CN117295759A - Lag-3蛋白突变体及其制备和应用 - Google Patents

Lag-3蛋白突变体及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及LAG‑3蛋白突变体，其融合蛋白及其应用。本发明的LAG‑3蛋白突变体在LAG‑3蛋白结构域2中存在以下一个或多个位置的突变：188，192，196，197，172，175，177，178，183，185，186，187，189，190，195，199，203，208，210，211，212，214，216，218，198，201，207，209。

Description

LAG-3蛋白突变体及其制备和应用 技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及LAG-3融合蛋白突变体及其制备和应用。
背景技术
淋巴细胞活化基因3(LAG-3，CD223)，是一种由LAG-3基因编码的含有498个氨基酸的I型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。胞外区具有四个Ig样结构域，称为结构域1到结构域4(D1-D4)，类似于CD4，但与CD4的氨基酸同源性仅为20％。胞内区由3部分组成：丝氨酸磷酸化位点、“KIEELE”基序和EP重复序列，其中“KIEELE”基序是在其他蛋白质中均没有出现过的高度保守序列，参与胞内信号转导。
在生理条件下，LAG-3主要表达在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和树突状细胞的细胞膜上，主要通过三种方式来调节T细胞的免疫应答：通过负调节直接抑制T细胞增殖和活化；通过促进调节性T细胞(Treg)的抑制功能间接抑制T细胞应答；通过调节抗原提呈细胞(APC)的功能防止T细胞活化。LAG-3通过细胞内区域传递抑制信号抑制T细胞激活。
LAG-3区分pMHCII的构象并选择性地与稳定的pMHCII结合。到目前为止，除了稳定的pMHCII外，还有其他几种分子被报道为LAG-3的可能配体。半乳糖凝集素-3(galectin-3)和肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)已被证明与LAG-3上的聚糖相互作用。2019年陈列平团队证明了FGL1是LAG-3的一个重要的功能性配体，并揭示了该LAG-3-FGL1通路是独立于PD-L1-PD-1通路的另一条肿瘤免疫逃逸通路，阻断这条通路能和抗PD-1治疗起到协同作用。
目前针对LAG-3的药物开发，包括抗LAG-3阻断性抗体、消耗抗体、激动剂抗体以及LAG-3的融合蛋白。IMP321是一种可溶性重组融合蛋白，由LAG-3的胞外区和IgG的Fc区组成，通过MHCII介导反向信号激活抗原提呈细胞，导致IL-12和TNF的增加，CD80和CD86的上调。该药物被用于癌症治疗，目前处于临床研究中。
发明内容
本发明涉及LAG-3蛋白突变体，其融合蛋白及其应用。具体地，本发明涉及以下内容：
1.LAG-3蛋白突变体，其特征在于，在LAG-3蛋白的结构域2中以下一个或多个位置处存在突变：188，192，196，197，172，175，177，178，183，185，186，187，189，190，195，199，203，208，210，211，212，214，216，218，198，201，207， 209，优选地，在LAG-3蛋白结构域2中以下一个或多个位置处存在突变：177、183、185、186、187、190、195、197、198、199、201、207、212、214、218，优选地，在LAG-3蛋白结构域2中以下一个或多个位置处存在突变：183、185、186、187、190、195、197、199、201、207、212，所述氨基酸位置的编号对应SEQ ID NO:63所示序列的编号，优选所述LAG-3蛋白的结构域2的序列如SEQ ID NO:11所示；
优选地，所述LAG-3蛋白包含结构域1和结构域2，以及任选的结构域3和/或结构域4；
优选地，所述LAG-3蛋白包括完整LAG-3蛋白或LAG-3蛋白片段，其中所述LAG-3蛋白片段选自下组：
(1)LAG-3蛋白片段，包含结构域1和结构域2，或由其组成；
(2)LAG-3蛋白片段，包含结构域1、结构域2和结构域3，或由其组成；
(3)LAG-3蛋白片段，包含结构域1、结构域2、结构域3和结构域4，或由其组成。
2.项目1的LAG-3蛋白突变体，其特征在于，在LAG-3蛋白的结构域2中存在以下突变中的一种或多种：R188A，R192A，H196A，H197A，P172A，P175A，S177A，V178A，N183A，G185A，Q186A，G187A，V189A，P190A，P195A，L199A，F203A，Q208A，S210A，P211A，M212A，S214A，P216A，G218A，H198G，H198L，H198M，H198W，H198Y，H198V，E201R，E201N，E201D，E201Q，E201H，E201G，E201F，E201S，P207R，P207D，P207E，P207I，P207M，P207S，P207T，P207Y，V209T，优选地，P207E、P207I、P207R、P207D、M212A、P207M、S177A、P207T、Q186A、G187A、E201D、E201G、H197A、H198Y、G185A、L199A、N183A、P190A、P195A、S214A、P207Y、G218A、H198W、H198V，优选地，N183A、G185A、Q186A、G187A、P190A、P195A、H197A、L199A、E201D、E201G、P207E、P207I、P207R、P207D、M212A、P207M。
3.项目1或2所述的LAG-3蛋白突变体，其特征在于，在LAG-3蛋白的结构域2中存在选自以下各项组成的组的突变：R188A，R192A，H196A，H197A，P172A，P175A，S177A，V178A，N183A，G185A，Q186A，G187A，V189A，P190A，P195A，L199A，F203A，Q208A，S210A，P211A，M212A，S214A，P216A，G218A，H198G，H198L，H198M，H198W，H198Y，H198V，E201R，E201N，E201D，E201Q，E201H，E201G，E201F，E201S，P207R，P207D，P207E，P207I，P207M，P207S，P207T，P207Y，V209T，P207E和M212A，P207E和E201D，P207I和E201G，E201D和Q186A，H197A和E201G，P207I、E201D和Q186A，E201D、Q186A和P195A，P207E、Q186A和E201G，P207E、E201D、P195A和H197A，P207I、M212A、E201D和N183A，P207E、M212A、E201G和N183A、N183A、G185A、Q186A、G187A、P190A、P195A、L199A 和E201D；或优选地，选自以下各项组成的组的突变：N183A，G185A，Q186A，G187A，P190A，P195A，L199A，E201D，E201G，P207E和M212A，P207E和E201D，P207I和E201G，E201D和Q186A，H197A和E201G，P207I、E201D和Q186A；
优选地，所述LAG-3蛋白突变体的结构域2序列如SEQ ID NO:14-60中任一个所示。
4.LAG-3融合蛋白，其特征在于结构如下：结构单元1-结构单元2，其中所述结构单元1选自LAG-3 D1-D2、LAG-3 D1-D2-D3、或LAG-3 D1-D2-D3-D4，
其中D1表示LAG-3的结构域1，D2表示LAG-3蛋白的结构域2或结构域2突变体，D3表示LAG-3的结构域3，D4表示LAG-3的结构域4，
优选地，D1序列如SEQ ID NO：10所示或如SEQ ID NO:64的第37-167位氨基酸所示，
D2序列如SEQ ID NO:11所示、如权利要求1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体的结构域2序列所示，或如SEQ ID NO:64的第168-252位氨基酸所示，
D3序列如SEQ ID NO：12所示或如SEQ ID NO:64的第265-343位氨基酸所示，
D4序列如SEQ ID NO：13所示或如SEQ ID NO:64的第348-419位氨基酸所示，
所述结构单元2为使LAG-3融合蛋白形成二聚体或多聚体的结构单元，优选选自Fc片段(优选Fc区是来自IgG(如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)抗体的Fc区，优选序列如SEQ ID NO:1所示)，Fab片段的VL-CL或VH-CH1，所述VL-CL和VH-CH1配对形成针对抗原具有特异性的Fab片段或Fab’片段(优选Fab片段的VL-CL序列如SEQ ID NO:4所示时，VH-CH1序列如SEQ ID NO:5所示；或VL-CL序列如SEQ ID NO:61所示时，VH-CH1序列如SEQ ID NO:62所示)，c-JUN(优选序列如SEQ ID NO:2的第1-39位所示)或c-FOS(优先序列如SEQ ID NO:3的第1-39位所示)，所述c-JUN和c-FOS配对形成亮氨酸拉链；当D2表示LAG-3蛋白的D2结构域时，结构单元2为Fab片段的VL-CL或VH-CH1。
5.LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体，其特征在于包含项目4所述的LAG-3融合蛋白，所述LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体中的结构单元1相同或不同。
6.项目5所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体，其为LAG-3融合蛋白二聚体，其特征在于所述结构单元1选自：LAG-3 D1-D2、LAG-3 D1-D2-D3或LAG-3D1-D2-D3-D4，
其中D1表示LAG-3的结构域1，D2表示LAG-3蛋白的结构域2或结构域2突变体，D3表示LAG-3的结构域3，D4表示LAG-3的结构域4，
优选地，D1序列如SEQ ID NO：10所示或如SEQ ID NO:64的第37-167位氨基酸所示，
D2序列如SEQ ID NO:11所示、如权利要求1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体的结构域2序列所示，或如SEQ ID NO:64的第168-252位氨基酸所示，
D3序列如SEQ ID NO：12所示或如SEQ ID NO:64的第265-343位氨基酸所示，
D4序列如SEQ ID NO：13所示或如SEQ ID NO:64的第348-419位氨基酸所示，
其中所述结构单元2选自：
(1)所述结构单元2为Fc片段，优选Fc片段的序列如SEQ ID NO:1所示；或
(2)所述结构单元2为VL-CL或VH-CH1，作为所述LAG-3融合蛋白二聚体中的两个结构单元2的VL-CL和VH-CH1配对形成针对抗原具有特异性的Fab片段；优选所述抗原选自肿瘤细胞表面抗原，免疫细胞表面抗原，病毒，细菌，内毒素，细胞因子，例如CD3，SLAMF7，CD38，BCMA，CD16a，CEA，PD-L1，PD-1，CTLA-4，TIGIT，LAG-3，VEGF，B7-H3，TGF-β或IL-10；优选Fab片段的VL-CL序列如SEQ ID NO:4所示，VH-CH1序列如SEQ ID NO:5所示。
7.项目4所述的LAG-3融合蛋白，其特征在于LAG-3 D1、D2、D3、D4和结构单元2之间通过接头或不通过接头连接，优选所述接头选自SEQ ID NO:6-9任一个所示的序列。
在一些实施方案中，接头是柔性的。在另一些实施方案中，接头是刚性的。在一些实施方案中，接头可以衍生自天然存在的多结构域蛋白或者是本领域常规使用的连接肽的接头。在一些实施方案中，接头可以使用接头设计数据库和计算机程序来设计。
8.偶联物，其包含项目1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体以及偶联部分，或包含项目4所述的LAG-3融合蛋白以及偶联部分，或包含项目5或6所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体以及偶联部分，其中，所述偶联部分为纯化标签(如His标签、Fc标签)、可检测的标记、药物、药物前体、毒素、细胞因子、蛋白(如酶)、病毒、脂质、生物反应调节剂(如免疫调节剂)、PEG、激素、多肽、寡核苷酸、诊断剂、细胞毒性剂、或其组合；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质、化疗剂、生物毒素、聚乙二醇或酶。
9.药物组合物，其包含项目1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体或项目4所述的融合蛋白或项目5或6所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体或项目8所述的偶联物；
优选地，所述药物组合物还包括至少一种治疗癌症或感染性疾病的药物；优选所述药物选自化学治疗药物、免疫治疗药物、或其组合；优选所述药物选自放疗试剂、化疗试剂(如紫杉醇类、蒽环类、吉西他滨)、治疗性抗体(如利妥昔单抗、西妥昔单抗、依决洛单抗、曲妥珠单抗、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)、细胞因子、多肽、抗代谢物、或其组合；
优选地，所述药物组合物还包括至少一种免疫检查点调节剂，所述至少一种免疫检查点调节剂选自：(a)抑制性免疫检查点分子的拮抗剂；以及(b)刺激性免疫检查点分子的激动剂。
10.项目1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体或项目4所述的融合蛋白或项目5或6所 述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体或项目8所述的偶联物在调节免疫反应、免疫刺激、治疗或诊断癌症或帕金森中的应用，或在制备用于调节免疫反应、治疗或诊断癌症或帕金森的药物、免疫刺激剂或佐剂中的应用。
在一些实施例中，所述药物组合物与其他的治疗或预防方案，例如放射治疗、化学治疗、免疫治疗组合施用，优选同时或顺序施用。
在一些实施方案中，优选所述化疗药为烷化剂，抗代谢药物，抗生素，植物类药物和/或激素类药物，优选环磷酰胺，培美曲塞，铂类药物如顺铂、卡铂、奥沙利铂，阿霉素类，紫杉醇类，长春碱类，蒽环类，吉西他滨，他莫昔芬，甲地孕酮，戈舍瑞林，门冬酰胺酶和/或氟尿嘧啶类抗肿瘤药。
11.核酸分子，其包含编码项目1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体或项目4所述的融合蛋白或项目5或6所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体或项目8所述的偶联物的核酸序列或其互补序列。
12.载体，其包含项目11所述的核酸分子。
13.宿主细胞，其包含项目11所述的核酸分子，或项目12所述的载体。
14.治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的项目1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体，或项目4所述的融合蛋白，或项目5或6所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体，项目8所述的偶联物，或项目9所述的药物组合物。
15.试剂盒，其包括项目1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体，或项目4所述的融合蛋白，或项目5或6所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体，项目8所述的偶联物，或项目9所述的药物组合物；优选地，所述试剂盒还包括抗体，其特异性识别所述LAG-3蛋白；任选地，所述抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。在本发明中涉及的术语具备本领域技术人员理解的常规含义。在本技术领域内使用和/或可接受的情况下，一个术语有两个或两个以上定义时，本文使用的术语的定义用于包括所有的含义。
LAG-3分子由胞外区、穿膜区和胞内区3部分组成。胞外区由D1(LAG-3蛋白的结构域1)、D2(LAG-3蛋白的结构域2)、D3(LAG-3蛋白的结构域3)和D4(LAG-3蛋白的结构域4)共4个免疫球蛋白结构域组成。D1区属于V系免疫球蛋白超家族(IgSF)，D2、D3和D4区属于C2系IgSF。D1结构域中包括一个由富含脯氨酸的30个氨基酸组成的额外环结构(extra loop)，据报道此环参与了LAG-3和主要组织相容性复合体II类(MHCII)之间的相互作用。2019年陈列平团队发现FGL1是LAG-3的T细胞抑制功能的配体，并且通过删除特定结构域实验，说明LAG-3的D1和D2是与FGL1相互作用的 主要结构域(Wang et al.,Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3,Cell(2019))。LAG-3依靠D1和D2来结合MHCII和FGL1。本领域的普通技术人员可以理解，含有LAG-3的D1和D2结构域的部分或完整LAG-3蛋白均可以实现与FGL1或MHCII的相互作用，例如，包含D1，D2和D3结构域的部分LAG-3蛋白，或包含D1，D2，D3和D4结构域的完整LAG-3蛋白。
在本发明的一个实施方案中，D1序列如SEQ ID NO:10所示；D2序列如SEQ ID NO:11所示或如本发明的结构域2突变体所示，所述结构域2突变体如项目1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体的结构域2所定义；D3序列如SEQ ID NO:12所示；D4序列如SEQ ID NO:13所示。
在本发明的一个实施方案中，按照Uniprot数据库对LAG-3的D1-D4结构域进行划分，LAG-3的D1、D2、D3和D4的序列与本发明的D1、D2、D3和D4序列(SEQ ID NO:10、11、12和13)的N端和C端存在氨基酸差异，具体参见Uniprot P18627(SEQ ID NO:64)，其中D1-D4的序列划分如下：D1：37-167位氨基酸；D2：168-252位氨基酸；D3：265-343位氨基酸；D4：348-419位氨基酸。本领域的普通技术人员可以理解，按照Uniprot数据库划分的LAG-3蛋白的D1-D4结构域与发明对应的D1-D4(SEQ ID NO:10-13)发挥同样的作用。
LAG-3(CD223)已知在体外诱导单核细胞衍生的树突状细胞的成熟，并且在体内用作免疫治疗佐剂诱导CD41型辅助性T细胞反应和CD8T细胞反应。关于LAG-3和其用作免疫刺激剂的进一步信息可在TRIEBELE等人、TRIEBEL等人以及HUARD等人的著作中找到。可溶性LAG-3的一些形式能够与MHC II类分子结合并且能够诱导树突状细胞成熟并迁移至次级淋巴器官，在次级淋巴器官中它们能够启动导致肿瘤排斥的原态CD4-辅助和CD8细胞毒性T细胞。最近，重组可溶性人LAG-3-Ig融合蛋白显示在先天性免疫应答和获得性免疫应答中均能激活大范围的效应器细胞，例如诱导单核细胞-巨噬细胞分泌细胞因子/趋化因子。
在本发明的一个优选实施方案中，所述LAG-3蛋白片段选自以下任一种情况：
A)所述片段为LAG-3天然蛋白的全长可溶性片段，该可溶性片段保留了LAG-3蛋白中具有结合其天然配体能力的结构域或部分LAG-3蛋白的胞外段，且缺乏部分或者全部的LAG-3蛋白跨膜段及胞内段；
B)所述片段为包含LAG-3天然蛋白的胞外段全长的片段；
C)所述片段为包含了LAG-3天然蛋白胞外段中保留其生物活性的片段；
D)所述片段为除去N端、C端或两者同时的一个或多个(例如5-10个)连续氨基酸残基后的LAG-3天然蛋白胞外段；
E)所述片段为LAG-3蛋白的突变体。
在本发明中，用于形成二聚体的结构单元可以选自例如Fc片段，c-JUN，c-FOS， VL-CL和VH-CH1，所述VL-CL和VH-CH1配对形成针对抗原具有特异性的Fab片段，所述c-JUN和c-FOS配对形成亮氨酸拉链。
在具体的实施方案中，Fc片段序列如SEQ ID NO:1所示，VL-CL序列如SEQ ID NO:4所示时，VH-CH1序列如SEQ ID NO:5所示；或VL-CL序列如SEQ ID NO:61所示时，VH-CH1序列如SEQ ID NO:62所示；c-JUN-His序列如SEQ ID NO:2所示，c-FOS-His序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明中，形成三聚体的结构单元是T4纤维蛋白折叠域(T4 fibritin foldon domain)。
本领域的普通技术人员可以理解，本领域中已知的能够用于形成二聚体或多聚体的结构单元均可以用于形成本发明的二聚体或多聚体。
在一些实施方案中，本发明所述LAG-3蛋白突变体、LAG-3融合蛋白或LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体可以结合治疗剂、药物前体、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。本发明LAG-3蛋白突变体、LAG-3融合蛋白或LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体可以连接至或融合至治疗剂上，该治疗剂可包括可检测标记物，如放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、多肽、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂，其可为药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记物，它们的组合和其他这类本领域已知的成分。
在本发明中，linker表示为接头，linker1表示为接头1，linker2为接头2，linker3为接头3。
与现有技术相比，本发明的有益效果为以下效果的一种或多种：
LAG-3蛋白突变体表达量提高，纯度提高，具有优异的生物活性和特异性，均产生了显著的体外和体内抗肿瘤生物学活性，并且稳定性好。本发明具有LAG-3-Fab结构(如LAG3 D1-D2-D3-D4-Fab、LAG3 D1-D2-Fab)的二聚体保持了LAG-3端和Fab端活性，同时还具有良好的稳定性。
附图说明
图1.LAG-3-Fc的示例性示意图。A，LAG-3 D1-D2-Fc；B，LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc。
图2.LAG-3 D1-D2(野生型)氨基酸序列，其中1-149为D1结构域，150-239为D2结构域(斜体加粗标记)。
图3.LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体与人FGL1(hFGL1)的ELISA检测。
图4.LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体与人MHCII +Daudi细胞的FACS检测，其中A：直接结合；B：与IMP321的竞争结合。
图5.LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体热加速样品SDS-PAGE非还原电泳检测，泳道1：W1161-WT D0；泳道2：W1161-WT D7；泳道3：W1161-WT D14；泳道4： WS447 D0；泳道5：WS447 D7；泳道6：WS447 D14；MK：蛋白Marker。
图6.LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体与人FGL1(hFGL1)的ELISA检测。
图7.LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体与人MHCII +Daudi细胞的FACS检测(直接结合)。
图8.LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体热加速样品SDS-PAGE非还原电泳检测，泳道1：IMP321 D0；泳道2：IMP321 D14；泳道3：A7817 D0；泳道4：A7817 D14；MK：蛋白Marker。
图9.LAG-3 D1-D2-LZ的示例性示意图，其中LZ表示亮氨酸拉链。
图10.LAG-3 D1-D2-LZ野生型及其突变体与人FGL1(hFGL1)的ELISA检测。
图11.LAG-3 D1-D2-LZ野生型及其突变体与人MHCII +Daudi细胞的FACS检测(直接结合)。
图12.LAG-3-Fab的示例性示意图。LAG-3包括D1-D2或D1-D2-D3-D4两种形式。
图13.LAG-3-Fab热加速样品SDS-PAGE非还原电泳检测。泳道1：Y103-7A D0；泳道2：Y103-4A D0；泳道3：Y103-7A D14；泳道4：Y103-4A D14。
图14.LAG-3 D1-D2-Fc和LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc突变体诱导JAWSII细胞释放mTNF-α的生物学活性检测。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内容的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1：LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体
通过基因合成得到LAG-3中D1和D2结构域的基因片段，并在D2结构域的3’端通过linker加Fc基因，将其构建至真核表达载体pCDNA3.1的多克隆酶切位点之间，获得重组蛋白的真核表达载体LAG-3 D1-D2-Fc(如图1A)。LAG-3 D1-D2结构域对应氨基酸序列(SEQ ID NO:63)及位置如图2，对其中的D2结构域进行氨基酸点突变，获得不同突变体。LAG-3 D1-D2-Fc及其突变体构建物的具体结构为D1-D2-Linker-Fc，序列信息如表1。
表1.LAG-3 D1-D2-Fc及其突变体的氨基酸序列信息
实施例2：LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体的表达与纯化
按常规的质粒提取方法进行质粒的提取，并用于化学转染CHO-S细胞(gibco)。转染后的细胞在37℃、5％CO 2摇床中悬浮震荡培养7-10天。通过3000xg离心收获上清并用0.22μm滤膜过滤。通过蛋白A亲和层析纯化得到LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体的融合蛋白。通过在280nm处的UV吸光度以及相应的消光系数测定纯化的蛋白浓度，并计算各蛋白对应的表达量，部份突变体较野生型表达量明显提高，具体如表2。
表2.LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体的表达量
通过高性能尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)测试LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体的高聚体含量，部份突变体的高聚体含量较野生型明显减少，纯度提高，具体如表3，并进行SDS-PAGE检测，其大小与理论分子量110KD相符。
表3.LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体的HPLC-SEC纯度
构建物编号 突变点 HPLC-SEC 构建物编号 突变点 HPLC-SEC
W1161-WT 野生型 65.65％ WS342 P211A 84.00％
WS126 H197A 87.40％ WS343 M212A 84.79％
WS319 S177A 79.34％ WS344 S214A 80.43％
WS323 N183A 84.27％ WS346 P216A 80.65％
WS324 G185A 85.12％ WS443 H198Y 86.37％
WS325 Q186A 86.84％ WS447 E201D 89.03％
WS326 G187A 86.21％ WS451 E201G 87.73％
WS328 P190A 83.00％ WS482 P207R 81.77％
WS331 P195A 81.07％ WS488 P207I 78.50％
WS332 L199A 84.52％ WS494 P207S 78.09％
WS339 Q208A 79.63％ WS495 P207T 85.02％
WS341 S210A 82.49％ WS512 V209T 79.22％
实施例3：LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体的活性检测
1.LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体与人FGL1(hFGL1)的结合能力
采用ELISA方法检测LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体与人FGL1(hFGL1)的结合能力。用PBS缓冲液将待测试样品配制成10μg/ml包被液，加入酶标板(100μl/孔)，4℃包被过夜。次日，弃包被残液，每孔加入300μl的PBST(含0.1％吐温20的PBS)洗1次，每孔再加入300μl 3％BSA，37℃封闭1小时。每孔加入300μl的PBST洗1次后，加入梯度稀释的人FGL1-His抗原(ACRO，FG1-H52Hy)，100μl/孔，37℃孵育1小时。每孔加300μl的PBST清洗3次后，加入稀释好的6×His tag antibody[GT359](HRP)(GeneTex，GTX628914-01)，100μl/孔，37℃孵育1小时。每孔加300μl的PBST清洗5次，加入TMB显色液(100μl/孔)进行显色。最后，加入2M HCl终止反应，并通过酶标仪(Molecular Devices，SPECTRA Max plus 384)进行OD450检测。
结果如图3所示，与突变前的W1161-WT野生型相比，突变体WS323，WS324，WS325，WS326，WS328，WS331，WS332与人FGL1的结合力提高，WS447和WS451保持不变。
2.LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体与人MHCII的结合能力
利用FACS方法，以Daudi细胞(细胞来源于CCTCC-GDC097)作为人MHCII的阳性细胞，检测LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体与人MHCII的直接结合和竞争结合能力。
直接结合：离心收集Daudi细胞，并重悬于缓冲液中(PBS+1％FBS)，按照1X10 5个细胞/孔加入96孔板中，每孔100μl。后按照350xg离心5min后去除上清。将待测样品用缓冲液稀释至2000nM，并3倍或4倍稀释至11个浓度，而后按照100μl/孔加入96孔板中，重悬后置于4℃避光孵育1h，离心后去上清，用缓冲液洗两次后再重悬于稀释好的PE标记抗人IgG Fc抗体(Biolegend,409304)中，4℃避光孵育30min，用缓冲液洗两次后再重悬于100μl缓冲液中，通过流式细胞仪(BD Accuri TM C6)上机检测。
结果如图4A所示，与突变前的W1161-WT野生型相比，突变体WS323，WS324，WS447，WS451与人MHCII +Daudi细胞的直接结合力提高。
竞争结合：离心收集Daudi细胞，并重悬于缓冲液中(PBS+1％FBS)，按照1X105个细胞/孔加入96孔板中，每孔100μl。后按照350xg离心5min后去除上清。将待测样品用缓冲液稀释至4000nM，并3倍或4倍稀释至11个浓度，分别取出30μl与4000nM的IMP321-PE(IMP321序列来源于US20110008331A1中的SEQ ID NO：17)进行等体积混合，而后按照50μl/孔加入96孔板中，重悬后置于4℃避光孵育30min，用缓冲液洗两次后再重悬于50μl缓冲液中，通过流式细胞仪(BD Accuri TM C6)上机检测。
结果如图4B所示，突变体WS447，WS451能够与IMP321竞争结合人MHCII +Daudi细胞，且竞争结合能力优于突变前的W1161-WT野生型。
上述突变体通过结合MHCII、FGL1等，均产生了显著的体外和体内抗肿瘤生物学活性。
实施例4：LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体的稳定性检测
采用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)对样品的稳定性进行评估。突变体WS447，WS451与突变前的W1161-WT相比，Tm1值均有提高，具体如表4。
表4.LAG-3 D1-D2-Fc野生型及其突变体的DSC检测结果
构建物编号 突变点 Tm1
W1161-WT 野生型 56.4℃
WS447 E201D 58.59℃
WS451 E201G 57.89℃
将样品稀释至0.5mg/ml，以100μl/管分装到1.5mL EP管中，放入40℃水浴中进行14天的热加速实验，当天计为D0，第7天记为D7，第14天记为D14。两周后，将D0、D7和D14样品一起进行SDS-PAGE检测。
结果如图5所示，热加速第7天，突变前的W1161-WT出现一条较明显的80KD左右的杂带，而突变体WS447 D7未见杂带；热加速第14天，突变体WS447杂带明显弱于突变前，说明突变体WS447稳定性较突变前更优。
实施例5：LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体制备
LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc(图1B)及其突变体构建物的具体结构为D1-D2-D3-D4-Linker1-Fc，序列信息如表5-1。表达与纯化方法同实施例2。通过高性能尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)测试其高聚体含量。
结果如表5-2所示，突变体A7817、A7820、A7836和A7842的表达量和纯度，较野生型均提高。D2结构域上的突变E201D、E201G、P207I和M212A在LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc融合蛋白中(A7817、A7820、A7836和A7842)产生的效果与在LAG-3 D1-D2-Fc融合蛋白中(WS447、WS451、WS488和WS343)产生的效果基本相同，较野生型均能够显著提高表达量和纯度。
同样地，对于LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc融合蛋白，D2结构域上的其他突变(如N183A、G185A、Q186A、G187A、H197A、H198Y、L199A、P207R、P207T、M212A、P211A等)相较野生型均能够提高表达量或纯度，与在LAG-3 D1-D2-Fc融合蛋白中产生的效果(提高表达量或纯度)均基本相同。
表5-1.LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc及其突变体的氨基酸序列信息
表5-2.LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc及其突变体的表达量及纯度信息
构建物编号 突变点 表达量mg/L HPLC-SEC
IMP321 野生型 20 76.21％
A7817 E201D 47 85.72％
A7820 E201G 42 88.89％
A7836 P207I 76 82.33％
A7842 M212A 82 85.47％
实施例6：LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体的活性检测
采用ELISA方法检测LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体与人FGL1的结合能力，具体方法同实施例3。如图6所示，与突变前的IMP321野生型相比，突变体A7817，A7820与人FGL1的结合力保持不变，突变体A7848，A7850与人FGL1的结合力提高。同样地，对于LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc融合蛋白，D2结构域上的其他突变(如N183A、G185A、Q186A、G187A、P190A、P195A、L199A等)相较野生型均能够提高与人FGL1的结合力，相同突变点在LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc中引起的变化趋势与LAG-3 D1-D2-Fc基本一致(与人FGL1结合力变化)。
利用FACS方法，以Daudi细胞作为人MHCII的阳性细胞，检测LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体与人MHCII的直接结合能力，具体方法同实施例3。如图7所示，与突变前的IMP321野生型相比，突变体A7817，A7820与人MHCII +Daudi细胞的直接结合力显著提高。同样地，对于LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc融合蛋白，D2结构域上的其他突变(如N183A、G185A)相较野生型均能够提高与人MHCII的结合力，相同突变点在LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc中引起的变化趋势与LAG-3 D1-D2-Fc 基本一致(与人MHCII结合力变化)。
上述突变体通过结合MHCII、FGL1等，均产生了显著的体外和体内抗肿瘤生物学活性。
实施例7：LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体的稳定性检测
采用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)对样品的稳定性进行评估。突变体A7817，A7820与突变前的IMP321相比，Tm1值均有提高，具体如表6。
表6.LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体的DSC结果
构建物编号 突变点 Tm1
IMP321 野生型 52.09℃
A7817 E201D 55.67℃
A7820 E201G 54.79℃
将样品稀释至0.5mg/ml，以100μl/管分装到1.5mL EP管中，放入40℃水浴中进行14天的热加速实验，当天计为D0，第14天记为D14。两周后，将D0和D14样品一起进行SDS-PAGE检测。如图8所示，热加速第14天，突变前的IMP321完全降解，而突变体A7817仅部分降解，目标条带仍清晰可见，突变体A7817稳定性较突变前更优，相同突变点在LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc中的引起的变化趋势与LAG-3 D1-D2-Fc基本一致(热稳定性变化)。
实施例8：LAG-3 D1-D2-LZ野生型及其突变体制备
LAG-3 D1-D2-LZ示意图如图9，野生型及突变体构建物的具体结构为D1-D2-Linker2-c-JUN-His和D1-D2-Linker2-c-FOS-His，其中c-JUN-His和c-FOS-His相互配对从而使LAG-3 D1-D2-LZ形成二聚体结构，序列信息如表7-1。表达方法同实施例2，通过Ni柱的亲和层析纯化获得蛋白，通过高性能尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)测试其高聚体含量。
结果如表7-2所示，突变体WS447-LZ、WS451-LZ、WS488-LZ和WS343-LZ的表达量和纯度，较野生型均提高。并且，D2结构域上的突变E201D、E201G、P207I和M212A在LAG-3 D1-D2-LZ融合蛋白中(WS447-LZ、WS451-LZ、WS488-LZ和WS343-LZ)产生的效果与在LAG-3 D1-D2-Fc融合蛋白中(WS447、WS451、WS488和WS343)产生的效果基本相同，较野生型均能够显著提高表达量和纯度。
同样地，对于LAG-3 D1-D2-LZ融合蛋白，D2结构域上的其他突变(如N183A、G185A、Q186A、G187A、H197A、H198Y、L199A、P207R、P207T、M212A、P211A等)相较野生型均能够提高表达量或纯度，与在LAG-3 D1-D2-Fc融合蛋白中产生的效果(提高表达量或纯度)均基本相同。
表7-1.LAG-3 D1-D2-LZ及其突变体的氨基酸序列信息
表7-2.LAG-3 D1-D2-LZ及其突变体的表达量及纯度信息
构建物编号 突变点 表达量mg/L HPLC-SEC
W1161-LZ 野生型 26 68.58％
WS447-LZ E201D 55 81.67％
WS451-LZ E201G 40 80.27％
WS488-LZ P207I 67 79.67％
WS343-LZ M212A 72 78.27％
实施例9：LAG-3 D1-D2-LZ野生型及其突变体的活性检测
采用ELISA方法检测LAG-3 D1-D2-LZ野生型及其突变体与人FGL1的结合能力，具体方法同实施例3。如图10所示，与突变前的W1161-LZ野生型相比，突变体WS447-LZ和WS451-LZ与人FGL1的结合力保持不变，突变体WS323-LZ和WS331-LZ与人FGL1的结合力提高，变化趋势与之前Fc标签的一致，突变产生的效果不受标签的影响。同样地，LAG-3 D1-D2-LZ融合蛋白中D2结构域上的其他突变(如N183A、G185A、Q186A、G187A、P190A、P195A、L199A等)相较野生型均能够提高与人FGL1的结合力。
利用FACS方法，以Daudi细胞作为人MHCII的阳性细胞，检测LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc野生型及其突变体与人MHCII的直接结合能力，具体方法同实施例3。如图11所示，与突变前的W1161-LZ野生型相比，突变体WS447-LZ，WS451-LZ与人MHCII +Daudi细胞的直接结合力显著提高，变化趋势与之前Fc标签的一致，突变产生的效果不受标签的影响。同样地，LAG-3 D1-D2-LZ融合蛋白中D2结构域上的其他突变(如N183A、G185A等)相较野生型均能够提高与人MHCII的结合力。上述突变体通过结合MHCII、FGL1等，均产生了显著的体外和体内抗肿瘤生物学活性。
实施例10：LAG-3 D1-D2-LZ野生型及其突变体的稳定性检测
采用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)对样品的稳定性进行评估。突变体WS447-LZ，WS451-LZ与突变前的W1161-LZ相比，Tm1值均有提高，具体如表8。
表8.LAG-3 D1-D2-LZ野生型及其突变体的DSC结果
构建物编号 突变点 Tm1
W1161-LZ 野生型 55.95℃
WS447-LZ E201D 58.3℃
WS451-LZ E201G 57.97℃
实施例11：LAG-3-Fab野生型及其突变体制备
LAG-3-Fab的示例性示意图如图12，野生型及突变体构建物的具体结构为LAG-3-Linker3-VL-CL和LAG-3-Linker3-VH-CH1，本实施例中的LAG-3为LAG-3 D1-D2或者LAG-3 D1-D2-D3-D4，序列信息如表9-1。其中VL-CL和VH-CH1相互配对形成针对抗原具有特异性的Fab片段，从而使融合蛋白形成二聚体结构。Y103-4A、4A-D、4A-G、Y103-7A、7A-D和7A-G中的VL-CL和VH-CH1形成的Fab片段针对PD-L1具有特异性；Y103-4B和Y103-7B中的VL-CL和VH-CH1形成的Fab片段针对PD-1具有特异性。表达和纯化方法同实施例2，通过高性能尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)测试其高聚体含量，突变体的表达量与纯度较野生型均提高，具体如表9-2。
表9-1.LAG-3-Fab及其突变体的氨基酸序列信息
表9-2.LAG-3-Fab及其突变体的表达量及纯度信息
构建物编号 突变点 表达量mg/L HPLC-SEC
Y103-4A 野生型 21 74.81％
4A-D E201D 36 84.52％
4A-G E201G 35 83.23％
Y103-7A 野生型 18 72.04％
7A-D E201D 35 89.35％
7A-G E201G 42 84.29％
实施例12：LAG-3-Fab的活性检测
采用ELISA和FACS方法分别检测LAG-3-Fab野生型及其突变体中LAG-3端的活性，包括与人FGL1和人MHCII的结合能力，具体方法同实施例3。突变在LAG3-Fab中引起的变化趋势与之前LAG-3 D1-D2-Fc的基本一致。
采用Biacore检测LAG-3-Fab两端的活性，包括LAG-3端与抗PD-L1或PD-1的Fab端。采用氨基偶联方法将抗原固定于CM5芯片上，抗原偶联量为800RU，采用1×HBS-EP+buffer稀释样品至起始浓度，再2倍梯度稀释4个浓度，上机从低浓度至高浓度进行检测，结合流速30μL/min，结合时间120s，解离时间300s；采用pH1.5Glycine溶液再生芯片，再生流速10μL/min，再生时间30s。检测检测结束后，采用软件Biacore T200 Evaluation Software以1:1Binding拟合方式对结果图谱进行数据拟合，得到解离平衡常数(KD)。
结果如表10所示，Y103-4A、Y103-7A、Y103-4B和Y103-7B与hFGL1抗原及PD-L1(SB公司,Cat:10084-H08H)或PD-1(SB公司,Cat:HPLC-10377-H08H)抗原均有较强结合作用，且hFGL1端亲和力高于IMP321，并且均产生了显著的体外和体内抗肿瘤生物学活性。
表10.LAG-3-Fab的BIACORE检测
构建物编号 KD hFGL1(M) KD PD-L1或PD-1(M)
IMP321(LAG3 D1-D2-D3-D4-Fc) 8.430E-09 --
Y103-4A(LAG3 D1-D2-D3-D4-Fab) 9.292E-10 2.234E-13(PD-L1)
Y103-7A(LAG3 D1-D2-Fab) 2.458E-09 3.648E-11(PD-L1)
Y103-4B(LAG3 D1-D2-D3-D4-Fab) 6.365E-10 1.071E-8(PD-1)
Y103-7B(LAG3 D1-D2-Fab) 3.257E-09 1.571E-8(PD-1)
实施例13：LAG-3-Fab的稳定性检测
采用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)对样品的稳定性进行评估。Y103-4A和Y103-4B与IMP321相比，Tm1值提高；Y103-7A和Y103-7B与W1161-WT相比，Tm1值提高，具体如表11。
表11.LAG3-Fab的DSC结果
构建物编号 Tm1
IMP321(LAG3 D1-D2-D3-D4-Fc) 52.09℃
Y103-4A(LAG3 D1-D2-D3-D4-Fab) 57.82℃
Y103-4B(LAG3 D1-D2-D3-D4-Fab) 57.22℃
W1161-WT(LAG3 D1-D2-Fc) 56.4℃
Y103-7A(LAG3 D1-D2-Fab) 58.40℃
Y103-7B(LAG3 D1-D2-Fab) 57.86℃
将样品稀释至0.5mg/ml，以100μl/管分装到1.5mL EP管中，放入40℃水浴中进行14天的热加速实验，当天计为D0，第14天记为D14。两周后，将D0和D14样品 一起进行SDS-PAGE检测。如图13所示，LAG-3-Fab(包括LAG-3 D1-D2-Fab和LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fab结构)热加速14天后，无变化；而IMP321(LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc结构)在热加速14天时完全降解(如图8)，W1161-WT(LAG-3 D1-D2-Fc结构)在热加速14天时出现杂带(如图5)，说明LAG3-Fab稳定性明显优于LAG-3-Fc。
实施例14
构建LAG-3 D1-D2-D3-Fc及其突变体，具体结构为D1-D2-D3-Linker-Fc。其中各突变体的突变位点分别为E201D、E201G、P207I和M212A，linker和Fc序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:1所示。重复上述实施例2-4的实验步骤，同样实现了类似的效果，即相较于野生型，各突变体的表达量和纯度显著提高(表达量提高>50％，纯度提高>15％)，并且亲和力和稳定性也提高，通过结合MHCII、FGL1等均产生了显著的体外和体内抗肿瘤生物学活性。
实施例15
对上述实施例验证的单点突变进行组合，融合蛋白构建物包括LAG-3 D1-D2-Fc、LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc、LAG-3 D1-D2-LZ和LAG-3-Fab，具体突变组合参见下表12，具体序列参见上述实施例1-12，其中LAG-3-Fab中VL-CL和VH-CH1的序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。LAG-3 D1-D2-Fc和LAG-3 D1-D2-D3-D4-Fc的结构如图1所示，LAG-3 D1-D2-LZ的结构如图9所示，LAG-3 Fab的结构如图12所示。重复上述实施例2-4的步骤，结果发现双位点突变、三位点突变、四位点突变组合同样实现类似的效果，如以下一种或多种效果：表达量提高，纯度提高，稳定性好，亲和力提高。并且，双位点突变、三位点突变、四位点突变组合均优于单点突变结果，并且这些突变体通过结合MHCII、FGL1，均产生了显著的体外和体内抗肿瘤生物学活性。
表12.突变位点的组合
双位点突变组合 三位点突变组合 四位点突变点组合
P207E,M212A P207E,M212A,E201D P207E,M212A,E201D,H197A
P207E,E201D P207I,M212A,E201G P207E,N183A,E201D,H197A
P207I,E201G P207I,H197A,E201D P207I,M212A,E201D,N183A
P207E,N183A P207E,H197A,E201G P207E,E201D,P195A,H197A
H197A,E201D P207E,N183A,E201D M212A,E201D,N183A,H197A
H197A,E201G P207E,Q186A,E201G P207E,M212A,E201G,H197A
E201D,N183A P207I,E201D,Q186A P207E,N183A,E201G,H197A
E201G,Q186A P207R,E201G,P195A P207E,M212A,E201G,N183A
E201D,G185A P207D,E201D,G187A P207E,E201G,G185A,H197A
E201D,Q186A E201D,H197A,Q186A M212A,E201G,Q186A,H197A
E201D,G187A E201D,P190A,N183A P207E,M212A,S177A,Q186A
E201G,P190A M212A,E201G,G187A E201D,H197A,Q186A,H198Y
E201G,P195A E201G,H197A,L199A E201G,G187A,P195A,L199A
E201G,L199A E201D,Q186A,P195A E201D,Q186A,G187A,P190A
实施例16：诱导单核细胞释放细胞因子的生物学活性检测
取对数生长期的JAWSII细胞(细胞来源于 CRL-11904 TM)，以5×10 4个细胞/孔加入96孔板中，每孔100μl。将待测样品用缓冲液稀释至500nM，并5倍稀释至9个浓度，而后按照100μl/孔加入96孔板中。置于37℃，5％CO 2培养箱中培养，48小时后取出96孔板，300g×5min离心，收集细胞上清，用mTNF-αELISA试剂盒(R&D，DY410-05)检测细胞上清中mTNF-α的表达情况。
结果如图14所示，突变体WS447，WS451，A7817和A7820均能够诱导未成熟小鼠树突状细胞JAWSII释放mTNF-α，且与IMP321相比活性相当或更优。这说明构建物WS447，WS451，A7817和A7820能引起MHCII类分子的正向信号传递，促使抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells,APC)分泌促炎因子和趋化因子，活化的APC可以增强现有的免疫反应。
序列表

Claims (10)

  1. LAG-3蛋白突变体，其特征在于，在LAG-3蛋白的结构域2中以下一个或多个位置处存在突变：188，192，196，197，172，175，177，178，183，185，186，187，189，190，195，199，203，208，210，211，212，214，216，218，198，201，207，209，优选地，在LAG-3蛋白结构域2中以下一个或多个位置处存在突变：177、183、185、186、187、190、195、197、198、199、201、207、212、214、218，优选地，在LAG-3蛋白结构域2中以下一个或多个位置处存在突变：183、185、186、187、190、195、197、199、201、207、212，所述氨基酸位置的编号对应SEQ ID NO:63所示序列的编号，优选所述LAG-3蛋白的结构域2的序列如SEQ ID NO:11所示；
    优选地，所述LAG-3蛋白包含结构域1和结构域2，以及任选的结构域3和/或结构域4；
    优选地，所述LAG-3蛋白包括完整LAG-3蛋白或LAG-3蛋白片段，其中所述LAG-3蛋白片段选自下组：
    (1)LAG-3蛋白片段，包含结构域1和结构域2，或由其组成；
    (2)LAG-3蛋白片段，包含结构域1、结构域2和结构域3，或由其组成；
    (3)LAG-3蛋白片段，包含结构域1、结构域2、结构域3和结构域4，或由其组成。
  2. 权利要求1的LAG-3蛋白突变体，其特征在于，在LAG-3蛋白的结构域2中存在以下突变中的一种或多种：R188A，R192A，H196A，H197A，P172A，P175A，S177A，V178A，N183A，G185A，Q186A，G187A，V189A，P190A，P195A，L199A，F203A，Q208A，S210A，P211A，M212A，S214A，P216A，G218A，H198G，H198L，H198M，H198W，H198Y，H198V，E201R，E201N，E201D，E201Q，E201H，E201G，E201F，E201S，P207R，P207D，P207E，P207I，P207M，P207S，P207T，P207Y，V209T，优选地，P207E、P207I、P207R、P207D、M212A、P207M、S177A、P207T、Q186A、G187A、E201D、E201G、H197A、H198Y、G185A、L199A、N183A、P190A、P195A、S214A、P207Y、G218A、H198W、H198V，优选地，N183A、G185A、Q186A、G187A、P190A、P195A、H197A、L199A、E201D、E201G、P207E、P207I、P207R、P207D、M212A、P207M。
  3. 权利要求1或2所述的LAG-3蛋白突变体，其特征在于，在LAG-3蛋白的结构域2中存在选自以下各项组成的组的突变：R188A，R192A，H196A，H197A，P172A，P175A，S177A，V178A，N183A，G185A，Q186A，G187A，V189A，P190A，P195A，L199A，F203A，Q208A，S210A，P211A，M212A，S214A，P216A，G218A，H198G，H198L，H198M，H198W，H198Y，H198V，E201R，E201N，E201D，E201Q，E201H，E201G，E201F，E201S，P207R，P207D，P207E，P207I，P207M，P207S，P207T， P207Y，V209T，P207E和M212A，P207E和E201D，P207I和E201G，E201D和Q186A，H197A和E201G，P207I、E201D和Q186A，E201D、Q186A和P195A，P207E、Q186A和E201G，P207E、E201D、P195A和H197A，P207I、M212A、E201D和N183A，P207E、M212A、E201G和N183A、N183A、G185A、Q186A、G187A、P190A、P195A、L199A和E201D；或优选地，选自以下各项组成的组的突变：N183A，G185A，Q186A，G187A，P190A，P195A，L199A，E201D，E201G，P207E和M212A，P207E和E201D，P207I和E201G，E201D和Q186A，H197A和E201G，P207I、E201D和Q186A；
    优选地，所述LAG-3蛋白突变体的结构域2序列如SEQ ID NO:14-60任一个所示。
  4. LAG-3融合蛋白，其特征在于结构如下：结构单元1-结构单元2，其中所述结构单元1选自LAG-3 D1-D2、LAG-3 D1-D2-D3、或LAG-3 D1-D2-D3-D4，其中D1表示LAG-3的结构域1，D2表示LAG-3蛋白的结构域2或结构域2突变体，D3表示LAG-3的结构域3，D4表示LAG-3的结构域4，
    优选地，D1序列如SEQ ID NO：10所示或如SEQ ID NO:64的第37-167位氨基酸所示，
    D2序列如SEQ ID NO:11所示、如权利要求1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体的结构域2序列所示，或如SEQ ID NO:64的第168-252位氨基酸所示，
    D3序列如SEQ ID NO：12所示或如SEQ ID NO:64的第265-343位氨基酸所示，
    D4序列如SEQ ID NO：13所示或如SEQ ID NO:64的第348-419位氨基酸所示，所述结构单元2为使LAG-3融合蛋白形成二聚体或多聚体的结构单元，优选选自Fc片段(优选Fc区是来自IgG(如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)抗体的Fc区，优选序列如SEQ ID NO:1所示)，Fab片段的VL-CL或VH-CH1，所述VL-CL和VH-CH1配对形成针对抗原具有特异性的Fab片段或Fab’片段(优选VL-CL序列如SEQ ID NO:4所示时，VH-CH1序列如SEQ ID NO:5所示；或VL-CL序列如SEQ ID NO:61所示时，VH-CH1序列如SEQ ID NO:62所示)，c-JUN(优选序列如SEQ ID NO:2的第1-39位所示)或c-FOS(优先序列如SEQ ID NO:3的第1-39位所示)，所述c-JUN和c-FOS配对形成亮氨酸拉链；当D2表示LAG-3的天然D2结构域时，结构单元2为Fab片段的VL-CL或VH-CH1。
  5. LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体，其特征在于包含权利要求4所述的LAG-3融合蛋白，所述LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体中的结构单元1相同或不同。
  6. 权利要求5所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体，其为LAG-3融合蛋白二聚体，其特征在于所述结构单元1选自：LAG-3 D1-D2、LAG-3 D1-D2-D3、或LAG-3 D1-D2-D3-D4，
    其中D1表示LAG-3的结构域1，D2表示LAG-3蛋白的结构域2或结构域2突变体，D3表示LAG-3的结构域3，D4表示LAG-3的结构域4，
    优选地，D1序列如SEQ ID NO：10所示或如SEQ ID NO:64的第37-167位氨基酸所示，
    D2序列如SEQ ID NO:11所示、如权利要求1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体的结构域2序列所示，或如SEQ ID NO:64的第168-252位氨基酸所示，
    D3序列如SEQ ID NO：12所示或如SEQ ID NO:64的第265-343位氨基酸所示，
    D4序列如SEQ ID NO：13所示或如SEQ ID NO:64的第348-419位氨基酸所示，
    所述结构单元2选自：
    (1)所述结构单元2为Fc片段，优选Fc片段的序列如SEQ ID NO:1所示；或
    (2)所述结构单元2为VL-CL或VH-CH1，作为所述LAG-3融合蛋白二聚体中的两个结构单元2的VL-CL和VH-CH1配对形成针对抗原具有特异性的Fab片段；优选所述抗原选自肿瘤细胞表面抗原，免疫细胞表面抗原，病毒，细菌，内毒素，细胞因子，例如CD3，SLAMF7，CD38，BCMA，CD16a，CEA，PD-L1，PD-1，CTLA-4，TIGIT，LAG-3，VEGF，B7-H3，TGF-β或IL-10；优选Fab片段的VL-CL序列如SEQ ID NO:4所示，VH-CH1序列如SEQ ID NO:5所示。
  7. 权利要求4所述的LAG-3融合蛋白，其特征在于LAG-3 D1、D2、D3、D4和结构单元之间通过接头或不通过接头连接，优选所述接头选自SEQ ID NO:6-9任一个所示的序列。
  8. 偶联物，其包含权利要求1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体以及偶联部分，或包含权利要求4所述的LAG-3融合蛋白以及偶联部分，或包含权利要求5或6所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体以及偶联部分，其中，所述偶联部分为纯化标签(如His标签、Fc标签)、可检测的标记、药物、药物前体、毒素、细胞因子、蛋白(如酶)、病毒、脂质、生物反应调节剂(如免疫调节剂)、PEG、激素、多肽、寡核苷酸、诊断剂、细胞毒性剂、或其组合；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质、化疗剂、生物毒素、聚乙二醇或酶。
  9. 药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体或权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5或6所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体或权利要求8所述的偶联物；
    优选地，所述药物组合物还包括至少一种治疗癌症或感染性疾病的药物；优选所述药物选自化学治疗药物、免疫治疗药物、或其组合；优选所述药物选自放疗试剂、化疗试剂(如紫杉醇类、蒽环类、吉西他滨)、治疗抗体(如利妥昔单抗、西妥昔单抗、依决洛单抗、曲妥珠单抗、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)、细胞因子、多肽、抗代谢物、或其组合；
    优选地，所述药物组合物还包括至少一种免疫检查点调节剂，所述至少一种免疫检查点调节剂选自：(a)抑制性免疫检查点分子的拮抗剂；以及(b)刺激性免疫检查点分子的 激动剂。
  10. 权利要求1-3任一项所述的LAG-3蛋白突变体或权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5或6所述的LAG-3融合蛋白二聚体或多聚体或权利要求8所述的偶联物在调节免疫反应、免疫刺激、治疗或诊断癌症或帕金森中的应用，或在制备用于调节免疫反应、治疗或诊断癌症或帕金森的药物、免疫刺激剂或佐剂中的应用。
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