CN117295767A - 针对wnt受体ryk的抗体变体 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物。在一些方面，本公开涉及分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的用途。

Description

针对WNT受体RYK的抗体变体
I.相关申请
本申请要求2020年11月11日提交的美国临时专利申请第63/112,616号的优先权，出于所有目的，其公开内容通过引用整体并入本文。
II.ASCII文本序列表
本专利或申请文件包含以计算机可读ASCII文本格式提交的序列表(文件名：4894-3000200_SeqList_ST25.txt，记录日期：2020年10月27日，大小：28,469字节)。序列表文件的内容通过引用整体并入本文。
III.技术领域
本发明涉及分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物。在一些方面，本发明涉及分离的抗-Ryk抗体或抗体衍生物的用途。
IV.背景技术
Wnts是一类分泌型糖蛋白家族，可与细胞表面的受体结合并控制多种细胞功能。Wnts激活的不同通路分为经典和非经典Wnt信号通路(Niehrs 2012)。在经典通路中，Wnts与复合物结合，该复合物由Frizzled受体蛋白家族成员和辅助受体(如LRP5或LRP6)组成。经典Wnt信号通路中的主要下游事件是β-连环蛋白的稳定化，这会导致基因转录发生变化，基因转录对胚胎发育和成人组织稳态至关重要。非经典Wnt信号通路可分为Wnt平面细胞极性(Wnt/PCP)和Wnt/Ca2+通路，其涉及Wnts与Frizzled家族成员和辅助受体(如Ryk、PTK7或ROR1/2)的结合。通过PCP通路的信号重塑肌动蛋白细胞骨架并调节细胞迁移和组织(tissue)组织(organization)。
Ryk是一种单程跨膜蛋白，其胞外区域有一个Wnt-inhibitory-factor-1(WIF1)结构域，可与Wnts结合(Patthy 2000)。Ryk的胞内区包含一个假激酶结构域，该结构域具有不可接近的ATP结合口袋和非活性构象(Sheetz等人，2020)。Ryk的细胞内的C端包含一个PDZ结构域，该结构域对于与其他蛋白质(如Src激酶家族)的相互作用很重要(Petrova等人，2013年)。Wnts与Ryk结合后发生的下游事件没有详尽描述，但被认为涉及蛋白质-蛋白质相互作用、信号转导途径和Ryk的蛋白水解加工(Roy、Halford和Stacker 2018)。
在胚胎发育过程中，Ryk是中枢神经系统中Wnt信号转导的重要媒介(Clark、Liu和Cooper，2014)。表达Ryk的轴突被排斥远离含有高浓度Wnt蛋白的区域，这种机制对于正确建立皮质脊髓束、胼胝体和视网膜系统至关重要(Schmitt等人，2006年；Y.Liu等人，2005年；Keeble等人，2006年)。Ryk在正常成人组织中的功能不太清楚，但已知Ryk参与乳腺干/祖细胞调节以及造血干细胞增殖(Kessenbrock等人，2017年；Famili等人，2016年)。
除了其正常的生物学功能外，Ryk在多种病理学中具有有害作用。脊髓损伤后，会在损伤部位诱导多个Wnts和Ryk并限制轴突再生(Y.Liu等人，2008年；Hollis等人，2016年；Miyashita等人，2009年)。同样，Wnts和Ryk在受伤的脊神经中被诱导，并介导损伤后对疼痛刺激的持续超敏反应，称为神经性疼痛(Zhang等人，2013年；S.Liu等人，2015年；Yang等人，2017年；Simonetti和Kuner 2020年)。Ryk的高表达发生在几种类型的癌症中，Wnt/Ryk信号转导在例如肿瘤迁移、侵袭和转移等的致癌过程中发挥作用(VanderVorst等人，2019年；Roy、Halford和Stacker，2018年；Daulat和Borg，2017年)。
抗Ryk抗体已被证明可促进脊髓损伤后的轴突再生，并可减少啮齿动物模型中的神经性疼痛(Hollis等人，2016年；Miyashita等人，2009年；S.Liu等人，2015年；Yang等人，2017年)。然而，鼠和其他非人源抗体经常在人体中引起强烈的免疫反应(Khazaeli、Conry和LoBuglio，1994年)，这限制了它们用作治疗剂的潜力。因此，需要改进的具有低免疫原性潜力的抗Ryk抗体，可以将其开发用于治疗人类疾病，包括脊髓损伤、神经性疼痛和癌症。本发明解决了这个问题以及相关的需求。
下面列出了背景技术部分中引用的参考文献。
Clark,Charlotte E.J.,Yaobo Liu,and Helen M.Cooper.2014.“The Yin andYang of Wnt/Ryk Axon Guidance in Development and Regeneration.”ScienceChina.Life Sciences 57(4):366–
71.https://doi.org/10.1007/s11427-014-4640-3.
Daulat,Avais M.,and Jean-Paul Borg.2017.“Wnt/Planar Cell PolaritySignaling:New Opportunities for Cancer Treatment.”Trends in Cancer 3(2):113–25.
https://doi.org/10.1016/j.trecan.2017.01.001.
Famili,Farbod,Laura Garcia Perez,Brigitta Ae Naber,JasprinaN.Noordermeer,Lee G.Fradkin,and Frank Jt Staal.2016.“The Non-Canonical WntReceptor Ryk Regulates Hematopoietic Stem Cell Repopulation in Part byControlling Proliferation and Apoptosis.”Cell Death&Disease 7(11):e2479.https://doi.org/10.1038/cddis.2016.380.
Hollis,Edmund R.,Nao Ishiko,Ting Yu,Chin-Chun Lu,Ariela Haimovich,Kristine Tolentino,Alisha Richman,et al.2016.“Ryk Controls Remapping of MotorCortex during Functional Recovery after Spinal Cord Injury.”NatureNeuroscience 19(5):697–705.
https://doi.org/10.1038/nn.4282.
Keeble,Thomas R.,Michael M.Halford,Clare Seaman,Nigel Kee,MariaMacheda,Richard B.Anderson,Steven A.Stacker,and Helen M.Cooper.2006.“The WntReceptor Ryk Is Required for Wnt5a-Mediated Axon Guidance on theContralateral Side of the Corpus Callosum.”The Journal of Neuroscience:TheOfficial Journal of the Society for Neuroscience 26(21):5840–48.https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1175-06.2006.
Kessenbrock,Kai,Prestina Smith,Sander Christiaan Steenbeek,NicholasPervolarakis,Raj Kumar,Yasuhiro Minami,Andrei Goga,Lindsay Hinck,and ZenaWerb.2017.“Diverse Regulation of Mammary Epithelial Growth and BranchingMorphogenesis through Noncanonical Wnt Signaling.”Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 114(12):3121–26.https://doi.org/10.1073/pnas.1701464114.
Khazaeli,M.B.,R.M.Conry,and A.F.LoBuglio.1994.“Human Immune Responseto Monoclonal Antibodies.”Journal of Immunotherapy with Emphasis on TumorImmunology:Official Journal of the Society for Biological Therapy 15(1):42–52.
https://doi.org/10.1097/00002371-199401000-00006.
Liu,Su,Yue-Peng Liu,Zhi-Jiang Huang,Yan-Kai Zhang,Angela A.Song,Ping-Chuan Ma,and Xue-Jun Song.2015.“Wnt/Ryk Signaling Contributes to NeuropathicPain by Regulating Sensory Neuron Excitability and Spinal Synaptic Plasticityin Rats.”Pain 156(12):2572–84.https://doi.org/10.1097/j.pain.0000000000000366.
Liu,Yaobo,Jun Shi,Chin-Chun Lu,Zheng-Bei Wang,Anna I.Lyuksyutova,Xue-Jun Song,Xuejun Song,and Yimin Zou.2005.“Ryk-Mediated Wnt Repulsion RegulatesPosterior-Directed Growth of Corticospinal Tract.”Nature Neuroscience 8(9):1151–59.
https://doi.org/10.1038/nn1520.
Liu,Yaobo,Xiaofei Wang,Chin-Chun Lu,Rachel Kerman,Oswald Steward,Xiao-Ming Xu,and Yimin Zou.2008.“Repulsive Wnt Signaling Inhibits AxonRegeneration after CNS Injury.”The Journal of Neuroscience:The OfficialJournal of the Society for Neuroscience 28(33):
8376–82.https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1939-08.2008.
Miyashita,Tomohiro,Masao Koda,Keiko Kitajo,Masashi Yamazaki,KazuhisaTakahashi,Akira Kikuchi,and Toshihide Yamashita.2009.“Wnt-Ryk SignalingMediates Axon Growth Inhibition and Limits Functional Recovery after SpinalCord Injury.”Journal of Neurotrauma 26(7):955–64.https://doi.org/10.1089/neu.2008.0776.
Niehrs,Christof.2012.“The Complex World of WNT Receptor Signalling.”Nature Reviews Molecular Cell Biology 13(12):767–79.https://doi.org/10.1038/nrm3470.
Patthy,L.2000.“The WIF Module.”Trends in Biochemical Sciences 25(1):12–13.
https://doi.org/10.1016/s0968-0004(99)01504-2.
Petrova,Iveta M.,Liza L.Lahaye,TaniaAnja W.M.de Jong,MartijnJ.Malessy,
Joost Verhaagen,Jasprina N.Noordermeer,and Lee G.Fradkin.2013.“Homodimerization of the Wnt Receptor DERAILED Recruits the Src Family KinaseSRC64B.”Molecular and Cellular Biology 33(20):4116–27.https://doi.org/10.1128/MCB.00169-13.
Roy,James P.,Michael M.Halford,and Steven A.Stacker.2018.“TheBiochemistry,Signalling and Disease Relevance of RYK and Other WNT-BindingReceptor Tyrosine Kinases.”Growth Factors 36(1–2):15–40.https://doi.org/10.1080/08977194.2018.1472089.
Schmitt,Adam M.,Jun Shi,Alex M.Wolf,Chin-Chun Lu,Leslie A.King,andYimin Zou.2006.“Wnt-Ryk Signalling Mediates Medial-Lateral RetinotectalTopographic Mapping.”Nature 439(7072):31–37.https://doi.org/10.1038/nature04334.
Sheetz,Joshua B.,Sebastian Mathea,Hanna Karvonen,Ketan Malhotra,DeepChatterjee,Wilhelmiina Niininen,Robertet al.2020.“Structural Insightsinto Pseudokinase Domains of Receptor Tyrosine Kinases.”Molecular Cell 79(3):390-405.e7.
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.06.018.
Simonetti,Manuela,and Rohini Kuner.2020.“Spinal Wnt5a Plays a KeyRole in Spinal Dendritic Spine Remodeling in Neuropathic and InflammatoryPain Models and in the Pro-Algesic Effects of Peripheral Wnt3a.”The Journalof Neuroscience:The Official Journal of the Society for Neuroscience,July.https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2942-19.2020.
VanderVorst,Kacey,Courtney A.Dreyer,Sara E.Konopelski,Hyun Lee,Hsin-Yi Henry Ho,and Kermit L.Carraway.2019.“Wnt/PCP Signaling Contribution toCarcinoma Collective Cell Migration and Metastasis.”Cancer Research 79(8):1719–29.https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-2757.
Yang,Qing Ou,Wen-Jing Yang,Jian Li,Fang-Ting Liu,Hongbin Yuan,andYue-Ping Ou Yang.2017.“Ryk Receptors on Unmyelinated Nerve Fibers MediateExcitatory Synaptic Transmission and CCL2 Release during Neuropathic PainInduced by Peripheral Nerve Injury.”Molecular Pain 13(May).https://doi.org/10.1177/1744806917709372.
Zhang,Yan-Kai,Zhi-Jiang Huang,Su Liu,Yue-Peng Liu,Angela A.Song,andXue-Jun Song.2013.“WNT Signaling Underlies the Pathogenesis of NeuropathicPain in Rodents.”The Journal of Clinical Investigation 123(5):2268–86.https://doi.org/10.1172/JCI65364.
V.发明内容
在一个方面或实施方案中，本发明提供了一种分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其：a)特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1[RANRLVE]中所示的CDR序列；b)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1[RANRLVE]中所示的CDR序列；c)特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ IDNO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:3[HGDSGDY]或SEQ ID NO:4[HGDQGDY]中所示的CDR序列；和/或d)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:3[HGDSGDY]或SEQ ID NO:4[HGDQGDY]中所示的CDR序列，前提是所述抗体或抗体衍生物不是WO 2017/172733A1中公开和/或要求保护的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其：a)特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]具有至少约85％序列一致性的氨基酸序列；b)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或者SEQ ID NO:13[VL3]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列；c)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14[VHl]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ IDNO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或者SEQ ID NO:18[VH5]具有至少约85％序列一致性的氨基酸序列；和/或d)特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或者SEQ ID NO:18[VH5]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列，前提是所述抗体或抗体衍生物不是WO 2017/172733 A1中公开和/或要求保护的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了一种免疫偶联物，包含上述分离的抗体或抗体衍生物，其与检测剂和/或治疗剂连接。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了一种双特异性分子，其包含上述分离的抗体或抗体衍生物，其连接至具有与本发明的分离的抗体或抗体衍生物不同的结合特异性的第二功能部分。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的上述抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物或上述双特异性分子，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在又一个方面或实施方案中，本发明提供了编码上述分离的抗体或抗体衍生物的核酸序列。还提供了包含上述核酸序列的载体。还提供了包含上述载体的宿主细胞。还提供了一种转基因非人动物，例如转基因小鼠，其包含上述宿主细胞，其中该非人动物或小鼠表达由上述核酸编码的多肽。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了一种干扰Wnt与Ryk相互作用的方法，包括使包含Wnt和Ryk的样品与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物，上述双特异性分子接触，从而干扰Wnt和Ryk的相互作用。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了一种用于抑制神经元退化的方法，该方法包括使神经元与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸序列、上述载体或上述宿主细胞接触，从而抑制神经元的退化。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗患有神经系统疾病、病症或损伤的受试者或具有罹患神经系统疾病、病症或损伤的风险的受试者的神经系统疾病、病症或损伤的方法，包括向受试者施用有效量的上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸序列、上述载体或上述宿主细胞，从而治疗受试者的神经系统疾病、病症或损伤。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了一种用于调节神经元定向生长的方法，包括使神经元与上述分离的抗体或抗体、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸序列、上述载体或上述宿主细胞接触，从而调节神经元的定向生长。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了有效量的上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述核酸序列、上述载体或上述宿主细胞用于制备治疗或预防患有或有具有罹患神经系统疾病、病症或损伤的风险的受试者的神经系统疾病、病症或损伤的药物的用途。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了预防或治疗患有癌症或肿瘤的受试者或具有罹患癌症或肿瘤的风险的受试者的癌症或肿瘤的方法，包括向受试者施用有效量的上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸序列、上述载体或上述宿主细胞，从而或治疗受试者的癌症或肿瘤。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了有效量的上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述核酸序列、上述载体或上述宿主细胞用于制备用于预防或治疗患有癌症或肿瘤的受试者或具有罹患癌症或肿瘤的风险的受试者的癌症或肿瘤的药物的用途。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了一种评估样品中Ryk多肽的方法，所述方法包括：a)使含有或疑似含有Ryk多肽的样品与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物或上述双特异性分子接触；和b)分析Ryk多肽(如果存在于样品中)与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物或上述双特异性分子之间的结合以评估样品中Ryk多肽的存在、不存在、水平或量。
VI.附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩色绘图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由办公室提供。
图1显示了具有Chothia CDR定义和编号的示例性Ab5.5 VL结构域。
图2显示了具有Chothia CDR定义和编号的示例性Ab5.5 VH结构域。
图3显示了Ab5.5 VL结构域与受体框架的示例性比对。
图4显示了Ab5.5 VH结构域与受体框架的示例性比对。
图5显示了Ab5.5和最低DRB1评分变体Ab5.5_var15的示例性全局DRB1风险评分，与44种上市治疗性抗体的DRB1评分直方图对比。人抗体由蓝色条表示，人源化由浅蓝色条表示，嵌合体由深蓝色条表示。参考集中的DRB1分数已针对抗体可变域或完整抗体进行了预测。
图6显示了四种抗体变体Ab5.5、Ab5.5_var1、Ab5.5_var2和Ab5.5_var10的示例性表位定位。
图7显示了包含人Ryk抗原序列的重组融合蛋白的示例性序列比对，人Ryk抗原具有(A,抗原)和不具有(DE,表位缺失)使用肽图分析发现的推定表位。麦芽糖结合蛋白(MBP)序列显示为橙色，凝血酶切割位点显示为蓝色，人Ryk序列显示为绿色。
图8显示了具有重组人Ryk抗原的Ab5.5变体的示例性蛋白质印迹筛选。Ab5.5变体用于免疫印迹以检测具有(A，抗原)或不具有(DE，Delta表位)推定表位的人Ryk蛋白序列，该推定表位是氨基酸序列TSRTIYDPV。两种重组蛋白都标记有麦芽糖结合蛋白(MBP)。上图显示Ab5.5变体的免疫反应性，下图是用抗MBP抗体探测的相同印迹。该图显示了根据MBP归一化的Ab5.5变体结合的条带强度分析(N＝3次实验)。
图9显示了示例性Ab5.5取代扫描热图。
图10显示了示例性Ab5.5取代扫描氨基酸图。
图11显示了示例性Ab5.5_var1取代扫描热图。
图12显示了示例性的Ab5.5_var1取代扫描氨基酸图。
图13示例性地显示了HEK 293STF细胞中经典的Wnt信号转导被Ab5.5_var1抑制。
图14显示了胆管癌中的示例性RYK mRNA表达。
图15显示了淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤中的示例性Ryk mRNA表达。
图16显示了多形性胶质母细胞瘤中的示例性Ryk mRNA表达。
图17显示了头颈部鳞状细胞癌中的示例性Ryk mRNA表达。
图18显示了急性髓性白血病中的示例性Ryk mRNA表达。
图19显示了低级别神经胶质瘤中的示例性Ryk mRNA表达。
图20显示了肺鳞状细胞癌中的示例性Ryk mRNA表达。
图21显示了胰腺癌中的示例性Ryk mRNA表达。
图22显示了胸腺瘤中的示例性Ryk mRNA表达。
图23示例性地显示了高Ryk mRNA水平与低级别神经胶质瘤的低存活率相关。
图24示例性地显示了高Ryk mRNA水平与胰腺癌中较差的存活率相关。
图25显示了Ab5.5_Var1与在人HEK293细胞系中表达的全长人和小鼠RYK的蛋白质印迹结合确认的示例。编码人和小鼠RYK构造的载体用作空对照。
图26显示了Ab5.5_Var1对Wnt5a引导的SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞迁移的示例性功能阻断。迁移的细胞由Hoechst(蓝色)标记，其数量由Cytation 5细胞成像多模式仪(Cell Imaging Multi-Mode Reader)自动量化。该图显示了在指定处理下对非治疗组(N＝3次实验)进行归一化后迁移细胞数量的分析。
图27显示了通过Ab5.5_Var1和αHFc-CL-PNU抗体的联合治疗进行的示例性细胞毒性研究，但不是单独的Ab5.5_Var1或IgG与αHFc-CL-PNU抗体。该图显示了针对非治疗组归一化的细胞活力分析(N＝3次实验)。
图28显示了在人HEK293细胞系中Ab5.5_Var1对Wnt5a诱导的RhoA激活的示例性功能阻断。该图显示了根据总RhoA水平归一化的诱导百分比的分析(N＝3次实验)。
VII.详细说明
下面连同说明所要求保护的主题的原理的附图一起提供了所要求保护的主题的一个或多个实施例的详细描述。要求保护的主题是结合这些实施例描述的，但不限于任何特定实施例。应当理解，要求保护的主题可以以各种形式体现，并且包括许多替代、修改和等同物。因此，本文公开的具体细节不应被解释为限制，而是作为权利要求的基础和用于教导本领域技术人员以几乎任何适当详细的系统、结构或方式使用要求保护的主题的代表性基础。为了提供对本发明的透彻理解，在以下描述中阐述了许多具体细节。这些细节是出于示例的目的而提供的，并且可以根据根据没有这些具体细节的部分或全部的权利要求来实践要求保护的主题。应当理解，在不脱离要求保护的主题的范围的情况下，可以使用其他实施例并且可以进行结构改变。应当理解，在一个或多个单独实施例中描述的各种特征和功能不限于它们对描述它们的特定实施例的适用性。相反，它们可以单独或以某种组合应用于本发明的一个或多个其他实施例，无论这些实施例是否被描述，以及这些特征是否被呈现为所描述的实施例的一部分。为清楚起见，未详细描述与要求保护的主题相关的技术领域中已知的技术材料，以免不必要地混淆要求保护的主题。
除非另有定义，本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或专门名词旨在具有与要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有通常理解含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应必然被解释为表示与本领域通常理解的内容存在实质性差异。本领域技术人员使用常规方法很好地理解并常规应用本文所描述或引用的许多技术和程序。
本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、科学文章和数据库，都出于所有目的通过引用整体并入，其程度与每个单独的公开文献通过引用单独并入的程度相同。如果本文阐述的定义与通过引用并入本文的专利、专利申请、公开的申请或其他公开文献中阐述的定义相反或不一致，则本文阐述的定义优先于通过引用并入本文的定义。引用出版物或文件并不意味着承认其中任何一个是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。
所有标题都是为了方便读者，不应该用来限制标题后面的文本的含义，除非另有说明。
除非另有说明，所提供的实施方案的实践将采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述，这些常规技术和描述在本领域技术人员的技能范围内。此类常规技术包括多肽和蛋白质合成和修饰、多核苷酸合成和修饰、聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接以及使用标记检测杂交。可以通过参考本文的示例来获得合适技术的具体说明。然而，当然也可以使用其他等效的常规程序。这些常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如：Green等人编,GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)(1999)；Weiner,Gabriel,Stephens编,Genetic Variation:A Laboratory Manual(2007)；Dieffenbach,Dveksler编,PCRPrimer:A Laboratory Manual(2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:AMolecularCloning Manual(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis(2004)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols from Molecular Cloning:A LaboratoryManual(2006)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2002)(均来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Ausubel等人编,CurrentProtocols in Molecular Biology(1987)；T.Brown编,Essential Molecular Biology(1991),IRL Press；Goeddel编,Gene Expression Technology(1991),Academic Press；A.Bothwell等人编,Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(1990),Bartlett Publ.；M.Kriegler,Gene Transfer和Expression(1990),Stockton Press；R.Wu等人编,Recombinant DNA Methodology(1989),Academic Press；M.McPherson等人,PCR:APractical Approach(1991),IRL Press at Oxford University Press；Stryer,Biochemistry(第4版)(1995),W.H.Freeman,New York N.Y.；Gait,OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach(2002),IRL Press,London；Nelson和Cox,Lehninger,Principles of Biochemistry(2000)第3版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Berg,etal.,Biochemistry(2002)第5版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；D.Weir&C.Blackwell编,Handbook of Experimental Immunology(1996),Wiley-Blackwell；Cellular andMolecular Immunology(A.Abbas等人,W.B.Saunders Co.1991,1994)；Current Protocolsin Immunology(J.Coligan等人编.1991)。出于所有目的，所有这些都通过引用整体并入本文。
贯穿本发明，要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对要求保护的主题的范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限的每个中间值，以及在规定的范围内的任何其他规定值或中间值都包含在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在要求保护的主题内，受制于所规定范围内的任何具体排除的限制。在所规定范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制中的一个或两个的范围也包括在要求保护的主题中。无论范围的宽度如何，这都适用。例如，对诸如1至6的范围的描述应被视为具有具体公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，并具有该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。
在一些实施方案中，本发明基于以下发现：特异性结合Ryk上Wnt的结合结构域的抗Ryk抗体或抗体片段抑制Wnt-Ryk信号传导。在一些实施方案中，本发明提供使用抗-Ryk抗体或抗体片段调节神经元退化和神经元引导的方法。因此，抗Ryk抗体或抗体片段可用于治疗患有或具有罹患神经疾病或病症(例如神经退行性疾病或病症)的风险的受试者的神经疾病或病症(例如神经退行性疾病或病症)，和/或治疗受试者的脊髓损伤(SCI)。
在描述本组合物和方法之前，应当理解本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
A.定义
如本文所用，除非上下文另有明确规定，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，“一(a/an)”表示“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。应当理解，本文描述的方面和变化包括“由”和/或“基本上由……组成”的方面和变化。
与“包括”、“含有”或“特征在于”可互换使用的术语“包含”是包容性或开放式语言，不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。短语“由...组成”排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤，以及那些不会实质性影响要求保护的发明的基础和新颖特征的材料或步骤。本发明涵盖对应于这些短语中的每一个的范围的本发明组合物和方法的实施例。因此，包括所列举的要素或步骤的组合物或方法考虑了特定的实施方案，其中所述组合物或方法基本上由或者由那些要素或步骤组成。
本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知晓的各个值的通常误差范围。本文提及“大约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产品、物质或化合物的任何混合物，包括细胞。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水性的、非水性的或其任何组合。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))和单域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖免疫球蛋白的基因工程和/或其他修饰形式，例如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异源偶联抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、双链抗体、三链抗体和四链抗体、串联二价scFv，串联三价scFv。除非另有说明，术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。抗体主要分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。
与“高变区”或“HVR”同义的术语“互补决定区”和“CDR”在本领域中已知是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链可变区的非CDR部分。通常，每个全长重链可变区有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，每个全长轻链可变区有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以很容易地使用许多众所周知的方案中的任何一种来确定，包括由以下描述的方案：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第五版；Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”numbering scheme),Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”numbering scheme),MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding sitetopography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”numbering scheme),Lefranc MP等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003Jan；27(1):55-77(“IMGT”numbering scheme),Honegger A和Plückthun A,“Yet another numberingscheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysistool,”J Mol Biol,2001Jun 8；309(3):657-70,(“Aho”numbering scheme)。
给定CDR或FR的边界可能因用于识别的方案而异。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。Kabat和Chothia方案二者的编号基于最常见的抗体区域序列长度，其中插入通过插入字母(例如“30a”)来顺应，并且一些抗体中出现缺失。这两个方案将某些插入和缺失(“indels”)放置在不同的位置，从而导致不同的编号。Contact方案基于对复杂晶体结构的分析，在许多方面与Chothia编号方案相似。
因此，除非另有说明，给定抗体或其区域(例如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或个别指定的CDR(例如，“CDR-H1、CDR-H2”)应理解为涵盖由任何上述方案定义的(或特定的)互补决定区。例如，当声明特定CDR(例如，CDR-H3)包含给定VH或VL氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列时，应当理解，如任何上述方案所定义的，这样的CDR在可变区内具有相应CDR(例如，CDR-H3)的序列。
同样，除非另有说明，给定抗体或其区域(例如其可变区)的FR或个别指定的FR(例如，FR-H1、FR-H2)应理解为涵盖由任何已知方案定义的(或特定的)框架区。在一些情况下，指定用于识别特定CDR、FR或FRs或CDRs的方案，例如由Kabat、Chothia或Contact方法定义的CDR。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别地，VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,6thed.,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以通过以下来分离：使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分别筛选互补VL或VH结构域的文库(参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628(1991))。
本文中的术语“Fc区”用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可能存在也可能不存在。除非本文另有规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统的，也称为EU索引，如下所描述的：Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在具体实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，例如scFv。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是骆驼单域抗体。
抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，例如包含非天然排列的片段，例如具有两个或更多抗体区域或链的通过合成接头(例如肽接头)连接的片段，和/或可能不是通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。
“人源化”抗体是其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR的抗体。术语“嵌合”抗体是指其中一部分重链和/或轻链源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
所提供的抗体包括单克隆抗体，包括单克隆抗体片段。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体或从其中获得的抗体，即，除了可能含有天然发生的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生的变体，构成群体的受试者抗体是相同的，此类变体通常以少量存在。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个表位。该术语不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于从杂交瘤产生、重组DNA方法、噬菌体展示和其他抗体展示方法。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽，包括所提供的抗体和抗体链以及其他肽，可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可以包含相对于天然或自然序列的修饰，只要蛋白质保持期望的活性。这些修饰可能是有意的，如通过定点诱变，也可能是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增引起的错误。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映了结合对成员之间的1:1相互作用(例如，抗体和抗原)。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法测量，方法包括本文所述的那些。下文描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的母体抗体相比，此类改变导致抗体对抗原的亲和力提高。
如本文所用，术语“特异性结合”是指结合物(例如抗体)的特异性，使得它优先结合靶标(例如多肽抗原)。当提及结合配偶体时，例如蛋白质、核酸、抗体或其他亲和捕获剂等，“特异性结合”可以包括两个或多个具有高亲和力和/或互补性的结合配偶体的结合反应，以确保在指定测定条件下的选择性杂交。通常，特异性结合至少是背景信号标准偏差的三倍。因此，在指定条件下，结合配偶体与其特定靶分子结合，并且不会大量结合样品中存在的其他分子。在存在其他潜在干扰物质的情况下，结合物或抗体对特定靶标的识别是此类结合的一个特征。优选地，特异性针对或特异性结合靶标的结合物、抗体或抗体片段以比结合其他非靶标物质更高的亲和力结合靶标。还优选地，特异性针对或特异性结合靶标的结合物、抗体或抗体片段避免结合相当大比例的非靶标物质，例如测试样品中存在的非靶标物质。在一些实施方案中，本发明的结合物、抗体或抗体片段避免结合大于约90％的非目标物质，然而更高的百分比显然是可以预期的和优选的。例如，本发明的结合物、抗体或抗体片段避免结合约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％,以及大约99％或更多的非目标物质。在其他实施方案中，本发明的结合物、抗体或抗体片段避免结合大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，或大于约75％，或大于约80％，或大于约85％的非目标物质。
“受试者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物，如猴子)、兔子和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。“受试者”或“受试者”可包括鸟类(如鸡)、脊椎动物(如鱼)和哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、牛、牛、绵羊、山羊、马、猴和其他非人类灵长类动物)。在某些实施例中，受试者或受试者是人。
“如本文所用，术语“样本”是指任何可能包含需要对其进行分析物测定的分析物的事物。如本文所用，“样品”可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水性的、非水性的或其任何组合。样品可以是生物样品，例如生物流体或生物组织。生物体液的例子包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊液、泪液、粘液、羊水等。生物组织是细胞的集合体，通常是特定种类的细胞及其细胞间质，构成人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一，包括结缔组织、上皮细胞、肌肉和神经组织。生物组织的例子还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单个细胞。
在一些实施例中，样品是生物样品。本发明的生物样品包括溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水性样品或非水性样品形式的样品。如本文所用，“生物样品”包括从活体或病毒(或朊病毒)来源或其他大分子和生物分子来源获得的任何样品，并包括受试者的任何细胞类型或组织，从其可以获得核酸、蛋白质和/或其他大分子。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。例如，扩增的分离核酸构成生物样品。生物样品包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、来自动植物的组织和器官样品以及源自它们的加工样品。在一些实施例中，样本可源自组织或体液，例如结缔组织、上皮、肌肉或神经组织；选自由以下组成的组的组织：脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾脏、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、腺体和内部血管；或者体液，体液选自由以下组成的组：血液、尿液、唾液、骨髓、精子、腹水及其亚组分，例如血清或血浆。
“分离的”抗体是从其自然环境的成分中分离出来的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于90％、95％或99％的纯度，纯度通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定。有关评估抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已经从其天然环境的成分中分离出来的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比”定义为候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，在比对序列并引入空位(如有必要)之后，为实现最大序列一致性百分比，不考虑将任何保守取代作为序列一致性的一部分。可以以本领域技术范围内的各种方式实现用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对，例如，使用可公开的现有的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“缓和”或“改善”在本文中可互换使用。这些术语指获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在病症。此外，通过根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理症状从而在患者中观察到改善来实现治疗益处，尽管患者可能仍然患有潜在病症。为了预防益处，即使可能尚未做出该疾病的诊断，可将组合物施用于处于发展特定疾病风险中的患者，或施用于报告疾病的一种或多种生理症状的患者。治疗包括预防疾病，即通过在诱发疾病之前施用保护性组合物使疾病的临床症状不发展；抑制(suppressing)疾病，即通过在诱发事件之后但在疾病的临床表现或再现之前施用保护性组合物使疾病的临床症状不发展；抑制(inhibiting)疾病，即在临床症状最初出现后通过给予保护性组合物来阻止其发展；预防疾病的再次发生和/或缓解疾病，即在临床症状最初出现后通过施用保护性组合物引起临床症状消退。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以诱导所需生物学结果的活性剂的量。结果可能是疾病的体征、症状或病因的减轻，或生物系统的任何其他所需的改变。术语“治疗有效量”在本文中用于表示当在一段时间内重复施用于受影响区域时引起疾病状况显著改善的制剂的任何量。该量将随着所治疗的病症、病症的进展阶段以及所用制剂的类型和浓度而变化。在任何给定情况下的适当量对本领域技术人员而言将是显而易见的或能够通过常规实验确定。
术语“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域公知的多种有机和无机反离子的盐，包括(仅举例来说)钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，(当分子含有碱性官能团时)有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠科动物、类人猿、人、农场动物、运动动物和宠物。还包括在体外获得或在体外培养的生物实体的组织、细胞和它们的后代。
如本文所用，“促进(promote)”或“增加(increase)”或“促进(promoting)”或“增加(increasing)”在本文中可互换使用。这些术语是指与未处理的细胞(组织或受试者)相比，经处理的细胞(组织或受试者)的测量参数(例如，活性、表达、信号转导、神经元退化)的增加。也可以在治疗前后对同一细胞或组织或受试者进行比较。增加是足以被检测到的。在一些实施方案中，与未处理的细胞相比，经处理细胞的增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或更多。
如本文所用，“抑制(inhibit)”、“预防(prevent)”或“减少(reduce)”或“抑制(inhibiting)”、“预防(preventing)”或“减少(reducing)”在本文中可互换使用。这些术语是指与未处理的细胞(组织或受试者)相比，经处理的细胞(组织或受试者)的测量参数(例如，活性、表达、信号转导、神经元退化)的降低。也可以在治疗前后对同一细胞或组织或受试者进行比较。减少量是足以被检测到的。在一些实施方案中，与未处理的细胞相比，经处理的细胞的减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或被完全抑制。在一些实施方案中，与未处理的细胞相比，所测量的参数在处理的细胞中是不可检测的(即，完全抑制)。
涉及生物活性剂的术语“选择性抑制(inhibition)”或“选择性抑制(inhibit)”是指与脱靶信号传导活性相比，试剂通过与靶标的直接或间接相互作用优先降低靶标信号传导活性的能力。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基硫鎓。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置，密码子可以改变为任何描述的相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，是一种保守修饰的变异。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个描述的序列中。
至于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加(这改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中这样的改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体是本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因的补充，并不排除它们。
以下八组中的每组都包含示例性的相互保守替代的氨基酸：[待增加]
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。
“序列一致性百分比”是通过在比较窗口中比较两个最佳比对序列来确定的，其中与不包含添加或缺失的参考序列(例如，本发明的多肽)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即，缺口)，以实现两个序列的最佳比对。百分比是通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量来计算的，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100得到序列一致性的百分比。
在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同的”或百分比“一致性”是指两个或多个序列或子序列是相同的序列。当通过比较窗口或指定区域进行比较和比对以获得最大对应性时，使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查进行测量，如果两个序列具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的(即，在指定区域上60％的一致性，可选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的一致性，或者，当未指定区域时，则是在整个序列上)，则两个序列“基本相同”。本发明分别提供与本文示例的多肽基本上相同的多肽及其用途，包括但不限于用于治疗或预防神经疾病或病症，例如神经退行性疾病或病症，和/或治疗SCI。可选地，一致性存在于长度至少约50个核苷酸的区域，或更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸的区域，或参考序列的全长。
对于序列比较，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如果需要，指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括参考连续位点的编号中的任何一个的片段，所述连续位点的编号选自由以下组成的组：从20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150，其中，在两个序列最佳比对后，可以将序列与相同编号的连续位点的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。可以通过以下进行用于比较的序列的最佳比对：例如，局部同源算法，Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c；同源比对算法，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；相似性搜索法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444；这些算法的计算机化实现(GAP,BESTFIT,FASTA,andTFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)；或者手动比对和目视检查(参见,例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
适用于确定序列一致性百分比和序列相似性的两个算法示例是BLAST和BLAST2.0算法，分别在Altschul等人.(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402,和Altschul等人.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中有描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短词来识别高分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的词比对时，这些短词匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域词命中充当种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。单词命中沿着每个序列在两个方向上扩展，只要累积比对分数可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的惩罚分数；总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。在以下情况下，单词命中在每个方向的扩展将停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积分数变为零或更低；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)或10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)，比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行了统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小加和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则核酸被认为与参考序列相似。
“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物，以及它们的互补物。该术语包括核酸，所述核酸含有已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
如本文所用，术语蛋白质的“显性失活突变体”是指突变的多肽或核酸，其缺乏野生型活性，并且，一旦在细胞(其中也表达了相同蛋白质的野生型)中表达，其支配野生型蛋白质并且有效地与野生型蛋白质竞争底物、配体等，从而抑制野生型分子的活性。显性失活突变体可以是具有与野生型蛋白质基本相似(即至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％相似)的氨基酸序列的多肽。显性失活突变体也可以是包含野生型蛋白质片段的多肽，例如野生型蛋白质的C结构域。显性失活突变体可以是野生型蛋白质的截短形式。
小鼠模型
如本文所用，“转基因生物”是指当动物仍处于其胚胎阶段时已将外源DNA引入其中的动物。在大多数情况下，转基因方法旨在对基因组进行特定修饰，例如，通过将整个转录单元引入基因组，或通过上调或下调或突变预先存在的细胞基因。这些程序中某些程序的目标特征使转基因技术有别于将随机突变赋予种系的实验方法，例如施用化学诱变剂或用电离溶液处理。转基因生物可包括具有基因敲除或可能导致基因突变的生物。
“基因敲除”是指部分或完全抑制由细胞内源DNA序列编码的蛋白质的表达。“基因敲除”可能受到编码蛋白质的基因的全部或部分的定向删除的影响。或者，可以通过胚胎干细胞中功能蛋白的靶向突变获得转基因生物。因此，缺失或突变可能会阻止或减少蛋白质在正常表达的整个动物的任何细胞中的表达，或导致具有不同于正常/野生型蛋白质的生物学功能的突变蛋白质的表达。
术语“基因敲除动物”和“转基因动物”是指其中给定基因已通过与靶向载体重组而被抑制或突变的转基因动物。需要强调的是，该术语旨在包括所有后代。因此，包括原始动物及其所有F1、F2、F3等后代。
如本文所用，短语“条件性敲除”或“cKO”在用于描述非人转基因哺乳动物，例如小鼠时，是指在特定组织中包含特定基因敲除的小鼠。基因工程cKO小鼠的创建涉及将特定的DNA序列(例如敲除构建体/载体)插入小鼠DNA。插入的序列被两种DNA特异性酶识别，frt重组酶(也称为翻转酶)和Cre重组酶，通常不存在于小鼠中。Cre重组酶识别位点称为loxP位点，翻转酶识别位点称为frt位点。这些酶中的每一种都可以切割和去除位于其识别位点两侧的DNA序列。如果去除感兴趣基因的功能性DNA序列，这可能会导致基因功能的破坏。此外，将一个可选择的标记基因插入小鼠体内，引入该基因可以选择包含Cre重组或翻转酶识别位点的小鼠胚胎细胞(干细胞)。得到的小鼠是条件性基因敲除小鼠。
敲除构建体是核酸序列，例如DNA构建体，当其被引入细胞时，导致抑制(部分或完全)由细胞内源DNA编码的多肽或蛋白质的表达。本文提供了示例性敲除构建体。该构建体包含Ryk基因5'到外显子3和3'到外显子6的loxP位点、选择标记盒和3'到选择标记盒的loxP位点。选择标记盒包含5'和3'到选择标记的frt位点，并且在3'frt位点和选择标记基因之间。合适的选择标记包括但不限于新霉素、嘌呤霉素和潮霉素。
可以以多种方式中的任一种制备含有多于一种转基因构建体和/或多于一种转基因表达构建体的动物。一种示例性的制备方式是产生一系列动物，每只动物都含有一种所需的转基因表型。此类动物通过一系列杂交、回交和选择繁殖在一起，以最终产生包含所有所需转基因性状和/或表达构建体的单个动物，其中，除了构建体和/或转基因的存在外，该动物与野生型在其他方面是同源的(遗传上相同)。
通常选择胚胎干(ES)细胞是因为它们能够整合并成为发育中胚胎种系的一部分，从而产生转基因的种系传递。因此，可以这样做的任何ES细胞系都适用于本文。使用本领域技术人员熟知的方法生成和维持ES细胞，例如如下所描述的那些方法：Doetschman等人.(1985)J.Embryol.Exp.Mol.Biol.87:27-45。可以使用任何ES细胞系，但是，所选择的品系通常是根据细胞整合到发育中胚胎的种系并成为其一部分的能力来选择的，以便创建转基因/敲除构建体的种系传递。因此，任何被认为具有这种能力的ES细胞系都适用于本文。一个通常用于生产ES细胞的小鼠品系是129J品系。另一个ES细胞系是鼠细胞系D3(美国典型培养物保藏中心，目录号CKL 1934)。还有另一个ES细胞系是WW6细胞系(Ioffe等人(1995)PNAS 92：7357-7361)。使用本领域技术人员熟知的方法培养细胞并准备敲除构建体的插入，例如在以下文献中提出的那些方法：Robertson.Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells:A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.IRL Press,Washington,D.C.(1987))；Bradley等人.(1986)Current Topics in Devel.Biol.20:357-371)；Hogan等人.(Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1986)).
可以使用本领域熟知的多种方法将敲除构建体引入ES细胞，包括(例如)电穿孔、显微注射和磷酸钙处理。为了引入DNA序列，在适合所选插入方法的条件下，将敲除构建体DNA添加到ES细胞中。如果要对细胞进行电穿孔，则使用电穿孔机(电穿孔器)将ES细胞和构建体DNA暴露于电脉冲，并遵循制造商的使用指南。电穿孔后，允许细胞在合适的孵育条件下恢复。然后针对敲除构建体的存在筛选细胞。可以使用多种方法筛选含有转基因的细胞(同源重组体)。例如，如本文所述，可根据需要处理细胞以使其中的DNA可用于通过聚合酶链式反应(PCR)用特定探针进行筛选。
一旦确定了合适的ES细胞，就会使用标准方法将它们引入胚胎。例如，可以使用显微注射将它们引入。获得处于发生ES细胞整合的适当发育阶段的胚胎，例如通过对怀孕雌性的子宫进行灌注获得。例如，可以获得3-4天发育的小鼠胚胎，并使用微量移液器向其注射ES细胞。将ES细胞引入胚胎后，将胚胎引入假孕雌性小鼠的子宫。选择假孕阶段以增加成功植入的机会。在小鼠中，2-3天的假孕雌性是合适的。
将ES细胞成功整合到植入的胚胎中会产生称为嵌合体的后代。通过标准方法鉴定能够种系传递突变等位基因的嵌合体。培育嵌合体并筛选产生的后代是否存在所需的改变(例如修饰的重组Ryk等位基因)。例如，这可以基于毛色或通过从后代获得DNA(例如，尾部DNA)以使用已知方法(例如，Southern分析、斑点印迹分析、PCR分析)评估转基因来完成。转基因表达也可以通过已知的方法评估(例如，判断是否表达替代构建体)，例如northern分析或PCR分析。可以进行子代DNA(例如，尾部DNA)的Southern杂交或PCR分析以鉴定所需的基因型。WO 98/06834中描述了一种用于获得完全源自ES细胞的转基因非人类生物体的合适技术，该专利通过引用并入本文。
在各种实施方案中，本文公开的cKO小鼠包括至少三个要素：(1)至少两个位于靶基因关键部分侧翼的酶特异性识别位点；(2)编码选择标记的基因，例如但不限于新霉素；(3)至少两个位于选择标记基因两侧的酶特异性识别位点，以便在与特定小鼠品系繁殖时轻松去除。在一个非限制性例子中，目标基因的外显子3-6被指定为关键部分。在一个实施方案中，靶基因关键部分侧翼的酶特异性识别位点是loxP位点。在另一个实施方案中，选择标记基因侧翼的酶特异性识别位点是frt位点。
如上所述，上述“敲除”和/或“敲入”构建体的同源重组有时很少见，这样的构建体可以非同源地插入基因组的随机区域，在该区域它对已作为删除目标的基因没有影响，并且它可能会重组而破坏另一个原本不打算改变的基因。这种非同源重组事件可以通过修饰上述靶向载体，使它们在任一端侧接阴性选择标记来选择淘汰，特别是通过使用阴性选择标记白喉毒素基因、胸苷激酶基因，它们的多肽产物可以在本领域熟知的适当组织培养基(例如含有药物(如更昔洛韦ganciclovir)的培养基)中的表达细胞系中进行选择淘汰。包含阴性选择标记的靶向载体与基因组之间的非同源重组通常会导致这些阴性选择标记基因之一或两者的稳定整合，因此，可以通过在适当的选择性培养基(例如，含有更昔洛韦等药物的培养基)中生长来选择淘汰经过非同源重组的细胞。同时选择阳性选择标记和阴性选择标记将导致克隆的大量富集，其中构建体已在拟突变基因的基因座处同源重组。可以通过本领域技术人员熟知的Southern印迹分析技术证实在所得干细胞系中靶基因座处预测的染色体改变的存在。或者，可以使用PCR。
制造转基因动物的其他方法也是众所周知的。参见，例如，Manipulating theMouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。重组酶依赖性转基因生物也可以产生，例如，通过同源重组插入靶序列，使得Ryk基因失活的组织特异性和/或时间控制可以通过重组酶序列来控制。
因此，一方面，本发明提供了一种转基因非人哺乳动物(例如小鼠)及其制备方法，其基因组包含Ryk基因的杂合或纯合缺失、失活或敲除。在各种实施方案中，小鼠具有表型Frizzled3.sup.-/-Ryk.sup.+/-。在各种实施方案中，小鼠含有皮质脊髓束(CST)特异性破坏的Ryk基因。在各种实施方案中，被破坏的Ryk基因包括重组Ryk等位基因、选择标记、选择标记侧翼的frt位点以及位于等位基因的一部分侧翼的loxP位点。标记可以是PGK Neo，并且loxP位点可以位于等位基因的外显子3-6的侧翼。还提供了衍生自转基因非人哺乳动物的分离细胞。
B.分离的抗Ryk抗体和相关组合物
在在一方面或实施例中，本发明提供一种分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其：a)特异性结合Ryk上的Wnt结合域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如小鼠Ryk(SEQID NO:24)的第35-211位氨基酸或人类Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1[RANRLVE]中所示的CDR序列；b)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1[RANRLVE]中所示的CDR序列；c)特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:3[HGDSGDY]或SEQ ID NO:4[HGDQGDY]中所示的CDR序列；和/或d)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:3[HGDSGDY]或SEQ ID NO:4[HGDQGDY]中所示的CDR序列，前提是所述抗体或抗体衍生物不是WO 2017/172733 A1中公开和/或要求保护的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物结合小鼠Ryk(SEQID NO:24)的第118-211位氨基酸或第195-202位氨基酸内的表位。在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物结合人Ryk(SEQ ID NO:25)的第134-227位氨基酸或第211-218位氨基酸内的表位。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可包含任何合适的轻链可变区或轻链可变区内的CDR序列。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:1中所示的CDR序列。在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区还包含SEQ ID NO:5[KASQDINSYLS]和/或SEQ ID NO:6[LQYDEFPLT]中所示的CDR序列。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可包含任何合适的重链可变区或重链可变区内的CDR序列。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:3[HGDSGDY]或SEQ ID NO:4[HGDQGDY]中所示的CDR序列。在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:7[GFTFSSY]以及SEQ ID NO:3[HGDSGDY]、SEQ ID NO:4[HGDQGDY]或SEQ ID NO:8[HGDNGDY]中的其中一个所示的CDR序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:1[RANRLVE]、SEQ ID NO:5[KASQDINSYLS]及SEQ ID NO:6[LQYDEFPLT]中所示的CDR序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:7[GFTFSSY]及SEQ ID NO:3[HGDSGDY]、SEQ ID NO:4[HGDQGDY]或SEQ ID NO:8[HGDNGDY]中的其中一个所示的CDR序列。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区可包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]至少约85％的序列一致性。例如，本发明分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区可包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]所示的、氨基酸序列。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物重链可变区可包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含与SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或SEQ ID NO:18[VH5]至少约85％的序列一致性。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区可包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含与SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或SEQ ID NO:18[VH5]至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。在一些实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ IDNO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，
其：a)特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列；b)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或者SEQ ID NO:13[VL3]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列；c)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ IDNO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14[VHl]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或者SEQ ID NO:18[VH5]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列；和/或d)特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQID NO:17[VH4]或者SEQ ID NO:18[VH5]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列，前提是所述抗体或抗体衍生物不是WO 2017/172733 A1中公开和/或要求保护的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物。
本发明分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可包含任何合适轻链可变区或轻链可变区内的CDR序列。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物
轻链可变区可包含SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可包含任何合适的重链可变区或重链可变区内的CDR序列。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区可包含SEQID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或SEQ IDNO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区可包含SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区可包含SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:15[VH2]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:16[VH3]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:17[VH4]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:15[VH2]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:16[VH3]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:17[VH4]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:15[VH2]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:16[VH3]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:17[VH4]所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区包含SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
本发明分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可以是任何合适的形式。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可以是人源化抗体，例如人源化单克隆抗体。在另一实施例中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可以是多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、单域抗体(例如sdAb、sdFv或纳米抗体)、胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体、异源偶联抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、串联二价scFv或串联三价scFv。抗体片段可以是任何合适的形式。例如，抗体片段可为抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(例如单链可变片段(scFv))或单域抗体片段。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可以抑制或减少Ryk与Wnt的结合，和/或抑制或减少平面细胞极性信号通路，抑制或减少任何合适程度或达到任何合适程度。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可抑制或减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的Ryk与Wnt的结合。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可以特异性结合Ryk的第90-183位氨基酸残基内的表位。例如，本发明分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可以结合到SEQ ID NO:19[SRTIYDPV]中列出的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位，或结合到与SEQ IDNO:19[SRTIYDPV]中列出的氨基酸序列具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位。在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可以结合到与SEQ ID NO:19[SRTIYDPV]中列出的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位。在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物结合到SEQ ID NO:20[ARTIYDPV]、SEQ ID NO:21[PRTIYDPV]或SEQ ID NO:22[SRTLYDPV]中列出的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位。在一些实施方案中，本发明的分离的抗-Ryk抗体或抗体衍生物结合到SEQ ID NO:23[SRXIYDPV]中列出的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位，X为非T天然氨基酸。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物在人类中可具有低于WO
2017/172733A1中公开和/或要求保护的Ab5.5的免疫原性。本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物在人类中可具有比WO 2017/172733 A1中公开和/或要求保护的Ab5.5低任何合适程度的免疫原性。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可具有比WO2017/172733A1中公开和/或要求保护的Ab5.5的DRB1风险评分低至少约30％或40％的DRB1风险评分。在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物具有比WO 2017/172733 A1中公开和/或要求保护的Ab5.5的DRB1风险评分低至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的DRB1风险评分。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可具有任何合适的DRB1风险评分。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可具有约500至约700范围内的DRB1风险评分。在一些实施方案中，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物具有约500、550、600、650、700或其任何子范围的DRB1风险评分。
本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可以对Ryk多肽具有任何合适的结合亲和力或强度。例如，本发明的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物可具有结合Ryk多肽的在约0.01pM至约500pM范围内的KD值，例如，约0.01pM、0.1pM、1pM、10pM、20pM、30pM、40pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM或其任何子范围内的KD值。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种免疫偶联物，其包含连接到检测剂和/或治疗剂的上述分离的抗体或抗体衍生物。本发明的免疫偶联物可包含任何合适的检测剂或治疗剂。例如，所述检测剂或治疗剂可以是细胞毒素或放射性同位素。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种双特异性分子，其包含上述分离的抗体或抗体衍生物，其连接至具有与本发明的分离的抗体或抗体衍生物不同的结合特异性的第二功能部分。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的上述抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物或上述双特异性分子，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在又一个方面或实施方案中，本发明提供编码上述分离的抗体或抗体衍生物或上述双特异性分子的核酸序列。
在又一个方面或实施方案中，本发明提供包含上述核酸序列的载体。所述载体可以是任何合适的形式。例如，所述载体可以是表达载体。
在一些实施方案中，编码抗Ryk抗体的重组核酸特别适用于在实际上充当抗Ryk抗体工厂的宿主细胞中表达。当通过标准技术从其他细胞成分或其他污染物(例如存在于细胞中的其他核酸或蛋白质)中纯化时，核酸被分离出来，标准技术包括碱/SDS处理、CsCl条带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他方法，参见例如F.Ausubel等人编.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York。在各种实施方案中，核酸是例如DNA或RNA，并且可以包含或不包含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。在各种实施方案中，重组核酸提供编码抗Ryk抗体的重组基因，其自宿主细胞基因组自主存在或作为宿主细胞基因组的一部分存在。
在一些实施方案中，重组基因包含编码蛋白质的核酸以及蛋白质表达的调控元件。通常，重组基因中存在的调控元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和可选存在的操纵子。启动子定义为指导RNA聚合酶结合DNA并启动RNA合成的DNA序列。也可存在抗体相关内含子。遗传密码的简并性使得除了两个氨基酸之外的所有氨基酸，不止一个密码子编码一个特定的氨基酸。这允许构建编码蛋白质的合成DNA，其中合成DNA的核苷酸序列与本文公开的核苷酸序列显著不同，但仍然编码此蛋白质。此类合成的DNA意欲包含在本发明的范围内。
在又一个方面或实施方案中，本发明提供包含上述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任何合适的形式。例如，宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞，例如人类宿主细胞。
在又一个方面或实施方案中，本发明提供转基因非人动物，例如转基因小鼠，其包含上述宿主细胞，其中该非人动物或小鼠表达由所述核酸编码的多肽。
本发明的抗体可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内，以及如果局部治疗需要，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下给药。此外，抗体可通过脉冲输注给药，尤其是使用剂量递减抗体。可以通过任何合适的途径给药，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于给药是短暂的还是长期的。
在一些实施方案中，术语“抗体”以其最广义使用以包括多克隆和单克隆抗体，以及此类抗体的抗原结合片段。抗体的部分特征在于它们特异性结合抗原，特别是抗原的一个或多个表位。在一些实施方案中，术语“特异性结合”或“特异性结合活性”等当用于指代抗体时是指抗体与特定表位的相互作用具有至少约1X10-6 M的解离常数，通常至少约1X10-7 M，通常至少约1X10-8 M，以及尤其至少约1X10-9 M或1X10-10 M或更少。因此，保留特异性结合活性的抗体的Fab、F(ab').sub.2、Fd和Fv片段包括在抗体的定义中。
在一些实施方案中，如本文所用的术语“抗体”包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括(例如)单链抗体、嵌合抗体、双功能抗体和人源化抗体及其抗原结合片段。这种非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生或者可以通过(例如)筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库来获得(参见Huse等人.Science 246:1275-1281,1989,其以引用方式并入本文)。这些和其他制备(例如)嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植抗体、单链抗体和双功能抗体的方法是众所周知的(Winter和Harris,Immunol.Today14:243-246,1993；Ward等人,Nature 341:544-546,1989；Harlow和Lane,Antibodies:Alaboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；Hilyard等人,Protein Engineering:A practical approach(IRL Press 1992)；Borrabeck,AntibodyEngineering,第2版.(Oxford University Press 1995)；其中的每一个均以引用方式并入本文)。此外，经修饰的或衍生化的抗体，或抗体的抗原结合片段，例如聚乙二醇化的(经聚乙二醇修饰的)抗体，可用于本发明的方法。
可以使用本领域熟知的多种方法测试抗体的抗靶多肽活性。多种技术可用于筛选以鉴定具有所需特异性的抗体，包括各种免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，包括直接和配体捕获ELISA、放射免疫测定(RIA)、免疫印迹和荧光激活细胞分选(FACS)。许多使用具有确定的特异性的多克隆或单克隆抗体的竞争性结合或免疫放射测定的方案是本领域众所周知的。此类免疫测定通常涉及测量靶多肽和特异性抗体之间的复合物形成。优选使用对靶多肽上的两个非干扰表位具有反应性的单克隆抗体的双位点、基于单克隆的免疫测定，但也可以采用诸如竞争性结合测定的其他测定。参见，例如，Maddox等人,1983,J.Exp.Med.158:1211。
在抗体的制备和施用中可以考虑本发明所使用的抗体的结合靶标的位置。当结合靶标是细胞内分子时，本发明的某些实施方案提供准备待引入结合靶标所在的细胞中的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明的抗体可以胞内抗体形式在胞内表达。如本文所用，术语“胞内抗体”是指在细胞内表达并能够选择性结合靶分子的抗体或其抗原结合部分，如Marasco,Gene Therapy 4:11-15,1997；Kontermann,Methods34:163-170,2004；美国专利第6,004,940号及第6,329,173号；美国专利申请公开第2003/0104402号及PCT公开第WO 03/077945号中所描述。通过将编码所需抗体或其抗原结合部分的核酸(缺乏通常与编码该抗体或抗原结合片段的基因相关的野生型前导序列和分泌信号)引入靶细胞来实现胞内抗体的细胞内表达。可以使用将核酸引入细胞的任何标准方法，包括但不限于显微注射、弹道注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体，及携带感兴趣的核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及牛痘载体的转染。
在另一个实施方案中，提供了内化抗体。抗体可具有增强抗体向细胞内递送的某些特性，或可被修饰以具有此类特性。实现这一点的技术在本领域中是已知的。例如，已知抗体的阳离子化促进其摄取到细胞中(参见例如美国专利第6,703,019号)。脂质转染或脂质体亦可用于将抗体递送至细胞中。在使用抗体片段的情况下，特异性结合靶蛋白结合域的最小抑制片段通常是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白序列能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术制备(参见例如，Marasco等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:7889-7893,1993)
可通过本领域已知的方法促进调节性多肽进入靶细胞。例如，某些序列，例如源自HIV Tat或触角足突变(Antennapedia)同源域蛋白的序列，能够指导异源蛋白跨细胞膜得到有效摄取(参加例如，Chen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4325-4329,1999)。
当结合靶位于脑中时，本发明的某些实施方案提供穿过血脑屏障的抗体或其抗原结合片段。某些神经性/神经退行性疾病与血脑屏障通透性增加有关，因此抗体或抗原结合片段可以很容易地引入脑中。当血脑屏障保持完整时，存在几种本领域已知的方法用于将分子转运穿过它，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法以及基于受体和通道的方法。
将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于完全规避血脑屏障，或通过在血脑屏障中产生开口。规避方法包括但不限于直接注射到大脑中(参见，例如，Papanastassiou等人，Gene Therapy 9:398-406,2002)、间质输注/对流增强递送(参见，例如，Bobo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:2076-2080,1994)，及在大脑中植入递送装置(参见例如Gill等人，Nature Med.9:589-595,2003；和Gliadel Wafers.TM.，Guildford Pharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声(参见例如美国公开号2002/0038086)、渗透压(例如通过施用高渗甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication ofthe Blood-Brain Barrier and its Manipulation,第1卷及第2卷,Plenum Press,N.Y.,1989))，通过例如缓激肽或透化剂A-7进行透化(参见例如美国专利第5,112,596号、第5,268,164号、第5,506,206号和第5,686,416号)，以及用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经元(参见例如，美国公开号2003/0083299)
将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于，将抗体或抗原结合片段封装在脂质体中，脂质体与抗体结合片段偶联，抗体结合片段结合血脑屏障血管内皮上的受体(参见例如，美国公开号2002/0025313)；以及将抗体或抗原结合片段包被在低密度脂蛋白颗粒中(参见例如，美国公开号2004/0204354)或载脂蛋白E中(参见例如，美国公开号2004/0131692)。
将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但不限于：使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的通透性(参见例如，美国公开号2002/0065259、2003/0162695及2005/0124533)；激活钾通道(参见例如，美国公开号2005/0089473)，抑制ABC药物转运蛋白(参见例如，美国公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体并调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见例如美国公开号2003/0129186)，以及使抗体阳离子化(参见例如美国专利第5,004,697号)。
本发明方法中使用的抗体组合物以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此情形下，考虑因素包括正在治疗的特定疾病、正在治疗的特定哺乳动物、受试者患者的临床状况、疾病的原因、药物的递送部位、给药方法、给药时间安排，以及医学从业者已知的其他因素。抗体无需(但可选地)与一种或多种目前用于预防或治疗有关的病症的药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的本发明抗体的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和给药途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和途径使用。
为了预防或治疗疾病，抗体的适当剂量(单独使用或与其他药物联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程，是否出于预防或治疗目的而施用抗体、既往治疗、患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判断。适当地一次性或在一系列治疗中向患者施用抗体。根据疾病的类型和严重程度，无论通过(例如)一次或多次单独给药或通过连续输注大约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体均可作为对患者给药的初始候选剂量。根据上述因素，一个典型的每日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更大的范围内。对于数天或更长时间的重复施用，根据病症，治疗通常会持续直到出现所需的疾病症状抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。这样的剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周(例如，使得患者接受约二至约二十剂抗体，或者例如，约六剂抗体)。可以给予初始较高负载剂量，然后给予一个或多个较低剂量。示例性给药方案包括施用约4mg/kg的初始负载剂量，随后施用约2mg/kg抗体的每周维持剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。
在一些实施方案中，不同的抗体区域通过参考IgG来说明，IgG含有四个氨基酸链——两条较长的重链和两条较短的轻链，它们通过二硫键相互连接。重链和轻链各包含一个恒定区和一个可变区。重链由重链可变区和重链恒定区组成。轻链系由轻链可变区和轻链恒定区组成。在各种实施方案中，可变区内有三个高变区，其负责抗原特异性。在各种实施方案中，高变区称为互补决定区(CDR)并且介于称为框架区(FW)的更保守的侧翼区之间。在各种实施方案中，重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
C.抗Ryk抗体和相关组合物的用途
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种干扰Wnt和Ryk相互作用的方法，包括使包含Wnt和Ryk的样品与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物或上述双特异性分子接触，从而干扰Wnt和Ryk的相互作用。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种用于抑制神经元退化的方法，该方法包括使神经元与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞接触，从而抑制神经元退化。
本方法可用于以任何合适的方式抑制神经元的退化。例如，可以抑制神经元轴突的退化。在另一个例子中，可以抑制神经元细胞体的退化。本发明方法可用于抑制任何合适类型的轴突的退化。例如，本发明方法可用于抑制脊髓连合轴突、上运动神经元轴突或中枢神经系统轴突的退化。
本方法可用于抑制任何合适类型的神经元的退化。例如，本发明方法可用于抑制受损脊髓神经元、感觉神经元、运动神经元、小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮层神经元、交感神经元或海马神经元的退化。在另一个实施例中，本发明方法可用于抑制形成神经移植体或神经移植物的一部分的神经元的退化。神经移植物或神经移植体可以是生物体或构成生物体的一部分。
本方法可用于以任何合适的方式抑制神经元的退化。例如，可以使神经元与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞离体或体外接触。
本方法可用于抑制任何合适生物体中神经元的退化。例如，本发明方法可用于抑制哺乳动物神经元的退化。在另一个实施例中，本发明方法可用于抑制人类神经元的退化。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种预防或治疗患有神经性疾病、病症或损伤的受试者或具有罹患神经性疾病、病症或损伤的风险的受试者的神经性疾病、病症或损伤的方法，其包含向受试者施用有效量的上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞，从而治疗受试者的神经性疾病、病症或损伤。
本发明的方法可用于预防或治疗受试者的任何合适神经性疾病、病症或损伤。例如，本发明的方法可用于预防或治疗神经退行性疾病或病症，例如肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)或帕金森病(Parkinson's disease)。在另一实施例中，本发明的方法可用于预防或治疗脊髓损伤、创伤性脑损伤或周围神经损伤。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种用于调节神经元定向生长的方法，其包含使神经元与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞接触，从而调节神经元的定向生长。
本发明的方法可用于调节任何合适神经元的定向生长。举例而言,本发明之方法可用于调节脊髓连合轴突、上运动神经元轴突、中枢神经系统轴突、周围神经系统轴突、受损的脊髓神经元、感觉神经元或运动神经元的定向生长。在一些实施例中，定向生长促进神经元的再生。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种有效量的上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞的用途，其用于制备用以治疗或预防患有神经性疾病、病症或损伤的受试者或具有罹患神经性疾病、病症或损伤的风险的受试者的神经性疾病、病症或损伤的药物。上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞可用于制备用以治疗或预防任何合适神经性疾病、病症或损伤的药物。例如，神经性疾病或病症可为神经退行性疾病或病症。
如本文所用，术语“神经元”包括神经元及其一或多个部分(例如，神经元细胞体、轴突或树突)。如本文所用的术语“神经元”表示神经系统细胞，其包括中央细胞体或胞体以及两种类型的延伸或投射：树突，一般来说，大部分神经元信号通过树突传递到细胞体；及轴突，一般来说，大部分神经元信号通过它们从细胞体传递到效应细胞，例如目标神经元或肌肉。神经元可以将信息从组织和器官传递到中枢神经系统(传入或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传递到效应细胞(传出或运动神经元)。其他神经元，称为中间神经元，连接中枢神经系统(大脑和脊柱)内的神经元。可进行根据本发明的治疗或方法的神经元类型的某些具体实例包括小脑颗粒神经元、背根神经节神经元和皮层神经元。
术语“神经元退化”的使用范围很广，是指神经元细胞的任何病理变化，包括但不限于神经元细胞的死亡或丢失、细胞死亡之前的任何变化，以及神经元细胞活动或功能的任何减少或丧失。病理变化可以是自发的或可以由任何事件诱导并且包括(例如)与细胞凋亡相关的病理变化。神经元可以是任何神经元，包括但不限于感觉神经元、交感神经元、副交感神经元或肠神经元，例如背根神经节神经元、运动神经元和中枢神经元，例如来自脊髓的神经元。神经元退化或细胞丢失是多种神经疾病或病症(例如神经退行性疾病或病症)的特征。在一些实施方案中，神经元是感觉神经元。在一些实施方案中，神经元是运动神经元。在一些实施方案中，神经元是受损的脊髓神经元。
在一些实施方案中，退化发生在神经元的一部分中，例如神经元细胞体、轴突或树突。因此，可以在神经元的一个或多个退化部分中抑制退化。在一些实施方案中，神经元轴突的退化受到抑制。在一些实施方案中，神经元细胞体的退化受到抑制。轴突可以是任何神经元的轴突。例如，在一些实施方案中，轴突是脊髓连合轴突，或上运动神经元轴突，或中枢神经系统轴突。
在一些实施方案中，轴突退化是许多神经和神经退行性疾病/病症以及外伤性损伤的普遍特征。研究表明，它可以独立于神经元细胞体死亡并在其死亡之前发生。然而，轴突退化和保护的分子和细胞机制仍不清楚。阐明在轴突病理学过程中被激活的退化途径或被灭活的保护途径将有助于开发保持轴突完整性和增强再生的特定治疗剂。
在神经系统的发育过程中，轴突对促进生长和抑制生长的细胞外信号作出反应。一些细胞外信号吸引轴突向更高浓度方向生长，而其他信号将轴突自较高浓度处驱离。调节这些相反轴突反应的信号通路对轴突的延伸和去除具有深远的影响，尽管它们在成熟轴突中的功能尚未得到很好的表征。研究表明，轴突导向分子可能在神经性/神经退行性疾病(例如肌萎缩性侧索硬化症(ALS))中发挥作用。
在一些实施方案中，本发明提供用于通过使神经元与试剂接触以调节神经细胞的生长从而抑制神经元退化的方法及组合物。在各种实施方案中，试剂可以是特异性结合影响Wnt信号通路的Wnt结合结构域的抗Ryk单克隆抗体或抗体片段。这些方法和组合物可用于神经生长和再生有益的多种治疗情况中。例如，影响Wnt信号通路的抗Ryk抗体或抗体片段可用于刺激受损神经元沿SCI患者A-P轴的轴突生长。因为还观察到Wnt在大脑的几个区域中表达，并且Wnt信号通路的成分也存在于其他中枢神经系统神经元的轴突中，有可能本文所述的抗Ryk抗体或抗体片段可用于调节中枢神经系统中轴突的生长和定向引导。
在一些实施方案中，与对照神经元群相比，本文所述的方法导致神经元群体的退化或者神经元群体中神经元的轴突或细胞体或树突的退化减少至少10％(例如，至少减少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至100％)。在一些实施方案中，与未施用本文所述的一种或多种药剂的受试者中退化的神经元(或其神经元体、轴突或树突)数量相比，本文所述的方法导致受试者中退化的神经元(或其神经元体、轴突或树突)数量减少至少10％(例如，至少减少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)。在一些实施方案中，本文所述的方法导致神经性/神经退行性疾病或病症和/或病况的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9种)症状减少至少10％(例如，至少减少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至100％)。在一些实施方案中，本文所述的方法导致发生神经性/神经退行性疾病或病症和/或病况的可能性降低至少10％(例如，至少减少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)。
抑制神经元退化的方法包括体外、体内和/或离体方法。在一些实施方案中，该方法在体内实施，即，将抑制神经元退化的药剂施用于受试者。在一些实施方案中，该方法离体实施，即，待治疗的神经元形成受试者中的神经移植体或神经移植物的部分。在一些实施例方案中，该方法在体外实施。
在一些实施方案中，抑制神经元退化的方法可用于抑制或预防新诊断为患有神经性/神经退行性疾病或病症或有发展成新的神经性/神经退行性疾病或病症的风险的患者的神经元退化。另一方面，抑制神经元退化的方法也可用于抑制或预防已经患有神经性/神经退行性疾病或病症或具有其症状的患者的进一步神经元退化。预防神经元退化包括减少或抑制神经元退化，其特征可以是完全或部分抑制神经元退化。这可以通过例如神经功能分析来评估。
在一些实施方案中，本文所述的抗Ryk抗体或抗体片段可用于抑制神经元(例如轴突)退化的方法中。因此，这些抗体或抗体片段可用于(例如)以下治疗中：(i)神经系统的病症(例如，神经性/神经退行性疾病或病症)，(ii)继发于在神经系统外具有主要影响的疾病、病况或治疗的神经系统病况，(iii)由物理、机械或化学创伤所导致的神经系统损伤，(iv)疼痛，(v)与眼部相关的神经退化，(vi)记忆损失，及(vii)精神病症。下面提供了这些疾病、病症和损伤中的一些的非限制性示例。
根据本发明的预防或治疗的神经性/神经退行性疾病和病症的实例包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝尔氏麻痹症(Bell’s Palsy)、重症肌无力、肌肉萎缩症、进行性肌肉萎缩症、原发性侧索硬化症(PLS)、假性延髓麻痹、进行性延髓麻痹、脊髓性肌萎缩症、进行性延髓麻痹、遗传性肌肉萎缩症、无脊椎动物椎间盘综合征(例如，突出、破裂和脱垂的椎间盘综合征)、颈椎病、神经丛疾病、胸廓出口破坏综合征、周围神经病变、呲各紫质沉着症(prophyria)、轻度认知障碍、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、帕金森病、帕金森综合症(Parkinson's-plus diseases)(例如，多系统萎缩、进行性核上性麻痹和质基底节变性(corticobasaldegeneration))、路易体痴呆(dementia with Lewybodies)、额颞叶痴呆(frontotemporal dementia)、脱髓鞘疾病(例如，格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)和多发性硬化症)、腓骨肌萎缩症(CMT；也称为遗传性运动和感觉神经病(HMSN)、遗传性感觉运动神经病(HSMN)和腓骨肌萎缩症)、朊病毒病(例如，克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、格斯特曼–斯特劳斯勒–申克综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome(GSS))、致死性家族性失眠症(FFI)、牛海绵状脑病(BSE，俗称疯牛病)、匹克氏病(Pick's disease)、癫痫和AIDS痴呆综合症(也称为HIV痴呆、HIV脑病和HIV相关痴呆)。
在一些实施方案中，本发明的方法还可用于预防和治疗眼部相关神经退化和相关疾病和病症，例如青光眼、晶状体营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、与湿性或干性AMD相关的光感受器退化、其他视网膜退化、视神经玻璃膜疣、视神经病变和视神经炎。可以根据本发明预防或治疗的不同类型的青光眼的非限制性实例包括原发性青光眼(也称为原发性开角型青光眼、慢性开角型青光眼、慢性单纯性青光眼和单纯性青光眼)、低眼压性青光眼、原发性闭角型青光眼(也称为原发性闭角型青光眼、窄角型青光眼、瞳孔阻滞性青光眼和急性充血性青光眼)、急性闭角型青光眼、慢性闭角型青光眼、间歇性闭角型青光眼、慢性开角型/闭角型青光眼、色素性青光眼、剥脱性青光眼(也称为假性剥脱性青光眼或囊性青光眼)、发育性青光眼(例如，原发性先天性青光眼和婴儿型青光眼)、继发性青光眼(例如，炎性青光眼(例如，葡萄膜炎和Fuchs异色性虹膜睫状体炎))、晶状体源性青光眼(例如，伴有成熟白内障的闭角型青光眼、继发于晶状体囊破裂的晶状体过敏性青光眼、由于晶状体毒性网状物阻塞导致的晶状体溶解性青光眼和晶状体半脱位)、继发于眼内出血的青光眼(例如，前房积血和溶血性青光眼，也称为红细胞青光眼)、创伤性青光眼(例如，房角后退性青光眼、前房角外伤性后退、术后青光眼、无晶状体瞳孔阻滞和睫状体阻滞性青光眼)、新生血管性青光眼、药物诱发的青光眼(例如，皮质类固醇诱发的青光眼和α-胰凝乳蛋白酶青光眼)、中毒性青光眼，以及与眼内肿瘤、视网膜脱离、眼睛严重化学灼伤和虹膜萎缩相关的青光眼。
在神经系统之外具有主要影响的某些疾病和病症可导致神经系统损伤，其可根据本发明的方法进行治疗。此类病症的实例包括由以下原因引起的周围神经病变和神经痛：例如，糖尿病、癌症、艾滋病、肝炎、肾功能障碍、科罗拉多蜱热(Colorado tick fever)、白喉、HIV感染、麻风病、莱姆病、结节性多动脉炎、类风湿性关节炎、结节病、干燥综合征、梅毒、系统性红斑狼疮和淀粉样变性。
此外，本发明的方法可用于治疗诸如周边神经病变的神经损伤，其是由于接触有毒化合物引起的，包括重金属(例如铅、砷及汞)及工业溶剂；以及药物，包括化疗药物(例如长春新碱和顺铂)、氨苯砜、HIV药物(例如齐多夫定(Zidovudine)、地达诺新(Didanosine)、司他夫定(Stavudine)、扎西他滨(Zalcitabine)、利托那韦(Ritonavir)及安普那韦(Amprenavir))、降胆固醇药物(例如(Lovastatin)、吲达帕胺(Indapamid)及吉非洛齐(Gemfibrozil))、心脏或血压药物(例如，胺碘酮、肼苯哒嗪、哌可昔林(Perhexiline))和甲硝哒唑。
本发明的方法也可用于治疗由物理、机械或化学创伤引起的神经系统损伤。因此，该方法可用于治疗由物理损伤(与例如烧伤、创伤、手术和事故相关)、局部缺血、长时间暴露于低温(例如冻伤)造成的周边神经损伤，以及因例如中风或颅内出血(如脑出血)引起的中枢神经系统损伤。
此外，本发明的方法可用于预防或治疗记忆丧失，例如与年龄有关的记忆丧失。可受损失影响且因此根据本发明治疗的记忆类型包括情景记忆、语义记忆、短期记忆和长期记忆。可以根据本发明治疗的与记忆丧失相关的疾病和病症的实例，包括轻度认知障碍、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、化疗、压力症、中风和创伤性脑损伤(例如脑震荡)。
此外，本发明的方法可用于预防或治疗神经性疼痛。本发明方法可用于预防或治疗任何合适类型的神经性疼痛。例如，本方法可用于预防或治疗由体感系统的病变或疾病引起的神经性疼痛。在另一个实例中，本发明方法可用于预防或治疗外周神经性疼痛、中枢神经性疼痛或混合性(外周和中枢)神经性疼痛。所述分离的抗体或抗体衍生物、免疫偶联物、双特异性分子、药物组合物、核酸序列、载体或宿主细胞可以通过任何合适的途径施用于受试者。例如，分离的抗体或抗体衍生物、免疫偶联物、双特异性分子、药物组合物、核酸序列、载体或宿主细胞可以通过鞘内给药或输注给药施用于受试者。
在一些实施例中，神经性疼痛是由体感系统的病变或疾病引起的疼痛，估计影响7-10％全球总人口1,2。Wnt信号可以在神经性疼痛的啮齿动物模型中增加3，阻断Wnt信号目前被认为是神经性疼痛的潜在治疗策略4。多项体内研究支持的一种治疗神经性疼痛的策略是靶向Wnt共受体Ryk。
在一个实例中，在大鼠中，坐骨神经的慢性压迫性损伤导致受损感觉神经元中Ryk、Wnt3a和Wnt5a的快速增加5。坐骨神经损伤后鞘内输注抗Ryk功能阻断抗体可显著减少通过评估机械异常性疼痛和热痛觉过敏确定的神经性疼痛5。
在另一个例实例中，在大鼠中，大鼠L5脊神经的脊神经结扎导致损伤后背根神经节神经元中的Ryk和Wnt1 mRNA和蛋白水平增加6。脊神经结扎后鞘内输注抗Ryk抗体可显著减少通过机械异常性疼痛评估的神经性疼痛，但不会影响该模型中的热痛觉过敏6。
在另一个实例中，在小鼠中，脊髓中的Wnt5a水平在神经性、炎症性和癌症疼痛的模型(分别为幸免神经损伤、完全弗洛伊德佐剂注射(Complete Freud's Adjuvantinjection)和LL2细胞注射)中得到提高7。鞘内注射Wnt5a导致快速机械超敏反应，其在注射后24小时恢复到控制水平7。鞘内注射抗Ryk的siRNA降低脊髓中的Ryk mRNA水平，并显著降低由Wnt5a注射、幸免神经损伤和完全弗洛伊德佐剂注射引起的机械超敏反应7。
本发明的方法也可用于治疗精神疾病、包括(例如)精神分裂症、妄想症、分裂情感障碍、类精神分裂症精神病、共享性精神病、精神病、偏执型人格障碍、分裂样人格障碍、边缘型人格障碍、反社会人格障碍、自恋型人格障碍、强迫症、谵妄、痴呆、情绪障碍、双相情感障碍、抑郁症、应激障碍、恐慌症、广场恐惧症、社交恐惧症、创伤后应激障碍、焦虑症和冲动控制障碍(例如盗窃癖、病态性赌博、纵火癖和拔毛癖)。
除了上述体内方法外，本发明的方法还可用于离体治疗神经，其可在神经移植体或神经移植物的情形下具有帮助。因此,本文所提供之化合物可用作用于体外培养神经细胞的培养基的组分。
本文所述的抗体或抗体片段可视情况相互组合或协同施用，或者与已知可用于治疗相关疾病或病症的其他药剂组合或协同施用。因此，例如，在ALS的治疗中，化合物可以与利鲁唑(Riluzole/Rilutek)、米诺环素、胰岛素样生长因子1(IGF-I)和/或甲基钴胺素联合给药。在另一个例子中，在帕金森病的治疗中，抑制剂可以与左旋多巴(L-dopa)、多巴胺激动剂(例如溴隐亭(bromocriptine)、培高利特(pergolide)、普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、卡麦角林(cabergoline)、阿扑吗啡(apomorphine)和麦角乙脲(lisuride))、多巴脱羧酶抑制剂(例如左旋多巴(levodopa)、苄丝肼(benserazide)和卡比多巴(carbidopa))和/或MAO-B抑制剂(例如司来吉兰(selegiline)和雷沙吉兰(rasagiline))一起给药。在另一个例子中，在阿尔茨海默病的治疗中，抑制剂可以与乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)和利斯的明(rivastigmine))和/或NMDA受体拮抗剂(例如美金刚(memantine))一起给药。组合疗法可涉及通过相同或不同途径同时或顺序施用，如本领域技术人员确定为合适的。本发明还包括药物组合物和包括本文所述的组合的试剂盒。
在一些实施方案中，在本发明的上下文中，术语“接触(contact/contacting)”被定义为表示将化合物带入其可以介导、调节或抑制神经元生长的位置的任何方式。
“接触”可包括将可扩散或不可扩散的物质注射到神经元或邻近神经元的区域中。“接触”可包含以某种方式将编码化合物的核酸置于神经元或非神经元细胞中或靠近神经元或非神经元处，其方式使得核酸以其可以作用于神经元的方式表达以制造化合物。遵循本说明书的教导，本领域技术人员将能够以任何方式使神经元与物质接触。
在某些实施方案中，调节神经元生长的方法可以是刺激神经元生长的方法、使受损神经元再生的方法或引导神经元沿前-后轴生长的方法。在其他实施方案中，用于调节神经元生长的方法被进一步定义为用于在脊髓与脑部之间的神经元的定向轴突生长的方法。
在某些实施方案中，使神经元与特异性结合影响Wnt信号通路的Wnt结合结构域的抗Ryk单克隆抗体或抗体片段接触，并且可以进一步涉及将神经元暴露于梯度的抗Ryk单克隆抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段特异性结合影响Wnt信号通路的Wnt的结合结构域。该梯度可存在于脊髓中，诸如脊髓内的递减前-后梯度。在其他实施例中，将神经元暴露于梯度涉及刺激神经元沿前-后轴的定向轴突生长。本发明考虑轴突生长的任何方向。在某些实施方案中，轴突生长从脊髓定向到大脑，例如神经元在上行体感通路中的生长。在其他实施方案中，轴突生长从大脑定向到脊髓，例如神经元在下行运动通路或其他调节通路中的生长。在进一步的实施方案中，轴突生长被引导沿着脊髓丘脑通路。
本发明还包括调节受试者神经元生长的方法，包括：(a)提供一种组合物，其包含特异性结合影响Wnt信号通路的Wnt结合结构域的抗Ryk抗体或抗体片段；和适合递送给受试者的药物制剂；(b)将组合物施用于受试者。如上所述，本发明的调节神经元生长的方法考虑通过任何已知方式测量神经元生长。例如，调节神经元生长的方法可以定义为促进受试者神经元生长和再生的方法，促进受试者轴突生长和再生的方法，或促进受试者的定向轴突生长的方法。定向轴突生长可能沿着前-后轴，例如从脊髓到大脑，或从大脑到脊髓。
在另一个方面或实施例中，本发明提供一种预防或治疗患有癌症或肿瘤的受试者或具有罹患癌症或肿瘤的风险的受试者的癌症或肿瘤的方法，其包含向受试者施用有效量的上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述药物组合物、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞，从而预防或治疗受试者的癌症或肿瘤。
本发明的方法可用于预防或治疗任何合适的癌症或肿瘤。例如，本发明的方法可用于预防或治疗由受试者中Ryk和/或Wnt5a的过表达引起或与之相关的癌症或肿瘤。
在另一实例中，本发明的方法可用于预防或治疗神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM)、淋巴瘤、白血病、脑癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、胆管癌(胆管癌症)、肝癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、食道癌、头颈癌、胸腺癌、胃癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌或非典型畸胎样横纹肌样瘤。在一些实施例中，本发明方法可用于预防或治疗低级别神经胶质瘤。在一些实施方案中，本发明方法可用于预防或治疗T细胞和B细胞急性淋巴细胞白血病或急性髓性白血病。在一些实施方案中，本发明方法可用于预防或治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)。在一些实施方案中，本发明方法可用于预防或治疗胸腺瘤(THYM)。
在一些实施方案中，本发明方法可用于治疗受试者的癌症或肿瘤。在一些实施方案中，本发明方法可用于预防受试者的癌症或肿瘤。
本发明的方法可用于预防或治疗任何合适受试者的癌症或肿瘤。例如，本发明的方法可用于预防或治疗哺乳动物或人类的癌症或肿瘤。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供一种有效量的上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物、上述双特异性分子、上述核酸、上述载体或上述宿主细胞的用途，其用于制备用于预防或治疗患有癌症或肿瘤的受试者或具有罹患癌症或肿瘤的风险的受试者的癌症或肿瘤的药物。
在一些实施方案中并且不希望受任何特定机制或理论的束缚，重要发育信号通路的失调经常导致癌症的形成和进展。对胚胎发育和成人组织稳态至关重要的Wnt信号是这方面的一个主要例子。不受控制的Wnt信号与许多肿瘤高度相关，并可能导致癌症的耐药性和复发。受体样酪氨酸激酶或受体相关酪氨酸激酶(Ryk)是Wnt结合受体酪氨酸激酶(RTK)之一，似乎主要通过非经典Wnt通路发出信号。Ryk通过调节细胞骨架来控制基本的细胞进程(例如细胞极性)和运动。由于癌症的发展与胚胎发育有许多相似之处，因此有理由怀疑Wnt/Ryk信号失调在癌症的发病机制中起着潜在的作用，特别是在Ryk对发育很重要的组织中。
事实上，在神经胶质瘤中发现Ryk和Wnt5a的过度表达1，神经胶质瘤是一种发生在大脑和脊髓中的肿瘤，它们的表达水平与神经胶质瘤组织的组织学分级相关1。体外敲低和过表达实验表明，Ryk对神经胶质瘤细胞的迁移、侵袭和非贴壁依赖性生长至关重要1,2。此外，据报道，Wnt5a/Ryk信号可促进黑色素瘤细胞对靶向BRAF抑制的抗性3。Ryk的高表达也见于T细胞和B细胞急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病4。参见下面的参考资料：
参考文献：
(1)Habu,M.；Koyama,H.；Kishida,M.；Kamino,M.；Iijima,M.；Fuchigami,T.；Tokimura,H.；Ueda,M.；Tokudome,M.；Koriyama,C.；et al.Ryk Is Essential for Wnt-5a-Dependent Invasiveness in Human Glioma.J.Biochem.(Tokyo)2014,156(1),29–38.https://doi.org/10.1093/jb/mvu015.
(2)Adamo,A.；Fiore,D.；De Martino,F.；Roscigno,G.；Affinito,A.；Donnarumma,E.；Puoti,I.；Vitiani,L.R.；Pallini,R.；Quintavalle,C.；et al.RYKPromotes the Stemness of Glioblastoma Cells via the WNT/β-CateninPathway.Oncotarget2017,8(8).https://doi.org/10.18632/oncotarget.14564.
(3)Anastas,J.N.；Kulikauskas,R.M.；Tamir,T.；Rizos,H.；Long,G.V.；von Euw,E.M.；Yang,P.-T.；Chen,H.-W.；Haydu,L.；Toroni,R.A.；et al.WNT5A EnhancesResistance of Melanoma Cells to Targeted BRAF Inhibitors.J.Clin.Invest.2014,124(7),2877–2890.https://doi.org/10.1172/JCI70156.
(4)Alvarez-Zavala,M.；Riveros-A.R.；García-Castro,B.；Barrera-Chairez,E.；Rubio-Jurado,B.；Garcés-Ruíz,O.M.；Ramos-Solano,M.；Aguilar-Lemarroy,A.；Jave-Suarez,L.F.WNT Receptors Profile Expression in Mature Blood Cells andImmature Leukemic Cells:RYK Emerges as a Hallmark Receptor of AcuteLeukemia.Eur.J.Haematol.2016,97(2),155–165.https://doi.org/10.1111/ejh.12698.
如本文所述，所公开的方法可以在体内进行，例如在神经退行性疾病、神经性病症或神经系统损伤的治疗中。这些方法也可以在体外或体外进行，例如在神经元功能的实验室研究中和在神经移植体或移植物的治疗中。因此，在一些实施例中，神经元形成神经移植体或神经移植物的一部分。在一些实施例中，神经元是离体或体外的。在一些实施方案中，神经移植体或神经移植物形成生物体、人或非人(例如，哺乳动物、灵长类动物、大鼠、小鼠、兔、牛、狗、猫、猪等)的一部分。
在另一个方面或实施方案中，本发明提供了包含本发明的抗体或抗体片段的组合物，其可通过将抗体或免疫原性肽片段与生理上可接受的载体或赋形剂混合来制备用于施用于受试者。此类载体在所用剂量和浓度下对接受者无毒。通常，此类组合物的制备需要将特定抗体与盐水、缓冲液、抗氧化剂(如抗坏血酸)、低分子量(少于约10个残基)多肽、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖或葡聚糖)或螯合剂(如EDTA)、谷胱甘肽和其他稳定剂和赋形剂组合。这样的组合物可以是悬浮液、乳液或冻干形式，并且在使得它们被适当地制备和批准用于所需应用的条件下配制。
生理上可接受的载体或赋形剂可以是任何材料，当与本发明的免疫原性肽或多核苷酸组合时，允许该成分保留生物活性并且不会以非所需方式扰乱与受试者的免疫系统的反应。例子包括但不限于任何标准的生理学上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(例如油/水乳剂)，以及各种类型的润湿剂。用于雾剂或肠胃外给药的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理盐水(0.9％)。包含此类载体的组合物通过众所周知的常规方法配制(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第43章,第14版,Mack PublishingCo.,Easton Pa.18042,USA)。
通常将肽或编码的多核苷酸配制为组合物向受试者给药。因此，本发明提供了一种组合物，除了本发明的肽或多核苷酸外，该组合物通常还含有载体，可方便地将肽或多核苷酸配制成该载体以供给药。例如，载体可以是水溶液(如生理缓冲盐水)或其他溶剂或载体(如乙二醇、丙三醇)、油(如橄榄油)或可注射的有机酯。载体还可以包括生理上可接受的化合物，其(例如)起到稳定肽或编码的多核苷酸或增加其吸收的作用。生理学上可接受的化合物包括例如碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。类似地，为了实施本发明的方法而在培养物中已处理的细胞(例如，滑液单核细胞、树突细胞等)，也可以在要向受试者施用细胞时配制在组合物中。
熟练的临床医生将认识到，载体或赋形剂(包括生理上可接受的化合物)的选择取决于例如肽或编码的多核苷酸的给药方式以及组合物的给药途径。当组合物在免疫条件下施用时，即作为疫苗，它通常通过肌肉内、皮内或皮下施用，但也可以肠胃外施用，例如静脉内施用，并且可以通过注射、插管或本领域中已知的其他此类方法施用。当所需的免疫系统调节是耐受时，组合物优选口服给药，或可以如上所述地给药。
可用于配制施用于受试者的药剂的药学上可接受的载体是本领域熟知的，包括例如水溶液(如水或生理缓冲盐水)或其他溶剂或载体(如乙二醇、丙三醇)、油(如橄榄油)或可注射的有机酯。药学上可接受的载体可以包含生理学上可接受的化合物，其用于(例如)稳定或增加偶联物的吸收。这样的生理上可接受的化合物包括(例如)碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。本领域技术人员知晓，包括生理学上可接受的化合物的药学上可接受的载体的选择取决于(例如)治疗剂的物理化学特性和组合物的给药途径，给药途径可以是(例如)口服、鼻内或本领域已知的任何其他此类方法。药物组合物还可以含有第二种(或多种)化合物，例如诊断试剂、营养物质、毒素或治疗剂，例如癌症化疗剂和/或维生素。
在实践本发明的方法中要施用的化合物或组合物(例如抗Ryk抗体)的总量可以作为单一剂量，作为丸剂或通过输注在相对较短的时间内来施用给受试者，或者可以使用分次治疗方案进行给药，其中在较长时间段内给药多次剂量。本领域技术人员知晓，用于治疗受试者失血的血浆扩容剂的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康状况以及给药途径和待给药的治疗次数。考虑到这些因素，本领域技术人员将根据需要调整具体剂量。一般而言，药物组合物的配方以及给药途径和频率最初是使用I期和II期临床试验来确定的。
D.用于评估样品中Ryk多肽的方法
在又一个方面或实施例中，本发明提供了一种用于分析样品中的Ryk多肽的方法，该方法包括：a)使含有或疑似含有Ryk多肽的样品与上述分离的抗体或抗体衍生物、上述免疫偶联物或上述双特异性分子接触；和b)分析Ryk多肽(如果存在于样品中)与分离的抗体或抗体衍生物、免疫偶联物或双特异性分子之间的结合以分析样品中Ryk多肽的存在、不存在、水平或量。
本发明方法可用于分析任何合适样品中的Ryk多肽。例如，本发明方法可用于分析液体、半液体或固体样品中的Ryk多肽。在另一个例子中，本发明方法可用于分析生物样品中的Ryk多肽。在一些实施例中，生物样品是血液或尿液样品。在一些实施例中，血液样品是血清、血浆或全血样品。在一些实施方案中，样品是临床样品，例如组织活检样品。
本发明方法可用于分析任何合适的Ryk多肽。例如，本发明方法可用于分析样品中的天然Ryk多肽、蛋白质或其片段。
本发明方法可以以任何合适的方式或形式进行。在一些实施方案中，Ryk多肽与上述分离的抗体或抗体衍生物接触。在一些实施方案中，Ryk多肽与上述免疫偶联物接触。在一些实施方案中，Ryk多肽与上述双特异性分子接触。在一些实施方案中，Ryk多肽(如果存在于样品中)与分离的抗体或抗体衍生物、免疫偶联物或双特异性分子之间的结合通过选自由以下组成的组的形式分析：酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、乳胶凝集、间接血凝试验(IHA)、补体固定、间接免疫荧光测定(IFA)、比浊法、流式细胞术测定、表面等离子共振(SPR)、化学发光测定、横向流动免疫测定、u-捕获测定、抑制测定和亲和力测定。
在一些实施方案中，本发明方法用于分析样品中Ryk多肽的存在或不存在。在一些实施方案中，本发明方法用于分析样品中Ryk多肽的水平或量。
本发明方法可用于分析任何合适样品中的Ryk多肽。例如，样品可以分离自或来源于受试者。受试者可以是哺乳动物或人。
本发明方法可用于任何合适的目的。例如，本发明方法可用于与受试者中Ryk多肽的异常水平或量相关的疾病、病症或损伤的诊断、预后、分层、风险评估或治疗监测。可以将分析的Ryk多肽水平或量与阈值或范围进行比较，以分析受试者中Ryk多肽的水平或量是正常还是异常。可以使用任何合适的阈值或范围进行比较。例如，阈值或范围可获自或衍生自患有所述疾病、病症或损伤的受试者或受试者群体，未患有所述疾病、病症或损伤的受试者或受试者群体，或因所述疾病、病症或损伤接受治疗、经治愈或自其恢复的受试者或受试者群体。
在一些实施方案中，本发明方法用于诊断、预后、分层、风险评估或治疗监测与对象中异常低水平或量的Ryk多肽相关的疾病、病症或损伤。在一些实施方案中，本发明方法用于诊断、预后、分层、风险评估或治疗监测与对象中异常高水平或量的Ryk多肽相关的疾病、病症或损伤。在一些实施方案中，本发明方法用于神经元退化、神经疾病、病症或损伤、肿瘤或癌症的诊断、预后、分层、风险评估或治疗监测。
本发明方法还可包括治疗受试者的疾病、病症或损伤。在一些实施方案中，治疗包括调节或调整受试者中Ryk多肽的水平或量。
E.实施例
实施例1.Ab5.5的人源化和去免疫化
概述
WO 2017/172733 A1中公开的抗体Ab5.5使用EpibaseTM及在计算机模拟工具进行人源化和去免疫化。用于嫁接互补决定区(CDR)的首选受体框架选自一组人类种系，并使用Lonza Biologics分子建模平台构建了抗体Fv区的结构模型。CDR移植是通过替换亲代框架和受体框架之间的任何错配残基来完成的。对潜在关键位置(例如Vernier区、VH/VL链间界面或决定CDR规范类别的位置)的替换进行了前瞻性回复突变分析。对序列进行Ab5.5针对全局集中85个HLA II类同种异型的EpibaseTMv.4.0免疫分析。评估预测的表位用于去免疫取代，这将被认为有效降低潜在的免疫原性。
总共向VersaPeutics推荐了15个人源化/去免疫化变异序列以进行进一步表征。
人源化和去免疫化简介
通过CDR移植进行人源化是一种经过验证的成功技术，可以采用源自鼠类、其他异种物种或杂交瘤的抗体，并降低潜在的免疫原性，同时保留亲代抗体的结合和功能活性。通常从嵌合抗体开始，目的是去除可变结构域中可引起免疫反应的外来框架区(FR)(Bruggemann等人，1987年)。该问题的解决方案是将鼠抗体的CDR“移植”到人类受体框架上(Jones等人，1986年)。
然而，单独的CDR移植会导致结合亲和力的显著降低或完全丧失，因为Vernier区中的一组支持框架残基对于维持CDR的构象很重要(Foote和Winters 1992)。这个问题可以通过将鼠类残基重新引入人类框架来解决(Queen等人.1989)；这种替换通常称为回复突变。
大多数治疗性蛋白质在不同程度上具有免疫原性(Van Walle等人.2007年，Stas等人.2009年)，甚至所谓的全人抗体疗法也可能包含免疫原性区域(Harding等人.2010年)。免疫原性是诱发Th(T辅助子)反应的能力，当独特的T细胞受体识别出与抗原呈递细胞上显示的HLA II类分子结合的肽时，就会触发这种反应。这些肽是由抗原呈递细胞内化的蛋白质产生的，其随后通过内体裂解途径进行加工。只有对HLA II类分子具有足够亲和力的肽才会出现在细胞表面，并可能触发Th反应。
因此，可以通过去除Th表位来降低免疫原性潜力，这一过程称为去免疫化(Chamberlain 2002，Baker和Jones 2007)。这是通过预测治疗性蛋白质中的哪些肽可以与HLA II类分子结合，并随后引入取代来实现的，所述取代消除或降低肽对HLA II类分子的结合亲和力。
存在几种HLA II类基因，且几乎所有基因都具有高度多态性。此外，HLA II类分子由α和β链组成，每条链都源自不同的基因，其固有的多态性进一步增加了变异。具体来说，每个个体都表达以下基因：DRA/DRB、DQA/DQB和DPA/DPB。其中只有DRA是非多态的。此外，还可能存在“第二”DRB基因(DRB3、DRB4或DRB5)，其产物也与DRA链相关。
去免疫过程中的重点是DR异型，已知其表达水平高于DQ和DP(Laupeze等人1999年，Gansbacher和Zier 1988年，Berdoz等人1987年，Stunz等人1989年)。DR异型通常指DRB基因，因为DRA基因保持不变，例如DRB1*01:01，其中数字是等位基因特异性的。
对单个表位严重性的评估基于混杂标准，例如特定表位结合的HLA异型的数量，以及异型在群体中的重要性(频率)和HLA:肽复合物结合强度的定性分析。由于个体的T细胞群已被选择为不识别“自身肽”，因此可以针对与通常不应诱导Th反应的(已知)自身肽相对应的肽筛选经去免疫化的蛋白质。虽然尚不清楚哪些内源性蛋白质在T细胞成熟过程中被内化并因此产生自身肽，但其中包括抗体(Kirschmann等人1995年，Verreck等人1996年，Harding等人2010年)。
由于治疗性抗体最重要的特性是活性，因此在人源化和去免疫过程中提出的取代不影响抗体的亲和力或稳定性是很重要的。在过去20年中收集了大量关于以下的信息：CDR人源化和移植(Jones等人1986年，Foote和Winters 1992年)、抗体的生物物理特性(Ewert等人2003年)、CDR环(CDR-loops)的构象(Chothia和Lesk 1987,Al-Lazikani等人.1997,North等人.2011)和框架(Vargas-Madrazo和Paz-García 2003,Honegger等人.2009)，随着蛋白质建模的进步(Desmet等人.2002年，Almagro等人.2011年)，可以准确地对抗体进行人源化和去免疫化，同时保留结合亲和力和稳定性。
序列分析
Ab5.5的结构域内含物分析表明它是鼠IgG抗体。根据几个常用的定义(Kabat和Wu1991，Chothia和Lesk 1987，Al-Lazikani等人1997更新，Honegger和Plückthun 2001中)，一起确定了可变域边界以及互补决定区(CDR)的边界。更新的Chothia CDR定义(Al-Lazikani等人，1997年)将在整个报告中用作参考。因为在CDR H2定义中包括了重链Chothia位置H:57和H:58，该定义不同于最初的Chothia和Lesk1987出版物。除非另有说明，位置编号是顺序编号，在这种情况下，将使用Chothia1987编号。分离Ab5.5的可变域并用Chothia CDR定义进行注释，如图1和图2所示。
最佳受体框架选择
生成了将Ab5.5可变结构域与人类种系进行比较的序列比对。基于整体序列一致性、匹配的界面位置和类似分类的CDR规范位置，鉴定了每条轻链和重链的种系家族，其中包含最有希望的受体框架、轻链的VK1和重链的VH3。Ab5.5被发现与轻链种系VK1-L1和重链VH3-3-07最相容。在附录10.1中可以找到可变域与每个家族中10个最相似基因和最相似J区段的比对。
将J区段基因与FR4上的亲代序列进行比较，并分别为轻链和重链选择J区段JK4和JH4。亲代序列与受体框架的比对在下面的图3和图4中给出。
工程化链
进行了亲代重链和轻链序列的计算机模拟人源化、去免疫化和蛋白质工程化。总共设计了三(3)条人源化/去免疫化轻链和五(5)条人源化/去免疫化重链(见下表1)。
表1
工程化链序列
工程化链的序列显示在下方，CDR位置以灰色突出显示。
人源化和去免疫化轻链序列
>Ab5.5_VL(SEQ ID NO:9)
>Ab5.5_VL_1(SEQ ID NO:11)
>Ab5.5_VL_2(SEQ ID NO:12)
>Ab5.5VL3(SEQ ID NO:13)
人源化和去免疫化重链序列
>Ab5.5_VH(SEQ ID NO:10)
>Ab5.5_VH_1(SEQ ID NO:14)
>Ab5.5VH2(SEQ ID NO:15)
>Ab5.5_VH_3(SEQ ID NO:16)
>Ab5.5_VH_4(SEQ ID NO:17)
>Ab5.5_VH_5(SEQ ID NO:18)
序列比对
使用Clustal Omega(版本1.2.4)进行重链和轻链可变区的序列比对。CDR位置以灰色突出显示，不同于亲代链的氨基酸以彩色显示。
亲代VL序列与人源化/去免疫化链的比对
亲代VH序列与人源化/去免疫化链的比对
序列一致性百分比
使用Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)将工程化序列与亲代序列单独比对。使用EMBOSS Needle网页工具(Madeira等人，2019年)进行比对和计算(矩阵＝BLOSUM62，间隙打开(gap open)＝10，间隙扩展(gap extend)＝0.5，末端间隙惩罚(endgap penalty)＝false，末端间隙打开(end gap open)＝10，末端间隙扩展(end gapextend)＝0.5)。下表2显示了所示比较的一致性百分比。
表2
变体组合
基于人源化/去免疫化重链和轻链的可能组合设计了十五种变体(见下表3)。
表3
Epibase TM 免疫分析比较
Ab5.5(Ab5.5_var15)的去免疫化/工程化程度最高的变体组合是通过EpibaseTMv.4.0免疫分析获得的。由于EpibaseTM配置文件中的细节程度太低，无法进行详细比较，因此在亲代抗体和人源化/去免疫化变体(5.12)之间进行了基于三种类型的免疫谱统计数据的比较。
预测的人源化、去免疫化和亲代序列的DRB1、DRB3/4/5、DQ和DP表位的关键表位在下面的表4中显示。结合至相同基团的多个异型的肽计为一。
表4.每个基因家族的关键表位数量
表4中亲代抗体和变体抗体之间的差异说明了潜在表位的完全去除。许多表位，尤其是结合多个异型的混杂表位，很难完全去除。
下表5中给出了亲代序列和人源化/去免疫化变体的近似评分，近似评分表示基于DRB1的关键Th表位的最坏情况下的免疫原性风险。请注意，建议的取代不仅在DRB1上进行了评估，还在DRB3/4/5、DQ和DP以及取代组合的位置、取代物、风险类别和适用性上进行了评估。
表5
变体名称 DRB1评分
Ab5.5 1130.2
Ab5.5_var1 619.0
Ab5.5_var2 577.8
Ab5.5_var3 581.5
Ab5.5_var4 580.9
Ab5.5_var5 529.7
Ab5.5_var6 609.3
Ab5.5_var7 568.1
Ab5.5_var8 571.8
Ab5.5_var9 571.2
Ab5.5_var10 520.0
Ab5.5_var11 607.5
Ab5.5_var12 566.3
Ab5.5_var13 570.0
Ab5.5_var14 569.4
Ab5.5_var15 518.2
实施例2.肽阵列表位定位
方法
表位定位
来自人Ryk蛋白片段(人ECTO结构域，人Ryk蛋白的第134-227位氨基酸)的以下序列用于表位定位：
DMPQVNISVQGEVPRTLSVFRVELSCTGKVDSEVMILMQLNLTVNSSKNFTVLNFKRRKMCYKKLEEVKTSALDKNTSRTIYDPVHAAPTTSTR(SEQ ID NO:26)
蛋白质序列在C端和N端通过中性GSGSGSG(SEQ ID NO:27)接头延长，以避免肽截断。延长的序列被翻译成具有14个氨基酸的肽-肽重叠的15个氨基酸线性肽，并将肽印于定制的微阵列上。将抗体稀释至1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml，然后在4℃下与微阵列一起孵育16小时。冲洗微阵列，然后与山羊抗人IgG(Fc)DyLight680(0.2μg/ml)在室温下孵育45分钟。LI-COR Odyssey成像系统用于扫描微阵列并量化每个肽点的抗体结合。
斑点强度和肽注释的量化基于16位灰度tiff文件。分析器计算微阵列上每个点的原始、前景和背景荧光强度。如果点对点偏差大于40％，则每个微阵列的2-4个复制点的中值前景强度被校正为零。
在不清楚某个氨基酸是否有助于抗体结合的情况下，相应的字母以斜体书写。
结果
表位定位
Ab5.5变体(包括Ab5.5_var1、Ab5.5_var2和Ab5.5_var10)的氨基酸序列和其他描述可在上文公开的段落[00263]-[00267]和表1-3中找到。Ab5.5、Ab5.5_var1、Ab5.5_var2和Ab5.5_var10的线性表位定位如图6所示。使用第二及对照抗体对肽阵列进行预染未显示任何可干扰主要分析的与线性抗原衍生肽的背景相互作用。其他肽微阵列拷贝与抗体的孵育导致以下观察结果。
Ab5.5对由具有共有基序TSRTIYDPV(SEQ ID NO:28)的相邻肽形成的两个相同表位样斑点图案显示强烈且清晰的单克隆抗体反应。Ab5.5_var1对由具有共有基序TSRTIYDPV(SEQ ID NO:28)的相邻肽形成的两个相同表位样斑点图案显示中度IgG反应；此外，我们观察到与具有高度碱性共有基序SSKNFTVLNFKRRK(SEQ ID NO：29)、TVLNFKRRKMCYKK(SEQ ID NO：30)和RRKMCYKKLEEVK(SEQ ID NO：31)的肽的其他相互作用，这可能是由于抗体的非特异性离子结合。Ab5.5_var2对由具有共有基序TSRTIYDPV(SEQ IDNO:28)的相邻肽形成的两个相同表位样斑点图案表现出相似但明显较弱的IgG反应；此外，我们还观察到与具有高度碱性共有基序SSKNFTVLNFKRRK(SEQ ID NO：29)、TVLNFKRRKMCYKK(SEQ ID NO：30)和RRKMCYKKLEEVK(SEQ ID NO：31)的肽的其他且甚至更强的相互作用，这可能是由于变体2的非特异性离子结合。Ab5.5_var10对由具有共有基序TSRTIYDPV(SEQ IDNO:28)的相邻肽形成的两个相同表位样斑点图案显示出非常弱的反应；此外，我们观察到与单肽NSSKNFTVLNFKRRK(SEQ ID NO:35)和具有碱性共有基序VLNFKRRKMCYKK(SEQ ID NO:36)的肽的可能更弱的非特异性离子相互作用。
所有抗体均基于具有共有基序TSRTIYDPV的肽共享建议的表位；Ab5.5的响应最强，Ab5.5_var10的响应最弱；Ab5.5_var1和Ab5.5_var2进一步表现出与高碱性肽的离子相互作用。
实施例3.使用重组人蛋白对Ab5.5变体进行蛋白质印迹筛选
方法
质粒
质粒被设计成表达与人Ryk(134-227)融合的麦芽糖结合蛋白(MBP)，人Ryk(134-227)具有(A，抗原)和不具有(DE，表位缺失)使用肽图分析(参见图7序列比对)发现的推定表位。
转化细菌
为转化细菌，将SHuffle T7大肠杆菌细胞在冰上解冻10分钟，然后将30μL细胞悬浮液转移至2个预冷试管中。将0.750μL抗原质粒DNA和表位缺失质粒DNA添加到细胞悬液中，轻弹试管5次，使DNA与细胞混合。DNA和细胞混合物在冰上孵育30分钟，然后在42℃下进行45秒的热休克。将混合物置于冰上另外持续5分钟。将950μL室温LB培养基(KD MedicalBLE-3030)添加到混合物中，然后在37℃下孵育60分钟。孵育后，将500μL的每种转化细菌加入氨苄青霉素选择板，用ColiRollers(Novagen 71013-3)铺展，并在37℃下孵育过夜。孵育24小时后，从每个平板中选择1个菌落并放入10mL LB肉汤中，并在25℃下以200rpm振荡孵育过夜。第二天早上，将每个10mL培养物添加到含有500mL LB肉汤的烧瓶中，并在25℃下以200rpm振荡孵育，直到测得的OD介于0.5和0.8之间。然后用0.4mM IPTG诱导转化的细菌。
收集细菌
收集含有诱导的细菌细胞的LB肉汤并在4,000x g下离心10分钟。用1xPBS冲洗沉淀物并以4,000xg离心10分钟。在-80℃下冷冻或裂解沉淀。
裂解细菌
要裂解细菌，每克细菌使用4mL具有1x蛋白酶抑制剂混合物(ThermoScientificTMHaltTM磷酸酶抑制剂混合物PI78420)的BPER(Thermo Scientific PI89821)。轻轻摇动裂解1小时。通过以20,000xg离心10分钟来收集裂解物。使用45微米过滤器进行过滤。
蛋白质纯化
对于蛋白质纯化，购自New England Biolabs的直链淀粉树脂与ThermoScientific的离心柱一起使用。将一(1)mL直链淀粉树脂添加到5mL离心柱中，并用4mLTris缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA)通过以500x g离心1分钟来洗涤3次。然后，过滤后的细菌裂解物通过重力滴入每个柱子，并保存流出物。然后用4mL Tris缓冲液洗涤柱子5次，以500x g离心1分钟。将2mL洗脱缓冲液(Tris缓冲液中的10mM麦芽糖)添加到柱中并孵育2分钟以进行洗脱。然后将柱以500x g离心1分钟，收集每次的洗脱液。另外重复此过程4次。
样品制备和SDS-PAGE
使用具有BSA标准的660nm蛋白质测定法测定每个样品的蛋白质浓度。4xLaemmli样品缓冲液(BIO-RAD目录#161-0747)的是由每0.9mL 4x样品缓冲液添加0.1mL 2-巯基乙醇(#1610710)制备的。然后将4x Laemmli样品缓冲液以1:3的比例添加到每个样品中。在加热块中将样品在98℃下加热5分钟。
两(2)μL分子量标记(Precision Plus ProteinTM全蓝预染蛋白标准品#1610373)用于每对抗原和表位缺失样品。将一百(100)ng的每个样品加样到凝胶中。4块凝胶在200V下运行35分钟。
使用混合分子量(Mixed-MW)方案在TurboTM转移系统中使用/>TurboTM迷你硝化纤维素转移包(#1704158)。
免疫印迹
转移后，将膜干燥并使用黑色LI-COR笔标记。膜用水重新激活，然后使用用1x PBS以1:1稀释的Odyssey PBS封闭缓冲液(目录号)在室温下封闭1小时。封闭后，将膜切成16个单独的膜，并在4℃下与浓度为1g/mL的嵌合抗体或v1-v15抗体和1:4,000稀释的MBP抗体(细胞信号传导)孵育过夜。一抗孵育后，用PBS-T冲洗膜3次5分钟，然后在室温下用1:15,000稀释的抗人(LiCOR)和抗小鼠(LiCOR)抗体孵育1小时。然后将膜在PBS-T中洗涤3次5分钟，最后一次洗涤的PBS-T用水替换。然后将膜干燥并用LI-COR CLx(自动，169微米，中等质量，0偏移)扫描。
量化
从LI-COR CLx机器计算机导出文件并传输到VersaPeutics计算机以进行量化。在Image Studio Lite中，使用了分析工具。“添加矩形”功能用于在每个条带周围绘制矩形以在背景设为“中值,边框宽度＝3且区段设为全部的情况下进行量化。
结果
Ab5.5是针对小鼠Ryk蛋白的93个氨基酸序列产生的，该序列包含两个与人类Ryk蛋白不同的氨基酸。要成为对人类有效的治疗性蛋白质，人源化Ab5.5变体能够识别人Ryk序列是至关重要的。为了确认变体识别人类蛋白质，我们使用图7所示的重组融合蛋白进行了一系列蛋白质印迹实验。其中一种融合蛋白含有对应于原始小鼠抗原的人Ryk序列(人134-227，小鼠118-211)。另一种蛋白质是相同的，但其缺少我们在肽图分析实验中发现的Ab5.5的假定表位(TSRTIYDPV)(SEQ ID NO:28)。
图8显示了使用每种Ab5.5变体和两种纯化蛋白的三个重复的蛋白质印迹。这些数据表明所有抗体变体都有力识别人类Ryk蛋白序列，并且我们的定位鉴定的表位对于每个变体的结合都是至关重要的。重要的是，变体1、2和10的表位定位所识别的其他相互作用对于与Ryk的结合不是必需的。还观察到变体1在所有测试的变体中产生了最强的信号。
实施例4.Ab5.5和Ab5.5_var1的肽阵列取代扫描
方法
表位取代扫描
选择人Ryk蛋白的15个氨基酸序列(1LDKNTSRTIYDPVHA15)(SEQ ID NO:32)(对应于第206-220位氨基酸)用于通过取代扫描进行精细表位定位。将每个氨基酸位置被20个主要氨基酸取代的1LDKNTSRTIYDPVHA15(SEQ ID NO:32)的变体印于定制肽微阵列上。得到的1LDKNTSRTIYDPVHA15(SEQ ID NO:32)肽微阵列包含一式三肽打印的野生型肽的300种不同肽变体(900个肽点)，且由其他HA(YPYDVPDYAG(SEQ ID NO:33),80个点)对照肽构建。
微阵列用Rockland封闭缓冲液MB-070封闭30分钟，然后与Ab5.5(1μg/mL)或Ab5.5_var1(100μg/mL)在4℃下孵育16小时。冲洗微阵列，然后与山羊抗人IgG(Fc)DyLight680(0.1μg/mL)和对照小鼠单克隆抗HA(12CA5)DyLight800(0.5μg/mL)在室温下孵育45分钟。LI-COR Odyssey成像系统用于扫描微阵列并量化每个肽点的抗体结合。
点强度和肽注释的量化基于16位灰度tiff文件。分析器计算微阵列上每个点的原始、前景和背景荧光强度。
生成来自微阵列扫描的强度值的热图，并用黑色表示最大强度值，白色表示零。通过将给定人工肽的点强度除以野生型肽的点强度来生成氨基酸图。因此，氨基酸的位置反映了与天然野生型肽的氨基酸相比的强度比。
结果
Ab5.5
针对野生型肽1LDKNTSRTIYDPVHA15(SEQ ID NO：32)的取代扫描进行测定的Ab5.5的热图(图9)和氨基酸图(图10)突出显示了由N和C端可变延伸段1LDKNT5(SEQ ID NO：34)和14HA15构成的保守核心基序6SRTIYDPV13(SEQ ID NO：22)。这一发现与先前针对人Ryk第134-227位氨基酸的表位定位一致。
氨基酸位置10Y和11D高度保守，因为其他氨基酸的交换导致点强度至少降低83％，从而降低抗体结合。氨基酸位置9I对L的保守交换表现出高度容忍度，但也是高度保守的，且根本不能容忍任何其他氨基酸。氨基酸位置6S对A和P的取代表现出相似的容忍度，但在其他方面也高度保守。氨基酸位置7R和13V非常保守，因为被其他氨基酸替换导致点强度至少降低67％和58％。氨基酸位置8T和12P不太保守，但表现出对野生型氨基酸的明显偏好；其他氨基酸的交换导致点强度降低27％和33％。
所有其他N和C末端氨基酸都易于被任何其他氨基酸交换，并表现出可变特征。C端对被M或P取代的偏好归因于结构效应，而不是对抗体相互作用的真正影响。
Ab5.5_var1
针对野生型肽1LDKNTSRTIYDPVHA15(SEQ ID NO:32)的取代扫描进行测定的Ab5.5_var1的热图(图11)和氨基酸图(图12)突出显示了由N和C端可变延伸段1LDKNT5(SEQ ID NO:34)和14HA15构成的保守核心基序6SRTIYDPV13(SEQ ID NO:22)。这一发现与先前针对人Ryk第134-227位氨基酸的表位定位一致。
与Ab5.5非常相似，氨基酸位置10Y和11D高度保守，且在不普遍完全损失抗体结合之情况下不能容忍其他氨基酸的交换。除了对L的保守交换具有高度容忍度外，还发现氨基酸位置9I具有相同的高度序列保守性。氨基酸位置6S对A和P的取代表现出相似的容忍度，但在其他方面也高度保守。氨基酸位置7R和13V非常保守，因为被其他氨基酸替换导致点强度至少降低70％和62％。氨基酸位置8T和12P不太保守，但表现出对野生型氨基酸的明显偏好；其他氨基酸的交换导致点强度降低7.5％和35％。
所有其他N和C末端氨基酸都易于被任何其他氨基酸交换，并表现出可变特征。C末端对M、E、D或P取代的偏好归因于结构效应，而不是对抗体相互作用的真正影响。
实施例5.Ab5.5_var1对典型Wnt信号传导的抑制
方法
HEK 293STF(CRL-3249TM)是一种荧光素酶报告细胞系，它稳定表达7xLEF/TCF并通过表达荧光素酶响应经典Wnt信号传导。在与Ab5.5_var1孵育1小时后，将培养基更换为含有指定浓度的Ab5.5_var1和250ng/mL人Wnt-3a重组蛋白(R&D SystemsTM#5036WN010)的MEM。/>
HEK 293STF细胞以30,000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。36小时后，在无血清最低必需培养基(MEM)中用指定浓度(0-500g/mL)的Ab5.5_var1处理细胞。在与Ab5.5_var1孵育1小时后，将培养基更换为含有指定浓度的Ab5.5_var1和250ng/mL人Wnt-3a重组蛋白(R&D SystemsTM#5036WN010)的MEM。在与Ab5.5_var1和Wnt-3a孵育24小时后，使用Steady-GloTM荧光素酶检测系统(Promega#E2510)和CytationTM5成像系统(BioTek)检测荧光素酶。
将三参数log(抑制剂)与反应非线性回归模型拟合至底部限制为0的数据。为了用于模型，以5μg/mL(Log10＝0.699)绘制来自接受0μg/mL Ab5.5_var1的组别的资料图。沿具有95％置信区间(虚线)的非线性回归拟合(实线)绘制单个数据点。
结果
当用250ng/mL的Wnt-3a刺激HEK 293STF细胞时，Ab5.5_var1以剂量依赖性方式抑制经典Wnt信号传导(图13)。剂量反应模型(带虚线的实线，95％置信区间)拟合优度为R2＝0.6168，Ab5.5_var1的IC50经计算为484.5g/mL。
实施例6.RYK在癌症中的表达
方法
我们使用GEPIA2网页工具分析了正常和肿瘤样本中Ryk mRNA的表达。GEPIA2允许研究人员使用来自癌症基因组图谱(TCGA)和基因型组织表达(GTEx)项目的数据进行基因表达和生存分析，这些项目共同分析了数千个独特的人类样本。
对GEPIA2程序中所有可用的癌症类型进行了Ryk基因表达分析(肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、浸润性乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤、食道癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状肾细胞癌、急性髓性白血病、脑低级别胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺瘤、子宫体子宫内膜癌、子宫癌肉瘤和葡萄膜黑色素瘤)。
将Ryk mRNA表达值表示为log2(TPM+1)。Ryk mRNA表达的平均倍数变化大于2且单因素方差分析p值小于0.001的肿瘤被认为与对照组织有显著差异。每个分析中包含的肿瘤和正常样本的数量显示在箱线图下方。白色框表示肿瘤样本，而灰色框表示正常样本。
使用来自顶部25％和底部25％Ryk表达水平的样本进行基于Ryk mRNA表达的总体存活分析。对数秩检验、cox比例风险比和95％置信区间用于确定统计显著性。生存曲线以黑色显示低Ryk组，以浅灰色显示高Ryk组。
结果
来自胆管癌(图14)、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤(图15)、多形性胶质母细胞瘤(图16)、头颈部鳞状细胞癌(图17)、急性髓性白血病(图18)，低级别神经胶质瘤(图19)、肺鳞状细胞癌(图20)、胰腺癌(图21)和胸腺瘤(图22)的肿瘤样本中的Ryk mRNA表达显著升高。
肿瘤样本中的高Ryk表达量与低级别神经胶质瘤(图23)及胰脏癌(图24)中的低存活率显著相关。
科学文献中的报告证实，Ryk与胶质母细胞瘤1-4和白血病5,6有关。其他报告表明，Ryk与胃癌7、黑色素瘤8、前列腺癌9、卵巢癌10-12、小细胞肺癌13和非典型畸胎样横纹肌样瘤14有关。
实施例7.通过使用过表达小鼠RYK和人RYK的永生人细胞系的Ab5.5_Var1Western Blot验证
方法
质粒和细胞系
质粒经设计用于表达全长人RYK或全长小鼠RYK(参见Macheda,Maria L.,WillyW.Sun,Kumudhini Kugathasan,Benjamin M.Hogan,Neil I.Bower,Michael M.Halford,You Fang Zhang等人."The Wnt receptor Ryk plays a role in mammalian planarcell polarity signaling."Journal of Biological Chemistry 287,第35号(2012):29312-29323)(Macheda,Maria L.等人.)。HEK 293(ATCC，CRL-1573TM)是一种亚三倍体人细胞系，通常用于转染和哺乳动物蛋白表达。在37℃和5％CO2培养箱中，在添加10％胎牛血清(FBS，Gibco A3840002)和1x青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)的DMEM(Gibco 11965118)培养基中培养人胚肾细胞HEK293。
HEK293细胞转染
HEK293细胞在转染前以15,000个细胞/孔的密度接种到6孔板中持续24小时。转染过程中，将1μg质粒与1μl Lipofectamine 3,000(Invitrogen，L3000015)混合在100μlDMEM培养基中，室温放置30分钟，然后将混合物逐渐加入细胞的每个孔中，然后在37℃培养箱中培养4小时。孵育后，将细胞培养板的培养基更换为含有10％FBS和1x青霉素-链霉素的DMEM，然后将细胞培养板置于培养箱中再培养24小时。
裂解细胞
在6孔细胞培养板的每个孔中使用200μl RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific，J63324.EQE)和1x蛋白酶抑制剂混合物(Thermo ScientificTMHaltTM磷酸酶抑制剂混合物PI78420)以裂解哺乳动物细胞。在冰上裂解10分钟。以10,000g离心10分钟收集裂解物。
样品制备和SDS-PAGE
使用具有BSA标准的660nm蛋白质测定法测定每个样品的蛋白质浓度。4xLaemmli样品缓冲液(BIO-RAD目录#161-0747)的制备方法是每0.9mL 4x样品缓冲液添加0.1mL 2-巯基乙醇(#1610710)。然后将4x Laemmli样品缓冲液以1:3的比例添加到每个样品中。样品在室温下放置10分钟。每块凝胶使用2μL分子量标记(Precision Plus ProteinTM全蓝预染蛋白标准品#1610373)。将30μg的每个样品加样到凝胶中。凝胶在180V下运行60分钟。使用混合分子量(Mixed-MW)方案在TurboTM转移系统中使用/>TurboTM迷你硝化纤维素转移包(#1704158)。
免疫印迹
转移后，将膜干燥并使用黑色LI-COR笔标记。膜用水重新激活，然后使用用1x PBS以1:1稀释的Odyssey PBS封闭缓冲液(目录号)在室温下封闭1小时。封闭后，将膜与浓度为1μg/mL的Ab5.5_Var1在4℃下孵育过夜。一抗孵育后，用PBS-T冲洗膜3次5分钟，然后以1:15,000的稀释度与抗人(LiCOR)抗体在室温下孵育1小时。然后将膜在PBS-T中洗涤3次5分钟，最后一次洗涤的PBS-T用水替换。然后将膜干燥并用LI-COR CLx(自动，169微米，中等质量，0偏移)扫描。
结果
Ab5.5是针对小鼠Ryk蛋白的93个氨基酸序列产生的，该序列包含两个与人类Ryk蛋白不同的氨基酸。要成为对人类有效的治疗性蛋白质，人源化Ab5.5变体能够识别人类Ryk序列至关重要。为了确认Ab5.5_Var1识别人类蛋白质，我们使用全长人-RYK和全长小鼠-RYK表达蛋白进行了如前所述的一系列蛋白质印迹实验(Maceda，Maria L.等人)。
使用Ab5.5_Var1和全长人RYK、全长小鼠RYK以及作为对照的空载体进行的蛋白质印迹实验的代表性结果如图25所示。该数据证明Ab5.5_Var1有力地识别人类细胞表达的人类Ryk蛋白。
实施例8.Ab5.5_var1阻断非经典Wnt信号Wnt5a，诱导人神经母细胞瘤细胞系SK- N-SH的迁移
方法
SK-N-SH细胞系(ATCC HTB-11)是一种人神经母细胞瘤细胞系，常用于基于细胞的实验室检测。SK-N-SH细胞在ATCC配制的Eagle最低必需培养基中培养，培养基目录号30-2003，培养基中添加有10％胎牛血清(FBS，Gibco A3840002)和1x青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)，在37℃和5％CO2的培养箱中培养。
如图26所示，将SK-N-SH接种到24孔transwell板中，该板包含一个核心尺寸为8um的插入物(Falcon，353097)，接种密度为每孔8000个细胞。然后将浓度为25μg/mL的Ab5.5_Var1或人IgG对照抗体(Invitrogen，人IgG同型对照，02-7102)加入每孔底部，置于37℃培养箱中孵育1小时。然后取出transwell板，在每个孔的底部加入浓度为300ng/mL的Wnt-5a重组蛋白(R&D Systems，645WN010)。将板置于培养箱中24小时。
孵育后，将24孔transwell板置于室温下，并用1x PBS清洗插入物3次。然后将插入物在室温下用4％多聚甲醛固定20分钟。固定后，用浓度为1μg/ml的Hoechst 33342溶液(Thermo Scientific，62249)对插入物进行染色。
图像是通过使用DAPI观察通道在4倍物镜下使用Cytation 5细胞成像多模式读取器(BioTek)捕获的。通过Cytation 5查看器的程序自动计算每个插入物(孔)的细胞数。
为了量化，来自所有重复实验的每个孔中的细胞数通过Student’s t检验进行统计分析，*，p<0.05。
结果
如图26所示，当用300ng/mL的Wnt5a刺激SK-N-SH细胞迁移时，Ab5.5_Var1抑制了这种非经典Wnt信号传导及其介导的细胞迁移。Ab5.5_Var1引起的抑制对Wnt5a诱导的非经典Wnt信号传导及其介导的细胞迁移具有特异性。
实施例9.Ab5.5_var1介导αHFc-CL-PNU抗体在人T细胞淋巴母细胞系MOLT4中引导 的细胞毒性
方法
MOLT4(ATCC,CRL-1582)是一种从急性淋巴细胞白血病(ALL)患者身上收集的人T淋巴母细胞。MOLT4细胞用ATCC配制的RPMI-1640培养基(ATCC 30-2001)培养，培养基中有10％胎牛血清(FBS，Gibco A3840002)和1x青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)，在培养箱中37℃和5％CO2下培养。
αHFc-CL-PNU是“具有可裂解接头的IgGs抗人IgG Fc-PNU159682抗体”(Moradec，AH-102PN-50)，这是人IgG与细胞毒素PNU159682的结合物。
将MOLT4细胞接种到96孔细胞培养板中，密度为每孔10,000个细胞。孵育24小时后，用单独的Ab5.5_Var1、Ab5.5_Var1与αHFc-CL-PNU的混合物或人IgG与αHFc-CL-PNU的混合物处理细胞。然后将处理物和细胞的混合物再孵育72小时。
孵育后，用10％阿尔阿蓝(Alamar Blue)(Invitrogen，DAL1025)处理细胞并置于37℃培养箱中1小时。孵育后，使用Cytation 5细胞成像多模式读取器(BioTek)读取板。
为了量化，来自所有重复实验的每个孔中的细胞数通过Student’s t检验进行统计分析，*，p<0.05。
结果
如图27a所示，当与0.1nMαHFc-CL-PNU一起处理时，Ab5.5_Var1以剂量依赖性方式降低细胞活力，EC50为22.39nM。
如图27b所示，当与αHFc-CL-PNU一起处理时，与对照IgG相比，Ab5.5_Var1可降低24％的细胞活力。
实施例10.Ab5.5_var1阻断Wnt5a诱导的RhoA激活
方法
质粒和细胞系
设计质粒用于表达全长人RYK和全长人Frizzled3(参见Onishi,Keisuke,BethShafer,Charles Lo,Fadel Tissir,Andre M.Goffinet及Yimin Zou.“Antagonisticfunctions of Dishevelleds regulate Frizzled3 endocytosis via filopodia tipsin Wnt-mediated growth cone guidance.”Journal of Neuroscience33,第49号(2013):19071-19085)。
HEK 293(ATCC,CRL-1573TM)是亚三倍体人细胞系，通常用于转染和哺乳动物蛋白表达。人胚肾细胞HEK293在培养箱中在37℃和5％CO2下，在添加10％胎牛血清(FBS，GibcoA3840002)和1x青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)的DMEM(Gibco 11965118)培养基中培养。
HEK293细胞转染
HEK293细胞在转染前以15,000个细胞/孔的密度接种到6孔板中24小时。转染过程中，将1μg总质粒与1μl lipofectamine 3000(Invitrogen，L3000015)混合在100μlDMEM培养基中，室温放置30分钟，然后将混合物逐渐加入细胞的每个孔中，然后在37℃培养箱中培养4小时。孵育后，将细胞培养板的培养基更换为含有10％FBS和1x青霉素-链霉素的DMEM，然后将细胞培养板置于培养箱中再培养24小时。
RhoA活化试验
转染细胞在刺激前24小时使用不含FBS的DMEM培养基进行饥饿处理。饥饿处理后，用200ng/mL人重组Wnt5a或200ng/mL Wnt5a以及20μg/ml Ab5.5_Var1处理细胞。细胞在37℃下放置30分钟。
刺激后，通过使用RhoA G-LISA活化测定试剂盒(细胞骨架，BK124)并按照制造商的说明检测活性形式的RhoA。
通过使用Student’s t检验对从所有重复实验中收集的数据进行量化。
结果
如图28所示，Wnt5a刺激可以使RhoA的活性形式增加32.6％。Ab5.5_Var1与Wnt5a一起处理可以阻断这种刺激。
序列
下面的序列表中列出了各种序列。
序列表
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参考文献
下面列出了本实施例中引用的参考文献。
1.Habu M,Koyama H,Kishida M,Kamino M,Iijima M,Fuchigami T,Tokimura H,Ueda M,Tokudome M,Koriyama C,Hirano H,Arita K,Kishida S.Ryk is essential forWnt-5a-dependent invasiveness in human glioma.J Biochem.2014Jul 1；156(1):29–38.
2.Hirano H,Yonezawa H,Yunoue S,Habu M,Uchida H,Yoshioka T,Kishida S,Kishida M,Oyoshi T,Fujio S,Sugata S,Yamahata H,Hanaya R,AritaK.Immunoreactivity of Wnt5a,Fzd2,Fzd6,and Ryk in glioblastoma:evaluativemethodology for DAB chromogenic immunostaining.Brain Tumor Pathol.2014Apr 1；31(2):85–93.
3.Kim Y,Hong M,Do I-G,Ha SY,Lee D,Suh Y-L.Wnt5a,Ryk and Ror2expression in glioblastoma subgroups.Pathol Res Pract.2015 Dec；211(12):963–972.PMID:26596412
4.Adamo A,Fiore D,De Martino F,Roscigno G,Affinito A,Donnarumma E,Puoti I,Ricci Vitiani L,Pallini R,Quintavalle C,Condorelli G.RYK promotes thestemness ofglioblastoma cells via the WNT/β-catenin pathway.Oncotarget.2017Feb 21；8(8):13476–13487.PMCID:PMC5355113
5.Alvarez-Zavala M,Riveros-AR,García-Castro B,Barrera-ChairezE,Rubio-Jurado B,Garcés-Ruíz OM,Ramos-Solano M,Aguilar-Lemarroy A,Jave-SuarezLF.WNT receptors profile expression in mature blood cells and immatureleukemic cells:RYK emerges as a hallmark receptor of acute leukemia.EuropeanJournal of Haematology.2016；97(2):155–165.
6.Micci F,Panagopoulos I,Haugom L,Andersen HK,GE,Beiske K,Heim S.t(3；21)(q22；q22)leading to truncation of the RYK gene in atypicalchronic myeloid leukemia.Cancer Letters.2009 May 18；277(2):205–211.
7.Fu Y,Chen Y,Huang J,Cai Z,Wang Y.RYK,a receptor of noncanonical Wntligand Wnt5a,is positively correlated with gastric cancer tumorigenesis andpotential of liver metastasis.American Journal of Physiology-Gastrointestinaland Liver Physiology.American Physiological Society；2019 Dec 23；318(2):G352–G360.
8.Anastas JN,Kulikauskas RM,Tamir T,Rizos H,Long GV,Euw EM von,YangP-T,Chen H-W,Haydu L,Toroni RA,Lucero OM,Chien AJ,Moon RT.WNT5A enhancesresistance of melanoma cells to targeted BRAF inhibitors.J ClinInvest.American Society for Clinical Investigation；2014 Jul 1；124(7):2877–2890.PMID:0
9.Thiele S,Zimmer A,A,Rachner TD,Rother S,Fuessel S,Froehner M,Wirth MP,Muders MH,Baretton GB,Jakob F,Rauner M,Hofbauer LC.Role of WNT5Areceptors FZD5 and RYK in prostate cancer cells.Oncotarget.Impact Journals；2018 May 25；9(43):27293–27304.
10.Wang XC,Katso R,Butler R,Hanby AM,Poulsom R,Jones T,Sheer D,Ganesan TS.H-RYK,an unusual receptor kinase:isolation and analysis ofexpression in ovarian cancer.Mol Med.1996 Mar；2(2):189–203.PMCID:PMC2230112
11.Katso RMT,Manek S,Biddolph S,Whittaker R,Charnock MFL,Wells M,Ganesan TS.Overexpression of H-Ryk in Mouse Fibroblasts Confers TransformingAbility in Vitro and in Vivo:Correlation with Up-Regulation in EpithelialOvarian Cancer.Cancer Res.American Association for Cancer Research；1999 May15；59(10):2265–2270.PMID:10344726
12.Katso RMT,Manek S,Ganjavi H,Biddolph S,Charnock MFL,Bradburn M,Wells M,Ganesan TS.Overexpression of H-Ryk in Epithelial Ovarian Cancer:Prognostic Significance of Receptor Expression.Clin Cancer Res.AmericanAssociation for Cancer Research；2000 Aug 1；6(8):3271–3281.PMID:10955813
13.Hamilton G,Rath B,Klameth L,Hochmair M.Receptor tyrosine kinaseexpression of circulating tumor cells in small cell lungcancer.Oncoscience.2015；2(7):629–634.PMCID:PMC4549360
14.Chakravadhanula M,Hampton CN,Chodavadia P,Ozols V,Zhou L,Catchpoole D,Xu J,Erdreich-Epstein A,Bhardwaj RD.Wnt pathway in atypicalteratoid rhabdoid tumors.Neuro Oncol.Oxford Academic；2015Apr 1；17(4):526–535.
其他参考资料
下面列出了本文引用的其他选择的参考资料。
参考资料
Al-Lazikani B,Lesk AM,Chothia C.(1997).Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins.J.Mol.Biol.273,927-948.
Almagro JC,Beavers MP,Hernandez-Guzman F,Maier J,Shaulsky J,ButenhofK,Labute P,Thorsteinson N,Kelly K,Teplyakov A,Luo J,Sweet R,Gilliland GL.(2011).Antibody modeling assessment.Proteins 79,3050-3066.
Baker MP,Jones TD.(2007).Identification and removal of immunogenicityin therapeutic proteins.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.10,219-227.
Berdoz J,Gorski J,Termijtelen AM,Dayer JM,Irle C,Schendel D,Mach B.(1987).
Constitutive and induced expression of the individual HLA-DR beta andalpha chain loci in different cell types.J.Immunol.139,1336-1341.
Chamberlain P.(2002).Immunogenicity of therapeutic proteins Part 1:Causes and clinical manifestations of immunogenicity.The Regulatory Review5,4-9.
Chothia C,Lesk AM.(1987).Canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins.J.Mol.Biol.196,901-917.
Desmet J,Spriet J,Lasters I.(2002).Fast and accurate side-chaintopology and energy refinement(FASTER)as a new method for protein structureoptimisation.Proteins48,31-43.
Ewert S,Huber T,Honegger A,Pluckthun A.(2003).Biophysical propertiesof human antibody variable domains.J.Mol.Biol.325,531-553.
Foote J,Winter G.(1992).Antibody framework residues affecting theconformation of the hypervariable loops.J.Mol.Biol.224,487-499.
Gansbacher B,Zier KS.(1988).Regulation of HLA-DR,DP,and DQ expressionin activated T cells.Cell Immunol.117,22-34.
Harding FA,Stickler MM,Razo J,DuBridge RB.(2010).The immunogenicityof humanised and fully human antibodies:residual immunogenicity resides inthe CDR regions.MAbs.2,256-265.
Honegger A,Pluckthun A.(2001).Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysistool.J.Mol.Biol.309,657-670.
Honegger A,Malebranche AD,Rothlisberger D,Pluckthun A.(2009).Theinfluence of the framework core residues on the biophysical properties ofimmunoglobulin heavy chain variable domains.Protein Eng.Des.Se.l22,121-134.
Jones PT,Dear PH,Foote J,Neuberger MS,Winter G.(1986).Replacing thecomplementarity-determining regions in a human antibody with those from amouse.Nature321,522-525.
Kabat EA,Wu TT,Perry H,Gottesman K,Foeller C.(1991).Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition.NIH Publication.
Kirschmann DA,Duffin KL,Smith CE,Welply JK,Howard SC,Schwartz BD,Woulfe SL.(1995).Naturally processed peptides from rheumatoid arthritisassociated and non-associated HLA-DR alleles.J.Immunol.155,5655-5662.
Laupeze,B,Fardel O,Onno M,Bertho N,Drenou B.,Fauchet R,Amiot L.(1999).Differential expression of major histocompatibility complex class Ia,Ib,and II molecules on monocytes-derived dendritic and macrophagiccells.Hum.Immunol.60,591-597.
North B,Lehmann A,Dunbrack RL Jr.(2011).A new clustering of antibodyCDR loop conformations.J.Mol.Biol.406,228-256.
Stas P,Pletinckx J,Gansemans Y,Lasters I.(2009).Immunogenicityassessment of antibody therapeutics.Cambridge University Press,Cambridge.
Stunz LL,Karr RW,Anderson RA.(1989).HLA-DRB1 and-DRB4 genes aredifferentially regulated at the transcriptional level.J.Immunol.143,3081-3086.
Van WI,Gansemans Y,Parren PW,Stas P,Lasters I.(2007).Immunogenicityscreening in protein drug development.Expert Opin.Biol.Ther.7,405-418.
Vargas-Madrazo E,Paz-Garcia E.(2003).An improved model of associationfor VH-VL immunoglobulin domains:asymmetries between VH and VL in the packingof some interface residues.J.Mol.Recognit.16,113-120.
Verreck FA,van de Poel A,Drijfhout JW,Amons R,Coligan JE,Konig F.(1996).Natural peptides isolated from Gly86/Val86-containing variants of HLA-DR1,-DR11,-DR13,and-DR52.Immunogenetics43,392-397.
额外的参考资料
Madeira,F.,Y.M.Park,J.Lee,N.Buso,T.Gur,N.Madhusoodanan,P.Basutkar,etal.2019.“The EMBL-EBI Search and Sequence Analysis Tools APIs in 2019.”Nucleic Acids Research,April.https://doi.org/10.1093/nar/gkz268.
Needleman,S.B.,and C.D.Wunsch.1970.“A General Method Applicable tothe Search for Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins.”Journal of Molecular Biology 48(3):443–53.
序列表
<110> Versapeutics 公司（VersaPeutics, Inc.）
Hauser, David N.
Kampert, Taylor L.
Sun, Miao
<120> 针对 WNT 受体 RYK 的抗体变体
<130> 4894-3000200
<150> 63/112,616
<151> 2020-11-11
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Ryk抗体或抗体衍生物的CDR_L2
<400> 1
Arg Ala Asn Arg Leu Val Glu
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Ryk抗体或抗体衍生物的CDR_H2
<400> 2
Ser Thr Gly Gly Gly Gly Thr Tyr
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Ryk抗体或抗体衍生物的CDR_H3_1
<400> 3
His Gly Asp Ser Gly Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Ryk抗体或抗体衍生物的CDR_H3_2
<400> 4
His Gly Asp Gln Gly Asp Tyr
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Ryk抗体或抗体衍生物的CDR_L1
<400> 5
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
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<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Ryk抗体或抗体衍生物的CDR_L3
<400> 6
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Ryk抗体或抗体衍生物的CDR_H1
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Ryk抗体或抗体衍生物的CDR_H3_3
<400> 8
His Gly Asp Asn Gly Asp Tyr
1 5
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VL,抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区
<400> 9
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 10
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VH,抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区
<400> 10
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asp Asn Gly Asp Tyr Trp Gly His Gly Ser Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VL_1,抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VL_2,抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VL_3,抗Ryk抗体或抗体衍生物的轻链可变区
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VH_1,抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asp Asn Gly Asp Tyr Trp Gly His Gly Ser Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VH_2,抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asp Asn Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VH_3,抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Thr Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asp Ser Gly Asp Tyr Trp Gly His Gly Ser Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VH_4,抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Thr Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asp Gln Gly Asp Tyr Trp Gly His Gly Ser Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab5.5_VH_5,抗Ryk抗体或抗体衍生物的重链可变区
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Thr Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asp Asn Gly Asp Tyr Trp Gly His Gly Ser Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(8)
<223> 智人Ryk(211-218)
<400> 19
Ser Arg Thr Ile Tyr Asp Pro Val
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ryk人工肽1
<400> 20
Ala Arg Thr Ile Tyr Asp Pro Val
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ryk人工肽2
<400> 21
Pro Arg Thr Ile Tyr Asp Pro Val
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ryk人工肽3
<400> 22
Ser Arg Thr Leu Tyr Asp Pro Val
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ryk人工肽4
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X为非T天然氨基酸
<400> 23
Ser Arg Xaa Ile Tyr Asp Pro Val
1 5
<210> 24
<211> 594
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(594)
<223> 小家鼠Ryk
<400> 24
Met Arg Ala Gly Arg Gly Gly Val Pro Gly Ser Gly Gly Leu Arg Ala
1 5 10 15
Pro Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Met Leu Pro Ala Ala
20 25 30
Ala Pro Arg Ser Pro Ala Leu Ala Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ser Val
35 40 45
Ser Leu Tyr Leu Ser Glu Asp Glu Val Arg Arg Leu Leu Gly Leu Asp
50 55 60
Ala Glu Leu Tyr Tyr Val Arg Asn Asp Leu Ile Ser His Tyr Ala Leu
65 70 75 80
Ser Phe Asn Leu Leu Val Pro Ser Glu Thr Asn Phe Leu His Phe Thr
85 90 95
Trp His Ala Lys Ser Lys Val Glu Tyr Lys Leu Gly Phe Gln Val Asp
100 105 110
Asn Phe Val Ala Met Gly Met Pro Gln Val Asn Ile Ser Ala Gln Gly
115 120 125
Glu Val Pro Arg Thr Leu Ser Val Phe Arg Val Glu Leu Ser Cys Thr
130 135 140
Gly Lys Val Asp Ser Glu Val Met Ile Leu Met Gln Leu Asn Leu Thr
145 150 155 160
Val Asn Ser Ser Lys Asn Phe Thr Val Leu Asn Phe Lys Arg Arg Lys
165 170 175
Met Cys Tyr Lys Lys Leu Glu Glu Val Lys Thr Ser Ala Leu Asp Lys
180 185 190
Asn Thr Ser Arg Thr Ile Tyr Asp Pro Val His Ala Ala Pro Thr Thr
195 200 205
Ser Thr Arg Val Phe Tyr Ile Ser Val Gly Val Cys Cys Ala Val Ile
210 215 220
Phe Leu Val Ala Ile Ile Leu Ala Val Leu His Leu His Ser Met Lys
225 230 235 240
Arg Ile Glu Leu Asp Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ser Ser Ser Gln Gly
245 250 255
Leu Ser Gln Pro Ser Thr Gln Thr Thr Gln Tyr Leu Arg Ala Asp Thr
260 265 270
Pro Asn Asn Ala Thr Pro Ile Thr Ser Ser Ser Gly Tyr Pro Thr Leu
275 280 285
Arg Ile Glu Lys Asn Asp Leu Arg Ser Val Thr Leu Leu Glu Ala Lys
290 295 300
Ala Lys Val Lys Asp Ile Ala Ile Ser Arg Glu Arg Ile Thr Leu Lys
305 310 315 320
Asp Val Leu Gln Glu Gly Thr Phe Gly Arg Ile Phe His Gly Ile Leu
325 330 335
Val Asp Glu Lys Asp Pro Asn Lys Glu Lys Gln Thr Phe Val Lys Thr
340 345 350
Val Lys Asp Gln Ala Ser Glu Val Gln Val Thr Met Met Leu Thr Glu
355 360 365
Ser Cys Lys Leu Arg Gly Leu His His Arg Asn Leu Leu Pro Ile Thr
370 375 380
His Val Cys Ile Glu Glu Gly Glu Lys Pro Met Val Val Leu Pro Tyr
385 390 395 400
Met Asn Trp Gly Asn Leu Lys Leu Phe Leu Arg Gln Cys Lys Leu Val
405 410 415
Glu Ala Asn Asn Pro Gln Ala Ile Ser Gln Gln Asp Leu Val His Met
420 425 430
Ala Ile Gln Ile Ala Cys Gly Met Ser Tyr Leu Ala Arg Arg Glu Val
435 440 445
Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Val Ile Asp Asp Thr Leu
450 455 460
Gln Val Lys Ile Thr Asp Asn Ala Leu Ser Arg Asp Leu Phe Pro Met
465 470 475 480
Asp Tyr His Cys Leu Gly Asp Asn Glu Asn Arg Pro Val Arg Trp Met
485 490 495
Ala Leu Glu Ser Leu Val Asn Asn Glu Phe Ser Ser Ala Ser Asp Val
500 505 510
Trp Ala Phe Gly Val Thr Leu Trp Glu Leu Met Thr Leu Gly Gln Thr
515 520 525
Pro Tyr Val Asp Ile Asp Pro Phe Glu Met Ala Ala Tyr Leu Lys Asp
530 535 540
Gly Tyr Arg Ile Ala Gln Pro Ile Asn Cys Pro Asp Glu Leu Phe Ala
545 550 555 560
Val Met Ala Cys Cys Trp Ala Leu Asp Pro Glu Glu Arg Pro Lys Phe
565 570 575
Gln Gln Leu Val Gln Cys Leu Thr Glu Phe His Ala Ala Leu Gly Ala
580 585 590
Tyr Val
<210> 25
<211> 607
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(607)
<223> 智人Ryk
<400> 25
Met Arg Gly Ala Ala Arg Leu Gly Arg Pro Gly Arg Ser Cys Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Gly Leu Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Pro Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Arg Pro Pro Glu Leu Gln Ser Ala Ser Ala Gly Pro Ser Val
50 55 60
Ser Leu Tyr Leu Ser Glu Asp Glu Val Arg Arg Leu Ile Gly Leu Asp
65 70 75 80
Ala Glu Leu Tyr Tyr Val Arg Asn Asp Leu Ile Ser His Tyr Ala Leu
85 90 95
Ser Phe Ser Leu Leu Val Pro Ser Glu Thr Asn Phe Leu His Phe Thr
100 105 110
Trp His Ala Lys Ser Lys Val Glu Tyr Lys Leu Gly Phe Gln Val Asp
115 120 125
Asn Val Leu Ala Met Asp Met Pro Gln Val Asn Ile Ser Val Gln Gly
130 135 140
Glu Val Pro Arg Thr Leu Ser Val Phe Arg Val Glu Leu Ser Cys Thr
145 150 155 160
Gly Lys Val Asp Ser Glu Val Met Ile Leu Met Gln Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Val Asn Ser Ser Lys Asn Phe Thr Val Leu Asn Phe Lys Arg Arg Lys
180 185 190
Met Cys Tyr Lys Lys Leu Glu Glu Val Lys Thr Ser Ala Leu Asp Lys
195 200 205
Asn Thr Ser Arg Thr Ile Tyr Asp Pro Val His Ala Ala Pro Thr Thr
210 215 220
Ser Thr Arg Val Phe Tyr Ile Ser Val Gly Val Cys Cys Ala Val Ile
225 230 235 240
Phe Leu Val Ala Ile Ile Leu Ala Val Leu His Leu His Ser Met Lys
245 250 255
Arg Ile Glu Leu Asp Asp Ser Ile Ser Ala Ser Ser Ser Ser Gln Gly
260 265 270
Leu Ser Gln Pro Ser Thr Gln Thr Thr Gln Tyr Leu Arg Ala Asp Thr
275 280 285
Pro Asn Asn Ala Thr Pro Ile Thr Ser Tyr Pro Thr Leu Arg Ile Glu
290 295 300
Lys Asn Asp Leu Arg Ser Val Thr Leu Leu Glu Ala Lys Gly Lys Val
305 310 315 320
Lys Asp Ile Ala Ile Ser Arg Glu Arg Ile Thr Leu Lys Asp Val Leu
325 330 335
Gln Glu Gly Thr Phe Gly Arg Ile Phe His Gly Ile Leu Ile Asp Glu
340 345 350
Lys Asp Pro Asn Lys Glu Lys Gln Ala Phe Val Lys Thr Val Lys Asp
355 360 365
Gln Ala Ser Glu Ile Gln Val Thr Met Met Leu Thr Glu Ser Cys Lys
370 375 380
Leu Arg Gly Leu His His Arg Asn Leu Leu Pro Ile Thr His Val Cys
385 390 395 400
Ile Glu Glu Gly Glu Lys Pro Met Val Ile Leu Pro Tyr Met Asn Trp
405 410 415
Gly Asn Leu Lys Leu Phe Leu Arg Gln Cys Lys Leu Val Glu Ala Asn
420 425 430
Asn Pro Gln Ala Ile Ser Gln Gln Asp Leu Val His Met Ala Ile Gln
435 440 445
Ile Ala Cys Gly Met Ser Tyr Leu Ala Arg Arg Glu Val Ile His Lys
450 455 460
Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Val Ile Asp Asp Thr Leu Gln Val Lys
465 470 475 480
Ile Thr Asp Asn Ala Leu Ser Arg Asp Leu Phe Pro Met Asp Tyr His
485 490 495
Cys Leu Gly Asp Asn Glu Asn Arg Pro Val Arg Trp Met Ala Leu Glu
500 505 510
Ser Leu Val Asn Asn Glu Phe Ser Ser Ala Ser Asp Val Trp Ala Phe
515 520 525
Gly Val Thr Leu Trp Glu Leu Met Thr Leu Gly Gln Thr Pro Tyr Val
530 535 540
Asp Ile Asp Pro Phe Glu Met Ala Ala Tyr Leu Lys Asp Gly Tyr Arg
545 550 555 560
Ile Ala Gln Pro Ile Asn Cys Pro Asp Glu Leu Phe Ala Val Met Ala
565 570 575
Cys Cys Trp Ala Leu Asp Pro Glu Glu Arg Pro Lys Phe Gln Gln Leu
580 585 590
Val Gln Cys Leu Thr Glu Phe His Ala Ala Leu Gly Ala Tyr Val
595 600 605
<210> 26
<211> 94
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(94)
<223> 智人Ryk(134-227)
<400> 26
Asp Met Pro Gln Val Asn Ile Ser Val Gln Gly Glu Val Pro Arg Thr
1 5 10 15
Leu Ser Val Phe Arg Val Glu Leu Ser Cys Thr Gly Lys Val Asp Ser
20 25 30
Glu Val Met Ile Leu Met Gln Leu Asn Leu Thr Val Asn Ser Ser Lys
35 40 45
Asn Phe Thr Val Leu Asn Phe Lys Arg Arg Lys Met Cys Tyr Lys Lys
50 55 60
Leu Glu Glu Val Lys Thr Ser Ala Leu Asp Lys Asn Thr Ser Arg Thr
65 70 75 80
Ile Tyr Asp Pro Val His Ala Ala Pro Thr Thr Ser Thr Arg
85 90
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 中性肽接头
<400> 27
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(9)
<223> 智人Ryk(210-218)
<400> 28
Thr Ser Arg Thr Ile Tyr Asp Pro Val
1 5
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(14)
<223> 智人Ryk(179-192)
<400> 29
Ser Ser Lys Asn Phe Thr Val Leu Asn Phe Lys Arg Arg Lys
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(14)
<223> 智人Ryk(184-197)
<400> 30
Thr Val Leu Asn Phe Lys Arg Arg Lys Met Cys Tyr Lys Lys
1 5 10
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(13)
<223> 智人Ryk(190-202)
<400> 31
Arg Arg Lys Met Cys Tyr Lys Lys Leu Glu Glu Val Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(15)
<223> 智人Ryk(206-220)
<400> 32
Leu Asp Lys Asn Thr Ser Arg Thr Ile Tyr Asp Pro Val His Ala
1 5 10 15
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 中性肽接头
<400> 33
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly
1 5 10
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(5)
<223> 智人Ryk(206-210)
<400> 34
Leu Asp Lys Asn Thr
1 5
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(15)
<223> 智人Ryk(178-192)
<400> 35
Asn Ser Ser Lys Asn Phe Thr Val Leu Asn Phe Lys Arg Arg Lys
1 5 10 15
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(13)
<223> 智人Ryk(185-197)
<400> 36
Val Leu Asn Phe Lys Arg Arg Lys Met Cys Tyr Lys Lys
1 5 10

Claims (112)

1.一种分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其：
a)特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1[RANRLVE]中所示的CDR序列；
b)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸；或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1[RANRLVE]中所示的CDR序列；
c)特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:3[HGDSGDY]或SEQ ID NO:4[HGDQGDY]中所示的CDR序列；或
d)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸；或
与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:3[HGDSGDY]或SEQ ID
NO:4[HGDQGDY]中所示的CDR序列，前提是所述抗体或抗体衍生物不是WO 2017/172733A1中公开和/或要求保护的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物。
2.如权利要求1所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：1所示的CDR序列。
3.如权利要求2所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，所述轻链可变区还包含SEQ IDNO:5[KASQDINSYLS]和SEQ ID NO:6[LQYDEFPLT]中所示的CDR序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID
NO:3[HGDSGDY]或SEQ ID NO:4[HGDQGDY]中所示的CDR序列。
5.如权利要求4所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述重链可变区包含SEQID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:7[GFTFSSY]以及SEQ ID NO:3[HGDSGDY]、SEQ ID NO:4[HGDQGDY]或SEQ ID NO:8[HGDNGDY]中的其中一个所示的CDR序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:1[RANRLVE]、SEQ ID NO:5[KASQDINSYLS]及SEQ ID NO:6[LQYDEFPLT]中所示的CDR序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2[STGGGGTY]、SEQ ID NO:7[GFTFSSY]以及SEQ ID NO:3[HGDSGDY]、SEQ ID NO:4[HGDQGDY]或SEQ ID NO:8[HGDNGDY]中的其中一个所示的CDR序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或者SEQ ID
NO:13[VL3]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或者SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14[VHl]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或者SEQ ID NO:18[VH5]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述重链可变区包含SEQID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或者SEQ IDNO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
11.如权利要求1-10任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或者SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或者SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
12.一种分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其：
a)特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列；
b)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或者SEQ ID NO:13[VL3]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列；
c)如参考抗体或抗体衍生物一般，特异性结合Ryk上的Wnt结合结构域或特异性结合Ryk胞外域区域内的表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQID NO:25)的第26-227位氨基酸，所述抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14[VHl]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或者SEQ ID NO:18[VH5]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列；或
d)特异性结合Ryk上Wnt结合结构域上的相同表位或Ryk胞外域区域内的相同表位，例如，小鼠Ryk(SEQ ID NO:24)的第35-211位氨基酸或人Ryk(SEQ ID NO:25)的第26-227位氨基酸，或与参考抗体或抗体衍生物交叉竞争特异性结合到Ryk上的Wnt结合域或Ryk胞外域区域内的相同表位，参考抗体或抗体衍生物包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或者SEQ IDNO:18[VH5]包含至少约85％序列一致性的氨基酸序列，前提是所述抗体或抗体衍生物不是WO 2017/172733A1中公开和/或要求保护的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物。
13.如权利要求12所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列。
14.如权利要求12或13所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
15.如权利要求12-14任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]、SEQ ID NO:12[VL2]或SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]、SEQ ID NO:15[VH2]、SEQ ID NO:16[VH3]、SEQ ID NO:17[VH4]或SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]所示的氨基酸序列。
17.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:15[VH2]所示的氨基酸序列。
18.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:16[VH3]所示的氨基酸序列。
19.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:17[VH4]所示的氨基酸序列。
20.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11[VL1]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
21.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]所示的氨基酸序列。
22.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:15[VH2]所示的氨基酸序列。
23.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:16[VH3]所示的氨基酸序列。
24.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:17[VH4]所示的氨基酸序列。
25.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12[VL2]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
26.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:14[VH1]所示的氨基酸序列。
27.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:15[VH2]所示的氨基酸序列。
28.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:16[VH3]所示的氨基酸序列。
29.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:17[VH4]所示的氨基酸序列。
30.如权利要求15所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:13[VL3]所示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO:18[VH5]所示的氨基酸序列。
31.如权利要求1-30中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物是人源化抗体，例如人源化单克隆抗体。
32.如权利要求1-30中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物选自由以下组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、例如sdAb、sdFv或纳米抗体的单域抗体、胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体、异源偶联抗体、例如双特异性抗体的多特异性抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、串联二价scFv或串联三价scFv。
33.如权利要求32所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述抗体片段是抗抗结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG
(rIgG)片段、例如单链可变片段(scFv)的单链抗体片段或单域抗体片段。
34.如权利要求1-33中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物抑制或减少Ryk与Wnt的结合。
35.如权利要求1-34中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物特异性结合Ryk的第90-183位氨基酸残基内的表位。
36.如权利要求1-35中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物特异性结合到SEQ ID NO:19[SRTIYDPV]中列出的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位，或结合到与SEQ ID NO:19
[SRTIYDPV]中列出的氨基酸序列具有至少约80％的序列一致性的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位。
37.如权利要求36所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物特异性结合到SEQ ID NO:20[ARTIYDPV]、SEQ ID NO:21[PRTIYDPV]或SEQ ID NO:22[SRTLYDPV]中列出的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位。
38.如权利要求36所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物特异性结合到SEQ ID NO:23[SRXIYDPV]中列出的氨基酸序列内的表位或包含该氨基酸序列的表位，X为非T天然氨基酸。
39.如权利要求1-38中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其在人类中具有比WO 2017/172733A1中公开和/或要求保护的Ab5.5更低的免疫抗性。
40.如权利要求39所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其具有比WO
2017/172733A1中公开和/或要求保护的Ab5.5的DRB1风险评分低至少约30％的DRB1风险评分。
41.如权利要求39或40所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其具有范围为约500至约700的DRB1风险评分。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的分离的抗Ryk抗体或抗体衍生物，其具有结合Ryk多肽的在约0.01pM至约500pM范围内的KD值。
43.一种免疫偶联物，其包含与检测剂和/或治疗剂连接的权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物。
44.如权利要求43所述的免疫偶联物，其中所述检测剂或治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
45.一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的权利要求1-44中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物，所述第二功能部分具有与权利要求1-44中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物不同的结合特异性。
46.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-42中任一项所述的抗体或抗体衍生物、权利要求43或44所述的免疫偶联物或权利要求45所述的双特异性分子，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
47.编码权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物或权利要求45所述的双特异性分子的核酸序列。
48.一种包含权利要求47所述的核酸序列的载体。
49.如权利要求48所述的载体，其中所述载体是表达载体。
50.一种包含权利要求48或49所述的载体的宿主细胞。
51.根据权利要求50所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
52.转基因非人动物，例如转基因小鼠，其包含权利要求50或51所述的宿主细胞，其中所述非人动物或小鼠表达由所述核酸编码的多肽。
53.干扰Wnt和Ryk相互作用的方法，包括使包含Wnt和Ryk的样品与权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物、权利要求43或43所述的免疫偶联物或权利要求45所述的双特异性分子接触，从而干扰Wnt和Ryk的相互作用。
54.一种抑制神经元退化的方法，所述方法包括使神经元与权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物、权利要求43或44所述的免疫偶联物、权利要求45所述的双特异性分子、权利要求46所述的药物组合物、权利要求47所述的核酸序列、权利要求48或49所述的载体、或权利要求50或51所述的宿主细胞接触，从而抑制神经元的变性。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述神经元的轴突的退化被抑制或者其中所述神经元的细胞体的退化被抑制。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述轴突是脊髓连合轴突、上运动神经元轴突或中枢神经系统轴突。
57.如权利要求54所述的方法，其中所述神经元是受损的脊髓神经元。
58.如权利要求54所述的方法，其中所述神经元是感觉神经元。
59.如权利要求54所述的方法，其中所述神经元是运动神经元。
60.如权利要求54所述的方法，其中所述神经元是小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮层神经元、交感神经元或海马神经元。
61.如权利要求54所述的方法，其中所述神经元形成神经移植体或神经移植物的一部分。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述神经移植体或所述神经移植物形成生物体的一部分。
63.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中使所述神经元与所述分离的抗体或抗体衍生物、所述免疫偶联物、所述双特异性分子、所述药物组合物、所述核酸序列、所述载体或所述宿主细胞离体或体外接触。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述生物体是哺乳动物。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
66.一种预防或治疗患有神经疾病、病症或损伤的受试者或具有罹患神经疾病、病症或损伤风险的受试者的神经疾病、病症或损伤的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1-42任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物、权利要求43或44所述的免疫偶联物、权利要求45所述的双特异性分子、权利要求46所述的药物组合物、权利要求47所述的核酸序列、权利要求48或49所述的载体、或者权利要求50或51所述的宿主细胞，从而治疗受试者的神经系统疾病、病症或损伤。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述神经系统疾病或病症是神经退行性疾病或病症，例如肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病或帕金森病。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述神经损伤是脊髓损伤、创伤性脑损伤或周围神经损伤。
69.一种用于调节神经元定向生长的方法，包括使神经元与权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物、权利要求43或44所述的免疫偶联物、权利要求45所述的双特异性分子、权利要求46所述的药物组合物、权利要求47所述的核酸序列、权利要求48或49所述的载体、或权利要求50或51所述的宿主细胞接触，从而调节神经元的定向生长。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述神经元是脊髓连合轴突、上运动神经元轴突、中枢神经系统轴突、周围神经系统轴突、受损的脊髓神经元、感觉神经元或运动神经元。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述定向生长促进神经元的再生。
72.一种有效量的权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物、权利要求43或44所述的免疫偶联物、权利要求45所述的双特异性分子、权利要求47所述的核酸序列、权利要求48或49所述的载体、或权利要求50或51所述的宿主细胞的用途，其用于制备用以治疗或预防患有神经性疾病、病症或损伤的受试者或具有罹患神经性疾病、病症或损伤的风险的受试者的神经性疾病、病症或损伤的药物。
73.如权利要求72所述的用途，其中所述神经系统疾病或病症是神经退行性疾病或病症。
74.一种预防或治疗患有癌症或肿瘤的受试者或者具有罹患癌症或肿瘤的风险的受试者的癌症或肿瘤的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1-42任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物、权利要求43或44所述的免疫偶联物、权利要求45所述的双特异性分子、权利要求46所述的药物组合物、权利要求47所述的核酸序列、权利要求48或49所述的载体、或权利要求50或51所述的宿主细胞，从而预防或治疗受试者的癌症或肿瘤。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述癌症或肿瘤由受试者中Ryk和/或Wnt5a的过表达引起或与之相关。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中所述癌症或肿瘤是神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM)、淋巴瘤、白血病、脑癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、胆管癌(胆管癌症)、肝癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、食道癌、头颈癌、胸腺癌、胃癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌或非典型畸胎样横纹肌样瘤。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述神经胶质瘤是低级别神经胶质瘤。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述白血病是T细胞和B细胞急性淋巴细胞白血病或急性髓性白血病。
79.如权利要求76所述的方法，其中所述淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)。
80.如权利要求76所述的方法，其中所述胸腺癌是胸腺瘤(THYM)。
81.如权利要求74-80中任一项所述的方法，其用于治疗受试者的癌症或肿瘤。
82.如权利要求74-80中任一项所述的方法，其用于预防受试者的癌症或肿瘤。
83.如权利要求74-82中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
84.一种有效量的权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物、权利要求43或44所述的免疫偶联物、权利要求45所述的双特异性分子、权利要求47所述的核酸序列、权利要求48或49所述的载体、或权利要求50或51所述的宿主细胞的用途，其用于制备用于预防或治疗患有癌症或肿瘤的受试者或具有罹患癌症或肿瘤的风险的受试者的癌症或肿瘤的药物。
85.一种评估样品中Ryk多肽的方法，所述方法包括：
a)使含有或疑似含有Ryk多肽的样品与权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物、权利要求43或44所述的免疫偶联物或权利要求45所述的双特异性分子接触；和
b)如果Ryk多肽存在于样品中，则分析Ryk多肽与所述分离的抗体或抗体衍生物、所述免疫偶联物或所述双特异性分子之间的结合以评估所述样品中Ryk多肽的存在、不存在、水平或量。
86.根如权利要求85所述的方法，其中所述样品是液体、半液体或固体样品。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中所述样品是生物样品。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述生物样品是血液或尿液样品。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述血液样品是血清、血浆或全血样品。
90.如权利要求85-89中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是临床样品，例如组织活检样品。
91.如权利要求85-90中任一项所述的方法，其中所述Ryk多肽是天然Ryk多肽、蛋白质或其片段。
92.如权利要求85-91中任一项所述的方法，其中使所述Ryk多肽与如权利要求1-42中任一项所述的分离的抗体或抗体衍生物接触。
93.如权利要求85-91中任一项所述的方法，其中使所述Ryk多肽与如权利要求43或44所述的免疫偶联物接触。
94.如权利要求85-91中任一项所述的方法，其中使所述Ryk多肽与如权利要求45所述的双特异性分子接触。
95.如权利要求85-94中任一项所述的方法，其中如果Ryk多肽存在于样品中，则所述Ryk多肽与所述分离的抗体或抗体衍生物、所述免疫偶联物或所述双特异性分子之间的结合通过选自由以下组成的组的形式分析：酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、乳胶凝集、间接血凝试验(IHA)、补体固定、间接免疫荧光测定(IFA)、比浊法、流式细胞术测定、表面等离子共振(SPR)、化学发光测定、横向流动免疫测定、u-捕获测定、抑制测定和亲和力测定。
96.如权利要求85-95中任一项所述的方法，所述方法用于分析样品中Ryk多肽的存在或不存在。
97.如权利要求85-95中任一项所述的方法，所述方法用于分析样品中Ryk多肽的水平或量。
98.如权利要求85-97中任一项所述的方法，其中所述样品分离自或来源于受试者。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
101.如权利要求98-100中任一项所述的方法，其用于诊断、预后、分层、风险评估或治疗监测与对象中异常水平或量的Ryk多肽相关的疾病、病症或损伤。
102.如权利要求101所述的方法，其中将分析的Ryk多肽水平或量与阈值或范围进行比较，以分析受试者中Ryk多肽的水平或量是正常还是异常。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述阈值或范围获自或衍生自患有所述疾病、病症或损伤的受试者或受试者群体，未患有所述疾病、病症或损伤的受试者或受试者群体，或因所述疾病、病症或损伤接受治疗、经治愈或自其恢复的受试者或受试者群体。
104.如权利要求101-103中任一项所述的方法，其用于诊断、预后、分层、风险评估或治疗监测与对象中异常低水平或量的Ryk多肽相关的疾病、病症或损伤。
105.如权利要求101-103中任一项所述的方法，其用于诊断、预后、分层、风险评估或治疗监测与对象中异常高水平或量的Ryk多肽相关的疾病、病症或损伤。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述疾病、病症或损伤是神经元退化、神经系统疾病、病症或损伤、肿瘤或癌症。
107.如权利要求101-106中任一项所述的方法，其还包括治疗受试者的疾病、病症或损伤。
108.如权利要求107所述的方法，其特征在于，所述治疗包括调节或调整受试者中Ryk多肽的水平或量。
109.如权利要求66所述的方法，其中所述神经系统疾病、病症或损伤是神经性疼痛。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述神经性疼痛由体感系统的病变或疾病引起。
111.如权利要求109或110所述的方法，其中所述神经性疼痛是外周神经性疼痛、中枢神经性疼痛或混合性(外周和中枢)神经性疼痛。
112.如权利要求109-111中任一项所述的方法，其中所述分离的抗体或抗体衍生物、所述免疫偶联物、所述双特异性分子、所述药物组合物、所述核酸序列、所述载体或所述宿主细胞通过鞘内给药或输注给药施用于受试者。
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US8236307B2 (en) * 2007-08-03 2012-08-07 Genentech, Inc. Humanized anti-FGF19 antagonists and methods using same
CN103298833B (zh) * 2010-08-14 2015-12-16 Abbvie公司 β淀粉样蛋白结合蛋白
EP2621954A1 (en) * 2010-10-01 2013-08-07 Oxford Biotherapeutics Ltd. Anti-rori antibodies
US20130309223A1 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Seattle Genetics, Inc. CD33 Antibodies And Use Of Same To Treat Cancer
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