％)可能有易位。

在本试验中，发现一个特殊组合，即：167×035，其F1植株的花粉不育率高达88.01％。为了排除试验误差或不利生长条件等偶然因素导致这一结果的可能性，又做了包括正反交的另外两次杂交，花粉育性检查结果列于表1。

        表1    167×035正反交F1及其亲本花粉育性杂交年份      组合        F1种植条件       F1不育花粉粒百分数(％)第1年       167×035     公主岭控光室        88.01第3年       167×035     公主岭控光室        92.70第3年       035×167     公主岭控光室        58.44第3年       167          郑州田间            2.38第3年       035          郑州田间            2.17第5年       167×035     郑州田间            88.37

表1的数据表明两个亲本167和035花粉育性正常。167×035杂种F1代花粉高度不育性在不同的年份和不同生长条件下是可以重复的。三年平均，F1花粉不育率为89.69％，最高值与最低值之差仅为4.69％。这清楚地表明，遗传因素是造成不育的原因。

035×167F1植株花粉半不育，是由两个亲本中的一个染色体易位造成的。由于野生豆易位频率极高，品系035可能有一个染色体发生易位。以染色体无易位的现代大豆品种郑州64-1为共同亲本，分别与167和035杂交以验证这一假设。表2的试验结果说明，F1植株的半不育只出现在包含035的正反交组合中，而不出现在包含167的正反交组合中，因此，排除了167染色体易位的可能性。

    表2    郑州64-1、167和035杂交F1植株花粉育性杂交年份     组合          F1种植条件      F1花粉不育百分数(％)第3年    郑州64-1×035    公主岭控光室       55.60第3年    035×郑州64-1    公主岭控光室       54.95第5年    郑州64-1×167    郑州田间           0.26第5年    167×郑州64-1    郑州田间           3.04染色体杂合易位也产生半败育的胚珠。杂交组合郑州64-1×035和035×郑州64-1F1植株胚珠败育百分数分别为43.00％和35.78％，而167和035则分别为7.03％和6.74％。Beiling(1915)指出，在黧豆属(Stizolobium sp.)中，胚珠全败育的荚自然脱落，在大豆中会发生同样的情况，如果将已脱落的豆荚中的败育胚珠加到上面观察到的败育胚珠中，则败育胚珠百分数将接近50％。凡包含035的杂交组合，花粉和胚珠均为半不育，表明野生豆035存在染色体易位。

正反交组合F1植株花粉败育率不同。正交组合167×035F1花粉败育率比反交组合035×167高32.26％(见表1)。167的细胞质对F1植株育性的影响显而易见，而且，只有当035核基因组存在于167细胞质中时，这种影响才表现出来。167细胞质与035核基因的相互作用，预示着获得质核雄性不育系的可能性。1990年开始核置换回交。1991年获得三株BC1F1.各株的花粉败育率分别为99.93％，93.53％和99.27％。当年进行了第二次回交，从三株BC1F1上分别获得0、1、10粒杂交种子。所有BC2F1种子于1991年冬播于温室，得到四个BC2F1植株，均是同一BC1F1植株的后代。另一株BC1F1所结杂交种子，没有出苗。整个回交过程表述如下：年份      地点    杂交过程     花粉败育率(％)第5年夏    郑州    167×035第6年夏    郑州    F1×035         88.37第7年夏    郑州    BC1F1×035      97.58第7年冬    公主岭  BC2F1×035      99.57第8年夏    郑州    BC3F1×035      99.93第9年夏    郑州    BC4F1×035      99.93

               BC5F1×035

               A-系  B-系

经过五代回交，育成了高度雄性不育的CMS A系和它的雄性可育同型保持系B系。在本发明中，称该CMS A系为OA，称OA的同型保持系B系为OB。CMS雄性不育系OA一些重要特征如下：形态特征：

OA具有典型的一年生野生豆表现型：茎蔓生，株高约2米，无限结荚习性，小叶，椭园形，种皮黑色，有泥膜，百粒重2.5克，白花，紫喉，灰色茸毛，在原产地春播生育期约135天。OA和OB在形态上基本相似，但OA成熟时叶绿色，延迟脱落，结荚很少，有大量未授精的小荚，长度约0.5-1cm。花药和花粉粒显微特征：

在光学显微镜下发现，OA(不育系)花粉粒直经小，为17.15μm，而OB(保持系)花粉粒直经正常为21.73μm。花粉粒外壁看起米发育完好，但内容物皱缩。花粉粒不能被I2-KI染色，呈淡褐色。雄性不育稳定性：

BC4F1植株曾在三种不同的光照条件和温度条件下种植。雄性不育性保持高度稳定。其种植条件如下：

第8年冬：植株播于设在公主岭的温室，出苗后前两周24小时光照，后缩短到13.5小时，直到开花。由于供热系统不稳定，温度变化很大，不育花粉率仍为97.95％。

第9年夏：植株播于郑州田间，六月初播种，八月初开花，整个生育期间持续高温，不育花粉率为99.93％。

第9年夏：植株播种于设在公主岭的控光室，出苗后至结荚一直保持14小时不变光照。五月初播种，温度低，七月初开花时温度升高，不育花粉率为99.94％。

上述资料表明：在变化极大的不同环境条件下，OA植株花粉不育率几乎保持不变，雄性不育性稳定。雌性育性：

以167为公用父本，分别与OA和OB杂交。杂交在同一时间进行。以杂交成功率(即结荚率)代表雌性育性。为了将试验误差减少到最低水平，这一平行杂交试验由同一人进行。结果见表3。

                表3  雌性育性试验结果

杂交组合    杂交花数    结实荚数    成功率(％)

OA×167       123         33         26.82

OB×167       123         35         28.46

OA的结荚率只比OB少1.64％，显著性测验表明，在0.01显著标准下，两者无差异.OA的雌性部分是正常的。

167和035正反交F1雄性育性差异很大，以及连续核置换回交后保持高度雄性不育这两点只能用质核雄性不育系统加以解释。为了避免理论上的局限，暂时假定，存在于167中的不育细胞质S与存在于035中的一对隐性基因rfrf相结合，即S(rfrf)导致了OA的雄性不育。OB和167的遗传控制模式分别是N(rfrf)和S(RfRf)。然而，167×035F1植株的高度雄性不育现象与这一假设不符。为了再一次避免理论上的局限，暂做如下解释：品系035含有易位染色体，在167×035F1中，易位染色体为杂合(T/N)，导致F1花粉半不育，但杂合易位的比例在回交五代(BC5)群体中已减少到1/32。另一个解释可能是恢复基因Rf为不完全显性，在其他物种的CMS不育系统中也有这类现象。其他的解释还包括：杂合易位与rf基因相互作用；rf基因在易位染色体上；这一不育系统属配子体不育，杂合体Rfrf产生半不育花粉粒。最后，控制不育的核基因是显性。除染色体易位外，这些解释可用更精确的研究加以证实。再次说明，发明者不愿被理论所局限。

在轮回回交时，野生豆(G.soja)提供了核基因组，因此OA和OB具有野生豆表现型。由于野生豆有许多不良农艺性状，他们不能在杂种大豆生产中直接利用。然而，CMS雄性不育系统很容易转换成栽培豆类型。关键在于野生豆(G.soja)和栽培豆(G.max)是亲缘关系极近的两个种，它们之间的基因流动没有任何障碍，实际上，在常规育种中，经常利用它们之间的基因相互转移，不存在任何问题。实施例2

野生豆(G.Soja)是栽培豆(G.max)的祖先，农艺性状不良。本发明所叙述的具有野生豆表现型的细胞质雄性不育系OA，很难直接用于大豆杂交种生产。如前所述，野生豆和栽培豆之间没有种间隔离，可进行任何形式的交配。在本领域中技术熟练的人都了解，有很多办法可将OA的细胞质雄性不育系统转移到栽培豆。其中之一，是通过测交，在栽培豆中筛选含有存在于OB中的细胞质雄性不育遗传成分，或者说，筛选可保持OA的细胞质雄性不育性的隐性核恢复基因。

在实施例1中，于第8年获得(167×035)×035回交第三代BC3F1(在本实施例中以下称OABC3)，其不育花粉百分率已高达99.93％。以OABC3为母本，与若干栽培豆进行测交。以下是以伊川绿大豆为父本的测交、回交过程。

年份       地点        杂交过程         不育花粉％

第8年夏    郑州    OABC3×伊川绿大豆

第8年冬    公主岭  F1×伊川绿大豆       99.00

第9年夏    郑州    BC1F1×伊川绿大豆    99.05

第9年冬    公主岭  BC2F1×伊川绿大豆    99.92

第10年夏   郑州    BC3F1×伊川绿大豆    99.95

第10年冬   公主岭  BC4F1×伊川绿大豆    99.95

第11年夏   郑州    BC5F1

                   A系    B系

以伊川绿大豆为父本与OABC3连续回交后获得新CMS A系，在本发明中称YA，相应的同型保持系伊川绿大豆称YB。

YA、YB具有典型的栽培豆性状。经五轮回交，染色体已经无易位。实施例3

表4列出了三个三交测交群体花粉育性的观察结果。在每个三交组合中，母本在左侧，父本在右侧，所有杂交和花粉观察均在试材的原产地河南进行。

YA是栽培豆(Glycine max)，细胞质为雄性不育，核恢复基因具有隐性位点(S-rfrf)。YB也是栽培豆(Glycine max)，含可育细胞质，在同一个核恢复基因上有隐性位点(F-rfrf)。品种167含不育细胞质遗传成份，但由于核恢复基因为显性纯合位点，细胞质已恢复可育(S-RfRf)。表4  YABC5×(167×YB)，YABC5×(YB×167)，(YA×167)×YB花粉败

                   育百分数不育花粉％    YABC5×(167×YB)    YABC5×(YB×167)    (YABC5×167)×YB1-10                 0                0                  220.1-20              0                0                  020.1-30              0                0                  030.1-40              0                0                  040.1-50              4                5                  250.1-60              5                9                  760.1-70              1                5                  170.1-80              0                0                  080.1-90              0                0                  090.1-100             1               16                  7可育∶半不育∶不育    可育∶半不育∶不育  可育∶半不育∶不育

0∶10∶1                0∶19∶16           2∶10∶7

第一竖行，是以YA为母本，以(167×YB)F1为父本杂交的结果。从遗传上看，是S-rfrf(YA)与S-Rfrf(167×YB)杂交。需注意的是，由于有167细胞质的存在，在父本中只有携带Rf的花粉才有生活力。这一杂交的后代遗传模式为S-Rfrf，还需注意的是，由于品种167具有配子体不育细胞质，而不是孢子体不育细胞质，在(167×YB)F1中，携带隐性恢复位点的花粉粒没有生活力。这可以解释为什么有50％花粉粒不育。这一三交组合后代育性分离比例为：可育∶半不育∶不育＝0∶10∶1。其中一个可育株，是由于发生了细胞质反转为可育，使隐性恢复位点也可以传递造成的。这种细胞质反转在文献中已有不少实例。在这些例子中，细胞质反转为可育，表现为携带隐性rf位点的花粉粒发育正常。如果这种情况出现，可获得完全雄性不育的后代。在玉米中，出现这一现象的频率，取决于基因型。参见Gabay-Laugnam，S.，G.Zabala，J.R.Langham，(1995)，″S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize″，pp.395-432.刊于Ch.S.Levings III和I.K.Vasil编辑的“The MolecularBiology of Plant Mitochondria ”，Kuwar Academic Publishers，Netherlands.

第二竖行，是以YA为母本，以(YB×167)F1为父本杂交的结果。从遗传上看，是S-rfrf与F-Rfrf杂交，其后代应有两种基因型S-Rfrf和S-rfrf，比例为1∶1。在这种情况下，Rf和rf位点都是可以传递的，因为(YB×167)F1携带可育细胞质。这一三交组合后代育性分离比例为：可育∶半不育∶不育＝0∶19∶16，反映了预计的半不育∶不育＝1∶1的分离比例。

第三竖行，YA先与167杂交，F1的基因型为S-Rfrf；再以F1为母本与父本YB杂交。其后代期望的分离比例仍为半不肓∶不育＝1∶1，因为Rf和rf位点在通过母本传递的情况下，都有生活力。两个可育株的出现，同样可以用前面叙述过的细胞质反转为可育来解释。

表5列出了对两个F2群体进行测验的结果。第一个是YA与167杂交，第二是167与YB杂交。这些结果也反映了所包含的遗传机制。在YA×167的F2群体中，在遗传上，是S-rfrf与S-RfRf杂交，F1为S-Rfrf，F2分离为可育(S-RfRf)∶半不育(S-Rfrf)＝1∶1。在第二个杂交组合167×YB中，F1应为S-Rfrf，F2和第一个杂交一样，分离为可育(S-RfRf)∶半不育(Rfrf)＝1∶1。和前面已经叙述过的一样，第一个杂交组合中的6个不育后代和第二个杂交组合中的7个不育后代的出现，仍可用细胞质反转来解释。在两个已知遗传材料杂交时，许多因素都可以影响实际获得的结果。环境就是其中之一。上面提到的种种异常现象，发生在配子体不育系统中，隐性位点只由雌性部分传递。考虑到这些实际情况，这里所列的资料令人信服地说明，存在一个单基因配子体不育系统。为了不受理论的局限，发明人再次强调，在单基因配子体不育系统中，不排除在某些遗传材料中存在修饰基因。

表5(YA×167)F2，(167×YB)F2代花粉败育百分数不育花粉％    (YA×167)F2     (167×YB)F20-10              111             11510.1-20             4               120.1-30             7               630.1-40            22               840.1-50            42              2750.1-60            31              5860.1-70             2               370.1-80             2               080.1-90             0               090.1-100            6               7

可育∶半不育∶不育    可育∶半不育∶不育

    111∶110∶6           115∶103∶7

可以肯定，该系统与Davis的双基因孢子体不同，是单基因配子体系统。应该指出，大豆是二倍体化了的多倍体，一个特定性状可能与数个基因有关，然而，这些基因是典型的不活动基因。就本发明而言，只需一个核基因控制育性。对本领域技术熟练的人都懂得，通过杂交，回交等手段进行遗传操作时，单基因极容易运作。实施例4

在本发明中，温度和光照变化时，不育性状稳定。表6列出了在昼夜温度相同光周期不同时，不育花粉粒的百分数。在表7中，列出了在光周期相同，昼夜温度不同时，不育花粉百分数。温度的第一数字是白天温度，第二数字是夜间温度。试验数据表明，在温度和光照大幅度波动时，不育花粉百分数变化不大。

表6昼夜温度设定为30℃-20℃时，不同昼夜光照长度下，野生型不育

            系OA不育花粉百分数材料     重复            光照长度(小时)

               12.5     14.0    15.5OA        1        99.92    99.94   99.80

      2        99.96    99.96   99.70

      3        96.69    96.99   99.65平均               99.82    99.90   99.72表7    昼间光照设定为14.0小时，不同昼夜温度下，不育花粉百分数材料           重复                 温度(℃)

                            25-15  30-20  35-25OA    1            99.91  99.65  99.85

  2           100.00  99.78  99.75

  3            99.93  99.85  99.60平均               99.94  99.76  99.93

               参考文献1.BEILING，G.，1915.Linkage and semi-sterility.American Nature，49：582-584.2.DAVIS，W.H.，1985.Route to hybrid soybean production.UnitedStates Patent，4,545,146.3.DELANNAY，X.，KILEN，T.C.，PALMER，R.G.，1982.Screening of soybean(G.max)accessions and G.soja accessions for chromosome interchange andinversions.Agronomy abstract，American Society of Agronomy，Madison，Wisconsin.pp.63.4.DUVICK，D.N.，1966.Inference of morphology and sterility onbreeding  methodology. In″Plant Breeding″，pp.85-138.Ed.FREY，K，J.，Asymposium held at lowa State University.Press Ames.5.GRAYBOSCH，R.A.and PALMER，R.G.，1988.Male sterility in soybean-Anoverview.American Journal of Botany.75(1)：144-156.6.KAUL，M.L.H.，1988.Male sterility in higher plant.Monographs onTheor.and Appl.Genet.Vol.10.Springer-Verlag，Berlin.7.LASER，K.D.，and LERSTERN，N.J.R.，1972. Anatomy and cytology ofMicrosporogenesis in cytoplasmic male sterileangiosperms.BotanicalReview，Vol.38，No.3，425-454.8.PALMER，R.G.，1976.Cytogenetics in soybean improvement.Proc.SixthSoybean Res.Conf.，American Seed Trade Assoc.Publ.6：55-66.9.PALMER，R.G.，ALBERTSEN，N.C.，HORNER，H.T.and SKORUPSKA，H.，1992.Malesterility in soybean and maize：developmental comparisons.Thenucleus，Vol.35(1)，1-18.10.PALMER，R.G.and  HEER，H.，1984.Agronomic characteristics  andgenetics of a chromosome interchange in sybean.Euphytica，33：651-653.11.PALMER，R.G.and  KILEN，T.C.，1987. Qualitative genetics andcytogenetics. In″Soybeans：improvement，production and uses″，135-209，Ed.Wilcox，J.R.，American  Society of Agronomy，No.16，Madison，Wisconsin，U.S.A.-

Claims (3)

1、一个细胞质雄性不育大豆，其特征是由含有不育细胞质的大豆品种为母本，与含有特异于该细胞质的配子体细胞质雄性不育遗传成份的大豆为父本杂交，其F1再与父本反复回交得到的。

2、根据权利要求1所述的细胞质雄性不育大豆，其特征是细胞质雄性不育大豆的不育细胞质，存在于以汝南天鹅蛋为代表的大豆品种中，特异于该细胞质的配子体雄性不育遗传成分存在于以5090035为代表的大豆品种中。

3、一种生产大豆杂交种的方法，其特征在于，以权利要求1所述的细胞质雄性不育大豆为母本，以核恢复基因座位为显性位点RfRf的恢复系大豆为父本杂交，从母本上收获F1杂种，用于大田生产。