CN117323465A - 一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶及其制备方法和应用,涉及医用生物材料技术领域。水凝胶包括氧化透明质酸,多巴胺改性明胶以及聚赖氨酸。本发明利用氧化透明质酸(OHA)的醛基,与多巴胺改性明胶(GelDA)、聚赖氨酸(EPL)的氨基间的席夫碱反应形成可注射的GOE水凝胶,该水凝胶具有抗感染、抗氧化、巨噬细胞表型调控、促血管生成等方面的作用且具有较好的生物相容性、粘附性和流变性。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域,具体涉及一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
由于人口老龄化、肥胖、糖尿病等原因,慢性伤口的发病率呈上升趋势。当伤口在各种内部或外部因素的影响下,无法完成正常、有序和及时的修复,会发展为慢性伤口。最常见的慢性伤口类型包括糖尿病性溃疡、压力性溃疡和血管性溃疡,这种伤口在临床均难以愈合。研究发现,糖尿病伤口的高葡萄糖水平会导致ROS水平升高、一氧化氮阻断、DNA改变、缺血和伤口周围炎症,这些均影响着伤口的愈合进程。多功能水凝胶具有应对慢性伤口复杂环境的潜力。通过一定的材料设计,可使水凝胶具有生物相容性、生物降解性、粘附性、促血管形成,以及抗菌、抗炎特性,从而具有对抗慢性伤口感染和促愈合的作用。
水凝胶创面敷料可以防止创面感染和干燥,避免进一步的皮肤损伤。天然聚合物由于具有优良的生物相容性、生物降解性以及促进细胞粘附和增殖的能力,已广泛应用于伤口治疗。明胶因其良好的生物相容性、生物降解性、非免疫原性和商业易得性而被广泛应用于生物医学领域。明胶分子结构中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列,可以促进细胞粘附和迁移,使明胶成为理想的组织修复材料。海洋生物贻贝所具有的强粘附性能,为设计和合成具有许多优异性能的仿生贻贝水凝胶带来了灵感。受贻贝启发的带有邻苯二酚基团的水凝胶可以赋予材料良好的粘附能力和自愈合性能。
明胶基水凝胶在伤口修复中应用广泛,但仍存在粘附力差、易撕裂等缺点。无论用作组织粘结剂还是伤口敷料,水凝胶都需要有足够的粘附性能。粘附性对于维持伤口区域水凝胶敷料的稳定性、保持伤口湿润以及在愈合过程中吸收组织渗出物等方面起重要作用。现有技术中公开的明胶基水凝胶,在施用到机体上后总会受到人体运动所产生的持续应力作用,可能导致水凝胶粘附性能降低、变形和撕裂。现有技术中公开的可喷雾成膜的自愈合海藻酸钠/明胶基水凝胶材料,成胶时间快(10s),自愈合性能强,但是没有抑菌能力,促愈合效果有限,不适用于复杂创面。现有技术中公开的基于明胶、抗菌肽和重组胶原蛋白的促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法,虽然该复合凝胶在创面应用时,能引导成纤维细胞迁移增殖,增加新胶原沉积于血管重建,但是其制备工艺复杂,且成本较高,不利于大规模生产。现有技术中公开的明胶基高强度水凝胶的制备方法,该方法操作简单,成本低廉,可进行大规模推广生产,但是在创面作用时,没有明显的抗菌和抗炎效果,不利于创面的愈合和修复等。
发明内容
为了解决上述背景技术中存在的不足,主要针对现有水凝胶没有明显的抗菌和抗炎效果,不利于创面的愈合和修复的技术问题,本发明提供一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶及其制备方法和应用,该水凝胶是利用氧化透明质酸(OHA)的醛基,与多巴胺改性明胶(GelDA)、聚赖氨酸(EPL)的氨基间的席夫碱反应形成可注射的GOE水凝胶,具有优异的抗菌性、抗炎性、抗氧化性,生物相容性好,可促进糖尿病等复杂感染性创面的愈合等功能。
本发明第一个目的是提供一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶,所述水凝胶包括氧化透明质酸,多巴胺改性明胶以及聚赖氨酸;
所述氧化透明质酸的浓度为5~10%(w/v);
所述多巴胺改性明胶的浓度为2.5~5%(w/v);
所述聚赖氨酸的浓度为1~5%(w/v)。
优选的,所述水凝胶利用醛基与氨基间的席夫碱反应成胶。
优选的,所述水凝胶的孔径为1.6~13.0μm。
优选的,所述水凝胶具有可注射和形状自适应特性,其线性粘弹区为0.01%~68.5%;所述水凝胶的粘附强度为6.61~10.10kPa。
优选的,所述聚赖氨酸中还加入0.1~1%(w/v)的铜肽。
优选的,所述水凝胶对E.coli、S.aureus和MRSA三种细菌的杀菌率都达到了99%以上。
优选的,所述水凝胶能在体外诱导调控巨噬细胞表型,促使细胞向抑制炎症反应的M2表型极化;所述水凝胶能降低促炎因子TNF-α的表达。
本发明第二个目的是提供一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
制备氧化透明质酸;
将氧化透明质酸溶解在PBS中,然后加入多巴胺改性明胶,制成GelDA/OHA溶液;
将聚赖氨酸溶解在PBS中配置成溶液,然后将GelDA/OHA溶液和聚赖氨酸溶液均匀混合;获得用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶。
优选的,所述氧化透明质酸制备过程,包括:在透明质酸溶液中加入高碘酸钠溶液,
进行避光反应,随后经透析、冷冻干燥,获得氧化透明质酸。
本发明第三个目的是提供一种水凝胶在制备用于复杂慢性伤口的抗炎组织药物中应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明提供的一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶及其制备方法和应用,该水凝胶含有GelDA结构,GelDA的抗氧化特性已获得许多的研究证实,这也是GOE水凝胶抗氧化性、抗炎的分子结构基础。EPL是一种通过发酵方法获取的经济型阳离子AMP,具有良好的广谱抗菌性能。此外,GOE水凝胶能够促进L929细胞迁移,具备用于治疗感染型慢性伤口的条件和潜力,可促进糖尿病等复杂感染性创面的愈合等功能;在促进愈合的过程中,通过明胶、多巴胺的粘附性能,封闭创面,浓缩凝血因子,红细胞和血小板等血液成分发挥止血性能。本发明所使用的原材料均为生物大分子或发酵所得,廉价,环境友好,具有良好的生物相容性。
本发明针对情况更为复杂的慢性伤口,如糖尿病伤口,而提供了一种能够诱导巨噬细胞抗炎表型,具有粘附性、抗氧化性、抗菌性的可注射水凝胶。首先对透明质酸(HA)进行氧化改性,制备出了含醛基侧链的氧化透明质酸(OHA),然后利用醛基与氨基间的席夫碱反应,与多巴胺改性明胶(GelDA)、聚赖氨酸(EPL)形成可注射的GOE水凝胶。以OHA(5%,w/v)和GelDA(2.5%,w/v)为基础,通过与不同浓度的EPL(1%、3%和5%,w/v)在PBS中反应,制备出系列GOE水凝胶(GOE1、GOE3和GOE5)。GOE水凝胶的孔径范围为1.6~13.0μm。GOE水凝胶具有可注射和形状自适应特性,GOE水凝胶的线性粘弹区都为0.01%~68.5%,而GOE3和GOE5凝胶-溶胶转变点分别为217%和279%。此外,GOE水凝胶具有组织粘附性、抗氧化性、抗菌性和良好的生物相容性。通过构建耐药菌感染的糖尿病小鼠全层皮肤损伤模型,使用GOE3和GOE3/GHK(Cu)水凝胶对伤口进行处理,其在体内具有抗感染、抗氧化、巨噬细胞表型调控、促血管生成等方面的作用,即GOE水凝胶具有促进糖尿病伤口愈合作用。本发明基于席夫碱制得的GOE水凝胶具有抗感染、抗氧化、巨噬细胞表型调控、促血管生成等方面的作用且具有较好的生物相容性、粘附性和流变性。因此,GOE水凝胶是一种可用于复杂慢性感染组织愈合的粘合剂。
附图说明
图1是OHA和HA的化学结构表征。(A)OHA和HA的1H NMR谱图;(B)OHA和HA的红外光谱。
图2是GOE水凝胶的制备流程。(A)合成氧化透明质酸(Oxidated hyaluronicacid,OHA)的化学过程;(B)GOE水凝胶的制备和凝胶原理;(C)混合均匀的多巴胺改性明胶(GelDA)、氧化透明质酸(OHA)和聚赖氨酸(EPL)溶液能够在室温下快速形成GOE水凝胶。
图3是GOE水凝胶的微观SEM形貌。(A)GOE1;(B)GOE3;(C)GOE5;(D)孔径统计分析。*P<0.05,****P<0.0001。
图4是水凝胶的可注射、形状自适应和自愈合特性。(A)GOE1水凝胶能够通过27号针头而不发生堵塞,表明其可注射性;(B)绿色墨水染色的GOE3水凝胶注射进水中,水凝胶纤维在水中稳定;(C)将GOE3水凝胶注射到模具中,重塑成五角星状水凝胶(得到的水凝胶经过压缩和弯曲后能够恢复到初始状态并保持完整);(D)凝胶化后的GOE3水凝胶宏观自愈实验。
图5是频率扫描测量GOE水凝胶的流变性能(G':储能模量,G”:损耗模量)。
图6是GOE水凝胶在动态应变扫描和循环应变扫描下的流变学测试。(A-C)GOE1、GOE3和GOE5的动态应变扫描测试;(D-F)1%和400%的剪切应变下的循环扫描测试(ω=1rad/s)。
图7是GOE水凝胶的组织粘附性。(A)GOE水凝胶粘附在人手指关节处的照片;(B)GOE水凝胶的粘附强度。*P<0.05,****P<0.0001。
图8是GOE3水凝胶的止血性能。(A)水凝胶止血效果照片;(B)出血量统计.**P<0.01。
图9是GOE水凝胶的抗氧化测试结果。(A)不同组与DPPH共培养后的溶液颜色变化;(B)GOE水凝胶的自由基清除率,n=3。
图10是水凝胶的抗菌性。(A)与水凝胶共培养后存活细菌在琼脂板上的菌落生长情况;(B)菌落计数法统计出的细菌存活率。***P<0.001,****P<0.0001。
图11是GOE水凝胶的血液相容性结果。(A)水凝胶溶血活性测试图片;(B)水凝胶的溶血率。****P<0.0001。
图12是GOE水凝胶的细胞相容性结果。(A)水凝胶与L929细胞共培养1、3和5天的细胞活力;(B)水凝胶与HUVECs细胞共培养1、3和5天的细胞活力;(C)水凝胶与L929细胞共培养5天的Live/dead染色图片。n=5,*p<0.05,**p<0.01,***P<0.001。
图13是GOE水凝胶对L929细胞迁移的影响。(A)划痕实验,黑色虚线表示原始划痕边缘,绿色虚线表示细胞迁移末端;(B)迁移率。n=5,*P<0.05。
图14是GOE水凝胶刺激RAW264.7巨噬细胞的M2表型极化(各组巨噬细胞CD206、ARG-1、IL-10、TGF-β、VEGF、IL-6、IL-1β、TNF-α的相对mRNA水平),*P<0.05、**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图15是MRSA耐药菌感染的糖尿病伤口修复。A:伤口的愈合效果;B:伤口愈合率;C:创面完全闭合时间。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施,下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明,但所举实施例不作为对本发明的限定。
目前。过度炎症是慢性伤口愈合延迟的主要原因,抗炎水凝胶可以通过促进从炎症阶段过渡到增殖阶段来缩短伤口愈合期。伤口区域的氧气和营养输送受限是慢性伤口愈合延迟的另一个原因,促血管生成水凝胶可以刺激血管生成,将所需的营养物质和氧气输送到伤口处,从而加速慢性伤口愈合。通过将各种类型的药物或治疗剂掺入水凝胶中,可以进一步提高水凝胶的功能。因此,研发出一种能够诱导巨噬细胞抗炎表型,具有粘附性、抗氧化性、抗菌性的可注射医用水凝胶。
本发明基于氧化透明质酸和多巴胺改性明胶以聚赖氨酸为支架,利用席夫碱反应合成具有抗炎、抗菌、止血、促愈合作用的GOE水凝胶。该水凝胶包含氧化透明质酸(OHA)、多巴胺改性明胶(GelDA)和聚赖氨酸(EPL)其中,投料比分别为OHA(5%,w/v)、GelDA(2.5%,w/v)和EPL(1%、3%和5%,w/v)。GOE的孔径范围为1.6~13.0μm。GOE水凝胶具有可注射和形状自适应特性,GOE水凝胶的线性粘弹区都为0.01%~68.5%,而GOE3和GOE5凝胶-溶胶转变点分别为217%和279%。GOE水凝胶的制备过程不需要复杂的设备,工艺简单,条件温和;此外,无副产物生成,对环境友好。在此基础上,完成了本发明。
本发明第一方面提供一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶(简称:GOE水凝胶),所述水凝胶包括氧化透明质酸(OHA),多巴胺改性明胶(GelDA)和聚赖氨酸(EPL);
所述氧化透明质酸的浓度为5~10%(w/v);所述多巴胺改性明胶的浓度为2.5~5%(w/v);所述聚赖氨酸的浓度为1~5%(w/v)。
本发明提供的的GOE水凝胶具有优异的抗菌性、抗炎性、抗氧化性,生物相容性好,可促进糖尿病等复杂感染性创面的愈合等功能。
其中,所述水凝胶利用醛基与氨基间的席夫碱反应成胶。所述水凝胶的孔径为1.6~13.0μm。所述水凝胶具有可注射和形状自适应特性,其线性粘弹区为0.01%~68.5%;所述水凝胶的粘附强度为6.61~10.10kPa。
在一实施例中,所述聚赖氨酸中还加入0.1~1%(w/v)的铜肽。
所述水凝胶对E.coli、S.aureus和MRSA三种细菌的杀菌率都达到了99%以上。所述水凝胶能在体外诱导调控巨噬细胞表型,促使细胞向抑制炎症反应的M2表型极化;所述水凝胶能降低促炎因子TNF-α的表达。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶中EPL的浓度分别为1%、3%和5%(w/v),通过改变EPL的浓度分别为1%、3%和5%(w/v)分别获得不同EPL的浓度的水凝胶,记为GOE1,GOE3和GOE5。
所述的GOE水凝胶的孔径范围为1.6~13.0μm,且随着EPL浓度的增大,多孔网络结构变的更为致密、且孔径更小。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶中GOE5水凝胶的孔径最小,平均孔径为3.27μm,GOE1和GOE2的平均孔径分别为6.10和4.25μm。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶具有可注射和形状自适应特性,GOE水凝胶的线性粘弹区都为0.01%~68.5%。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶中,GOE3和GOE5凝胶-溶胶转变点分别为217%和279%。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶具有黏附性能,GOE1、GOE3、GOE5的粘附强度分别为6.61、9.29、10.10kPa。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶具有抗氧化性,GOE1、GOE3和GOE5水凝胶的自由基清除率分别为75.66%、75.27%和76.73%。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶具有抗菌性,其中,GOE5水凝胶组的抗菌效果最强,对E.coli、S.aureus和MRSA 3种细菌的杀菌率都达到了99%以上。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶具有抗炎性,GOE水凝胶可以在体外诱导调控巨噬细胞表型,促使细胞向抑制炎症反应的M2表型极化。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶具有抗炎性,GOE水凝胶可有效地降低促炎因子TNF-α的表达。
在另一优选例中,所述的GOE水凝胶具有粘附性,GOE1、GOE3、GOE5的在新鲜猪皮表面的粘附强度分别为6.61、9.29、10.10kPa。
在另一优选例中,GOE3水凝胶中可加入1%(w/v)的铜肽GHK(Cu),将1%(w/v)的GHK(Cu)加入到3%(w/v)的EPL中,GelDA/OHA溶液混合制得GOE3-GHK(Cu)。
在另一优选例中,ε-聚赖氨酸盐酸盐(EPL)的分子量为2000~5000Mw。
本发明第二方面提供一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
制备氧化透明质酸;
将氧化透明质酸溶解在PBS中,然后加入多巴胺改性明胶,制成GelDA/OHA溶液;
将聚赖氨酸溶解在PBS中配置成溶液,然后将GelDA/OHA溶液和聚赖氨酸溶液均匀混合;获得用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶。
其中,所述氧化透明质酸制备过程,包括:在透明质酸溶液中加入高碘酸钠溶液,进行避光反应,随后经透析、冷冻干燥,获得氧化透明质酸。
在一实施例中,提供的的一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)氧化透明质酸(OHA)的制备,利用0.25M的高碘酸钠溶液氧化透明质酸,透析3天后冷冻干燥。
(2)将步骤(1)中的OHA以10%(w/v)的浓度溶解在PBS中,然后加入GelDA使其在溶液中的浓度为5%(w/v),制成GelDA/OHA溶液。
(3)将EPL溶解在PBS中,配置成2%、6%和10%(w/v)的EPL溶液,然后将步骤(2)中的GelDA/OHA溶液和不同浓度的EPL溶液在30℃下混合均匀。
在另一优选例中,所述方法还包括将步骤(1)获得的OHA制备中,在避光下缓慢加入8.25mL(0.25M)的高碘酸钠溶液,室温下避光反应3h。
在另一优选例中,明胶的类型为Type A,来源猪皮。
本发明提供的一种新型的明胶基GOE水凝胶,具有抗炎、抗菌、止血、促进糖尿病感染伤口的愈合,并公开了其制备工艺。具体制备工序包括氧化透明质酸、多巴胺交改性明胶、聚赖氨酸和GHK(Cu)的合成步骤。
氧化透明质酸的制备:称取1.5g的HA,加入到150mL去离子水中,室温下搅拌10h至HA完全溶解。然后在避光下缓慢加入8.25mL(0.25M)的高碘酸钠溶液,室温下避光反应3h。随后,向反应液中加入30mL乙二醇,继续搅拌1h终止反应。最后,将反应后得到的溶液装入透析袋中,在去离子水中透析3天,以去除反应液中的副产物。透析过程中,第1天每5h换一次水,后2天每8h换水。待透析结束后,将透析袋中的氧化透明质酸(OHA)溶液冷冻干燥,得到白色海绵状的干燥样品,储存在-20℃以供后续实验使用。
多巴胺改性明胶的制备:称取2.0g明胶粉末,将其加入100mL的PBS中,50℃水浴加热并搅拌至完全溶解。之后,将水浴温度降至37℃,用1M的盐酸溶液调整溶液pH值至5.5。搅拌条件下充氮气10min,在氮气保护下,加入2.0g盐酸多巴胺粉末,待盐酸多巴胺完全溶解后加入1.0g的EDC和0.6g的NHS。此时,监测溶液pH值,使用1M的盐酸溶液调节溶液pH值,使溶液pH值稳定在5~6之间,反应时间为30min,进行37℃水浴搅拌反应12h。将所得GelDA溶液装入透析袋中,在酸性去离子水(pH=5)中透析2天以去除副产物。透析过程中,每8h换一次水。透析结束后将GelDA溶液冷冻干燥,得到干燥的淡黄色海绵状GelDA,产物置于-20℃下保存以待后续实验使用。
GOE水凝胶的制备:称取已制备的OHA,将OHA以10%(w/v)的浓度溶解在PBS中。然后加入一定量的GelDA使其在溶液中的浓度为5%(w/v),制成GelDA/OHA溶液。将EPL溶解在PBS中,配置成2%、6%和10%(w/v)的EPL溶液。最后,将GelDA/OHA溶液和不同浓度的EPL溶液在30℃下混合均匀,静待数秒后凝胶,即可制备出GOE水凝胶。制备含GHK(Cu)的水凝胶时,先将GHK(Cu)按量加入EPL溶液中,然后再与GelDA/OHA溶液混合制备出水凝胶。
本发明第三方面,提供一种上述水凝胶在制备用于复杂慢性伤口的抗炎组织药物中应用。本发明的提供的GOE水凝胶的用途,用于制备止血材料、皮肤修复、复杂创面愈合、材料或组织工程材料。
本发明中所述的GOE水凝胶具有较强的抗菌性、抗炎性、促细胞迁移、止血和复杂感染伤口的促愈合功能,通过在创面处使用时可以抑制细菌乃至耐药菌的生长,促进糖尿病感染伤口的愈合,同时具有止血性能,可以防止创面的出血和二次出血,可直接或与其他止血材料复合应用于紧急止血和皮肤修复,具有较高的临床应用价值。
本发明中氧化透明质酸提供醛基,利用醛基与氨基间的席夫碱反应,与多巴胺改性明胶以聚赖氨酸为支架形成可注射的GOE水凝胶,制备方法简单,无副产物生成。发现聚赖氨酸浓度为1%,3%和5%(w/v)所得GOE1、GOE3和GOE5的水凝胶孔径分别为6.10、4.25和3.27μm,其中,GOE5的孔径最小。以OHA(5%,w/v)和GelDA(2.5%,w/v)为基础,通过与不同浓度的EPL(1%、3%和5%,w/v)。GOE水凝胶中,氧化透明质酸(OHA)在9.22ppm(1H NMR)处具有醛基(-CHO)的特征吸收峰,在1729cm-1(FTIR)同样具有-CHO的特征峰。所制备的系列GOE水凝胶孔径分布均匀,具有可注射和形状自适应特性,GOE1、GOE3和GOE5水凝胶的自由基清除率分别为75.66%、75.27%和76.73%,具有较好的抗氧化性,同时生物相容性好,没有细胞毒性。
同时本发明中含聚赖氨酸的GOE水凝胶所述制备方法,EPL具有良好的广谱抗菌性能,同时基于EPL良好的生物相容性,并被广泛用作食品防腐剂、药物载体、组织工程支架和水凝胶材料。GOE水凝胶不仅对E.coli、S.aureus表现了抗菌活性,对耐药菌MRSA也有显著的抗菌作用,杀菌率分别达到了63.63%(GOE1)、92.42%(GOE3)和99.13%(GOE5)。GOE1、GOE3、GOE5和GOE3/GHK(Cu)的L929细胞迁移率分别为74.03%、71.33%、65.30%和87.62%。在MRSA感染的糖尿病伤口模型中,第14天时GOE3和GOE3/GHK(Cu)组的伤口愈合率分别达到了94.41%和98.36%,可有效地促进耐药菌感染的糖尿病伤口愈合。
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
需要说明的是,本发明中采用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;采用的试剂和材料,如无特殊说明,均可在市场上购买得到。
实施例1
本实施例涉及氧化透明质酸OHA的合成
OHA的制备:称取1.5g的HA,加入到150mL去离子水中,室温下搅拌10h至HA完全溶解。然后在避光下缓慢加入8.25mL(0.25M)的高碘酸钠溶液,室温下避光反应3h。随后,向反应液中加入30mL乙二醇,继续搅拌1h终止反应。最后,将反应后得到的溶液装入透析袋中,在去离子水中透析3天,以去除反应液中的副产物。透析过程中,第1天每5h换一次水,后2天每8h换水。待透析结束后,将透析袋中的氧化透明质酸(OHA)溶液冷冻干燥,得到白色海绵状的干燥样品,储存在-20℃以供后续实验使用。
使用核磁共振谱仪(NMR)(Bruker Avance 400MHz,德国Bruker)和傅里叶红外光谱仪(Bruker ALPHAII,德国Bruker)测定OHA和HA的化学结构表征进行(图1)。
图1为OHA和HA的化学结构表征。(A)OHA和HA的1H NMR谱图;(B)OHA和HA的FTIR;图1A中,对比OHA和HA的1H NMR谱图,能够发现OHA在9.22ppm处出现了一个新峰,而这正是醛基(-CHO)存在的标志;图1B中OHA的FTIR光谱中能够观察到在1729cm-1处出现了一个HA中没有的特征峰,这同样证实了-CHO基团的存在,即-CHO基团的存在证明透明质酸经氧化后醛基的生成。
实施例2
本实施例涉及多巴胺改性明胶的合成
GelDA的制备:称取2.0g明胶粉末,将其加入100mL的PBS中,50℃水浴加热并搅拌至完全溶解。之后,将水浴温度降至37℃,用1M的盐酸溶液调整溶液pH值至5.5。搅拌条件下充氮气10min,在氮气保护下,加入2.0g盐酸多巴胺粉末,待盐酸多巴胺完全溶解后加入1.0g的EDC和0.6g的NHS。此时,监测溶液pH值,使用1M的盐酸溶液调节溶液pH值,使溶液pH值稳定在5~6之间,反应时间为30min,进行37℃水浴搅拌反应12h。将所得GelDA溶液装入透析袋中,在酸性去离子水(pH=5)中透析2天以去除副产物。透析过程中,每8h换一次水。透析结束后将GelDA溶液冷冻干燥,得到干燥的淡黄色海绵状GelDA,产物置于-20℃下保存以待后续实验使用。
实施例3
本实施例涉及GOE系列水凝胶的合成
GOE水凝胶的制备:称取已制备的OHA,将OHA以10%(w/v)的浓度溶解在PBS中。然后加入一定量的GelDA使其在溶液中的浓度为5%(w/v),制成GelDA/OHA溶液。将EPL溶解在PBS中,配置成2%、6%和10%(w/v)的EPL溶液。最后,将GelDA/OHA溶液和不同浓度的EPL溶液在30℃下混合均匀,静待数秒后凝胶,即可制备出GOE水凝胶(GOE1、GOE3和GOE5)。制备含GHK(Cu)的水凝胶时,先将GHK(Cu)按量加入EPL溶液中,然后再与GelDA/OHA溶液混合制备出水凝胶(GOE3-GHK(Cu))。
本实施例涉及GOE系列水凝胶配方见下表1。
表1GOE系列水凝胶配方
GOE凝胶制备中,氧化透明质酸的制备如图2(A)席夫碱反应结构式如图2(B),所制备的GOE水凝胶见图2(C)使用扫描电子显微镜((SEM,JSM-7500F,JEOL,Japan)观察制备的GOE水凝胶表面形貌及孔结构(图3)。
图2GOE水凝胶的制备流程。(A)合成氧化透明质酸(Oxidated hyaluronic acid,OHA)的化学过程;(B)GOE水凝胶的制备和凝胶原理;(C)混合均匀的多巴胺改性明胶(GelDA)、氧化透明质酸(OHA)和聚赖氨酸(EPL)溶液能够在室温下快速形成GOE水凝胶。从图2可知,GOE水凝胶的成功制备。
图3GOE水凝胶的微观SEM形貌。(A)GOE1;(B)GOE3;(C)GOE5;(D)孔径统计分析。*P<0.05,****P<0.0001。从图3可知,GOE1、GOE3、GOE5的平均孔径分别为6.10、4.25和3.27μm,EPL含量的增加提高了交联密度,形成了更为致密的内部结构。
实施案例4
本实例涉及GOE水凝胶的制备过程
以实施例1中透明质酸分子链上的相邻羟基被NaIO4氧化生成醛基(图2A)。然后将GelDA、OHA和EPL溶液混合,OHA上的醛基与EPL和GelDA分子上的氨基反应,通过亚胺键交联形成水凝胶(图2B)。以OHA(5%,w/v)和GelDA(2.5%,w/v)为基础,通过与不同浓度的EPL(1%、3%和5%,w/v)在PBS中反应,制备出系列GOE水凝胶。水凝胶的交联成胶主要由醛基与氨基形成席夫碱完成,图2C所示,在将各组分溶液进行混合后,能够迅速形成GOE水凝胶(10s内),设计思路和制备过程如图2所示。
实施案例5
本实例涉及GOE水凝胶的形貌及结构表征
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,从扫描电镜图像和可以观察到不同EPL比例制备的水凝胶。所有水凝胶都呈现出了均匀的、多孔且孔互连的内部网络结构,孔径范围约为1.6~13μm。且随着EPL浓度的增大,多孔网络结构变的更为致密、且孔径更小。具体来讲,GOE5水凝胶的孔径最小,平均孔径为3.27μm,GOE1和GOE2的平均孔径分别为6.10和4.25μm。图3结果表明,聚赖氨酸含量的增加提高了交联密度,形成了更为致密的内部结构。
实施案例6
本实例涉及GOE水凝胶的可注射
以实施例3制备的系列GOE1和GOE3水凝胶为例,水凝胶的可注射性表征是将水凝胶装入注射器(27号针头,直径0.41mm)中,通过注射器针头对水凝胶进行注射操作,在纸上书写字母“NPU”,而没有出现堵塞,结果如图4A所示。将GOE3水凝胶(绿色墨水染色)直接注射进水中,水凝胶形成螺旋细线并在水中保持了形态的稳定。结果如图4B。
图4水凝胶的可注射、形状自适应和自愈合特性。(A)GOE1水凝胶能够通过27号针头而不发生堵塞,表明其可注射性;(B)绿色墨水染色的GOE3水凝胶注射进水中,水凝胶纤维在水中稳定;(C)将GOE3水凝胶注射到模具中,重塑成五角星状水凝胶(得到的水凝胶经过压缩和弯曲后能够恢复到初始状态并保持完整);(D)凝胶化后的GOE3水凝胶宏观自愈实验。从图4可知,所制备的GOE水凝胶具有形状自适应性和自愈合性。
实施案例7
本实例涉及GOE水凝胶的形状自适应特性
以实施例3制备的系列GOE3水凝胶为例,水凝胶的形状自适应特性是通过将水凝胶注射进模具中后,观察水凝胶的成型过程与成型后状态,通过录像和拍摄照片来记录相关过程。GOE3水凝胶注射进一个五角星状的硅胶模具中,待注射出的纤维状水凝胶充满模具后,将模具静置30min,在没有外界干预下,水凝胶通过重力诱导的慢速流动和自愈合重塑成型为完整的五角星状水凝胶,展现出了形状自适应特性。成型后的水凝胶在压缩弯曲后能够很快恢复到初始形态,没有出现屈服和破损,结果如图4C。
将透明的GOE3水凝胶和绿色墨水染色的GOE3水凝胶圆片切成两半,再沿切割线将两个不同颜色的半圆形水凝胶接触在一起,观察它们在周围环境下是否会形成圆形凝胶。在没有任何外界作用的情况下,两个物理接触的半圆水凝胶可以在30min后重新组合成具有不同颜色的、完整的水凝胶,重新组合的水凝胶甚至可以在垂直于切割线方向,经受住镊子的拉伸而不会破裂,表现出优异的自愈性,结果如图4D所示。
实施案例8
本实例涉及GOE水凝胶的流变性能
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,采用振荡应变扫描法测试水凝胶的自愈合性能。在固定频率1rad/s下,选取小应变(γ=1%)持续100s,然后切换到大应变(γ=500%)持续100s,共测试2.5个周期,测量水凝胶的存储模量(G′)和损耗模量(G″)的变化。GOE1和GOE3水凝胶的G'和G”随着频率的增加而增加,表明可逆动态化学交联网络中的物理纠缠。水凝胶的流变特性十分依赖于频率,这被认为是动态共价网络的一个关键特征。然而,GOE5水凝胶样品的G'和G”几乎保持不变,这主要是因为聚赖氨酸浓度增加导致了更大的交联密度和更稳定的网络结构。同时注意到,在整个测试范围内,GOE水凝胶的储能模量均大于损耗模量,这说明水凝胶处于稳定的凝胶态,有着较好的凝胶强度。在1rad/s的频率下,GOE1、GOE3和GOE5水凝胶的储能模量(弹性模量)分别为754.6、1829.8和3627.9Pa,能够表明随着聚赖氨酸含量的增加,交联密度增高,水凝胶的弹性模量也随之增大,结果如图5所示。
图5频率扫描测量GOE水凝胶的流变性能(G':储能模量,G”:损耗模量);从图5可知,在1rad/s的频率下,GOE1、GOE3和GOE5水凝胶的储能模量(弹性模量)分别为754.6、1829.8和3627.9Pa,能够表明随着聚赖氨酸含量的增加,交联密度增高,水凝胶的弹性模量也随之增大。
实施案例9
本实例涉及GOE水凝胶的流变性能
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,使用Anton Paar流变仪(MCR 302)进行水凝胶流变学测试,采用频率扫描模式测试并分析水凝胶的流变学性能。测试温度为37℃,恒定应变为1%,频率范围为0.1~20rad/s,测量水凝胶的存储模量(G′)和损耗模量(G″)。测试前,将水凝胶制备成直径为10mm、高为1mm的圆片。采用应变扫描模式测试水凝胶在不同应变下的流变行为。设定测试温度为37℃,测试频率为1rad/s,在应变0.01%~1000%的范围内记录存储模量(G′)和损耗模量(G″)的变化。在动态应变扫描下,GOE3和GOE5水凝胶有着和GOE1类似的流变行为,可以发现GOE3和GOE5的线性粘弹区都为0.01%~68.5%,而凝胶—溶胶转变点分别为217%和279%,即当应变大于217%和279%时,GOE3和GOE5的凝胶交联网络结构被破坏(水凝胶破裂)。结果如图6A、6B和6C。
通过循环应变扫描实验(1%应变→400%应变→1%应变,ω=1rad/s)来研究GOE水凝胶的剪切变稀和自愈合过程中的流变行为。当剪切应变从1%增加到400%时,水凝胶在大应变下被完全破坏,表现出剪切稀化,使其变成G”高于G'的液相。当测试应变恢复1%时,G'和G”迅速恢复到接近其原始值的水平,经过2次损伤循环后,GOE水凝胶仍具有快速的溶胶—凝胶转变行为,表明水凝胶具有良好的自修复特性。值得注意的是,GOE3和GOE5水凝胶在经历剪切稀化后应变恢复到1%时,其弹性模量几乎能恢复到初始水平,而GOE1的弹性模量则出现了明显的下降,这说明GOE1的自愈合性能较差,其原因可能是由于GOE1的动态共价交联点位较少,被破坏的凝胶网络结构无法在较短的时间内恢复足够多的交联,结果如图6D、6E和6F。
图6GOE水凝胶在动态应变扫描和循环应变扫描下的流变学测试。(A)、(B)、(C)分别表示GOE1、GOE3和GOE5的动态应变扫描测试;(D)、(E)、(F)分别表示在1%和400%的剪切应变下,GOE1、GOE3和GOE5的循环扫描测试(ω=1rad/s);从图6中可知,GOE3和GOE5水凝胶有着和GOE1类似的流变行为,GOE3和GOE5的线性粘弹区都为0.01%~68.5%,而凝胶—溶胶转变点分别为217%和279%,即当应变大于217%和279%时,GOE3和GOE5的凝胶交联网络结构被破坏,GOE水凝胶具有可注射性、自愈合特性和形状自适应性。
实施案例10
本实例涉及GOE水凝胶的粘附性能
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,采用剪切搭接法测试水凝胶的粘附强度。将猪皮清洗干净后,切成1cm×3cm的矩形。在猪皮一端表面1cm×1cm的区域滴加20μL的水凝胶,然后将另一片猪皮一端覆盖在水凝胶上,搭接重叠面积为1cm×1cm。测试前,将待测样品用浸透PBS的纱布覆盖以保持样品湿润。测试时,万能试验机的拉伸速率设置为1.0mm/min。GOE3水凝胶粘附在人的手指关节处的照片,在手指关节的运动(弯曲和伸直)过程中,水凝胶牢固地粘附在皮肤表面,没有出现任何脱离和开裂,结果如图7A所示。再次用镊子对水凝胶进行剥离,能够看到水凝胶和皮肤界面处局部水凝胶的能量耗散形变,这种现象得益于水凝胶良好的界面粘附性和材料基质的柔韧性。通过剪切搭接实验测试,获得GOE水凝胶在新鲜猪皮表面的粘附强度。GOE1、GOE3、GOE5的粘附强度分别为6.61、9.29、10.10kPa。GOE水凝胶的粘附特性有助于其用于关节处的动态伤口,也有作为组织粘合剂使用的潜力。结果如图7B所示。
图7GOE水凝胶的组织粘附性。(A)GOE水凝胶粘附在人手指关节处的照片;(B)GOE水凝胶的粘附强度。*P<0.05,**P<0.01;从图7可知,GOE水凝胶在新鲜猪皮表面具有粘附性,GOE1、GOE3、GOE5的粘附强度分别为6.61、9.29、10.10kPa。
实施案例11
本实例涉及GOE水凝胶的止血性能
以实施例3制备的GOE3水凝胶为例,构建了SD大鼠肝脏出血模型(250~300g,雄性,n=3)。首先,对SD大鼠注射7%水合氯醛,按0.5mL/100g体重进行腹腔内注射麻醉,将大鼠固定在手术操作板上进行腹部备皮后,使用碘伏消毒手术区域。用手术刀在大鼠腹部正中行一2.5cm纵向切口,逐层分离,充分暴露肝脏右叶,用滤纸小心地将肝脏周围的浆液清理干净,将预先称重的滤纸放在蜡纸上后置于肝脏下。使用20G的注射器针头穿刺诱导出血,取50μL的新制GOE3水凝胶溶液立即涂抹于出血部位。待10min后,对吸收血液后的滤纸进行称重并计算出血量,并与对照组(穿刺出血后不处理)进行比较。GOE3水凝胶显著的减少了肝脏出血,起到了封闭伤口止血的作用。未处理对照Control组的失血量为356.4mg,而GOE3水凝胶组的失血量仅为70.2mg,说明水凝胶具有良好的粘附止血性能,结果如图8所示。
图8是GOE3水凝胶的止血性能。(A)水凝胶止血效果照片;(B)出血量统计.**P<0.01;从图8可知,GOE水凝胶在SD大鼠肝脏出血模型中具有止血性能,未处理对照Control组的失血量为356.4mg,而GOE3水凝胶组的失血量仅为70.2mg。
实施案例12
本实例涉及GOE水凝胶的抗氧化性能
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,通过1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)法评价水凝胶的抗氧化性能,避光下,将DPPH以200μM的浓度溶解在无水乙醇中,然后将500μL去离子水或者新制的500mg水凝胶分散在3mL DPPH溶液中,在37℃恒温摇床中避光孵育1h。最后,用紫外分光光度计测定反应后溶液在517nm处的吸光度。1,1-二苯基2-苦基肼(DPPH)自由基本身是紫色,在加入GOE水凝胶后,由于水凝胶对于自由基的清除作用,GOE1、GOE3和GOE5水凝胶组的溶液变为淡黄色。经过统计,GOE1、GOE3和GOE5水凝胶的自由基清除率分别为75.66%、75.27%和76.73%,三个组间不存在差异性。结果如图9所示。
图9GOE水凝胶的抗氧化测试结果。(A)不同组与DPPH共培养后的溶液颜色变化;(B)GOE水凝胶的自由基清除率,n=3;从图9可知,GOE水凝胶具有抗氧化性。GOE1、GOE3和GOE5水凝胶的自由基清除率分别为75.66%、75.27%和76.73%。
实施案例13
本实例涉及GOE水凝胶的抗菌性能
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,将灭菌后的水凝胶置于24孔板中,在水凝胶表面滴加10μL的细菌悬液,然后将24孔板置于37℃恒温恒湿培养箱中进行培养。在水凝胶与细菌共培养4h后,加入1mL无菌PBS,超声1min,使细菌悬浮在PBS中。重悬后,取50ul菌液用细菌涂布棒均匀涂布在固体培养基的表面,置于37℃恒温恒湿培养箱中培养18h后,通过菌落计数法对存活细菌进行定量分析。GOE各组水凝胶对E.coli、S.aureus和MRSA有着显著的抗菌作用,体现出一定的广谱抗菌性。统计结果显示,GOE1水凝胶组E.coli、S.aureus和MRSA的细菌存活率分别为42.34%、38.65%和36.37%,而相应的GOE3水凝胶组的细菌存活率分别只有1.71%、10.88%和7.58%(基本上达到了90%以上的杀菌率)。EPL含量最高的GOE5水凝胶组的抗菌效果最强,对三种细菌的杀菌率都达到了99%以上,结果如图10所示。
图10水凝胶的抗菌性。(A)与水凝胶共培养后存活细菌在琼脂板上的菌落生长情况;(B)菌落计数法统计出的细菌存活率。***P<0.001,****P<0.0001;从图10可知,GOE水凝胶具有光谱抗菌性和耐药菌抗菌性。
实施案例14
本实例涉及GOE水凝胶的血液相容性
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,将4mL大鼠血液加入5mL PBS中制备血液稀释剂。然后将500μL水凝胶和500μL血液稀释液加入到2mL离心管中,在37℃的搅拌器中100rpm孵育1h。孵育结束后,将离心管于1000rpm离心10min,然后取上清液(100μL)加入96孔板。通过多功能酶标仪(Synergy HT)读取溶液在540nm处的吸光度。实验中加入500μL水做为阳性对照,500μL PBS缓冲液为阴性对照。结果表明,GOE水凝胶组和阴性对照组没有明显的溶血现象(上清液保持澄清),而Triton组的上清液则呈现鲜红色,这是由于发生溶血后红细胞破裂造成血红蛋白外泄所致。通过对上清液在540nm处的吸光度进行测试,得出GOE水凝胶的溶血率,GOE1、GOE3、GOE5和GOE3/GHK(Cu)的溶血率分别为1.63%、0.47%、0.90%和0.55%,远远低于5.0%的安全溶血水平,从而表明GOE水凝胶具有优异的血液相容性,结果如图11所示。
图11GOE水凝胶的血液相容性结果。(A)水凝胶溶血活性测试图片;(B)水凝胶的溶血率。****P<0.0001;从图11中可知,GOE水凝胶具有较好的血液相容性。
实施案例14
本实例涉及GOE水凝胶的细胞相容性
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,将1.0g的水凝胶浸入5.0mL的细胞培养基中,37℃孵育24h获取浸提液,浸提液再用0.22μm无菌过滤头过滤除菌。正常的完全培养基作为对照。以3×103个细胞/孔的密度接种于96孔板,在200μL培养基中培养24h。然后用相应的浸提液(对照组使用正常培养基)更换培养基,继续培养1、3和5天后,进行MTT实验测试水凝胶的细胞毒性。测试时,将孔板中的上清培养液吸除,每孔加入含有MTT(0.5mg/mL)的无血清DMEM培养基150μL在37℃孵育4h,然后移除上清液,加入200μL的DMSO以溶解生成的紫色甲氧嘧啶。用酶标仪测定490nm波长处的OD值。实验设置5个重复,以平均值作为最终数据。为了进一步评估水凝胶的细胞毒性,用Calcein-AM/PI双染色试剂盒检测细胞活力和细胞形态。使用徕卡MD IL倒置显微镜分别在495nm/515nm激发/发射波长下观察活细胞和在495nm/635nm激发/发射波长下观察死细胞。
所有与水凝胶进行共培养的细胞在5天的培养过程中,均保持与对照组相当的细胞活力,且均随着时间正常增加,表明各组GOE水凝胶均对细胞没有毒性。所有组中的大多数L929细胞和HUVECs细胞在经过1、3和5天的培养后都处于健康的生长状态(绿色,活细胞),几乎没有死细胞(红色)存在。GOE水凝胶具有良好的细胞相容性,可以作为伤口敷料安全地应用于伤口修复,结果如图12所示。
图12GOE水凝胶的细胞相容性结果。(A)水凝胶与L929细胞共培养1、3和5天的细胞活力;(B)水凝胶与HUVECs细胞共培养1、3和5天的细胞活力;(C)水凝胶与L929细胞共培养5天的Live/dead染色图片。n=5,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;从图12中可知,GOE水凝胶具有良好的细胞相容性。
实施案例15
本实例涉及GOE水凝胶的促细胞迁移性能
以实施例3制备的系列GOE水凝胶为例,通过L929细胞划痕实验,获得细胞的迁移率。将细胞接种于24孔板中,细胞种植密度为5×105细胞/孔,使用含有10%胎牛血清(FBS)的完全生长培养基进行培养。16~24h后形成单层细胞,用200μL的移液管尖端刮伤单层细胞,用无菌PBS漂洗3遍,去除细胞碎片后,将消毒后的水凝胶切片放入孔板中。不含水凝胶的组为对照组。各组细胞均用含有0.1%胎牛血清的培养基,在恒温恒湿的细胞培养箱中培养48h。据报道,含0.1%胎牛血清的培养基可以抑制细胞增殖,因此可以确保体外伤口闭合仅由细胞迁移引起。然后,去除培养基、水凝胶和细胞碎片。使用倒置显微镜拍摄细胞划痕的照片。
在四个水凝胶组中,GOE3/GHK(Cu)组的细胞迁移率显著高于其它各组(87.62%),说明其促进细胞迁移的作用最大。GOE1、GOE3和GOE5水凝胶组的细胞迁移率分别为74.03%、71.33%和65.30%。结果表明,GOE水凝胶能够有效促进L929细胞的迁移,GOE3/GHK(Cu)组由于GHK(Cu)的释放,促进细胞迁移和增殖的效果更好,结果如图13所示。
图13GOE水凝胶对L929细胞迁移的影响。(A)划痕实验,黑色虚线表示原始划痕边缘,绿色虚线表示细胞迁移末端;(B)迁移率。n=5,*P<0.05;从图13中可知,GOE水凝胶能促进L929细胞迁移,有利于创面处细胞增殖和皮肤愈合。
实施案例16
本实例涉及GOE水凝胶的诱导巨噬细胞极化性能
以实施例3制备的GOE3和GOE3/GHK(Cu)水凝胶为例,测试GOE水凝胶诱导RAW264.7极化的作用。将RAW 264.7细胞接种在6孔板中,每孔接种1×105个细胞,在细胞培养箱中培养24h后加入水凝胶与RAW 264.7细胞共培养24h。然后收集细胞,使用AG RNAex Pro试剂(Accurate Biology,中国)从细胞和皮肤组织中提取总RNA。根据试剂盒说明(Evo M-MLV RT Premix for qPCR,Accurate Biology,中国),使用反转录试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒(Accurate Biology,中国),按照说明进行实时荧光定量PCR。PCR反应条件为:95℃,10s→60℃,30s→72℃,5s→80℃,2s。以上步骤都进行40个循环。将目标基因的相对mRNA表达水平归一化至GAPDH。使用2-ΔΔCt法进行分析计算。
在伤口愈合过程中,巨噬细胞由M1到M2的表型转变,说明了伤口从炎症期到增殖期的转变,代表着从病原体清除到细胞增殖、血管生成和ECM沉积的转变。进一步通过检测RAW 264.7的M2表型相关标志物(CD206、ARG-1和IL-10)和促炎因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的基因表达,来研究GOE水凝胶对巨噬细胞的影响。与对照组相比,GOE3和GOE3/GHK(Cu)水凝胶显著提高了M2巨噬细胞标记基因(包括CD206、IL-10、ARG-1、TGF-β和VEGF)的表达,GOE3/GHK(Cu)组的基因表达也显著高于GOE3组。与此同时,包括IL-6、IL-1β和TNF-α在内的M1巨噬细胞标记基因表现出相反的趋势,GOE3和GOE3/GHK(Cu)水凝胶组的水平显著降低,结果如图14所示。
图14GOE水凝胶刺激RAW264.7巨噬细胞的M2表型极化(各组巨噬细胞CD206、ARG-1、IL-10、TGF-β、VEGF、IL-6、IL-1β、TNF-α的相对mRNA水平),*P<0.05、**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001;从图14中可知,GOE水凝胶可以在体外诱导调控巨噬细胞表型,促使细胞向抑制炎症反应的M2表型极化,这将有利于使伤口摆脱过度的炎症状态进入增殖和重塑期,加快组织修复,达到促进伤口愈合的目的。
实施案例17
本实例涉及GOE水凝胶对耐药菌感染的糖尿病伤口的促愈合性能
以实施例3制备的GOE3和GOE3/GHK(Cu)水凝胶为例,将培养至对数期的MRSA用无菌PBS稀释,得到浓度为n×107CFU/mL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌液。然后,按照2.3.10所述方法在糖尿病小鼠背部构建出全层皮肤缺损创面。最后,将10μL菌液滴加到创面处,则构建出耐药菌感染型糖尿病小鼠全层皮肤伤口。将建模成功的小鼠随机分成3组,每组12只,分别为空白对照组(Control)、GOE3水凝胶组(GOE3)和GOE3/GHK(Cu)水凝胶组(GOE3/GHK(Cu))。Control组小鼠创面给予50μL无菌PBS,GOE3组和GOE3/GHK(Cu)组小鼠的创面分别涂敷50μL对应的水凝胶材料。最后所有组用3MTMTegadermTM透明敷料来保护伤口区域。在第0、3、7和14天时,拍照记录各组小鼠的创面状态。
在第14天时,GOE3和GOE3/GHK(Cu)组的创面已基本完成闭合,且皮肤状态较好;Control组的创面也已经结痂,同时伤口面积明显缩小,开始愈合。GOE3和GOE3/GHK(Cu)水凝胶具有很好的抗菌能力,能够有效地抑制细菌的生长繁殖,避免了伤口的持续感染,使得皮肤创面更快地进入正常的愈合阶段,此外,GOE3/GHK(Cu)水凝胶具有更强的抗炎和抗氧化作用,能够进一步控制炎症反应,促进创面修复,结果如图15A所示。
第3天时,GOE3/GHK(Cu)组愈合最快,伤口愈合率为41.89%;GOE3组的伤口愈合率(38.84%)也显著高于对照组的12.66%。第7天时,GOE3和GOE3/GHK(Cu)组的伤口愈合率分别为70.46%和69.35%,明显高于Control组37.80%的伤口愈合率,值得注意的是GOE3和GOE3/GHK(Cu)组的伤口愈合率没有显著性差异。第14天时,GOE3和GOE3/GHK(Cu)组的伤口愈合率分别达到了94.41%和98.36%,伤口基本上已经完全愈合,而Control组的伤口愈合率只有67.38%。之后,统计了创面完全闭合所需时间,GOE3/GHK(Cu)组的皮肤创面愈合速度最快,GOE3略慢,同时两种水凝胶组愈合速度均显著快于Control组,结果如图15A和15B所示。
图15MRSA耐药菌感染的糖尿病伤口修复。A:伤口的愈合效果;B:伤口愈合率;C:创面完全闭合时间。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;从图15可知,第14天时,GOE3和GOE3/GHK(Cu)组的伤口愈合率分别达到了94.41%和98.36%,伤口基本上已经完全愈合,而Control组的伤口愈合率只有67.38%。以上结果表明,GOE3水凝胶能够有效地促进伤口愈合,加入GHK(Cu)后的GOE3/GHK(Cu)水凝胶能够有效地促进MRSA感染的糖尿病小鼠皮肤创面愈合。
本发明描述了优选实施例及其效果。但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶,其特征在于,所述水凝胶包括氧化透明质酸,多巴胺改性明胶以及聚赖氨酸;
所述氧化透明质酸的浓度为5~10%(w/v);
所述多巴胺改性明胶的浓度为2.5~5%(w/v);
所述聚赖氨酸的浓度为1~5%(w/v)。
2.根据权利要求1所述的用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶,其特征在于,所述水凝胶利用醛基与氨基间的席夫碱反应成胶。
3.根据权利要求1所述的用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶,其特征在于,所述水凝胶的孔径为1.6~13.0μm。
4.根据权利要求1所述的用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶,其特征在于,所述水凝胶具有可注射和形状自适应特性,其线性粘弹区为0.01%~68.5%;所述水凝胶的粘附强度为6.61~10.10kPa。
5.根据权利要求1所述的用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶,其特征在于,所述聚赖氨酸中还加入0.1~1%(w/v)的铜肽。
6.根据权利要求1所述的用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶,其特征在于,所述水凝胶对E.coli、S.aureus和MRSA三种细菌的杀菌率都达到了99%以上。
7.根据权利要求1所述的用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶,其特征在于,所述水凝胶能在体外诱导调控巨噬细胞表型,促使细胞向抑制炎症反应的M2表型极化;所述水凝胶能降低促炎因子TNF-α的表达。
8.一种权利要求1~7任一项所述的用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
制备氧化透明质酸;
将氧化透明质酸溶解在PBS中,然后加入多巴胺改性明胶,制成GelDA/OHA溶液;
将聚赖氨酸溶解在PBS中配置成溶液,然后将GelDA/OHA溶液和聚赖氨酸溶液均匀混合;获得用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶。
9.根据权利要求8所述的用于复杂慢性伤口的抗炎组织水凝胶的制备方法,所述氧化透明质酸制备过程,包括:在透明质酸溶液中加入高碘酸钠溶液,进行避光反应,随后经透析、冷冻干燥,获得氧化透明质酸。
10.一种权利要求1~7任一项所述的水凝胶在制备用于复杂慢性伤口的抗炎组织药物中应用。
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