CN117304271A - 一种o型口蹄疫病毒vp2蛋白t细胞表位多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽及其应用，为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑2的所示；或将SEQ ID NO.1‑2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.1‑2衍生的且保持SEQ ID NO.1‑2所示的蛋白功能的氨基酸序列。本发明通过设计O型口蹄疫病毒VP2蛋白的重叠肽段，利用酶联免疫斑点技术检测，筛选出功能性T细胞抗原表位多肽，并利用磁珠分选手段，分别纯化CD4+与CD8+T细胞，进一步检测筛选出的功能性T细胞抗原表位多肽所激活的T细胞类型，可用于制备O型口蹄疫病毒多表位疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及抗原表位多肽技术领域，尤其涉及一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽。
背景技术
口蹄疫(Foot and mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus,FMDV)引起的一种急性传染病。该病感染偶蹄目动物，包括猪、牛、羊等常见家畜，感染动物口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱，给畜牧业带来严重经济损失。FMDV分为七个血清型，分别为A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，其中O型FMDV仍在我国流行。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病毒属(Aphthovirus)，在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，编码四种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)，病毒外壳为对称的20面体。
目前，临床上使用的FMDV疫苗以灭活疫苗为主，该类疫苗主要诱导体液免疫，诱导细胞免疫的能力较差。T细胞表位能够被T细胞受体识别，从而刺激特异性T细胞的活化，产生抗病毒免疫。目前，O型FMDVT细胞的表位尚不完全清晰，为此，提出一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽及其应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决背景技术提出的问题，而提出的一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽，其为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2的所示；或
将SEQ ID NO.1-2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.1-2衍生的且保持SEQ ID NO.1-2所示的蛋白功能的氨基酸序列。
在另一方面，一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽的编码基因。
在另一方面，一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽编码基因的生物材料，所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。
在另一方面，一种药物，含有一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽。
在另一方面，一种多肽疫苗，含有所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的T细胞的抗原表位多肽，所述多肽疫苗还含有佐剂，所述佐剂包括壳聚糖、载体蛋白。
在另一方面，一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在提高机体产生细胞数量或提高机体分泌IFN-γ细胞数量中的应用，以及在制备预防口蹄疫病毒感染的疫苗,药物,试剂或试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽，具备以下有益效果：
本发明通过设计O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的重叠肽段，利用酶联免疫斑点技术检测，筛选出功能性T细胞抗原表位多肽，并利用磁珠分选手段，分别纯化CD4+与CD8+T细胞，进一步检测筛选出的功能性T细胞抗原表位多肽所激活的T细胞类型，可用于制备O型口蹄疫病毒多表位疫苗。
附图说明
图1为ELISPOT筛选O型FMDV结构蛋白VP2功能性抗原表位肽结果图,横坐标为刺激物名称，其中PC为阳性对照，NC为阴性对照。
纵坐标为斑点数；
图2为对筛选出的56、57号肽进行CD4+T细胞ELISPOT验证结果图，横坐标为刺激物名称，其中PC为阳性对照，NC为阴性对照。
纵坐标为斑点数；
图3为对筛选出的56、57号肽进行CD8+T细胞ELISPOT验证结果图，横坐标为刺激物名称，其中PC为阳性对照，NC为阴性对照。
纵坐标为斑点数；
图4为对56和57号肽的重叠序列ELISPOT验证结果图，横坐标为刺激物名称，其中PC为阳性对照，NC为阴性对照。纵坐标为斑点数。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
步骤1.蛋白肽库的合成
参照GenBank发表的O/BY/CHA/2010株(JN998085)的结构蛋白VP2氨基酸序列，设计一系列覆盖VP2蛋白全长氨基酸序列的重叠肽段，每个肽段长度为18AA，相邻肽段间重叠12AA，一共35个肽段，由南京肽谷生物科技公司合成。合成多肽纯度≥95％，溶解在纯水中，-80℃保存。步骤2.小鼠攻毒与脾脏淋巴细胞的分离将5-8周龄的IFNAR-/-C57/BL6小鼠分为免疫组和对照组(n＝5)，免疫组小鼠以5000PFUs/0.1mL进行腹部皮下注射攻毒，对照组小鼠以相同方式注射PBS溶液。免疫7天后，将小鼠安乐死，无菌取脾脏，碾磨均匀后过70μm细胞滤网，置于装有完全培养基(rpmI1640+10％FBS+1％双抗)的50mL离心管中，1700rpm离心5分钟，弃上清。采用红细胞裂解液重悬上述细胞，常温静置5分钟后，加入3倍体积的完全培养基，于1700rpm离心5分钟，弃上清。最后用完全培养基重悬细胞并计数。步骤3.ELISPOT试验初步筛选功能性表位肽小鼠免疫后7天，分离脾脏淋巴细胞，分别用肽库的每一条多肽刺激淋巴细胞，通过ELISPOT试验检测O型FMDV特异性T细胞受多肽刺激后分泌IFN-γ的水平，从而初步筛选出功能性抗原表位多肽。
96孔ELISPOT板(达科为，2210003)，每孔加入2*105脾脏淋巴细胞，再加入1中合成的单个蛋白肽刺激(终浓度为10μg/mL)，总体积100μL/孔。同时设立阳性对照孔：加入PMA(500ng/mL)+Lonomycine(10μg/mL)，设立阴性对照孔：加入纯水。每类设立3个重复孔。置于37℃,5％CO2中培养20h后进行显色操作。
(1)裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基,加入冰冷的去离子水，200μL/well，4℃冰箱放置10分钟低渗裂解细胞。
(2)洗板：甩出孔内液体，加入1×WashingBuffer工作液，260μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复六次，每一次在吸水纸上扣干。
(3)检测抗体孵育：将1×BiotinylatedAntibody工作液加入各实验孔，100μL/well。37℃孵育1小时。
(4)洗板：加入1×WashingBuffer工作液，260μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复六次，每一次在吸水纸上扣干。
(5)酶联亲和素孵育：将1×Streptavidin-HRP工作液加入各实验孔，100μL/well37℃孵育1小时。
(6)洗板：甩出孔内液体，加入1×WashingBuffer工作液，260μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复五次，每一次在吸水纸上扣干，洗涤完成后揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤膜底面及底座，用吸水纸小心吸干底座及膜底残留的水迹，合上底座，加入1×WashingBuffer工作液，260μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，彻底扣干孔内液体。
(7)显色：将现配的AEC显色液加入各实验孔，100μL/well。室温避光静置5-30分钟，根据斑点生成情况选择终止显色时间。若室温低于20℃，建议在37℃孵箱做显色，每隔5-10分钟检查一次。
(8)终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤各实验孔正反面及底座3-5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。
(9)ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。结果显示，肽段56、57能有效刺激免疫组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，显著高于不加刺激物的阴性对照孔细胞如图1所示。同时，不能刺激对照组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，初步表明肽段56、57诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ是O型FMDV特异性T细胞激活的结果；功能性抗原表位肽氨基酸序列如表1所示。
表1O型FMDV结构蛋白功能性抗原表位多肽氨基酸序列
| 多肽名称 | 多肽序列 | 多肽所属结构蛋白 |
| 56 | FQLTLFPHQFINPRTNMT | VP2 |
| 57 | PHQFINPRTNMTAHIKVP | VP2 |
步骤4.CD4+和CD8+T细胞纯化
为进一步验证功能性抗原表位多肽所对应的T细胞表型，本试验将步骤2所得到的小鼠脾脏淋巴细胞，分别采用美天旎CD4(货号130-117-043)和CD8(货号130-117-044)分选磁珠对CD4+和CD8+T细胞进行纯化。实验步骤如下：
(1)将每107个细胞用90μL缓冲液(由美天旎MACS BSA Stock Solution货号130-091-376和美天旎autoMACS Rining Solution货号130-091-222 1：20混合)重悬。
(2)加入10μL CD4或CD8分选磁珠。
(3)混合均匀，于4℃孵育10分钟。
(4)将分离柱置于磁力架上，加入500μL缓冲液浸湿柱子，随后加入上述细胞悬液，静置其流穿。
(5)用500μL缓冲液冲洗柱子，并重复1次本操作。
(6)将柱子从磁力架上取下，用1ml缓冲液冲洗柱子，手机流穿细胞悬液，即为CD4+或CD8+T细胞。
步骤5抗原递呈细胞的制备
1.取未感染O型FMDV的小鼠脾脏，将脾匀浆后溶液于4度1500rpm离心10min。
2.离心期间，准备下述溶液：
(1)每2个脾脏准备1个T175的不透气细胞瓶，加入200ml 1640
(1％双抗、10％FBS)。
(2)加入500ul 2.5mg/ml的LPS。
(3)加入200ul 7mg/ml的Dextran Sulfate。
3.离心完成后，弃上清，将细胞用任意体积的R10重悬。转入上述T175细胞瓶，混匀。
4.于37度直立培养3天。
5.3天后，将细胞瓶中悬液分装于4个50ml离心管中。
6.4度1500rpm离心10min。
7.弃上清，用50ml R10重悬细胞。
8.将样品离心，弃去上清，再次重悬。
9.将样品置于25ml R10，重复洗涤3次。
10.洗涤完成后，吸取60ul细胞悬液(共25ml)，用PBS稀释10倍，进行细胞计数。随后将原液再次离心，备用。
11.每管6*107个细胞，冻存液90％ FBS、10％ DMSO。1ml每管分装。
12.程序性降温盒冻存1天后转入液氮。
步骤6ELISPOT试验探究表位肽刺激的细胞类型
小鼠免疫后7天，按照步骤2与步骤5中描述方法分离脾脏淋巴细胞，再分别纯化CD4+和CD8+T细胞。分别用56和57号肽刺激CD4+和CD8+T细胞，通过ELISPOT试验检测CD4+和CD8+T细胞受多肽刺激后分泌IFN-γ的水平，从而判断功能性抗原表位多肽刺激的细胞类型。
96孔ELISPOT板(达科为，2210003)，每孔加入2*105CD4+或CD8+T淋巴细胞，再加入105步骤5中制备的抗原递呈细胞，最后加入56和57号肽进行刺激(终浓度为10μg/mL)，总体积100μL/孔。同时设立阳性对照孔：加入PMA(500ng/mL)+Lonomycine(10μg/mL)，设立阴性对照孔：加入纯水。每类设立3个重复孔。置于37℃,5％CO2中培养20h后进行显色操作。显色操作同步骤3所述。
结果显示，肽段56、57能有效刺激免疫组小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ，显著高于不加刺激物的阴性对照孔细胞如图2所示。同时，不能刺激对照组小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ。此外，肽段56能有效刺激免疫组小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ，显著高于不加刺激物的阴性对照孔细胞如图3所示。同时，不能刺激对照组小鼠脾脏CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ。表明肽段56、57能够诱导脾脏CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ，肽段56能够诱导脾脏CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ。且上述的激活是O型FMDV特异性T细胞激活的结果
步骤7.蛋白肽合成
此步骤根据上述实验结果，将56-57,重叠序列合成新的肽段，用肽段重复上述实验，氨基酸序列如SEQ ID NO.3的所示。
| 多肽名称 | 多肽序列 | 多肽所属结构蛋白 |
| 56-57 | PHQFINPRTNMT | VP2 |
步骤8.ELISPOT
ELISPOT试验进一步确认功能性表位肽
将3只小鼠免疫后7天，分离脾脏淋巴细胞，用步骤7中合成的多肽刺激淋巴细胞，通过ELISPOT试验检测O型FMDV特异性T细胞受多肽刺激后分泌IFN-γ的水平，从而进一步确认功能性抗原表位多肽。
如图4所示，肽段56、57的重叠序列56-57能有效刺激免疫组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，显著高于不加刺激物的阴性对照孔细胞如图4所示。同时，不能刺激对照组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，初步表明肽段56-57诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ是O型FMDV特异性T细胞激活的结果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽，其特征在于，其为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2的所示；或
将SEQ ID NO.1-2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.1-2衍生的且保持SEQ ID NO.1-2所示的蛋白功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽的编码基因。
3.一种含有权利要求1所述一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽编码基因的生物材料，所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。
4.一种药物，其特征在于，含有权利要求1所述一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽。
5.一种多肽疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的T细胞的抗原表位多肽。
6.根据权利要求5所述的多肽疫苗，其特征在于，所述多肽疫苗还含有佐剂，所述佐剂包括壳聚糖、载体蛋白。
7.根据权利要求1所述一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在提高机体产生细胞数量或提高机体分泌IFN-γ细胞数量中的应用。
8.权利要求1所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的T细胞的抗原表位多肽或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备预防口蹄疫病毒感染的疫苗中的应用。
9.权利要求1所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的T细胞的抗原表位多肽或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备治疗口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
10.权利要求1所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的T细胞的抗原表位多肽或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备检测口蹄疫病毒的试剂或试剂盒中的应用。
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