CN117305467A - 一种用于检测毛干mRNA的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测毛干mRNA的试剂盒，其包含15对特异性多重PCR引物对和18个SNP单碱基延伸引物，用于检测位于11个毛干mRNA基因上的共计18个cSNP分子标记。本发明提供的毛干mRNA检测试剂盒具有良好的个人识别能力，解决了不能利用毛干进行个人识别的难题，也为法医无核细胞检材的个人识别提出了新的策略。
Description
技术领域
本发明属于法医学技术领域，具体涉及一种通过检测毛干mRNA分子上的SNP进行个人识别的试剂盒及其检测方法。
背景技术
个人识别是法医学中进行现场检材来源判定的过程，实现法医学现场检材的精准个人识别具有重大现实意义。毛发是犯罪现场常见的法医物证检材，检案人员在确定现场提取毛发来源于人类后，会对毛发进行DNA检测，以确定潜在的人类身份。
毛发在组织学上分为两部分，包括由皮肤内部的毛根和毛干组成的活细胞区和由皮肤外部的毛干代表的死细胞区。毛根被包裹在毛囊里，带毛囊的毛发有正常的细胞质和细胞核成分，目前法医物证领域带毛囊毛发样本的STR分型技术已非常成熟、可靠。然而，在犯罪现场获得的毛发70%处于静止期，静止期毛发的毛囊会退化或者只剩下毛干，导致可检测到的核DNA非常少或者核DNA已经降解，DNA分型成功率较低。
此时，法医们通常是以控制区的高变区为目标，对毛干进行线粒体DNA分析。但是由于线粒体母系遗传的特征，其仅能为排除提供依据，无法提供独特的个人信息。
近年来，有研究提出可以利用毛干蛋白质中的单氨基酸多态性（SAPs）遗传信息进行亲缘关系鉴定和个人识别。鸟枪法蛋白质组学是一种通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定复杂混合物中蛋白质和肽的既定方法。2020年，Katherine等使用该技术对毛干样品进行蛋白质组学分析，鉴定出244种蛋白质和1195种肽。2021年，Karim等对毛干样本进行蛋白质组分析和氨基酸序列分析后发现，与不相关的个体相比，相关个体具有更相似的蛋白质组谱、遗传变异肽谱以及更高的组合亲子关系指数和组合同胞指数。
然而，蛋白质谱分析的结果不容易应用于计算随机匹配概率，也无法满足法医进行个人识别的要求。
毛干由毛基质细胞衍生和终末分化的死细胞组成。2011年，Takumi Tochio等利用qRT-PCR技术靶向总RNA中普遍分布的管家基因β-actin和GAPDH，发现在对应位置产生了单个扩增子，证明毛干中存在可扩增的mRNA。同年，Lefkowitz等收集人类的毛干样本，并从中分离出RNA进行测序，揭示出7193个独特的mRNA。
RNA在毛发的形成过程中保持稳定，甚至在角化后几个月仍然存在，即使在毛干的远处区域也能被分离出来。因此，基于毛干中的RNA分子保留了外显子、内含子或基因间隔序列转录序列的多态性信息，有可能利用这种多态性进行法医个人识别。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测毛干mRNA的试剂盒及其检测方法，通过筛选检测毛干mRNA分子上的SNP位点，为法医无核细胞检材的个人识别提供新的策略。
为实现上述发明目的，本发明从文献中筛选毛干样本中共表达的mRNA基因，使用数据库在毛干基因编码转录本上筛选cSNP位点（MAF＞0.1），所筛选的mRNA基因及SNP位点如表1所示。
基于上述筛选的11个毛干mRNA基因和18个SNP位点，本发明提供了一种用于检测毛干mRNA的试剂盒，在所述试剂盒中含有SEQ ID NO.1～30所示的15对特异性多重PCR引物对，以及SEQ ID NO.31～48所示的18个SNP单碱基延伸引物，用于检测上述18个SNP位点中的一个或多个。
其中，具体地，所述SEQ ID NO.1～30所示的15对特异性多重PCR引物对分别对应扩增以下所述的SNP位点。
进一步地，可以将所述15对特异性多重PCR引物对分布于两个多重PCR体系中，其中多重PCR体系1st中包含上表中的前8对引物，多重PCR体系2nd中包含上表中的后7对引物。
其中，具体地，所述SEQ ID NO.1～30所示的15对特异性多重PCR引物对分别对应扩增以下所述的SNP位点。
更具体地，所述SEQ ID NO.31～48所示的18个SNP单碱基延伸引物分别对应延伸的SNP位点如下表所述。
进一步地，同样可以将所述的18个SNP单碱基延伸引物分布于两个SNaPshot延伸体系中，其中SNaPshot延伸体系1st和SNaPshot延伸体系2nd中各包含有9对延伸引物。
本发明还提供了所述用于检测毛干mRNA的试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：
1）、提取待测毛干样本的RNA作为模板，逆转录为cDNA，利用所述SEQ ID NO.1～30所示的15对特异性多重PCR扩增引物对，通过多重PCR制备扩增产物；
2）、对纯化后的扩增产物，利用所述SEQ ID NO.31～48所示的18个SNP单碱基延伸引物，通过单碱基延伸体系得到延伸产物；
3）、对纯化后的延伸产物，利用毛细管电泳及基因分析软件进行结果分析。
本发明所述的试剂盒和检测方法并非是用于疾病的诊断，而是可以应用于毛干检材的法医学鉴定或检测。
本发明从毛干RNA分子中获取得到了RNA多态性信息，打破了长期以来法医仅能对现场获取的毛干进行mtDNA分析，无法提供个人识别信息的局面，也为与毛干相似的无核细胞检材的个人识别提出了新的策略。
本发明用于检测毛干mRNA的试剂盒所涉及的cSNP均为人类所独有，且针对不同部位的毛发，如头发、腋毛、阴毛和腿毛等，本发明试剂盒均可以成功检测到完整的18个SNP，不存在组织异质性。因此，在案发现场发现毛发样本时，无需考虑其部位来源与种属来源。
附图说明
图1是18个毛干mRNA-cSNP分型检测结果。
图2是不同部位毛发的一致性检测结果。
图3是种属特异性检测结果。
图4是灵敏度检测示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例中涉及到的实验方法或检测方法，若无特别说明，均为现有技术中的常规方法，且其名称和/或简称均属于本领域内的常规名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例中使用的各种仪器、设备、原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过正规商业途径购买获得的常规产品，也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
在本发明的检测试剂盒中含有15对特异性多重PCR引物对，其引物浓度及其对应扩增的SNP位点如表2所示。
在本发明的检测试剂盒中还含有18个SNP单碱基延伸引物，其引物浓度及其对应延伸的SNP位点如表3所示。
实施例
实施例1：毛干RNA的提取及SNP分型检测
1. 毛干的预处理及消化
取5根毛发，去除长度约1cm的毛发近毛囊端部分，剪取近毛囊端毛干样本6cm，剪成0.3cm的若干小段，放入1.5mL RNase-free离心管中，依次用无水乙醇、RNase-freewater、无水乙醇各冲洗一次，挥干后加入毛干消化液，置于恒温金属浴中，设定温度为65℃，转速为1200rpm，消化2h。
2. 毛干RNA的提取、定量与反转录
用RNAiso Plus试剂（Takara）对毛干样本进行总RNA提取，再采用EppendorfBioSpectrometer®生物光谱仪进行定量检测。
使用5×EasyQuick RT Kit反转录试剂盒（康为世纪）对提取定量的RNA进行反转录，反应体系组成成分如表4所示。
反转录反应条件：37℃温育20min，85℃温育5min，10℃保持。
3. 多重PCR反应及纯化
将所有引物混合在两个反应体系中进行多重PCR反应，其中多重PCR体系1st包含8对引物，多重PCR体系2nd包含7对引物。多重PCR反应体系的组成成分如表5所示。
多重PCR反应程序设置为：95℃预变性10min；随后进行40个循环的扩增反应，包括95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃终延伸10min；10℃保持。
对多重PCR产物进行纯化处理，其反应组分如表6所示。
扩增后纯化反应程序设置为：37℃孵育1h，95℃酶灭活15min；10℃保持。
4. 单碱基延伸反应（SBE）及纯化
将所有延伸引物混合在两个反应体系中进行单碱基延伸反应，每个体系各包含9个延伸引物。单碱基延伸反应的组成成分如表7所示。
对延伸产物进行纯化处理，其反应组分如表8所示。
延伸后纯化反应程序设置为：37℃孵育1h，95℃酶灭活15min；10℃保持。
5. 毛细管电泳检测及结果分析
电泳前，先对延伸产物进行变性处理，其体系包括：1μL纯化产物、0.1μL内标（GeneScan-LIZ 120）、8μL甲酰胺（Hi-Di formamide）；95℃加热变性3min，随后置于冰板上保持。将体系加入96孔板中进行毛细管电泳，使用GeneMapper软件对电泳结果进行分析。
图1为毛干RNA分子上18个cSNP的标准分型结果，其中红峰代表胸腺嘧啶（T）、蓝峰代表鸟嘌呤（G）；绿峰代表腺嘌呤（A）；黑峰代表胞嘧啶（C）。1-18分别代表cSNP位点：rs626974、rs500079、rs2640738、rs2248745、rs11168830、rs1880738、rs17548783、rs8121、rs1129235、rs2297208、rs2640785、rs62023758、rs2259606、rs2239711、rs12451652、rs2071601、rs2241726、rs7786826。
实施例2：山西汉族102份毛干样本的人群多态性
根据实施例1提供的毛干RNA提取及检测方法，使用本试剂盒对山西汉族102份毛干样本的人群多态性进行分析。
所得到的18个cSNP的等位基因频率如表9所示。
由于同一基因上的SNPs呈连锁遗传，包括rs626974-rs500079、rs8121-rs1129235、rs2239711-rs12451652-rs2071601，故而将连锁的SNP位点视为基因表型多态性。11个毛干基因的表型及表型频率如表10所示。
实施例3：不同部位毛发的一致性检测
根据实施例1提供的毛干RNA提取及检测方法，使用本试剂盒对来自不同身体部位（包括腋毛、阴毛和腿毛）的6mg毛发进行检测，结果见图2，腋毛、阴毛和腿毛中的18个mRNA-cSNP均可以成功地检测出。
实施例4：种属特异性检测
根据实施例1提供的毛干RNA提取及检测方法，使用本试剂盒对猫、狗、大鼠和兔的6mg毛发进行检测，结果见图3，猫、狗、大鼠和兔的动物毛发中没有荧光信号，表明本发明体系的种属特异性良好。
实施例5：灵敏度检测
根据实施例1提供的检测方法，将20ng、10ng、5ng、2ng、1ng的毛干RNA经反转录合成cDNA后，加入复合扩增反应体系进行后续单碱基延伸和毛细管电泳检测，结果见图4，本发明试剂盒的检测灵敏度为2ng，低于2ng时存在位点丢失。
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于检测毛干mRNA的试剂盒，在所述试剂盒中含有SEQ ID NO.1～30所示的15对特异性多重PCR引物对，以及SEQ ID NO.31～48所示的18个SNP单碱基延伸引物，用于检测以下18个SNP位点中的一个或多个：
rs626974、rs500079、rs2640738、rs2248745、rs11168830、rs1880738、rs17548783、rs8121、rs1129235、rs2297208、rs2640785、rs62023758、rs2259606、rs2239711、rs12451652、rs2071601、rs2241726、rs7786826。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述的18个SNP位点位于以下11个毛干mRNA基因上：
PPP1R15A、S100A5、EXPH5、ABCA13、KMT2D、TRPV2、TBC1D4、TMC5、AHNAK、KRT35、RBM33。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述SEQ ID NO.1～30所示的15对特异性多重PCR引物对分别对应扩增以下所述的SNP位点：
4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述SEQ ID NO.31～48所示的18个SNP单碱基延伸引物分别对应延伸以下所述SNP位点：
5.权利要求1所述试剂盒用于非疾病诊断的检测方法，包括以下步骤：
1）、提取待测毛干样本的RNA作为模板，逆转录为cDNA，利用所述SEQ ID NO.1～30所示的15对特异性多重PCR扩增引物对，通过多重PCR制备扩增产物；
2）、对纯化后的扩增产物，利用所述SEQ ID NO.31～48所示的18个SNP单碱基延伸引物，通过单碱基延伸体系得到延伸产物；
3）、对纯化后的延伸产物，利用毛细管电泳及基因分析软件进行结果分析。
6.权利要求1所述试剂盒在毛干检材的法医学鉴定或检测中的应用。
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